Anda di halaman 1dari 76

UNIVERSITAS INDONESIA

SINTESIS SENYAWA DIMER KATEKIN DARI EKSTRAK


TEH HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN KATALIS ENZIM
PEROKSIDASE DARI KULIT BAWANG BOMBAY
(ALLIUM CEPA L.)

TESIS

HERONIATY
1006734451

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM


PROGRAM PASCASARJANA
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU KIMIA
DEPOK
JULI 2012

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


UNIVERSITAS INDONESIA

SINTESIS SENYAWA DIMER KATEKIN DARI EKSTRAK


TEH HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN KATALIS ENZIM
PEROKSIDASE DARI KULIT BAWANG BOMBAY
(ALLIUM CEPA L.)

TESIS
Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar
Magister Sains Ilmu Kimia

HERONIATY
1006734451

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM


PROGRAM PASCASARJANA
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU KIMIA
DEPOK
JULI 2012

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012
Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012
KATA PENGANTAR

Rasa syukur terindah dan terdalam penulis panjatkan kepada pemilik raga
yang Maha Agung Allah SWT berkat karunia dan izin-Nya maka penulis dapat
menyelesaikan tesis yang berjudul Sintesis Senyawa Dimer Katekin Dari Ekstrak
Teh Hijau Dengan Menggunakan Katalis Enzim Peroksidase Dari Kulit Bawang
Bombay (Allium cepa L.) dengan baik. Tesis ini disusun sebagai salah satu
persyaratan untuk menempuh ujian akhir Program Studi Magister Ilmu Kimia
pada Program Pascasarjana Universitas Indonesia.
Dalam penyusunan tesis ini penulis telah dibantu berbagai pihak baik
berupa dukungan materil maupun moril yang sangat berarti bagi penyelesaian
tesis ini. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Dr. Herry Cahyana, selaku pembimbing I penelitian yang telah banyak
membantu dan memberikan bimbingan serta arahan sehingga tesis ini
dapat diselesaikan dengan baik.
2. Dr. Widajanti Wibowo, selaku pembimbing II penelitian yang telah
banyak membantu dan membimbing dalam penyelesaian tesis ini.
3. Dr. Emil Budianto, selaku pembimbing akademis yang telah banyak
memberikan bimbingan selama penulis menjalani masa pendidikan di
Universitas Indonesia.
4. Dr. Endang Saepudin, selaku ketua Program Studi Magister Ilmu Kimia,
Program Pasca Sarjana Universitas Indonesia.
5. Seluruh Bapak Ibu dosen mata kuliah pada Program Studi Magister Ilmu
Kimia yang telah banyak memberikan ilmu yang sangat menunjang dalam
memahami penelitian ini dan sebagai sumber informasi dalam penulisan
tesis.
6. Bapak Jaswanto, dari Pusat Laboratorium Forensik Maber Polri atas waktu
dan bimbingannya dalam penelitian tugas akhir.
7. Ayahanda tercinta di surga, ibunda terkasih, kakak, dan adikku yang telah
memberikan doa, semangat dan dukungan moril yang tiada terkira selama
penelitian ini.

iv

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


8. Teman-teman mahasiswa S2 atas bantuan, dan dorongan semangatnya.
9. Semua orang tercinta yang banyak memberikan dukungan dan doa kepada
penulis.
Tesis ini khusus penulis persembahkan kepada Almarhum Ayahanda Heri
Suparto, yang telah memberikan kasih sayang yang tulus dan semua itu menjadi
motivasi untuk penulis dalam menyelesaikan pendidikan di Universitas Indonesia.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna. Saran dan
kritik sangat penulis harapkan. Semoga hasil penelitian ini dapat memberikan
sumbangan yang bermanfaat bagi kita semua.

Depok, 22 Juni 2012


Penulis

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012
ABSTRAK

Nama : Heroniaty
Program Studi : Magister Sains Ilmu Kimia
Judul : Sintesis Senyawa Dimer Katekin dari Ekstrak Teh Hijau
Dengan Menggunakan Katalis Enzim Peroksidase dari
Kulit Bawang Bombay (Allium cepa L.)

Penelitian ini bertujuan untuk meneliti aktivitas peroksidase yang berasal


dari kulit bawang bombay (Allium cepa L) untuk dapat melakukan reaksi
dimerisasi oksidatif dengan menggunakan substrat senyawa katekin dari ekstrak
teh hijau.
Sintesis senyawa dimer katekin yang dikatalis oleh peroksidase (EC
1.11.1.7) dari kulit bawang bombay, telah dilakukan dan menghasilkan suatu
senyawa baru. Aktivitas peroksidase optimum terjadi pada pH 5 dan suhu 30 0C.
Peroksidase merupakan enzim kelompok oksidoreduktase yang dapat mentransfer
atom H dari senyawa fenolik sehingga menghasilkan radikal fenoksi. Dua radikal
fenoksi yang bergabung melalui reaksi kopling oksidatif, menghasilkan senyawa
dimer. Senyawa yang terbentuk diidentifikasikan dengan instrumen GC-MS. Pada
radikal fenolik katekin, terjadi kopling pada posisi C-4 dan C-8 yang
membentuk senyawa 4- 8 dikatekin. Senyawa hasil reaksi dan substrat asalnya
dibandingkan aktifitas antioksidannya dengan menggunakan metode radical
scavenger DPPH sehingga diketahui IC50 masing-masing sebesar katekin : dimer
katekin = 60,248 : 58,928.

Kata kunci: Peroksidase, Katekin, Reaksi Kopling Oksidatif, Aktivitas


Antioksidan

vii

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


ABSTRACT

Name : Heroniaty
Study Program : Magister of Chemistry Science
Title : Synthesis of Catechin Dimer from Green Tea Extract
using Peroxidase as Catalist from Onion (Allium cepa
L.)

This study, aims to examine the activity of peroxidase from skin of onion
(Allium cepa L) to be able to perform oxidative dimerization reaction with the
substrate catechin compounds from green tea extract.
Synthesis of catechin dimer which catalized by peroxidase (EC 1.11.1.7)
from onion skins have been carried out and produce a compound of reaction.
Optimum activity of peroxidase occurs at pH 5 and temperature 30 0C. Peroxidase
is an oxidoreductase group that can transfer hidrogen from phenolic compound to
produce phenoxy radicals. Two phenoxy radicals are joined through the oxidative
coupling reaction, resulting a dimer compound. Compound formed were
identified by GCMS instrument. In a catechin phenolic radical, coupling occurs at
position C-4 'and C-8 "which form the compound 4'-8" dicatechin. Compounds of
reaction and native substrate were identified antioxidant activity by using DPPH
radical scavenger that is known IC50 respectively by catechins: catechin dimer =
60.248: 58.928.

Keywords: peroxidase, catechin, oxidative coupling reaction, antioxidant


activity

viii

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................................. i


HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS..................................... ii
LEMBAR PEGESAHAN ......................................................................... iii
KATA PENGANTAR ............................................................................... iv
LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .............. vi
ABSTRAK ................................................................................................. vii
DAFTAR ISI .............................................................................................. ix
DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xi
DAFTAR TABEL...................................................................................... xiii
BAB I: PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ................................................................................ 1
1.2 Perumusan Masalah.......................................................................... 2
1.3 Tujuan Penelitian.............................................................................. 2
1.4 Hipotesis ........................................................................................... 3
1.5 Ruang Lingkup ................................................................................. 3
1.6 Manfaat Penelitian............................................................................ 3
1.7 Batasan Penelitian ............................................................................ 4

BAB II: TINJAUAN PUSTAKA


2.1 Teh ................................................................................................... 5
2.2 Macam-Macam Teh ........................................................................ 5
2.3 Komponen Teh ................................................................................ 8
2.4 Antioksidaan Pada Teh Hijau ......................................................... 9
2.5 Katekin ............................................................................................ 10
2.6 Bawang Bombay ............................................................................. 12
2.7 Kandungan Bawang Bombay .......................................................... 13
2.2 Peroksidase ...................................................................................... 15
2.3 Reaksi Kopling Oksidatif ................................................................ 19
2.4 Antioksidan ..................................................................................... 22

BAB III: METODE PENELITIAN


3.1 Alat dan bahan ................................................................................. 24
3.1.1 Alat yang digunakan ............................................................ 24
3.1.2 Bahan yang digunakan ........................................................ 24
3.2 Metode Kerja ................................................................................... 24
3.2.1 Preparasi Larutan ................................................................. 24
3.2.2 Isolasi Enzim Peroksidase dari Kulit Bawang
Bombay................................................................................ 26
3.2.3 Pemurnian Enzim Peroksidase dengan Ammonium
Sulfat.................................................................................... 27
3.2.4 Karakterisasi Enzim Peroksidase ........................................ 28

ix

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


3.2.5 Penentuan Aktivitas Peroksidase ......................................... 28
3.2.6 Penentuan Kadar Protein Enzim Dengan Metode
Lowry .................................................................................. 29
3.2.7 Reaksi Dimerisasi Katekin Menggunakan Enzim
Peroksidase .......................................................................... 30
3.2.8 Uji KLT dan Pemisahan Komponen Hasil Reaksi .............. 31
3.2.9 Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH .............. 31

BAB IV: HASIL DAN PEMBAHASAN


4.1 Isolasi dan Pemurnian Enzim Peroksidase ...................................... 33
4.2 Karakterisasi Enzim Peroksidase .................................................... 35
4.3 Uji Aktivitas Enzim dan Penentuan Kadar Protein ......................... 36
4.4 Sintesis Senyawa Dimer Katekin .................................................... 39
4.5 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Menggunakan DPPH ................ 49

BAB V: KESIMPULAN DAN SARAN


5.1 Kesimpulan ..................................................................................... 54
5.2 Saran ................................................................................................ 54

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 55

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Komponen Teh .................................................................. 8

Gambar 2.2 Struktur Katekin ................................................................ 11

Gambar 2.3 Siklus Katalitik Enzim Peroksidase yang


Mengandung Heme ........................................................... 18

Gambar 2.4 Reaksi Kopling Oksidatif Fenolik ..................................... 19

Gambar 2.5 Resonansi radikal senyawa katekin ................................... 20

Gambar 2.6 Kemungkinan Dimer katekin yang Terbentuk .................. 21

Gambar 4.1 Enzim kasar (a) dan enzim fraksi III hasil
pemurnian (b) .................................................................... 34

Gambar 4.2 Grafik Penentuan pH optimum (atas) dan


grafik penentuan suhu optimum (bawah) ......................... 35

Gambar 4.3 Pembentukan Kuinonimina ............................................... 36

Gambar 4.4 Uji aktivitas enzim (a) kadar protein (b) .......................... 38

Gambar 4.5 Kurva Larutan Standar BSA ............................................. 38

Gambar 4.6 Senyawa katekin (kiri (a)) hasil reaksi antara katekin
dengan enzim peroksidase (kanan (a)), Ekstrasi hasil
reaksi (b)............................................................................ 39

Gambar 4.7 KLT senyawa katekin (a) dan KLT senyawa hasil
reaksi (b)............................................................................ 40

Gambar 4.8 Instrumen GCMS Mabes Polri .......................................... 41

Gambar 4.9 Kromatogram GC senyawa katekin .................................. 42

Gambar 4.10 Spektrum massa senyawa dimer dari katekin ................... 43

Gambar 4.11 Pola Fragmentasi Senyawa Hasil Reaksi .......................... 43

Gambar 4.12 Kromatogram GC senyawa hasil reaksi ............................ 44

xi

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


Gambar 4.13 Spektrum Massa hasil reaksi ............................................. 45

Gambar 4.14 Struktur 4-8 Dikatekin ................................................... 46

Gambar 4.15 Pola Fragmentasi senyawa hasil reaksi. ............................ 47

Gambar 4.16 Pembentukan Radikal Katekin .......................................... 48

Gambar 4.17 Struktur dimer katekin ...................................................... 48

Gambar 4.18 Reaksi antioksidan dengan DPPH..................................... 49

Gambar 4.19 Hasil uji aktivitas antioksidan (a) dan (c) kontrol,
(b) senyawa katekin, (d) senyawa hasil reaksi .................. 50

Gambar 4.20 Perubahan warna larutan pada reaksi radikal


DPPH dengan antioksidan ................................................ 50

Gambar 4.21 Grafik Aktivitas Antioksidan Katekin .............................. 51

Gambar 4.22 Grafik Aktivitas Antioksidan Dimer Katekin .................. 51

Gambar 4.23 Grafik % inhibisi Katekin ................................................. 52

Gambar 4.24 % inhibisi Dimer Katekin ................................................. 52

Gambar 4.25 Nilai IC50 antara monomer dimer katekin (1) dan
katekin (2) ......................................................................... 52

Gambar 4.25 Orientasi besarnya reduksi DPPH oleh gugus


hidroksil............................................................................. 53

xii

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Struktur Komponen Penyusun Teh ........................................ 9

Tabel 2.2 Komposisi Bermaca-Macam Katekin Pada Teh Hijau ......... 11

Tabel 2.3 Sifat Fisika dan Sifat Kimia Senyawa Katekin ..................... 12

Tabel 2.4 Kandungan Nutrisi Bawang Bombay .................................... 14

Tabel 2.5 Klasifikasi Enzim ................................................................... 16

Tabel 2.6 Rangkuman Kelompok dan Sub Kelompok Utama


Enzim ..................................................................................... 17

Table 4.1 Aktivitas enzim peroksidase fraksi III ................................... 39

Tabel 4.2 Hasil Analisis GC-MS Katekin.............................................. 42

Tabel 4.3 Penbandingan antara spektrum massa hasil sintesis


senyawa dimer katekin dengan hasil penelitian Angelyne
Benavides dan Paolo Montoro ............................................... 45

xiii

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Satu dari sekian banyak hasil riset kesehatan yang paling menarik
sekarang ini adalah bidang nutrien antioksidan. Berbagai perbincangan mengenai
antioksidan, mau tidak mau harus menyertakan penjelasan mengenai oksidan
termasuk didalamnya adalah radikal bebas. Radikal bebas acapkali dijumpai
dalam bentuk oksigen yang reaktif. Molekul yang sangat reaktif ini, jika tidak
dikendalikan dapat merusak tubuh dan berperan terhadap timbulnya berbagai
penyakit.
Secara sederhana antioksidan dinyatakan sebagai senyawa yang mampu
menghambat atau mencegah terjadinya oksidasi. Antioksidan memiliki
kemampuan dalam memberikan elektron, mengikat dan mengakhiri reaksi
berantai radikal bebas yang mematikan. Antioksidan yang dipakai kemudian
didaur ulang oleh antioksidan lain untuk mencegahnya menjadi radikal bebas
(bagi dirinya sendiri) atau tetap dalam bentuk tersebut tetapi dengan struktur yang
tidak dapat merusak molekul lainnya. Salah satu antioksidan yang kini tengah
mendapat perhatian yang sangat luas dalam berbagai penelitian adalah senyawa
katekin dalam teh hijau.
Berbagai penelitian memberikan buktibukti bahwa senyawa katekin yang
banyak terdapat pada teh hijau bermanfaat dalam meningkatkan sistem imun. Teh
hijau yang diminum secara teratur dalam kurun waktu tertentu dapat
meningkatkan sistem imun tubuh dengan meningkatkan ketahanan limfosit dan
respon proliferasi limfosit, daya fagositosis, dan sekresi IL-12 makrofag yang
kemudian menyebabkan meningkatnya sekresi interferon- yang akan
mengaktifkan makrofag sehingga makrofag dapat membunuh kuman penyebab
penyakit.
Hasil ini bisa dilihat dari banyaknya gugus hidroksi (OH) yang dimiliki
senyawa katekin. Gugus hidroksi ini dapat berfungsi sebagai antiradikal bebas

1 Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


2

atau antioksidan. Semakin banyak gugus hidroksi suatu senyawa, maka


kemampuannya sebagai senyawa antioksidan semakin baik.
Efektivitas senyawa katekin sebagai antioksidan dapat ditingkatkan
melalui proses dimerisasi oksidatif. Dimerisasi oksidatif dari beberapa senyawa
fenolik banyak terjadi di alam dan mengarah pada pembentukan produk dimer,
dimana proses biotransformasinya sendiri dikatalisis oleh enzim, yaitu enzim
peroksidase. Enzim peroksidase dapat membentuk pertahanan terhadap oksidan
atau radikal bebas di dalam tubuh dan mencegah kerusakan sel dengan cara
mengkatalisa peroksida menjadi air dan oksigen. Karena kemampuannya inilah
maka enzim ini disebut sebagai antioksidan.
Pemanfaatan sampah dari tanaman seperti lobak, sawi, kentang dan
bawang bombay ternyata dapat digunakan sebagai sumber enzim peroksidase
yang dapat berkontribusi tidak hanya mengurangi limbah industri makanan tetapi
juga dapat meningkatkan jumlah produk bernilai tinggi. Oleh karena itu, dalam
penelitian ini digunakan bagian dari kulit bawang bombay yang dianggap sampah
sebagai sumber dari enzim peroksidase untuk mengkatalisis reaksi dimerisasi
senyawa katekin dari ekstrak teh hijau.

1.2 Perumusan Masalah


Penggunaan senyawa fenolik saat ini yang cukup besar dalam bidang
industri membuat banyak penelitian yang ditujukan untuk mensintesis senyawa
fenolik. Proses sintesis senyawa fenolik ini dilakukan dengan menggunakan reaksi
kopling oksidatif dengan bantuan enzim peroksidase yang berasal dari ekstrak
bawang bombay. Pada penelitian perumusan masalah yang dapat diambil dalam
penelitian ini adalah sintesis senyawa dimer katekin dengan menggunakan katalis
enzim peroksidase yang berasal dari kulit bawang bombay dan meneliti aktivitas
antioksidannya dari senyawa dimer katekin yang dihasilkan.

1.3 Tujuan Penelitian


Tujuan penelitian ini adalah:
1. Mengisolasi enzim peroksidase dari bawang bombay yang akan digunakan
sebagai katalis dalam reaksi dimerisasi senyawa katekin dari ekstrak teh hijau.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


3

2. Mengkarakterisasi enzim peroksidase yang diisolasi dari kulit bawang bombay


3. Mensintesis senyawa dimer katekin dari ekstrak teh hijau dengan
menggunakan enzim peroksidase dari bawang bombay.
4. Mengetahui aktivitas antioksidan dari senyawa dimer katekin.

1.4 Hipotesis
Hipotesis dari penelitian ini adalah dapat dibuat senyawa dimer katekin
dari ekstrak teh hijau dengan bantuan enzim peroksidase yang berasal dari kulit
bawang bombay dan terdapat aktivitas antioksidan dari senyawa dimer yang
dihasilkan tersebut.

1.5 Ruang Lingkup Penelitian


Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan senyawa dimer katekin dari
ekstrak teh hijau dengan menggunakan bantuan enzim peroksidase yang berasal
dari kulit bawang bombay. Dan setelah senyawa dimer katekin terbentuk,
senyawa dimer tersebut akan diteliti aktivitas antioksidannya dengan
menggunakan metode radical scavenger DPPH. Dimerisasi dari senyawa katekin
dengan bantuan enzim peroksidase ini dilakukan melalui reaksi kopling oksidatif.
Pada reaksi kopling oksidatif, enzim peroksidase akan mengoksidasi senyawa
katekin yang menyebabkan terbentuknya senyawa radikal katekin. Senyawa
radikal ini dapat beresonansi dengan posisi orto atau para pada cincin aromatiknya
dan selanjutnya akan bergabung dengan radikal yang lain membentuk senyawa
dimer baru.

1.6 Manfaat Penelitian


Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi dunia ilmu
pengetahuan, khususnya mengenai reaksi dimerisasi senyawa katekin dari ekstrak
daun teh hijau dengan menggunakan katalis enzim peroksidase dari kulit bawang
bombay dan senyawa ini memiliki aktivitas antioksidan yang dapat bermanfaat
bagi kepentingan manusia.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


4

1.7 Batasan Penelitian


Penelitian ini terbatas pada studi pengaruh kondisi reaksi (temperatur dan
pH) terhadap mekanisme pembentukan dimer katekin dan menyimpulkan
mekanisme reaksinya dan juga efek antioksidannya.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teh
Di zaman dahulu, genus Camellia dibedakan menjadi beberapa spesies teh
yaitu sinensis, assamica, irrawadiensiesis. Menurut Graham HN (1984); Van
Steenis CGGJ (1987) dan Tjitrosoepomo (1989), tanaman teh Camellia sinensis
diklasifikasikan sebagai berikut (Tuminah, 2004).

Divisi : Spermatophyte (tumbuhan biji)


Sub divisi : Angiospermae (tumbuhan biji terbuka)
Kelas : Dicotylydoneae (tumbuhan biji belah)
Sub Kelas : Dialypetalae
Ordo (bangsa) : Guttiferales (Clusiales)
Famili (suku) : Camelliaceae (Tehaceae)
Genus (marga) : Camellia
Spesies (Jenis) : Camellia sinensis

2.2 Macam-Macam Teh


Teh dikelompokan berdasarkan cara pengolahan. Daun teh Camellia
sinensis segera layu dan mengalami oksidasi kalau tidak segera dikeringkan
setelah dipetik. Proses pengeringan membuat daun menjadi berwarna gelap,

5 Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


6

karena terjadi pemecahan klorofil dan terlepasnya unsur tanin. Proses selanjutnya
berupa pemanasan basah dengan uap panas agar kandungan air pada daun
menguap dan proses oksidasi bisa dihentikan pada tahap yang sudah ditentukan.
Pengolahan daun teh sering disebut sebagai "fermentasi" walaupun
sebenarnya penggunaan istilah ini tidak tepat. Pemrosesan teh tidak menggunakan
ragi dan tidak ada etanol yang dihasilkan seperti layaknya proses fermentasi yang
sebenarnya. Pengolahan teh yang tidak benar memang bisa menyebabkan teh
ditumbuhi jamur yang mengakibatkan terjadinya proses fermentasi. Teh yang
sudah mengalami fermentasi dengan jamur harus dibuang, karena mengandung
unsur racun dan unsur bersifat karsinogenik.
Pengelompokan teh berdasarkan tingkat oksidasi:
Teh putih
Teh yang dibuat dari pucuk daun yang tidak mengalami proses oksidasi dan
sewaktu belum dipetik dilindungi dari sinar matahari untuk menghalangi
pembentukan klorofil. Teh putih diproduksi dalam jumlah lebih sedikit
dibandingkan teh jenis lain sehingga harga menjadi lebih mahal. Teh putih
kurang terkenal di luar Tiongkok, walaupun secara perlahan-lahan teh putih
dalam kemasan teh celup juga mulai populer.
Teh hijau
Daun teh yang dijadikan teh hijau biasanya langsung diproses setelah dipetik.
Setelah daun mengalami oksidasi dalam jumlah minimal, proses oksidasi
dihentikan dengan pemanasan (cara tradisional Jepang dengan menggunakan
uap atau cara tradisional Tiongkok dengan menggongseng di atas wajan
panas). Teh yang sudah dikeringkan bisa dijual dalam bentuk lembaran daun
teh atau digulung rapat berbentuk seperti bola-bola kecil (teh yang disebut
gun powder).
Oolong
Proses oksidasi dihentikan di tengah-tengah antara teh hijau dan teh hitam
yang biasanya memakan waktu 2-3 hari.
Teh hitam atau teh merah
Daun teh dibiarkan teroksidasi secara penuh sekitar 2 minggu hingga 1 bulan.
Teh hitam merupakan jenis teh yang paling umum di Asia Selatan (India, Sri

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


7

Langka, Bangladesh) dan sebagian besar negara-negara di Afrika seperti:


Kenya, Burundi, Rwanda, Malawi dan Zimbabwe. Terjemahan harafiah dari

aksara hanzi untuk teh bahasa Tionghoa () atau () dalam bahasa

Jepang adalah "teh merah" karena air teh sebenarnya berwarna merah. Orang
Barat menyebutnya sebagai "teh hitam" karena daun teh berwarna hitam. Di
Afrika Selatan, "teh merah" adalah sebutan untuk teh rooibos yang termasuk
golongan teh herbal. Teh hitam masih dibagi menjadi 2 jenis: Ortodoks (teh
diolah dengan metode pengolahan tradisional) atau CTC (metode produksi
teh Crush, Tear, Curl yang berkembang sejak tahun 1932). Teh hitam yang
belum diramu (unblended) dikelompokkan berdasarkan asal perkebunan,
tahun produksi, dan periode pemetikan (awal musim semi, pemetikan kedua,
atau musim gugur). Teh jenis Ortodoks dan CTS masih dibagi-bagi lagi
menurut kualitas daun pasca produksi sesuai standar Orange Pekoe.
Pu-erh (Pu li dalam bahasa Kantonis)
Teh pu-erh terdiri dari dua jenis: "mentah" dan "matang." Teh pu-erh yang
masih "mentah" bisa langsung digunakan untuk dibuat teh atau disimpan
beberapa waktu hingga "matang". Selama penyimpanan, teh pu-erh
mengalami oksidasi mikrobiologi tahap kedua. Teh pu-erh "matang" dibuat
dari daun teh yang mengalami oksidasi secara artifisial supaya menyerupai
rasa teh pu-erh "mentah" yang telah lama disimpan dan mengalami proses
penuaan alami. Teh pu-erh "matang" dibuat dengan mengontrol kelembaban
dan temperatur daun teh mirip dengan proses pengomposan. Teh pu-erh
biasanya dijual dalam bentuk padat setelah dipres menjadi seperti batu bata,
piring kecil atau mangkuk. Teh pu-erh dipres agar proses oksidasi tahap
kedua bisa berjalan, karena teh pu-erh yang tidak dipres tidak akan
mengalami proses pematangan. Semakin lama disimpan, aroma teh pu-erh
menjadi semakin enak. Teh pu-erh yang masih "mentah" kadang-kadang
disimpan sampai 30 tahun bahkan 50 tahun supaya matang. Pakar bidang teh
dan penggemar teh belum menemui kesepakatan soal lama penyimpanan
yang dianggap optimal. Penyimpanan selama 10 hingga 15 tahun sering
dianggap cukup, walaupun teh pu-erh bisa saja diminum setelah disimpan
kurang dari setahun. Minuman teh pu-erh dibuat dengan merebus daun teh

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


8

pu-erh di dalam air mendidih seringkali hingga lima menit. Orang Tibet
mempunyai kebiasaan minum teh pu-erh yang dicampur dengan mentega dari
lemak yak, gula dan garam.

2.3 Komponen Teh


Teh mengandung komponen volatile sebanyak 404 macam dalam teh
hitam dan sekitar 230 macam dalam teh hijau. Komponen volatile tersebut
berperan dalam memberikan cita rasa yang khas pada teh. Komponen aktif yang
terkandung dalam teh, baik yang volatile maupun yang nonvolatile. Seperti yang
terlihat pada gambar diata ini, komponen teh terdiri dari polifenol (termasuk
katekin), kafein, asam amino, vitamin, flavonoid, polisakarida dan florin.
Polifenol dan kafein merupakan komponen yang paling penting dari teh.

Gambar 2.1. Komponen teh

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


9

Tabel 2.1. Beberapa Struktur Komponen Teh


Komponen
Rumus Struktur Komponen Teh
Penyusun Teh
1. Katekin

2. Kafein

3. Theanine

4. Saponin

2.4 Antioksidan Pada Teh Hijau


Salah satu zat antioksidan non nutrien yang terkandung dalam teh, yaitu
katekin dapat menyimpan atau meningkatkan asam askorbat pada beberapa proses
metabolisme. Studi epidemiologi menunjukkan bahwa konsumsi teh hijau

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


10

berbanding terbalik dengan kadar serum kolesterol total (TC) dan low density
lipoprotein (LDL-C), tetapi tidak terhadap trigliserida (TG) dan high density
lipoprotein (HDL-C).
Antioksidan digunakan untuk mencegah kerusakan tingkat seluler yang
akan mengakibatkan penyakit tertentu, khususnya kanker. Antioksidan dalam
makanan juga digunakan untuk mencegah terjadinya proses oksidasi, seperti pada
lemak.
Potensi antioksidan dari polifenol teh hijau khususnya senyawa katekin
secara langsung berhubungan dengan kombinasi cincin aromatis dan kelompok
hidroksil yang membangun struktur katekin dan sebagai hasilnya adalah mengikat
dan menetralkan radikal bebas oleh grup hidroksil. Sebagai tambahan, polifenol
teh hijau mendorong aktivitas detoksifikasi komponen xenobiotika, dan juga dapat
mengikat (kelator) ion logam seperti besi yang mana dapat mengakibatkan radikal
bebas oksigen (Anonymous, 2000 dalam skripsi Imannulkhan, 2006).
Menurut Ong dan Pocker (1992) dalam skripsi Imanulkhan (2006)
menyatakan bahwa cara kerja flavonoid sebagai antioksidan sebagai berikut:
1. Sebagai Scavenger radikal bebas yang terbentuk baik selama
persiapan bahan pangan atau radikal bebas yang dihasilkan proses
metabolik tertentu di dalam substrat.
2. Sebagai kelator, flavonoid dapat membentuk kompleks dengan logam
transisi seperti tembaga, dan mencegah kerusakan asam askorbat
dengan besi sehingga dapat mencegah reaksi inisiasi radikal bebas.
3. Mencegah peroksida lemak melalui cara mengkombinasikan sifat
kelator dan sifat antioksidan flavonol. Quercetin ditemukan efektif
mengahambat ion besi.

2.5 Katekin
Kunci utama dari khasiat teh pada komponen bioaktifnya, yaitu polifenol
yang secara optimal terkandung dalam daun teh yang masih muda dan utuh.
Katekin merupakan senyawa polifenol utama pada teh sebesar 90% dari total
kandungan polifenol (Anonymous, 2007).

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


11

Katekin adalah senyawa dominan dari polifenol teh hijau yang merupakan
senyawa larut dalam air, tidak berwarna dan memberikan rasa pahit (Alamsyah,
2006). Katekin merupakan kerabat tanin terkondensasi yang juga sering disebut
polifenol karena banyaknya gugus fungsi hidroksil yang dimilikinya. Katekin teh
hijau tersusun sebagian besar atas senyawa-senyawa katekin (C), epikatekin (EC),
galokatekin (GC), epigalokatekin (EGC), epikatekin galat (ECG), dan
epigalokatekin galat (EGCG). Perbedaan dari beberapa jenis katekin dilihat dari
jumlah gugus hidroksilnya (Robinson, 1995).

Tabel 2.2. Komposisi Bermacam-Macam Katekin Pada Daun Teh Hijau


No Komponen Kadar (%)
1 Katekin 1-2
2 Epikatekin 1-3
3 Epikatekin galat 3-6
4 Gallokatekin 1-3
5 Epigallokatekin 3-6
6 Epigallokatekin galat 7-13

Konsentrasi katekin sangat tergantung pada umur daun. Pucuk dan daun
pertama paling kaya katekin galat. Kadar katekin bervariasi tergantung pada
varietas tanaman tehnya. Sifat-sifat kimia dan fisik pucuk daun teh akan
mempengaruhi perubahan katekin dalam pucuk daun tehnya.

Gambar 2.2. Struktur Katekin

Katekin bersifat asam lemah (pKa1=7,72 dan pKa2=10,22). Sukar larut


dalam air dan sangat tidak stabil diudara terbuka. Bersifat mudah teroksidasi pada
pH mendekati netral (pH 6,9). Katekin juga mudah terurai oleh cahaya dengan
laju reaksi lebih besar pada pH rendah (3,45) dibanding pH 4,9 (Lucida, 2006).

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


12

Sifat fisikokimianya menjadi tantangan tersendiri dalam formulasi katekin sebagai


bahan alam.
Katekin biasanya disebut juga asam catechoat dengan rumus kimia
C15H14O6, tidak berwarna, dan dalam keadaan murni sedikit tidak larut dalam air
dingin tetapi sangat larut dalam air panas, larut dalam alkohol dan etil asetat,
hampir tidak larut dalam kloroform, benzen dan eter. Selain itu, Katekin
berbentuk kristal halus menyerupai jarum, larut dalam air mendidih dan alkohol
dingin. Katekin dalam larutan asam asetat akan membentuk larutan yang bening,
tetapi jika direaksikan dengan besi klorida (FeCl 3) akan membentuk cairan
berwarna hijau. Katekin merupakan senyawa fenolik yang komplek (polifenol).
Katekin memiliki dua atom karbon yang simetris yang membuatnya
memiliki 4 isomer, yaitu (+) katekin, (-) katekin, (+) epikatekin dan (-) epikatekin.
(+) katekin dan (-) epikatekin paling banyak terdapat di alam. Katekin dan
epikatekin memiliki tiga jenis turunannya, yaitu katekin galat, galokatekin,
galokatekin galat, epikatekin galat dan epigalokatekin galat.

Tabel 2.3. Sifat Fisika dan Sifat Kimia Senyawa Katekin


Sifat Fisika Sifat Kimia
Warna: putih Sensitif terhadap oksigen
Melting point: 104-106 C Sensitif terhadap cahaya (dapat
Boiling point: 254 C mengalami perubahan warna
Tekanan uap: 1 mm Hg pada 75 C apabila mengalami kontak
Densitas uap:3,8 g/m3 langsung dengan udara terbuka)
Flash point: 137 C Substansi yang dihindari: unsur
Eksplosion limit:1,79 % oksidasi, asam klorida, asam
anhidrida, basa, dan asam nitrit.
Larut dalam air hangat
Stabil dalam kondisi agak asam
atau netral ( pH optimum 4-8)
Sumber: Anonim, 2001, Micheal dan Irene, 1997 dan Alamsyah, 2006.

2.6 Bawang Bombay


Istilah bawang bombay berasal ketika komoditas ini pertama kali dibawa
oleh pedagang-pedagang dari kota Bombay (sekarang disebut Mumbay), India, ke
Indonesia. Bawang bombay (Allium cepa L.) termasuk herba biennial yang

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


13

dibudidayakan sebagai tanaman annual (semusim), kecuali untuk produksi benih.


Bawang bombay adalah sejenis bawang yang biasa digunakan dalam memasak
makanan di Indonesia, tidak hanya digunakan sebagai hiasan tapi juga bagian dari
masakan karena bentuknya yang besar dan tebal dagingnya. Klasifikasi bawang
bombay adalah sebagai berikut:

Kingdom : Plantae (Tumbuhan)


Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)
Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji)
Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)
Kelas : Liliopsida (berkeping satu / monokotil)
Sub Kelas : Liliidae
Ordo : Liliales
Famili : Liliaceae (suku bawang-bawangan)
Genus : Allium
Spesies : Allium cepa L.
Bawang bombay atau bawang timur berada dalam satu garis keturunan
dengan bawang merah (Allium cepa L). Perbedaannya tidak terlalu menyolok,
kecuali bentuk dan bau atau aromanya. Ia memiliki umbi yang berlapis, yang
terbentuk dari pangkal daun / lapisan-lapisan yang membesar dan bersatu dan
selanjutnya membentuk batang yang berubah bentuk dan fungsi, membesar, dan
menjadi umbi berlapis. Tanamannya sendiri memiliki akar serabut dengan daun
berbentuk silinder berrongga.

2.7 Kandungan Nutrisi Bawang Bombay


Di dalam bawang bombay terdapat kandungan allicin, asam amino,
kalsium, mangan, sodium, sulfur, vitamin C, vitamin E, minyak asiri, quercitin,

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


14

dan curcumin Berdasarkan penelitian, bahan-bahan yang dikandung oleh bawang


bombay memiliki manfaat untuk menekan kadar kolesterol dalam darah,
meningkatkan jumlah HDL (kolesterol baik) hingga 30%, memperbaiki
penyempitan pembuluh darah dan hipertensi, meredakan pilek, meredakan sakit
perut, menurunkan kadar gula dalam darah, mencegah kanker, mencegah
pemecahan insulin di hati, merangsang produksi insulin oleh pankreas, dan
menekan serangan osteoporosis.
Zat utama dalam bawang Bombai, alicin, memberikan manfaat untuk
menstabilkan tekanan darah, mengontrol gula darah, sebagai anti kolesterol dan
anti peradangan. Yang dimaksud peradangan ini adalah suatu reaksi dari tubuh
yang berlebihan karena rangsangan dari luar. Berikut ini disajikan tabel
kandungan nutrisi dari bawang bombay.

Tabel 2.4. Kandungan Nutrisi Bawang Bombay (dalam 100 g bawang bombay)

Komponen Gizi Jumlah Komponen Gizi Jumlah


Air 89,11 g Tembaga 0,039 mg
Energi 40 kcal Mangan 1,129 mg
Protein 1,1 g Fluor 1,1 mg
Lemak 0,10 g Selenium 0,15 g
Abu 0,35 g Vitamin C 7,4 mg
Karbohidrat 7,34 g Vitamin B1 0,046 mg
Serat 1,7 mg Vitamin B2 0,116 mg
Gula Total 4,24 g Vitamin B3 0,123 mg
Kalsium 23 mg Vitamin B5 0,126 mg
Zat Besi 0,21 mg Vitamin B6 0,120 mg
Magnesium 10 mg Folat 19 mg
Fosfor 29 mg Choline 6,1 mg
Kalium 146 mg Vitamin E 0,02 mg
Natrium 4 mg Vitamin K 0,4 mg
Seng 0,17 mg
Sumber: Direktorat Gizi Departemen Kesehatan RI (1992)

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


15

Pemanfaatan sampah dari tanaman seperti lobak, sawi, kentang dan


bawang bombay ternyata dapat digunakan sebagai sumber enzim peroksidase
yang dapat berkontribusi tidak hanya mengurangi limbah industri makanan tetapi
juga dapat meningkatkan jumlah produk bernilai tinggi. Oleh karena itu, dalam
penelitian ini digunakan bagian dari kulit bawang bombay yang dianggap sampah
sebagai sumber dari enzim peroksidase.

2.8 Peroksidase
Enzim atau biokatalisator adalah katalisator organik yang dihasilkan oleh
sel.Enzim sangat penting dalam kehidupan, karena semua reaksi metabolisme
dikatalis oleh enzim. Jika tidak ada enzim, atau aktivitas enzim terganggu maka
reaksi metabolisme sel akan terhambat hingga pertumbuhan sel juga terganggu.
Reaksi-reaksi enzimatik dibutuhkan agar bakteri dapat memperoleh
makanan/ nutrient dalam keadaan terlarut yang dapat diserap ke dalam sel,
memperoleh energi Kimia yang digunakan untuk biosintesis, perkembangbiakan,
pergerakan, dan lain-lain.Enzim bekerja dengan cara bereaksi dengan molekul
substrat untuk menghasilkan senyawa intermediat melalui suatu reaksi kimia
organik yang membutuhkan energi aktivasi lebih rendah, sehingga percepatan
reaksi kimia terjadi karena reaksi kimia dengan energi aktivasi lebih tinggi
membutuhkan waktu lebih lama.
Meskipun senyawa katalis dapat berubah pada reaksi awal, pada reaksi
akhir molekul katalis akan kembali ke bentuk semula. Sebagian besar enzim
bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu
macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur
kimia tiap enzim yang bersifat tetap.
Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama
adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan
suhu dan pH (tingkat keasaman) optimum yang berbeda-beda karena enzim
adalah protein, yang dapat mengalami perubahan bentuk jika suhu dan keasaman
berubah. Di luar suhu atau pH yang sesuai, enzim tidak dapat bekerja
secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Hal ini akan

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


16

menyebabkan enzim kehilangan fungsinya sama sekali. Kerja enzim juga


dipengaruhi oleh molekul lain. Inhibitor adalah molekul yang menurunkan
aktivitas enzim, sedangkan aktivator adalah yang meningkatkan aktivitas enzim.
Banyak obat dan racun adalah inihibitor enzim.
Penamaan enzim secara trivial, yaitu secara non sistematik misalnya
pepsin, tripsin, katalase tidak menerangkan sifat dan macam reaksi yang terjadi.
Penamaan dan klasifikasi enzim secara sistematik telah ditentukan oleh suatu
badan internasional bernama : Commission on Enzim of the international union of
Biochemistry (CEIUB). Dalam sistim yang baru ini enzim dibagi menjadi sub
bagian. Dalam beberapa hal tertentu, penanaman trivial masih dipakai, yaitu bila
nama sistematiknya terlalu panjang.
Klasifikasi enzim CEIUB meliputi nama golongan, nomor kode dan cara
reaksi yang dikatalisernya dan tiap golongan utama terbagi menjadi kelompok
kelompok enzim berdasarkan gugus substrat yang diserangnya. Sistim CEIUB
atau International Enzym Commision (IEC) adalah sebagai berikut.

Tabel 2.5. Klasifikasi Enzim

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


17

Tabel 2.6. Rangkuman Kelompok dan Sub Kelompok Utama Enzim

Peroksidase (EC 1.11.1.7) merupakan salah satu enzim yang tahan panas.
Jenis reaksi yang dikatalis oleh peroksidase melibatkan hidrogen peroksida
sebagai penerima, dan senyawa AH2 sebagai donor atom hidrogen, seperti
ditunjukkan berikut ini:

Pada reaksi ini tidak ada oksigen molekul yang terbentuk. Kerja
peroksidase dalam sayuran berguna untuk pendeteksian keefektifan pemutihan,
sedangkan enzim tersebut dapat juga merusak sayuran sehingga mengakibatkan
bau rasa yang menyimpang. Selain itu juga berguna dalam penentuan glukosa
dalam suatu bahan pangan yang dikombinasikan dengan glukosa peroksidase.
Kerja peroksidase dalam buah yaitu mengakibatkan terjadinya pencoklatan.
Dalam buah terdapat peroksidase, itu sebabnya buah dan sayur yang dikupas atau
dipotong akan berwarna kecoklatan jika didiamkan begitu saja.
Dari hasil penelitian diketahui bahwa peroksidase memiliki peranan dalam
proses lignifikasi, cross linking struktur protein pada dinding sel, katabolisme
auksin, dan pertahanan diri terhadap pathogen.
Peroksidase pada tumbuhan mengandung dua ion kalsium (Ca2+) yang
sangat penting untuk stabilitas struktural dan stabilitas termal dari enzim agar

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


18

sama seperti aktivitas in vitro ketika dianalisis (Manu and Prasada Rao, 2009).
Peroksidase secara luas digunakan pada laboratorium kesehatan dan industri
sebagai aplikasi untuk konservasi lingkungan.
Peroksidase merupakan enzim yang mengandung kofaktor heme pada
sisi aktifnya, yang dapat mengkatalisis reaksi oksidasi dari berbagai senyawa
organik maupun anorganik dengan adanya H2O2 sebagai akseptor elektron.

Gambar 2.3. Siklus Katalitik Enzim Peroksidase yang Mengandung Heme

Siklus katalitik dimulai dari bentuk Fe 3+. Molekul H2O2 berikatan


koordinasi dengan ion Fe3+ dan sudut histidine menjadi perantara transfer proton
sehingga kedua atom H ditempatkan pada atom O. Polarisasi ikatan secara
serempak oleh rantai samping guanidinium menghasilkan pemutusan heterolitik
ikatan O-O. Sebagian membentuk H2O dan sisanya terikat dengan Fe
menghasilkan intermediet dengan bilangan oksidasi tinggi.
Beberapa peroksidase seperti Horse Raddish Peroxidase (HRP)
mengalami keadaan inaktivasi permanen ketika H2O2 hadir secara berlebihan atau
ketika produk akhir polimer berada pada sisi aktifnya yang menyebabkan

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


19

inaktivasi permanen yang disebabkan perubahan pada konfigurasi geometrisnya


(Villalobos and Buchanan, 2002).

2.3 Reaksi Kopling Oksidatif


Reaksi kopling oksidatif adalah suatu reaksi penggabungan antara dua
molekul fenol atau lebih melalui proses reaksi oksidasi. Penggabungan dari dua
residu fenolat, dapat terjadi secara inetr dan intra molekuler dari dua radikal yang
dibentuk melalui oksidasi elektron tunggal pada masing-masing senyawa fenol.
Reaksi yang dikatalisis oleh peroksidase dengan adanya H2O2,
menghasilkan produk radikal, dimana radikal tersebut akan mengalami
penggabungan dengan senyawa lain yang memiliki radikal. Oleh karena itu,
enzim peroksidase sering kali digunakan sebagai katalis pada reaksi polimerisasi
dan reaksi kopling pada senyawa fenolik.

OH OH
OH OH
O

OH

Ikatan eter C-C linkage C-C linkage

Gambar 2.4. Reaksi Kopling Oksidatif Fenolik

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


20

Hasil kopling radikal fenoksi ini dapat membentuk dimer fenol, baik pada
posisi orto-orto, para-para, maupun orto-para. Selain itu, juga terdapat
kemungkinan penggabungan O-para, O-orto, O-O, dan C-C.
Reaksi yang dikatalis dengan menggunakan peroksidase dengan
menggunakan H2O2 akan menghasilkan produk radikal dimana radikal tersebut
akan mengalami penggabungan dengan senyawa lain yang memiliki radikal.
Senyawa katekin dapat mengalami proses kopling oksidatif yang sama dengan
senyawa fenolik.

Gambar 2.5. Resonansi radikal senyawa katekin

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


21

Dari kemungkinan resonansi radikal fenoksi katekin tersebut, maka dapat


diduga kemungkinan-kemungkinan kopling oksidatif yang dapat terbentuk antara
sesama radikal fenoksi katekin. Kemungkinan dimer yang terbentuk sebagai
berikut:
OH
OH

OH
OH OH
O
HO O

OH HO OH
OH

5-8 dimer katekin


OH

OH HO
OH
OH
OH
HO O
OH
HO O O

OH
OH OH
OH HO OH

Katekin 2-8 dimer katekin


OH
OH

HO O

OH
OH
HO
OH

O OH

HO OH

4-8 dimer katekin


OH
OH

HO O

OH
OH

HO OH

O
OH

HO
OH

4-6 katekin dimer


Gambar 2.6. Kemungkinan dimer katekin yang terbentuk

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


22

2.4 Antioksidan
Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau mencegah
proses oksidasi. Zat ini secara nyata mampu memperlambat atau menghambat
oksidasi zat yang mudah teroksidasi meskipun dalam konsentrasi rendah.
Antioksidan juga sesuai didefinisikan sebagai senyawa-senyawa yang melindungi
sel dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika berkaitan dengan
penyakit, radikal bebas ini dapat berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor
eksternal lainnya. Radikal bebas adalah spesies yang tidak stabil karena memiliki
elektron yang tidak berpasangan dan mencari pasangan elektron dalam
makromolekul biologi. Protein lipida dan DNA dari sel manusia yang sehat
merupakan sumber pasangan elektron yang baik. Kondisi oksidasi dapat
menyebabkan kerusakan protein dan DNA, kanker, penuaan, dan penyakit
lainnya. Komponen kimia yang berperan sebagai antioksidan adalah senyawa
golongan fenolik dan polifenolik. Senyawa-senyawa golongan tersebut banyak
terdapat dialam, terutama pada tumbuh-tumbuhan, dan memiliki kemampuan
untuk menangkap radikal bebas.
Tipe radikal bebas turunan oksigen reaktif sangat signifikan dalam tubuh.
Oksigen reaktif ini mencakup superoksida (O2-), hidroksil (OH), peroksil
(ROO), hidrogen peroksida (H2O2), oksigen singlet (1O2), oksida nitrit (NO),
peroksinitril (ONOO) dan asam hipoklorit (HOCl).
Sumber radikal bebas, bisa berupa sumber endogen maupun eksogen.
Sumber endogenous berasal dari hasil metabolism tubuh. Hal ini berlangsung
secara normal, dan tubuh memiliki enzim antioksidan alami yang dapat
menangkalnya. Sedangkan sumber radikal bebas eksogen berasal dari luar system
tubuh, diantaranya sinar UV dan zat kimia polutan.
Keberadaan radikal bebas yang membahayakan ini dapat ditangkal oleh
antioksidan. Antioksidan terbagi menjadi antioksidan enzim, vitamin, dan
senyawa-senyawa fenolik. Antioksidan vitamin lebih popular sebagai antioksidan
dibandingkan enzim. Antioksidan vitamin mencakup alfa tokoferol (vitamin E),
beta karoten dan asam askorbat (vitamin C). Sedangkan senyawa fenolik
merupakan antioksidan yang banyak terdapat pada teh, buah-buahan dan sayuran.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


23

Aktivitas antioksidan fenolik tergantung pada struktur molekunya terutama gugus


OH pada cincin aromatiknya.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


BAB III
METODE PENELITIAN

Penelitian ini terbagi menjadi empat tahap utama, yaitu isolasi enzim
peroksidase dari kulit bawang bombay, karakterisasi enzim peroksidase, sintesis
senyawa dimer katekin dengan menggunakan katalis enzim peroksidase dari kulit
bawang bombay yang telah diisolasi dan uji aktivitas antioksidan dari senyawa
dimer yang terbentuk.

3.1 Alat dan bahan


3.1.1 Alat yang digunakan
Alat-alat gelas laboratorium, icebath & magnetic stirrer, sentrifuge, pH
universal, kertas saring, KLT, spektrofotometer, vortex, dan GC-MS.

3.1.2 Bahan yang digunakan


Ekstrak teh hijau sebagai sumber senyawa katekin, kulit bawang bombay
sebagai sumber enzim peroksidase, (NH4)2SO4 padat, metanol, H2O2 30%, air
bidestilasi, 4-aminoantipyrine, katekin, Na2CO3, NaOH, CuSO4.5H2O, K-Na
tartarat, glisin, HCl, NaH2PO4, Na2HPO4, CMC, asam sitrat, sodium nitrat,
pereaksi follin ciocalteau, bovin serum albumin (BSA), etil asetat, Na2SO4
anhidrat, HCl, FeCl3.6H2O, MgSO4, kertas kromatografi lapis tipis.

3.2 Metode Kerja


3.2.1 Preparasi Larutan
a. Pembuatan Larutan Buffer HCl pH 2
Larutan Stok A: 0,1 M larutan glisin (7,507 g glisin dilarutkan dalam 1 L
aquades)
Larutan Stok B: 0,1 M larutan HCl
Untuk membuat larutan buffer HCl pH 2 maka campurkan 50,7 mL larutan
stok A dengan 49,3 mL larutan stok B.

24 Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


25

b. Pembuatan Larutan Buffer Sitrat pH 3, 4, dan 5


Larutan Stok A: 0.1 M larutan asam sitrat (21.01 gram asam sitrat dilarutkan
dalam 1 L aquades)
Larutan Stok B: 0.1 M larutan sodium sitrat atau natrium sitrat (29.41 gram
natrium sitrat atau C6H5O7Na3.2H2O dilarutkan dalam 1 L aquades)
Untuk membuat larutan buffer sitrat pH 3 maka campurkan 46,3 mL larutan
stok A dengan 3,5 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan
aquades hingga 100 mL
Untuk membuat larutan buffer sitrat pH 4 maka campurkan 33 mL larutan
stok A dengan 17 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan
aquades hingga 100 mL
Untuk membuat larutan buffer sitrat pH 5 maka campurkan 20,5 mL larutan
stok A dengan 29,5 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan
aquades hingga 100 mL

c. Pembuatan Larutan Buffer Fosfat pH 6, 7, dan 8


Larutan Stok A: 0,2 M larutan monobasic sodium phosphate atau NaH2PO4
(2,78 gram NaH2PO4 dilarutkan dalam 100 mL aquades).
Larutan Stok B: 0,1 M larutan dibasic sodium phosphate atau Na2HPO4
(5,365 gram Na2HPO4. 7H2O atau 7,17 gram Na2HPO4. 12H2O dilarutkan
dalam 100 mL aquades).
Untuk membuat larutan buffer fosfat pH 6 maka campurkan 87,7 mL larutan
stok A dengan 12,3 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan
aquades hingga 200 mL.
Untuk membuat larutan buffer fosfat pH 7 maka campurkan 39 mL larutan
stok A dengan 61 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan
aquades hingga 200 mL.
Untuk membuat larutan buffer fosfat pH 8 maka campurkan 5,3 mL larutan
stok A dengan 94,7 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan
aquades hingga 200 mL.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


26

d. Pembuatan Larutan H2O2 mM Dalam Buffer Fosfat pH 7


Sebanyak 1 mL H2O2 30% dilarutkan dengan air bidestilasi hingga volumenya
100 mL. Sebanyak 1 mL larutan ini dilarutkan dalam buffer fosfat 0,2 M pH 7
hingga volumenya mencapai 50 mL.

e. Pembuatan Larutan 4-aminoantipirin 2,5 mM Dalam Fenol 0,17 M


Melarutkan 810 mg fenol ke dalam 40 mL air bidestilasi. Ke dalam larutan
tersebut ditambahkan sebanyak 25 mg 4-aminoantipirin dan dilarutkan dengan air
bidestilasi hingga volumenya 50 mL.

f. Pembuatan Reagen Lowry


Lowry A: 2 g Na2CO3 dalam 100 mL NaOH 0,1 N
Lowry B: 0,25 g CuSO4.5.H2O 50 mL larutan K-Na tartrat 1%
Lowry C: Campuran 50 mL larutan A dan 1 mL larutan B
Lowry D: pereaksi follin ciocalteu 1 N

g. Pembuatan Standar Bouvine Serum Albumin


Larutan standar BSA (0,0625; 0,1250; 0,2500; 0,5000; 0,7500; 1,000 mg/mL),
0,2 g bouvine serum albumin dilarutkan dala aquades hingga 100 mL, dari larutan
ini kemudian diencerkan untuk membuat larutan konsentrasi diatas.

h. Pembuatan Larutan DPPH 0,1 mM


Sebanyak 10 g DPPH dilarutkan dalam 25 mL aquades sehingga diperoleh
konsentrasi DPPH 1mM. Lalu larutan tersebut diencerkan menjadi 0,4 mM
dengan penambahan aquades.

3.2.2 Isolasi Enzim Peroksidasi dari Kulit Bawang Bombay


Sebanyak 350 g kulit bawang bombay dihancurkan dengan blender
menggunakan larutan buffer fosfat pH 7 dalam keadaan dingin (0-50C).
Homogentat kemudian disaring dengan kain katun, filtrat yang diperoleh
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3400 rpm selama 6 menit untuk

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


27

memisahkan molekul enzim ekstrak kasar dari debris (serpihan sel). Supernatan
yang diperoleh dipisahkan dari endapannya.

3.2.3 Pemurnian Enzim Peroksidase Dengan Ammonium Sulfat


Ekstrak enzim kasar (supernatan) yang diperoleh dimurnikan dengan
penambahan garam (NH4)2SO4 dengan tingkat kejenuhan berturut-turut 0-30%,
30-50%, dan 50-70% (b/v).
Ammonium sulfat yang ditambahkan ke dalam larutan dengan tingkat
kejenuhan S1-S2% dihitung dengan menggunakan rumus:

Supernatan dalam beaker glass yang dilengkapi dengan ice salt bath
ditambahkan ammonium sulfat 0-30% sedikit demi sedikit pada suhu 0-50C, lalu
diaduk selama 2 jam. Kemudian larutan dibiarkan mengendap selama 1 malam di
lemari pendingin. Selanjutnya larutan disentrifugasi pada 3400 rpm selama 6
menit pada suhu ruang.
Hal yang sama juga dilakukan untuk penambahan (NH4)2SO4 30-50% dan
50-70%. Pada penambahan garam dengan kejenuhan 50-70% endapan yang
diperoleh melalui sentrifugasi kemudian ditentukan aktivitas enzim dan kadar
proteinnya.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


28

Bagan 3.1. Isolasi dan Pemurnian Enzim Peroksidasi dari Kulit bawang
Bombay
Kulit bawang bombay diblender
dengan larutan buffer fosfat pH 7
disaring

Endapan Filtrat

Sentrifugasi 3400 rpm 6 menit

Endapan Supernatan

+ (NH4)2SO4 0-30%, Sentrifugasi 3400 rpm 6 menit

Endapan Supernatan

+ (NH4)2SO4 30-50%, Sentrifugasi 3400 rpm 6 menit

Endapan Supernatan

+ (NH4)2SO4 50-70%, Sentrifugasi 3400 rpm 6 menit

Endapan Supernatan

3.2.4 Karakterisasi Enzim Peroksidase


3.2.4.1 Penentuan pH optimum
Penentuan pH optimum enzim dilakukan dengan reaksi enzim pada
berbagai pH mulai dari 2-8 (selang 1) dengan substrat CMC dalam buffer
fosfat 0,2 M, diinkubasi pada suhu 390C selama 45 menit.

3.2.4.2 Penentuan Suhu Optimum Enzim


Penentuan suhu optimum enzim dilakukan dengan menguji
aktivitas enzim pada berbagai suhu percobaan mulai dari 10-600C (selang
100C) pada pH optimum selama 45 menit.

3.2.5 Penentuan Aktivitas Peroksidase


Substrat yang digunakan:

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


29

Larutan H2O2 0,0017 M dalam buffer K-fosfat 0,2 M pH 7,0:


Larutan 4-aminoantipyrine 0,0025 M dalam katekin 0,17 M.
Langkah kerja:
1,4 mL larutan 4-aminoantipyrine/katekin dan 1,5 mL H2O2 1,7 mM
dicampur ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 0,1 mL enzim dan
dibiarkan bereaksi selama 1 menit. Reaksi dihentikan setelah 1 menit dengan
memanaskan larutan tersebut ke dalam penangas air mendidih (100 0C) selama 3
menit. Sebagai kontrol digunakan larutan blanko, dimana larutan enzim diganti
dengan aquabides.
Pengukuran aktivitas dilakukan dengan spektrofotometri pada 510 nm
berdasarkan pembentukan produk dari substrat yang teroksidasi. Aktivitas spesifik
enzim dihitung dengan menggunakan persamaan Wortington Manual Enzyme
yang dimodifikasi:

3.2.6 Penentuan Kadar Protein Enzim Dengan Metode Lowry


Pereaksi Lowry:
A. 2 g Na2CO3 dalam 100 mL NaOH 0,1 N
B. 0,25 g CuSO4.5H2O dalam 50 mL K-Na Tartarat 1%
C. Campuran 50 mL larutan A dan 1 mL larutan B
D. Pereaksi follin ciocalteau 1N
Langkah kerja:
Sebanyak 1 mL larutan enzim (protein) dicampurkan dengan 5 mL
pereaksi C, kemudian diaduk hingga merata lalu dibiarkan selama 10 menit.
Selanjutnya ke dalam campuran di atas ditambahkan 0,5 mL pereaksi D, lalu
diaduk kembali hingga merata dan dibiarkan selama 30 menit. Serapannya diukur
pada spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. Sebagai larutan standar
digunakan BSA dengan variasi konsentrasi mulai dari 0,0625 mg/mL hingga 1,00
mg/mL. pada pengukuran blanko, larutan enzim diganti dengan air.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


30

3.2.7 Reaksi Dimerisasi Katekin Menggunakan Enzim Peroksidase


Ke dalam gelas kimk ukuran 100 mL, dimasukkan enzim peroksidase (15
mg dalam 2 mL buffer fosfat 0,2 M pH 5,0) dan 6,7 mmol H2O2 30%, kemudian
ditambahkan 13,4 mmol katekin perlahan-lahan dengan menggunakan pipet tetes
dan sambil dikontrol suhunya (tidak melebihi 37 0C). Reaksi berlangsung melalui
proses pengadukan dengan magnetic stirrer pada suhu ruang, sampai semua
katekin tercampur.
Keberhasilan reaksi diamati secara kualitatif dengan terjadinya perubahan
warna campuran reaksi. Kemudian campuran hasil reaksi diekstraksi dengan
menggunakan pelarut etil asetat. Didapat fasa organik (etil asetat) dan fasa air.
Fasa air dipisahkan, dan sisa air yang masih terdapat pada fasa organik
dihilangkan dengan cara menambahkan Na 2SO4 anhidrat. Ekstrak yang diperoleh
kemudian dipekatkan dengan cara menguapkan pelarutnya. Untuk memeriksa
produk reaksi yang terbentuk, selanjutnya dilakukan pengecekan dengan
Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dimana sebagai pembanding digunakan larutan
katekin dalam metanol. Bila hasil samping (by product) tidak terlalu banyak,
dapat langsung dilakukan rekristalisasi dengan dua pelarut yang berbeda
kepolarannya. Tetapi jika hasil samping cukup banyak, maka perlu dilakukan
pemurnian melalui kromatografi kolom. Selanjutnya kristal murni hasil reaksi,
ditimbang.
Bagan 3.2. Reaksi Dimerisasi Katekin Menggunakan Enzim Peroksidase

Enzim Peroksidase + Buffer Fosfat pH 5 + H2O2 30%

Aduk 60 menit pada


suhu ruang + Katekin

Campuran Hasil Reaksi


Ekstraksi dengan etil asetat

Fase air Fase organik


+ Na2SO4 lalu dipekatkan

Cairan kental
Uji KLT

Isolat

Identifikasi

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


31

3.2.8 Uji KLT dan Pemisahan komponen Hasil Reaksi


Untuk mengetahui jumlah komponen yang terdapat di dalam senyawa
hasil reaksi, maka dilakukan uji KLT. Uji KLT dilakukan dengan menggunakan
pelarut etil asetat : metanol dengan perbandingan yang paling optimum yaitu 1:3.
Hasil uji KLT digunakan untuk mengidentifikasikan secara kualitatif berapa
banyak komponen yang terdapat didalam senyawa hasil reaksi.

3.2.9 Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode Radical Scavenger dengan


Menggunakan Larutan DPPH dalam Metanol
Disiapkan sampel yang masing-masing terdiri dari larutan katekin, dan
senyawa hasil reaksi dengan konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50
ppm, 60 ppm, dan 70 ppm dalam metanol, dan juga disiapkan larutan DPPH 0,4
mM dalam metanol. Pertama kali diukur absorbansi larutan DPPH, sebagai
kontrol (A0) dengan menggunakan spektrometer pada panjang gelombang 515
nm.
Sebanyak 2 mL larutan sampel 10 ppm ditambahkan 2 mL larutan DPPH
kemudian diaduk segera hingga bereaksi sempurna, dan diukur absorbansinya
(Ab). Pengukuran diulangi dengan menggunakan larutan sampel dengan
konsentrasi berbeda. Aktivitas antioksidan diukur sebagai penurunan serapan
campuran larutan DPPH dan sampel, akibat adanya aktivitas antioksidan dari
sampel. Aktivitas antioksidan dapat dihitung berdasarkan % inhibisi dengan
rumus:

Berdasarkan % inhibisi yang didapat dari perhitungan dapat ditentukan nilai IC 50


dari sampel dengan menggunakan grafik % inhibisi dengan konsentrasi.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


32

Bagan 3.3. Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode Radical Scavenger


dengan Menggunakan Larutan DPPH dalam Metanol

4 mL DPPH 0,4 mM dalam


metanol (kontrol)

2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 10 ppm dalam metanol
(kontrol)
2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 20 ppm dalam metanol

2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 30 ppm dalam metanol Diukur absorbansinya pada
maks 515 nm
2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 40 ppm dalam metanol

2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 50 ppm dalam metanol

2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 60 ppm dalam metanol

2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 70 ppm dalam metanol

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini, dilakukan sintesis suatu senyawa dimer katekin dengan
menggunakan katalis peroksidase dari kulit bawang bombay. Setelah peroksidase
berhasil diisolasi, kemudian dilakukan pemurnian dengan menggunakan
ammonium sulfat pada berbagai tingkat konsentrasi. Kemudian dilakukan
karakterisasi enzim meliputi pH optimum, dan suhu optimum.
Untuk mengetahui aktivitas dari peroksidase yang diperoleh maka
dilakukan uji aktivitas dan kadar protein dari enzim. Sedangkan penentuan kadar
protein pada peroksidase dilakukan dengan menggunakan metode Lowry.
Peroksidase yang diperoleh kemudian digunakan untuk mensintesis
senyawa dimer katekin dari daun teh. Pada senyawa hasil reaksi kemudian
dilakukan uji kromatigrafi lapis tipis (KLT), untuk mengetahui kehadiran senyawa
baru yang terbentuk. Untuk mengetahui struktur senyawa yang terbentuk maka
dilakukan pengujian dengan menggunakan Gas chromatography mass
spectrometry (GC-MS).
Hasil reaksi yang diperoleh, kemudian diuji aktivitas antioksidannya
dengan menggunakan metode radical scavenger menggunakan larutan DPPH
dalam metanol.

4.1 Isolasi Peroksidase dari Bawang Bombay


Pada penelitian ini digunakan bagian kulit dari bawang bombay sebagai
sumber enzim karena aktivitas peroksidase tertinggi ditemukan pada bagian kulit.
Peroksidase tergolong ke dalam jenis enzim intraseluler sehingga untuk
melepaskan enzim diperlukan pemecahan dinding sel, salah satunya dengan alat
homogenizer seperti blender. Kulit bawang bombay dihaluskan dengan blender
dalam buffer Na-fosfat pH 7,0 pada suhu 40C. pada kondisi tersebut akan
diperoleh aktivitas enzim peroksidase yang optimum. Selain itu, suhu dingin juga
akan mencegah terjadinya degradasi proteolitik.

33 Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


34

Setelah dinding sel dipecahkan, maka enzim yang dihasilkan harus


dipisahkan dari sel penghasilnya dan senyawa-senyawa lain seperti enzimenzim
lain, protein, metabolit, dan lain-lain. Pemisahan ini dilakukan dengan sentrifugasi
yang akan menghasilkan filtrat sebagai enzim kasar dan endapan. Pemisahan
dengan sentrifugasi akan berlangsung lebih cepat dan lebih mudah tercapai salah
satunya dengan radius putaran yang besar.
Ekstrak enzim kasar selanjutnya dimurnikan dengan menggunakan metode
pengendapan dengan garam (NH4)2SO4 pada berbagai tingkat konsentrasi. Prinsip
pengendapan ini didasarkan pada perbedaan kelarutan dari protein-protein.
Protein-protein yang mempunyai berat molekul besar mempunyai tingkat
kelarutan yang rendah sehingga akan mengendap terlebih dahulu, lalu diikuti
dengan protein-protein yang memiliki berat molekul lebih kecil. Dengan
memvariasikan tingkat konsentrasi (NH4)2SO4, diharapkan protein-protein dapat
dipisahkan dalam berbagai kelompok (fraksi) yang memiliki berat molekul sama
ataupun sangat berdekatan.
Penelitian ini menggunakan enzim fraksi III yang dihasilkan dari
pemurnian dengan menggunakan (NH4)2SO4 50 70% untuk mengkatalisis reaksi
karena diperoleh aktivitas peroksidase tertinggi pada fraksi ketiga. Volume enzim
fraksi III yang diperoleh pada penelitian ini sebanyak 5 mL yang seluruhnya akan
digunakan untuk mengkatalisis reaksi.

(a) (b)
Gambar 4.1 Enzim kasar (a) dan enzim fraksi III hasil pemurnian (b)

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


35

4.2 Karakterisasi Peroksidase


Karakterisasi peroksidase meliputi penentuan pH dan suhu optimum.
Pengujian pada berbagai pH dilakukan pada pH 2 sampai dengan pH 8 dengan
selang 1 unit menggunakan buffer glisin HCl (pH 2), buffer sitrat (pH 3-5) dan
buffer fosfat (pH 6-8). Suhu yang digunakan adalah 10C sampai dengan 60C
dengan selang 10C dalam substrat CMC 1% dalam buffer pH optimum dan
inkubasi selama 30 menit.

0.012

0.01
Absorbansi (nm)

0.008

0.006

0.004

0.002

0
0 2 4 6 8 10
pH

0.004
0.0035
0.003
Absorbansi (nm)

0.0025
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Suhu (0C)

Gambar 4.2 Grafik Penentuan pH optimum (atas) dan grafik penentuan suhu optimum
(bawah)

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


36

4.3 Uji Aktivitas Enzim dan Penentuan Kadar Protein


Enzim hasil karakterisasi yang telah didapat kemudian ditentukan
aktivitasnya berdasarkan reaksi oksidasi aminoantipyrine dan fenol dengan H 2O2.
Reaksi yang terjadi adalah:

Fenol
4-aminoantipirin Kuinonimina
Gambar 4.3 Pembentukan Kuinonimina

Adapun tahapan reaksi pembentukan kuinonimina adalah sebagai berikut:


Inisiasi

Propagasi

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


37

Terminasi

Dalam reaksi ini, 4-amoniantipyrine dan fenol bertindak sebagai substrat


donor H yang akan membentuk senyawa berwarna merah, quinonimina. Senyawa
ini mempunyai serapan maksimum pada = 510 nm.
Aktivitas enzim ditentukan dengan mengukur absorbansi pada = 510 nm.
Satu unit enzim dihasilkan dari dekomposisi 1 mol H2O2 per menit pada 300C
dan pH = 5,0 pada kondisi spesifik. Uji aktivitas enzim merupakan cara untuk
mengetahui apakah enzim yang sudah diisolasi dan dimurnikan merupakan enzim
peroksidase atau bukan serta memiliki aktivitas atau tidak. Senyawa quinonimina
berwarna merah yang terbentuk menandakan bahwa enzim peroksidase bekerja
mengkatalis reaksi redoks. Penggunaan substrat 4-aminoantipyrine dan fenol
didasarkan pada kemudahan kedua senyawa ini dalam mendonorkan H dan
menghasilkan produk berwarna merah yang intensif yang dapat dideteksi secara
spektroskopi pada daerah visible. Uji aktivitas ini pun dapat menggunakan
substrat lain yang mudah menghasilkan produk berwarna yang intensif, seperti
substrat guaikol.
Penentuan kadar protein pada peroksidase dilakukan dengan menggunakan
metode Lowry. Metode ini memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi karena
menghasilkan warna yang intensif. Dalam metode ini, terjadi reaksi biuret yaitu
ion Cu2+ dari CuSO4 bereaksi dengan ikatan peptide protein membentuk kompleks
dan mengalami reduksi menjadi Cu1+. Kemudian pereaksi Follin direduksi oleh
gugus tirosin dan triptofan. Reaksi Biuret ini tidak terlalu sensitive karena tidak

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


38

menghasilkan warna yang jelas, namun saat ditambahkan Follin terbentuk warna
ungu muda dan lebih sensitive dibanding reaksi Biuret saja.

(a) (b)
Gambar 4.4 Uji aktivitas enzim (a) kadar protein (b)

Sebagai larutan standar, digunakan larutan BSA dengan berbagai


konsentrasi sehingga menghasilkan kurva standar. Pada uji aktivitas enzim
diperoleh absorbansi pada 510 nm = 1,411 dan pada uji kadar protein diperoleh
absorbansi pada 750 nm = 1,278. Dengan menggunakan persamaan yang
diperoleh dari grafik regresi, maka akan diperoleh nilai kadar protein enzim
sebesar 0,756 mg/mL dengan perhitungan sebagai berikut:

mg/mL

y = 1.5942x + 0.0721
Absorbansi (nm)

1.5
R = 0.9871
1

0.5

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Konsentrasi (mg/mL)

Gambar 4.5. Kurva Larutan Standar BSA

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


39

Setelah menentukan kadar protein pada enzim, maka dapat dihitung aktivitas
spesifik enzim dengan menggunakan persamaan Wortington Manual Enzyme yang
dimodifikasi:

Table 4.1 Aktivitas enzim peroksidase fraksi III


A510 A750 Kadar Protein (mg/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg)
1,411 1,278 0,756 0,284

4.4 Pembentukan Senyawa Dimer Katekin


Senyawa katekin yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari ekstrak
tek hijau yang berwujud cairan kental berwarna coklat tua. Katekin adalah
senyawa fenolik yang mampu menyumbangkan proton dari gugus fenolnya jika
direaksikan dengan larutan H2O2, yang bertindak sebagai akseptor proton. Enzim
peroksidase yang digunakan dalam penelitian ini berfungsi sebagai biokatalisator.
Enzim peroksidase pada kulit bawang bombay memiliki aktivitas optimum pada
pH 5 dan suhu 300C, sehingga pada penelitian ini enzim peroksidase dilarutkan
dalam larutan buffer pH 5. Terjadinya reaksi kopling oksidatif antara katekin
dengan enzim peroksidase dapat dilihat secara visual dengan adanya perubahan
warna, yang semula berwarna coklat tua, berubah menjadi hijau tua, hal ini
menandakan adanya senyawa baru yang terbentuk. Seperti terlihat pada gambar
dibawah ini.

(a) (b)
Gambar 4.6. Senyawa katekin (kiri (a)) hasil reaksi antara katekin dengan enzim
peroksidase (kanan (a)), Ekstrasi hasil reaksi (b).

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


40

Enzim peroksidase dapat mengkatalisa reaksi karena adanya gugus heme


protoforfirin IX besi yang bereaksi dengan H2O2 menghasilkan intermediet radikal
hidroksi yang berikatan dengan enzim. Radikal ini akan berikatan dengan
senyawa katekin dan menghasilkan radikal fenoksi yang dapat mengalami
terminasi kopling.
Reaksi dihentikan setelah 30 menit, kemudian larutan diekstraksi dengan
etil asetat sebanyak 3 kali masing-masing 25 mL. Hasil ekstraksi yang diperoleh
berwarna hijau kekuningan. Ekstrak ini kemudian dipekatkan (diuapkan) sampai
kering dan diperoleh berat endapan campuran produk sebesar (0,2170 g).
Untuk mengetahui jumlah senyawa yang terdapat pada hasil reaksi antara
katekin dengan enzim peroksidase, maka dilakukan uji KLT. KLT dilakukan
sebagai analisis kualitatif dari suatu sampel dengan memisahkan komponen-
komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Umumnya fasa diam (silica
gel) pada KLT bersifat polar dan senyawa polar akan melekat lebih kuat pada
lempeng daripada senyawa nonpolar akibat interaksi tarik-menarik dipol-dipol.
Senyawa nonpolar kurang melekat erat pada fasa diam polar sehingga bergerak
maju lebih jauh ke atas lempeng. Jadi, jarak tempuh ke atas lempeng merupakan
gambaran dari polaritas suatu senyawa. Peningkatan polaritas pelarut akan
menurunkan ineraksi senyawa dengan fasa diam sehingga memungkinkan
senyawa dalam fasa gerak bergerak lebih jauh pada lempeng. Uji KLT dilakukan
dengan mengunakan pengembang etil asetat:metanol = 1:3.

Katekin
(monomer)
Hasil reaksi

Gambar 4.7. KLT senyawa katekin dan KLT senyawa hasil reaksi

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


41

Dari hasil pengujian, diperoleh 3 spot yang terdiri dari spot 1 dengan Rf =
0,91 (spot ini sama dengan spot katekin, berarti menunjukkan bahwa masih ada
katekin yang belum bereaksi), spot 2 dengan Rf = 0,60 (berukuran lebih kecil
daripada spot ketiga, berarti menunjukkan hasil samping reaks, by product). Spot
3 dengan Rf = 0,45 (berukuran lebih besar dibandingkan dengan spot kedua,
berarti menunjukkan hasil reaksi utama, main product).
Pada senyawa substrat (katekin) dan senyawa hasil reaksi dilakukan uji
dengan menggunakan instrument GC-MS untuk melihat berat molekul senyawa
yang dihasilkan. GC-MS adalah metode yang menggabungkan kromatografi gas
(pemisahan senyawa) dan spektrometer massa untuk mengidentifikasi zat-zat
yang terdapat dalam sampel dan menentukan berat molekulnya serta pola
fragmentasinya untuk mengetahui struktur molekul suatu senyawa. Saat sampel
diinjeksikan dalam injector GC, kemudian sampel diubah menjadi gas pada suhu
tinggi. Gas yang terbentuk dibawa oleh fase gerak, gas nitrogen melewati kolom
kapiler yang berisi fasa diam. Zat yang memiliki afinitas lebih rendah terhadap
fasa diamnyanakan keluar terlebih dahulu sehingga waktu retensinya rendah.
Sebaliknya zat yang memiliki afinitas lebih besar akan keluar lebih lama sehingga
waktu retensinya tinggi.

Gambar 4.8. Instrumen GC-MS Mabes Polri

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


42

Setelah zat terpisah dalam GC, dalam bentuk aliran gas akan masuk
kedalam separator jet, yang akan mempercepat momentum molekul analit yang
berat, sedangkan atom nitrogen yang ringan sebagai fasa gerak akan dibelokkan
oleh pompa vakum. Molekul analit akan masuk dan ditembak oleh sumber ion
dalam spektrometer massa, sehingga terbentuk spektrum massa berbagai puncak
dalam bentuk fragmen-fragmen. Setelah pemisahan selesai, rekonstruksi spektrum
massa untuk tiap puncak dapat ditampilkan pada komputer. Senyawa katekin dari
ekstrak teh hijau dianalisis dengan GC-MS, menghasilkan kromatogram sebagai
berikut:

Gambar 4.9. Kromatogram GC senyawa katekin

Dilihat dari kromatogram di atas, terlihat adanya 2 puncak yang memiliki


waktu retensi 8, 499 menit dengan luas area 73,34%, dan 8,697 menit dengan
luas area 26,66%, seperti disajikan pada Tabel 4.2 dibawah ini:

Tabel 4.2. Hasil Analisis GC-MS senyawa katekin


Waktu Retensi (menit) Luas Area (%) m/z
8, 499 73,34 280,9
8,697 26,66 290,0

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


43

Dari data GC, selanjutnya dilakukan analisis lebih lanjut dengan


menggunakan Mass Spectroscopy (MS) hasil analisis GC-MS diketahui pada
waktu retensi 8,697 menit terdapat senyawa dengan berat molekul 290 yang
diduga merupakan senyawa katekin dengan rumus molekul C15H14O6, seperti
terlihat pada Gambar 4.10 di bawah ini:

Gambar 4.10. Spektrum massa senyawa katekin

Dari data ini dapat terlihat bahwa terdapat senyawa dengan merat molekul 290
dengan pola fragmentasi seperti ditunjukkan pada Gambar 4.11 di bawah ini:

OH OH
H+
O OH
HO O
OH
HO CH2
OH
OH HO OH

m/z = 290 m/z = 139 m/z = 152

Gambar 4.11. Fragmentasi senyawa katekin

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


44

Setelah diperoleh senyawa katekin dari ekstrak teh hijau, maka dilakukan
reaksi dimer senyawa katekin. Pada senyawa hasil reaksi dilakukan analisis
dengan menggunakan instrumen yang sama yaitu GC-MS. Hasil analisis
ditunjukkan oleh Gambar 4.12 di bawah ini:

Gambar 4.12. Kromatogram GC senyawa hasil reaksi

Dari kromatogram di atas dapat dilihat bahwa ada satu puncak tertinggi
dengan waktu retensi 13,878 menit. Pada waktu retensi tersebut diketahui terdapat
senyawa dengan berat molekul 578,1. Senyawa ini diduga sebagai senyawa dimer
katekin. Data m/z sebesar 578,1 ini menunjukkan terbentuknya kopling dari 2
molekul katekin yang masing-masing kehilangan 2 atom H, dengan perhitungan:
2 x (Mr katekin) 2H = (2 x 290) 2 = 578. Gambar spektrum massa hasil reaksi
dapat dilihat pada Gambar 4.13 di bawah ini:

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


45

Gambar 4.13. Spektrum massa hasil reaksi

Spektrum massa yang dihasilkan dibandingkan dengan penelitian yang


dilakukan oleh Angelyne Benavides dan Paola Montoro tentang senyawa turunan
katekin. Ternyata terdapat persamaan antara nilai m/z dari senyawa hasil reaksi
yang terbentuk dengan m/z senyawa hasil penelitian Angelyne Benavides dan
Paola Montoro, seperti ditunjukkan pada Tabel 4.3 berikut ini:

Tabel 4.3 Perbandingan antara spektum massa hasil sintesis senyawa dimer katekin dengan
hasil penelitian Angelyne Benavides dan Paola Montoro

Spektrum massa senyawa hasil reaksi Spektrum masaa penelitian Angelyne


(m/z) Benavides dan Paola Montoro (m/z)
247,0 247,0
288,9 288,9
300,8 300,8
302,9 302,9
408,9 408,9
426,8 426,8
438,9 438,9
452,9 452,9
560,8 560,8
578,1 578,1

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


46

Dalam penelitian Angelyne Benavides dan Paola Montoro, senyawa


tersebut diidentifikasikan sebagai 4-8 dikatekin.

OH
OH

HO O

OH
OH
HO
OH

O OH

HO OH

Gambar 4.14 Struktur 4-8 dikatekin

Dalam sebuah spektrometer massa, sampel dalam keadaan gas


dibombardir dengan elektron berenergi tinggi. Tumbukan ini menyebabkan
lepasnya sebuah elektron n (lone pair electron) dari molekul suatu sampel dan
terbentuknya suatu ion organik. Ion organik yang dihasilkan ini tidak stabil dan
pecah menjadi fragmen kecil, dapat terbentuk radikal bebas ataupun ion-ion lain.
Dari peak untuk radikal ion (biasanya terletak paling kanan dalam spektrum) ini,
bobot molekul suatu senyawa dapat ditentukan.
Setelah ionisasi awal, ion molekul akan mengalami fragmentasi, dimana
radikal-radikal bebas atau molekul netral kecil dilepaskan dari ion molekul
tersebut. Sebuah ion molekul tidak pecah secara acak, melainkan cenderung
membentuk fragmen-fragmen yang sestabil mungkin. Adapun pola
fragmentasinya dapat dilihat pada Gambar 4.15 dibawah ini:

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


47

OH
OH

HO O

OH
OH
HO
OH
_
O OH

_ HO OH m/z = 170
m/z = 126
m/z = 578
_

m/z = 152
m/z = 408

m/z = 452
OH
_
HO O
m/z = 426 OH

OH
OH
m/z = 120
m/z = 332 m/z = 290

Gambar 4.15 Pola Fragmentasi Senyawa Hasil Reaksi

Pembentukan dimer katekin pada penelitian ini didasarkan pada reaksi


radikal, dimana digunakan enzim peroksidase dan H2O2. Peroksidase membentuk
suatu komplek dengan hidrogen peroksida yang kemudian dipecah menjadi dua
radikal hidroksi. Atom hidrogen pada gugus OH senyawa katekin akan diambil
oleh radikal hidroksi, sehingga dihasilkan radikal katekin yang distabilkan oleh
resonansi.
Dimer yang mungkin terbentuk dari dua radikal katekin terjadi pada atom
C-4 dan C-8, karena pada posisi ini senyawa mempunyai hambatan ruang yang
lebih kecil sehingga didapat struktur yang stabil.
Mekanisme yang terjadi:

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


48

Gambar 4.16. Pembentukan radikal katekin dan resonansi radikalnya.

Gambar 4.17. Struktur dimer katekin

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


49

4.5 Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Katekin dan Dimer Katekin


Senyawa fenolik merupakan salah satu sumber antioksidan yang
menghambat reaksi radikal dengan cara bereaksi dengan radikal bebas tersebut,
memberikan hidrogen, dan membentuk radikal fenolik yang tidak reaktif dan
terstabilkan dengan adanya resonansi. Senyawa katekin dan senyawa yang
dihasilkan pada reaksi ini merupakan senyawa yang mengandung gugus fenolik
yang akan diuji aktivitas bioaktifnya sebagai antioksidan.
Metode yang dipakai adalah metode radical scavenger dengan
menggunakan DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Metode DPPH dipilih karena
sedernaha, cepat dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel. Radikal DPPH
secara luas digunakan untuk mengukur kemampuan suatu senyawa yang dapat
bertindak sebagai penangkap radikal bebas atau donor hidrogen. Radikal yang
ditangkap oleh senyawa antioksidan melalui donor elektron membentuk DPPH
yang tereduksi, sehingga terjadi perubahan warna larutan dari ungu menjadi
kuning yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 515 nm.

Gambar 4.18. Reaksi antioksidan dengan DPPH

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


50

(a) (b) (c) (d)

Gambar 4.19. Hasil uji aktivitas antioksidan (a) dan (c) kontrol, (b) senyawa katekin, (d)
senyawa hasil reaksi

DPPH memberikan warna ungu karena adanya radikal bebas pada atom N
yang dapat membentuk diazo, dimana absorbansi maksimumnya adalah 515 nm.
Adanya penambahan sampel yang diduga berperan sebagai antioksidan dapat
menangkap radikal bebas DPPH. Penangkapan ini menurunkan terjadinya
pembentukan diazo, sehingga penurunan warna warna ungu selaras dengan
kemampuan aktivitas sebagai radical scavenger. Proses perubahan warna dari
ungu menjadi kuning ini diukur pada panjang gelombang 515 nm.

Gambar 4.20. Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH dengan antioksidan
(Witt, Lalk, Hager, dan Voigt, 2010)

Pengujian terhadap aktivitas antioksidan ini dilakukan dengan variasi


konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm dan 70 ppm untuk
senyawa katekin dan senyawa hasil reaksi.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


51

Absorbansi (515 nm)


0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)

Gambar 4.21. Grafik Aktivitas Antioksidan Katekin

0.8
Absorbansi (515 nm)

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)

Gambar 4.22. Grafik Aktivitas Antioksidan Senyawa Hasil Reaksi

Semakin besar konsentrasi senyawa yang ditambahkan ke dalam larutan


DPPH, semakin besar penurunan intensitas warna larutan DPPH. Hal ini
menandakan semakin tinggi kemampuan senyawa sebagai radical scavenger. Dari
grafik di atas terlihat aktivitas antioksidan dari senyawa hasil reaksi katekin
hampir sama dibandingkan dengan substrat awalnya, katekin. Dapat dikatakan
bahwa pembentukan senyawa baru dengan cara dimerisasi dengan katalis enzim
peroksidase dapat memiliki aktivitas antioksidan yang sama baiknya dengan
substrat awal.
Dari data pengukuran pada menit ke 30, maka dapat dihitung % inhibisi
untuk masing-masing konsentrasi sampel. Aktivitas radical scavenger ditentukan
berdasarkan persamaan:

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


52

60
50
40

%inhibisi
y = 0.4953x + 20.159
30
R = 0.9708
20
10
0
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)

Gambar 4.23. Grafik % inhibisi Katekin

60.000
50.000
% inhibisi

40.000
y = 0.4265x + 24.867
30.000 R = 0.9787
20.000
10.000
0.000
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)

Gambar 4.24. % inhibisi Senyawa Hasil Reaksi

Dari hasil perhitungan, diperoleh kemampuan menginhibisi (IC50)


senyawa hasil reaksi sebesar 58,928 ppm dan katekin sebesar 60,248 ppm.
Perbandingan IC50 dapat dilihat pada Gambar 4.25 dibawah ini:

60.5

60

59.5

59

58.5

58
Katekin Hasil Reaksi
Gambar 4.25. Nilai IC50 antara katekin dan senyawa hasil reaksi

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


53

Gambar di atas menunjukkan bahwa senyawa hasil reaksi mempunyai


aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan monomernya
(katekin) yang ditandai dengan nilai IC50 yang lebih kecil. Reduksi DPPH menjadi
DPPH-H disebabkan adanya donor hidrogen dari senyawa katekin atau dimer
produk. Oleh karena itu dapat diprediksikan bahwa didalam katekin maupun
senyawa hasil reaksi terdapat senyawa yang berperan dalam aktivitas antioksidan
yaitu golongan flavonoid dengan jumlah gugus hidroksil cukup sedikit. Jadi,
semakin banyak gugus hidroksil bebas yang dapat menyumbangkan hidrogen
maka semakin banyak juga reduksi yang dapat dilakukan terhadap DPPH.

Gambar 4.26. Orientasi besarnya reduksi DPPH oleh gugus hidroksil.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan
bahwa:
1. Bawang bombay (Allium cepa L.) mengandung enzim peroksidase dengan
aktivitas spesifik 0,284 unit/mg protein.
2. Senyawa dimer dari katekin berhasil disintesis dengan katalis enzim
peroksidase dari kulit bawang bombay dengan kondisi optimum
peroksidase pada pH 5 dan suhu 300C.
3. Reaksi antara katekin dan H2O2 yang dikatalisis oleh peroksidase
menghasilkan produk berupa padatan hijau tua dengan berat 0,2170 gram.
4. Produk dimer yang terbentuk merupakan senyawa 4-8 dikatekin, melalui
mekanisme reaksi kopling oksidatif radikal katekin pada posisi C-4 dan
C-8.
5. Senyawa 4-8 dikatekin mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih
besar dibandingkan dengan katekin dengan perbandingan IC 50 adalah
60,248 : 58,928. (katekin : dimer katekin).

5.2. Saran
Berdasarkan hasil dan kesimpulan yang diperoleh, maka disarankan
sebagai berikut:
1. Belum maksimalnya hasil yang diperoleh dari sintesis senyawa dimer
katekin yang telah dilakukan, maka disarankan untuk melakukan
penelitian lanjutan dengan menggunakan optimasi terhadap perbandingan
substrat, H2O2, dan enzim yang dipakai, serta optimasi kondisi reaksi yang
berlangsung.
2. Perlu dilakukan pemurnian kristal yang diperoleh dari hasil reaksi
sehingga bisa dianalisis dengan menggunakan alat yang lain.

54 Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


DAFTAR PUSTAKA

Anonymous, 2007. Mengenal Tanaman Teh,


http://www.sosro.com/indonesia/it_Mengenal Teh.htm. diakses pada
tanggal 11 April 2012.

Alamsyah, 2007. Antioksidan dan Peranannya Bagi Kesehatan.


http://www.beritaiptek.com/zberita-beritaiptek-2007-01-23-Antioksidan-
dan-peranannya-Bagi-Kesehatan.shtml. Diakses tanggal 27 Feb 2012.

Benadives, Angelyne et al. 2006. Catechin derivatives in Jatropha macrantha


stems: Characterisation and LC/ESI/MS/MS qualiquantitative analysis.
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Facolta di Farmacia, Universita
di Salerno, Via Ponte don Melillo, 84084 Fisciano, SA, Italy 40 (2006)
639647.

D Archivio M., Filesi C., Di Benedetto R., Gargiulo R., Giovanni C and Masella
R. (2007). Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann Istituto
Superior di Sanita 43(4), 348-361.

Gunawijaya, F. A. 1999. Efek Pemberian Katekin Teh Hijau Pada Pertumbuhan


Tumor Kelenjar Susu Mencit Strain Gr. (J Kedokteran Trisakti 1999; (2):
61-7).

Imanulkhan, 2006. Karakterisasi Edibel Film Beraktivitas dari Pati Ganyong


(Canna Edulis Kerr) dan Ekstrak Teh Hijau (Camellia Sinensis). Skripsi
Mahasiswa Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi
Pertanian, Universitas Brawijaya.

Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., dan Evstatieva, L.N.,
2002, Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity: A
Comparative Study on Three Testing Methods, Phytochemical Analysis,
13, 8-17.

55 Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


56

Lindiyah. (2008). Reaksi Dimerisasi Eugenol dan Isoeugenol dengan bantuan


Enzim Peroksidase dari Horseradish. FMIPA-UI: Depok.

Lucida, H. 2006. Determination of the ionization constants and the stability of


catechin from gambir (uncaria gambir (Hunter) Roxb), ASOPMS 12
International Conference, Padang November 2006.

Puspitasari, Agriana. 2006. Pengaruh Pemberian Katekin Teh Hijau Terhadap


Jumlah Sel Mononuklear Darah Tepi Pada Manusia, Karya Tulis Ilmiah.
Semarang: Universitas Diponegoro.

Robinson, T., 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, Penerbit ITB,


Bandung, hal 57 dan 211.

Rohdiana, Dadan. 2005. Aktivitas Antioksidan Beberapa Klon Teh Unggulan.


Bandung: Jurusan Teknologi Pangan Universitas Pasundan

Sonia, Mousounni. 2011. Crude Peroxidase From Onion Solid Waste as a Tool
For Organic Synthesis. Part II: Oxidative Dimerization-Cyclization of
Methyl p-Coumarate, Methyl Caffeat and Methyl Ferulate. Greece:
Elsevier.

Tuminah, S., 2004. [(Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast)] Sebagai
Salah Satu Sumber Antioksidan, Pusat Penelitian dan Pengembangan
Pemberantasan Penyakit, Balai Penelitian dan Pengembangan Kesehatan,
Departemen Kesehatan RI, Jakarta, Cermin Dunia Kedokteran No. 144,
2004.

Urquiaga I. and Leighton F. (2000). Plant Polyphenol Antioxidants and Oxidative


Stress Biological Research. 33(2), 55-64.

Villalobos D. A., and Buchanan I. D. (2002). Removal of Aqueous phenol by


Arthomyces Ramosus Peroxidase. Journal of environmental Engineering
Science I, 65-73.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


57

Witt, S., Lalk, M., Hager, C., dan Voigt, B., 2010, DPPH-Test: Determination of
Scavenger Properties, http://www.baltic-analytics.de/index.
php?id=7&L=1, diakses tanggal 14 April 2012.

Zaveri, Nurulain. 2005. Green tea and its polyphenolic catechins: Medicinal uses
in cancer and noncancer applications. USA: Science direct.

Universitas Indonesia

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


Lampiran 1

Tabel hasil pengukuran kadar protein dengan metode Lowry


Konsentrasi BSA (mg/ml) Absorbansi pada 750 nm
0.0625 0.1280
0.1250 0.2600
0.2500 0.4590
0.5000 0.9500
0.7500 1.3450
1.0000 1.5750
Sampel 1.2780

Kurva Larutan Standar BSA


2.0000
Absorbansi (nm)

1.5000 y = 1.5942x + 0.0721


R = 0.9871
1.0000

0.5000

0.0000
0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000
Konsentrasi (mg/mL)

Perhitungan aktivitas spesifik enzim:


dari persamaan regresi linier di atas, maka:
, ,
= = 0,756 mg/mL
,

Aktivitas spesifik enzim:


1,411
= = = 0,284
6,58 6,58 0,756

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


Lampiran 2

Absorbansi kontrol yaitu DPPH 0,4 mM = 1,074


Absorbansi Absorbansi
No Konsentrasi (ppm) Katekin Hasil Reaksi
1 2 1 2
1 10 0.845 0.836 0.734 0.751
2 20 0.725 0.728 0.712 0.714
3 30 0.686 0.677 0.695 0.676
4 40 0.647 0.625 0.642 0.633
5 50 0.589 0.590 0.582 0.587
6 60 0.539 0.547 0.533 0.541
7 70 0.485 0.508 0.453 0.479

Aktivitas Antioksidan Katekin


1
0.8
Absorbansi

0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)

Aktivitas Antioksidan Senyawa Hasil Reaksi


0.8
Absorbansi

0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)

0.8405
0.7265
0.6815
0.636
0.5895
0.543
0.4965

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


Lampiran 3

Contoh Perhitungan % inhibisi dan tabel % inhibisi

Katekin 10 ppm:
, ,
% = 100 % = 21,788 %
,

Tabel % inhibisi Katekin


Konsentrasi (ppm) Katekin (%) 60
10 21.788 50
20 32.356
40

%inhibisi
30 36.546 y = 0.4953x + 20.159
30
40 40.782 R = 0.9708
20
50 45.112
60 49.441 10
70 53.771 0
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)

Tabel % inhibisi Senyawa Hasil Reaksi


Konsentrasi (ppm) Katekin (%) 60.000
10 30.866 50.000
20 33.613 40.000
% inhibisi

y = 0.4265x + 24.867
30 36.173 30.000
R = 0.9787
40 40.642 20.000
50 45.577 10.000
60 50.000 0.000
0 20 40 60 80
70 56.611
Konsentrasi (ppm)

Penentuan nilai IC50 antara Katekin dan Senyawa Hasil Reaksi


Sampel IC50 60.5
Katekin 60.248
Hasil Reaksi 58.928 60

59.5

59

58.5

58
Katekin Hasil Reaksi

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


Abundance

TIC: CATECHIN SIM.D\ data.ms

900000

800000

700000

600000

500000

400000

300000

200000

100000

4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50
Time-->

Abundance

# 1 1 8 2 7 4 : C a t e c h in
1 3 9 .0

9000

8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000 2 9 0 .0
6 9 .0

1000
3 9 .0
1 0 7 .0 1 6 7 .0
8 8 .0 1 8 7 .0 2 0 8 .0 2 4 5 .0 2 7 1 .0
0
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
m / z -->

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


Abundanc e

T IC: CA T E CH IN S CA N .D \ d a ta .m s
1 3 .8 7 8
600000

550000

500000

450000

400000

350000

300000

250000

200000

6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0
T im e -->

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012