Captulo 4

Los componentes del medio de cultivo de tejidos vegetales 11:

Aditivos orgnicos, efectos osmticos y de pH y sistemas de soporte
El crecimiento y la morfognesis de los cultivos de tejidos vegetales pueden mejorarse con
pequeas cantidades de algunos nutrientes orgnicos. Estos son principalmente vitaminas
(incluyendo algunas sustancias que no son estrictamente vitaminas animales), aminocidos y
ciertos suplementos indefinidos. La cantidad de estas sustancias necesarias para el cultivo
exitoso vara con la especie y el genotipo, y es probablemente un reflejo de la capacidad
sinttica del explante.
VITAMINAS
Las vitaminas son compuestos requeridos por los animales en cantidades muy pequeas
como factores alimenticios auxiliares necesarios. La ausencia de la dieta conduce a un
crecimiento anormal y el desarrollo y una condicin poco saludable. Muchas de las mismas
sustancias son tambin necesarias por las clulas vegetales como intermediarios esenciales o
catalizadores metablicos, pero las plantas intactas, a diferencia de los animales, son capaces
de producir sus propias necesidades. Sin embargo, las clulas y los tejidos vegetales
cultivados pueden ser deficientes en algunos factores; El crecimiento y la supervivencia se
mejoran despus por su adicin al medio de cultivo.
En los primeros trabajos, los requerimientos de los cultivos de tejidos para trazas de ciertas
sustancias orgnicas fueron satisfechos por suplementos "indefinidos" tales como jugos de
frutas, leche de coco, extractos de levadura o malta y casena hidrolizada. Estos suplementos
pueden aportar vitaminas, aminocidos y reguladores del crecimiento a un medio de cultivo. El
uso de suplementos indefinidos ha disminuido a medida que se ha definido la necesidad de
compuestos orgnicos especficos, y estos se han incluido en los catlogos como productos
qumicos puros.
1.2. EL DESARROLLO DE MEZCLAS DE VITAMINAS
Las vitaminas ms frecuentemente usadas en los medios de cultivo de tejidos vegetales son la
tiamina (Vit. B1), el cido nicotnico (niacina) y la piridoxina (Vit. B6) y aparte de estos tres
compuestos, y el mio-inositol, Vitaminas son realmente esenciales.
La ventaja de aadir tiamina fue descubierta casi simultneamente por Bonner (1937, 1938),
Robbins y Bartley (1937) y White (1937). El cido nicotnico y la piridoxina aparecen, adems
de la tiamina, en medios publicados por Bonner (1940), Gautheret (1942) y White (1943b);
Esto sigui a los hallazgos de Bonner y Devirian (1939) que el cido nicotnico mejor el
crecimiento de races aisladas de tomate, guisante y rbano; Y los documentos de Robbins y
Schmidt (1939a, b), que indicaban que la piridoxina tambin era necesaria para el cultivo de
races de tomate. Estas cuatro vitaminas; Myo-inositol, tiamina, cido nicotnico y piridoxina
son ingredientes del medio Murashige y Skoog (1962) y se han usado en proporciones
variables para el cultivo de tejidos de muchas especies vegetales (Captulo 3). Sin embargo, a
menos que se hayan realizado investigaciones sobre los requisitos de un tejido o rgano
vegetal particular, no es posible concluir que todas las vitaminas que se han utilizado en un
experimento particular eran esenciales.
Los requisitos de las clulas para las vitaminas aadidas varan segn la naturaleza de la
planta y el tipo de cultivo. Welander (1977) encontr que las vitaminas Nitsch y Nitsch (1965)
no eran necesarias o incluso inhiban la formacin directa de brotes en los explantes de
pecolo de Begonia x hiemalis. Roest y Bokelmann (1975), por otro lado, obtuvieron una
mayor formacin de brotes en pedicelos de crisantemo cuando estaban presentes vitaminas
MS. El callo de Pinus strobus creci mejor cuando el nivel de inositol en medio MS se redujo a
50 mg / l mientras que el de P. echinata. Proliferaron ms rpidamente cuando no estaba
presente inositol (Kaul y Kochbar, 1985).
Los investigadores a menudo tienden a adoptar una actitud de "cinturn y tirantes" a los
componentes mediticos menores, y aadir suplementos inusuales slo para asegurarse de
que no falte ningn factor que limitar el xito de su experimento. A veces se han empleado
mezclas complejas de hasta nueve o diez vitaminas.
La experimentacin a menudo demuestra que algunas vitaminas pueden omitirse de los
medios recomendados. Aunque se utilizaron cuatro vitaminas en medio MS, trabajos
posteriores en el laboratorio del profesor Skoog mostraron que la tasa ptima de crecimiento
del tejido del callo del tabaco en las sales MS requiri la adicin de slo mio-inositol y tiamina.
El nivel de tiamina se multiplic por cuatro con respecto al utilizado por Murashige y Skoog
(1962), pero el cido nicotnico, la piridoxina y la glicina (aminocidos) fueron innecesarios
(Linsmaier y Skoog, 1965). Una simplificacin similar de las vitaminas MS fue hecha por Earle
y Torrey (1965) para el cultivo del callo Convolvulus.
Soczck y Hempel (1988) encontraron que en el medio de Murashige et al. (1974), ideado para
el cultivo de brotes de Gerbera jamesonii, tiamina, piridoxina e inositol, sin ninguna reduccin
en la tasa de multiplicacin de los brotes de sus cultivares locales. Ishihara y Katano (1982)
encontraron que las culturas de brotes de Malus podan crecer slo con sales de MS y que el
inositol y la tiamina eran en gran medida innecesarios.

COMPUESTOS ESPECFICOS
Mio-inositol. El mio-inositol (tambin a veces descrito como meso-inositol o i-inositol) es el
nico de los nueve estereoismeros tericos del inositol que tiene importancia biolgica
significativa. Mdicamente se ha clasificado como un miembro del complejo de la vitamina B y
se requiere para el crecimiento de la levadura y de muchas clulas de mamfero en el cultivo
de tejido. Las ratas y ratones lo requieren para el crecimiento del cabello y pueden desarrollar
dermatitis cuando no est en la dieta. El mio- inositol se ha clasificado como una vitamina
vegetal, pero algunos autores piensan que debe considerarse un carbohidrato suplementario,
aunque no contribuye a la utilizacin de hidratos de carbono como fuente de energa o como
osmoticum.
Uso histrico en cultivos de tejidos. El micono-inositol fue mostrado por primera vez por
Jacquiot (1951) para favorecer la formacin de yemas por el tejido cambial del olmo cuando
se suministra a 20-1000 mg / l. La necrosis fue retardada, aunque la proliferacin del callo no
fue promovida. Morel y Wetmore (1951) tambin utilizaron mioinositol a 100 mg / 1 para
combatir el callo del monocotiledn Amorphophallus rivieri (Araceae) en combinacin con
otras seis vitaminas. Las iniciales del brote aparecieron en algunas culturas y races y brotes
en otros segn la concentracin de auxina empleada. La vitamina fue adoptada por Wood y
Braun (1961) y Murashige y Skoog (1962) en combinacin con tiamina, cido nicotnico y
piridoxina en sus medios preferidos para el cultivo de Catharanthus roseus y Nicotiana
tabacum, respectivamente. Muchos otros trabajadores han incluido desde entonces en medios
de cultivo con resultados favorables sobre la tasa de crecimiento del callo o la induccin de la
morfognesis. Letham (1966) encontr que el mio- inositol interactuaba con la citoquinina para
promover la divisin celular en explantes de floema de zanahoria.
Ocurrencia y bioqumica. Parte de la propiedad promotora del crecimiento de la leche de coco
se debe a su contenido de mio-inositol (Pollard et al., 1961). La leche de coco tambin
contiene scyllo-inositol (Tabla 4.1). Esto tambin puede promover el crecimiento, pero en
menor grado que el mioismero (Pollard et al., 1961). Inositol es un componente del extracto
de levadura (Steiner et al., 1969, Steiner y Lester, 1972) y pequeas cantidades tambin
pueden estar contenidas en agar comercial (Wolter y Skoog, 1966). El mio-inositol es un
constituyente natural de las plantas y muchas de ellas se incorporan a menudo en fosfatidil-
inositol, que puede ser un factor importante en el funcionamiento de las membranas (Jung et
al., 1972; Harran y Dickinson, 1978). El ciclo de fosfatidilinositol controla diversas respuestas
celulares en clulas animales y levaduras, pero la evidencia de que desempea un papel
similar en las plantas es slo que se acumula. Se ha observado que las enzimas que se cree
estn implicadas en el ciclo tienen actividades en plantas y el cloruro de litio (que inhibe la
mio-inositol-1-fosfatasa y disminuye el ciclo) inhibe la formacin de callos en Brassica
oleracea (Bagga et al., 1987) , Y el crecimiento del callo en Amaranthus paniculatus (Das et
al., 1987). En ambas plantas la inhibicin se invierte por mio-inositol.
Como la molcula de mio-inositol tiene seis unidades hidroxilo, puede reaccionar con hasta
seis molculas de cido formando diversos steres. Parece que los fosfatos de inositol actan
como segundos mensajeros para la accin primaria de la auxina en las plantas: el cido ftico
(hexasfato de inositol) es uno de estos. Agregado a los medios de cultivo puede promover el
crecimiento de tejido si puede servir como una fuente de inositol (Watanabe et al., 1971). En
algunas especies, la auxina puede ser almacenada y puede ser transportada como ster de
IAA-myo-inositol (Captulo 5). O-Metil-inositol est presente en cantidades muy grandes en las
leguminosas; Se sabe que los teres metlicos de inositol ocurren en plantas de varias otras
familias, aunque su funcin es desconocida (Phillips y Smith, 1974).
El efecto estimulador del mio-inositol en los cultivos de plantas probablemente surge en parte
de la participacin del compuesto en vas biosintticas que conducen a la formacin de la
pectina y hemicelulosas necesarias en las paredes celulares (Loewus et al., 1962, Loewus,
1974, Loewus y Loewus , 1980), y puede tener un papel en la captacin y utilizacin de iones
(Wood y Braun, 1961). En los experimentos de Staudt (1984) mencionados a continuacin,
cuando el contenido de P043 del medio se elev a 4,41 mM, la velocidad de crecimiento del
callo de cv. 'Aris' fue progresivamente mejorado ya que el mio- inositol para enfatizar la
importancia del medio que contena inositol se puso a 4000 mg / l. Este resultado parece
fosfolpidos para el crecimiento.

Actividad en cultivos de tejidos. Los tejidos vegetales cultivados varan en su capacidad para
la biosntesis de mio-inositol. Los brotes intactos suelen ser capaces de producir sus propios
requisitos, pero aunque muchos tejidos no organizados son capaces de crecer lentamente sin
la adicin de vitamina al medio (Murashige, 1974) la adicin de una pequea cantidad se
encuentra con frecuencia para estimular la divisin celular. Se ha descubierto que el
compuesto es esencial para algunas plantas. En la opinin de Kaul y Sabharwal (1975) esto
incluye todos los monocotyldons, los medios para los cuales, si no contienen inositol,
necesitan ser complementados con la leche de coco, o el extracto de la levadura.
El callo de Fraxinus pennsylvanica tena un requisito absoluto de 10 mg / l de mio-inositol para
lograr el mximo crecimiento; Niveles ms altos, hasta 250 mg / l no tuvieron ningn efecto
adicional en los rendimientos de peso fresco o seco (Wolter y Skoog, 1966). Se demostr que
la formacin de brotes de brotes en callos de Haworthia spp dependa de la disponibilidad de
mio-inositol (Kaul y Sabharwal, 1972, 1975). En un medio revisado de Linsmaier y Skoog
(1965) [Staudt (1984) que contena 1,84 mM de PO43-], el tejido de callos de Vitis vinifera cv
'Mller-Thurgau' no requera mioinositol para el crecimiento, sino el de Vitis vinifera x V Riparia
cv. 'Aris' dependa de l y la tasa de crecimiento aument a medida que el nivel de mio-inositol
se increment hasta 250 mg / l (Staudt, 1984).
Gupta et al. (1988) encontraron que era esencial aadir 5 g / l de mio-inositol al medio DCR-1
de Gupta y Durzan (1985) para inducir embriognesis (masas suspensoras embrionarias) del
tejido gametofito femenino de Pseudotsuga menziesii y Pinus taeda. La concentracin
necesaria parece insuficiente para actuar como estmulo osmtico (ver seccin 3). Mio-
inositol redujo la tasa de proliferacin en cultivos de tiro de Euphorbia fulgens (Zhang et al.,
1986).
Tiamina. La tiamina (Vit. B1, aneurina) en forma de pirofosfato de tiamina, es un factor
esencial en el metabolismo de los carbohidratos y est directamente implicada en la
biosntesis de algunos aminocidos. Se ha aadido a los medios de cultivo de plantas con
ms frecuencia que cualquier otra vitamina. Los tejidos de la mayora de las plantas parecen
requerirlo para el crecimiento, la necesidad se hace ms evidente con los pasajes
consecutivos, pero algunas clulas cultivadas son autosuficientes. Los cultivos en suspensin
de maz de Polikarpochkina et al. (1979) mostraron un crecimiento mucho menor en el paso 2,
y murieron en el tercer paso cuando se omiti tiamina del medio.
El medio MS contiene tiamina 0,3 M. Que esto no sea suficiente para obtener resultados
ptimos de algunos cultivos se ilustra por los resultados de Barwale et al. (1986): aumentando
la concentracin de tiamina-HCl en medio MS a 5 M, aument la frecuencia con la que los
embriones zigticos de Glycine max formaron embriones somticos de 33% a 58%. La adicin
de 30 M de cido nicotnico (normalmente 4 M) mejor la aparicin de la embriognesis
an ms al 76%. Se encontr que la tiamina era esencial para estimular la induccin de callos
embriognicos en Zoysia japonica, una hierba de csped de estacin clida de Japn (Asano
et al., 1996). Tambin se ha demostrado que estimula el arraigo adventicia de Taxus spp.
(Che, 1995).
Puede haber una interaccin entre los reguladores de crecimiento de tiamina y citoquinina.
Digby y Skoog (1966) descubrieron que los cultivos de callo normales del tabaco producan un
nivel adecuado de tiamina para soportar el crecimiento proporcionando un nivel relativamente
alto de cinetina (aproximadamente 1 mg / l) al medio, pero el tejido no creca cuando Se
traslad a un medio con menos aadido cinetina a menos que se proporcion tiamina.
A veces pasa de un estado de tiamina a un estado de tiamina suficiente durante el cultivo (ver
habituacin - Captulo 7). En el callo del arroz, la tiamina influy en la morfognesis de una
manera que dependa del estado en el que se encontraban las clulas. La presencia de la
vitamina en un medio de precultivo (Etapa I) caus callo suficiente para formar races
primordiales en una induccin (Etapa II) , Pero suprimi el efecto estimulante de la cinetina en
la formacin de brotes de la etapa II en calos que requieren tiamina. Era esencial omitir
tiamina del medio de la Etapa I para inducir calos suficientes para producir brotes en la Fase II
(Inoue y Maeda, 1982).
Vitamina D. Algunas vitaminas del grupo D, especialmente la vitamina D2 y D3, pueden tener
un efecto regulador del crecimiento en los cultivos de tejidos vegetales. Su efecto se discute
en el captulo 7.
Vitamina E. La actividad antioxidante de la vitamina E (-tocoferol) se discutir en el captulo
12.
Otras vitaminas. Se ha obtenido evidencia de que el cido flico frena la proliferacin de
tejidos en la oscuridad, al tiempo que mejora la luz. Esto es probablemente porque se hidroliza
a la luz del cido p-aminobenzoico (PAB). En presencia de auxina, se ha demostrado que la
PAB tiene un dbil efecto estimulador del crecimiento en tejidos vegetales cultivados (de
Capite, 1952a, b).
Se ha encontrado que la riboflavina, que es un componente de algunas mezclas de vitaminas,
inhibe la formacin de callos, pero puede mejorar el crecimiento y la calidad de los brotes
(Drew y Smith, 1986). La supresin del crecimiento del callo puede significar que la vitamina
puede inhibir o estimular la formacin de races en los esquejes. Se ha demostrado que la
riboflavina estimula el enraizamiento adventicio en brotes de Carica papaya (Drew et al.,
1993), brotes de manzana (van der Krieken et al., 1992) y Eucalyptus globulus (Trindade y
Pais, 1997). Tambin mejora la induccin de callos embriognicos en Zoysia japonica en
asociacin con citoquininas y tiamina (Asano et al., 1996).
La glicina se describe ocasionalmente como una vitamina en cultivos de tejidos vegetales: su
uso se ha descrito en la seccin sobre aminocidos.
Adenina. La adenina (o sulfato de adenina) se ha utilizado ampliamente en los medios de
cultivo de tejidos, pero como causa principalmente efectos similares a los producidos por las
citocininas, se considera en el captulo sobre citoquininas (captulo 6).
Estabilidad. Algunas vitaminas son lbil al calor; Ver la seccin sobre preparacin media en el
Volumen 2.
1.5. SUPLEMENTOS INDEFINADOS
Se emplearon muchos suplementos indefinidos en los medios de cultivo de tejidos tempranos.
Su uso ha disminuido lentamente a medida que el equilibrio entre las sales inorgnicas se ha
mejorado, y como el efecto de los aminocidos y
Sustancias de crecimiento se ha comprendido mejor. Sin embargo, varios suplementos de
composicin incierta y variable siguen siendo de uso comn.
Los primeros cultivos exitosos de tejido vegetal implicaron el uso de extracto de levadura
(Robbins, 1922; White, 1934). Otras adiciones indefinidas hechas a los medios de cultivo de
tejidos vegetales han sido:
extractos de carne, malta y levadura y digestin de fibrina;
zumos, pulpas y extractos de diversas frutas (Steward y Shantz, 1959, Ranga Swamy, 1963,
Guha y Maheshwari, 1964, 1967), incluidos los de pltanos y tomates (La Rue, 1949);
los fluidos que nutren los embriones zigticos inmaduros;
extractos de plntulas (Saalbach y Koblitz, 1978) o hojas de plantas (Borkird y Sink, 1983);
el extracto de patatas hervidas y licor de maz (Fox y Miller, 1959);
savia de la planta o el extracto de races o rizomas. Se cree que las races de las plantas son
el sitio principal de la sntesis de citoquininas en las plantas (Captulo 6);
hidrolizados de protenas (normalmente casena) (que contienen una mezcla de todos los
aminocidos presentes en la protena original). Los hidrolizados de casena se denominan a
veces casaminocidos: se tratan en el captulo 3).
Muchas de estas enmiendas pueden ser una fuente de aminocidos, pptidos, cidos grasos,
carbohidratos, vitaminas y sustancias de crecimiento de plantas en diferentes
concentraciones. A continuacin se describen las que se han usado ms ampliamente.
1.6. EXTRACTO DE LEVADURA.
El extracto de levadura (YE) se usa menos como ingrediente de los medios vegetales que en
tiempos anteriores, cuando se aadi como fuente de aminocidos y vitaminas, especialmente
inositol y tiamina (vitamina B1) (Bonner y Addicott, 1937; Robbins y Bartley, 1937). En un
medio consistente slo en macronutrientes y micronutrientes, el aporte de extracto de
levadura era a menudo esencial para el crecimiento de los tejidos (White, 1934; Robbins y
Bartley, 1937). El contenido en vitaminas del extracto de levadura lo distingue del hidrolizado
de casena (CH) de modo que en tales medios CH o aminocidos solos no pueden sustituir a
YE (Straus y La Rue, 1954; Nickell y Maretzki, 1969). Pronto se encontr que los aminocidos
como la glicina, la lisina y la arginina, y vitaminas como la tiamina y el cido nicotnico, podran
servir como reemplazos para YE, por ejemplo en el crecimiento de races de tomate (Skinner y
Street, 1954) (Nickell y Maretzki, 1969). El porcentaje de aminocidos en un extracto de
levadura tpico es alto (por ejemplo, 7% de nitrgeno amnico - Nickell y Maretzki, 1969,
Bridson, 1978, Thom et al., 1981), pero hay menos cido glutmico que en casena u otro
hidrolizado de protenas . El extracto de malta contiene poco nitrgeno (aproximadamente un
0,5% en total).
El extracto de levadura ha sido aadido tpicamente a medios en concentraciones de 0,1-1 g /
l; Ocasionalmente 5, 10 e incluso 20 g / l (Morel y Muller, 1964). Normalmente slo aumenta el
crecimiento en medios que contienen concentraciones relativamente bajas de nitrgeno, o
donde faltan vitaminas. La adicin de 125-5000 mg / l de YE al medio MS inhibi
completamente el crecimiento del callo verde de 5 plantas diferentes, mientras que se
aadieron cantidades pequeas al medio THS de Vasil e Hildebrandt (1966) que contena 0,6
veces la cantidad de iones NO3- y NH4 + A diferencia de la EM no contena cido nicotnico o
piridoxina) dio un crecimiento ms vigoroso de zanahoria, endivias y callos de lechuga que
ocurri en la EM. Todava no haba crecimiento de callos de perejil y tomate en medio THS:
estos tejidos slo crecieron bien en MS no modificada (Vasil y Hildebrandt, 1966a, b, c).
Los medios de la fase I se enriquecen a veces con extracto de levadura para revelar la
presencia de microorganismos que pueden haber escapado a los procedimientos de
descontaminacin: se omite en etapas posteriores de cultivo.
Se ha demostrado que el extracto de levadura tiene algunas propiedades inusuales que
pueden estar relacionadas con su contenido de aminocidos. Obtiene la acumulacin de
fitoalexina en varias especies de plantas y en suspensiones de Glycyrrhiza echinata estimul
la actividad de la chalcona sintasa que condujo a la formacin de narengin (Ayabe et al.,
1988). Tambin estimul la produccin de furomocumarina en suspensiones de clulas de
Glehnia littoralis (Kitamura et al., 1998). En Monnier (1976, 1978) se encontr que el medio 1
g / l de extracto de levadura inhiba el crecimiento de embriones zigticos inmaduros de
Linum, efecto que, cuando se aadieron 0,05 mg / 1 de BAP y 400 mg / l de glutamina, indujo
la formacin directa De embriones adventicios (Pretova y Williams, 1986).
Extracto de levadura ahora se compra directamente a los proveedores de productos qumicos.
En las dcadas de 1930 y 1940 se prepar en el laboratorio. Brink et al. (1944) maceraron
levadura en agua, que luego se hirvi durante 30 minutos y, despus de enfriar, el material
almidonado se retir por centrifugacin. Sin embargo, Robbins y Bartley (1937) encontraron
que los componentes activos de la levadura podran extraerse con etanol al 80%.
1.7. EXTRACTO DE PATATA
Trabajadores en China encontraron que hubo un fuerte aumento en el nmero de plantas de
polen producidas a partir de anteras de trigo cuando fueron cultivadas en un medio solidificado
con agar que contena slo un extracto de papas hervidas, FeEDTA 0,1 mM, 9% de sacarosa
y reguladores de crecimiento. Se ha encontrado que el extracto de patata solo o extracto de
patata combinado con componentes de medios de cultivo convencionales (Chuang et al.,
1978) proporciona un medio til para el cultivo de anteras de trigo y algunas otras plantas de
cereal. Por ejemplo, se encontr que el medio de papa era mejor para el cultivo de anteras de
trigo de primavera que el medio sinttico (N6) (McGregor y McHughen, 1990). Sopory et al.
(1978) obtuvo la iniciacin de la embriognesis de anteras de papa en extracto de papa solo y
Lichter (1981) encontr beneficioso agregar 2,5 g / l de extracto de papa Difco a un medio
para el cultivo de anteras de Brassica napus, pero fue omitido por Chuong y Beversdorf 1985)
cuando repitieron este trabajo. No tenemos conocimiento de que el extracto de papa se
agregue a los medios de comunicacin para la micropropagacin, aparte de los informes
ocasionales de su uso para la propagacin de orqudeas. Sagawa y Kunisaki (1982)
suplementaron 1 litro de medio Vacin y Went (1949) con el extracto de 100 g de patatas
hervidas durante 5 minutos y Harvais (1982) aadi 5% de un extracto de 200 g de patatas
hervidas en 1 litro de agua a su orqudea medio. De inters fue el hallazgo de que el
tratamiento del zumo de papa permiti a los cultivos in vitro de Doritaenopsis (Orchidaceae)
recuperarse de la hiperhidricidad (Zou, 1995).
1.8. EXTRACTO DE MALTA
Aunque ya no se utiliza comnmente, extracto de malta parece desempear un papel
especfico en las culturas de ctricos. Se demostr que el extracto de malta, principalmente
una fuente de carbohidratos, inicia la embriognesis en explantes nucelares (Rangan et al.,
1968, Rangan, 1984). Varios estudios recientes mostraron un papel para el extracto en la
multiplicacin de embriones somticos de Citrus sinensis (Das et al., 1995), y en otros Citrus
spp. (Jumin, 1995), en la promocin de la formacin de plntulas a partir de embriones
somticos derivados de estilos de diferentes cultivares de Citrus (De Pasquale et al., 1994) y
en la embriognesis somtica y regeneracin de plntulas de capas de clulas delgadas de
pistilo de Citrus (Carimi et al. ., 1999). El extracto de malta tambin promovi la germinacin
de los embriones tempranos de la fase cotiledonariana, derivados del rescate in vitro de
embriones zigticos de naranja amarga (Carimi et al., 1998). El extracto est comercialmente
disponible y se usa a un nivel de 0,5 - 1 g / l.
HOMOGENADO DE BANANA
La fruta de pltano homogeneizada se agrega a veces a los medios para la cultura de
orqudeas y se divulga a menudo para promover crecimiento. La razn de su efecto
estimulante no se ha explicado. Una sugerencia mencionada anteriormente es que podra
ayudar a estabilizar el pH del medio. Pierik et al. (1988) encontr que era ligeramente
inhibitoria a la germinacin de las plntulas de Paphiopedilum ciliolare, pero promovi el
crecimiento de plntulas una vez que la germinacin haba tenido lugar.
1.10. FLUIDOS QUE PERMITEN EMBRIONES
El lquido que est presente en el saco embrionario de frutos inmaduros de Aesculus (por
ejemplo, A. woerlitzensis) (Shantz y Steward, 1956, 1964, Steward y Shantz, 1959, Steward y
Rao, 1970) y Juglans regia (Steward y Caplin, 1952 ) Se ha encontrado que tiene un fuerte
efecto promotor del crecimiento en algunos tejidos vegetales cultivados en medios simples,
aunque ocasionalmente se ha informado de inhibicin del crecimiento (Fonnesbech, 1972).
Los fluidos del gametofito femenino inmaduro de Ginkgo biloba (Steward y Caplin, 1952) y los
extractos del gametofito femenino de Pseudotsuga menziesii (Mapes y Zaerr, 1981) y los
granos de Zea mays inmaduros (menos de dos semanas despus de la polinizacin) pueden
tener un efecto similar . El lquido ms fcilmente obtenido con este tipo de actividad es la
leche de coco (agua).
1.11. LECHE DE COCO / AGUA
Cuando se aade a un medio que contiene auxina, el endosperma lquido de los frutos Cocos
nucifera puede inducir a las clulas vegetales a dividirse y crecer rpidamente. El fluido se
conoce ms comnmente como leche de coco, aunque Tulecke et al. (1961) sostuvo que el
trmino correcto en ingls es "agua de coco", porque el trmino leche de coco tambin
describe el lquido blanco obtenido por reticulacin del endospermo de coco blanco slido (la
"carne") en agua y esto no se usa generalmente en cultivo de tejidos medios de comunicacin.
Sin embargo, en esta seccin, ambos trminos se utilizan.
La leche de coco se us por primera vez en cultivos de tejidos por Van Overbeek et al. (1941,
1942) que descubrieron que su adicin a un medio de cultivo era necesaria para el desarrollo
de embriones muy jvenes de Datura stramonium. Gautheret (1942) encontr que la leche de
coco podra ser utilizada para iniciar y mantener el crecimiento en cultivos de tejidos de varias
plantas, y Caplin y Steward (1948) mostraron que el callo derivado de los explantes tisulares
de las races de Daucus carota creci mucho ms rpidamente cuando el 15% Leche era
Aadido a un medio que contiene IAA. A diferencia de otros suplementos indefinidos a los
medios de cultivo (como el extracto de levadura, el extracto de malta y el hidrolizado de
casena), la leche de coco ha resultado ms difcil de reemplazar por medios completamente
definidos. Se ha encontrado que el lquido es beneficioso para inducir el crecimiento tanto de
cultivos de callo como de suspensin y para la induccin de morfognesis. Aunque los
laboratorios comerciales de cultivo de tejidos de plantas (especialmente los de pases
templados) se esforzaran por no utilizar este ingrediente por su costo, todava se emplea
frecuentemente para fines especiales en la investigacin.
Es posible obtener crecimiento del callo slo en leche de coco (Steward et al., 1952), pero
normalmente se aade a un medio reconocido. La estimulacin efectiva slo se produce
cuando se aaden cantidades relativamente grandes a un medio; La incorporacin de 10-15
por ciento por volumen es bastante usual. Por ejemplo, Burnet e Ibrahim (1973) encontraron
que se requera 20% de leche de coco (es decir, un quinto del volumen final del medio) para el
inicio y el crecimiento continuo del tejido de callo de diversas especies de Citrus en medio MS;
Rangan (1974) ha obtenido un crecimiento mejorado de Panicum miliaceum en medio MS
usando 2,4-D en presencia de 15% de leche de coco. Por el contrario, Vasil y colaboradores
(por ejemplo, Vasil y Vasil, 1981a, b) necesitaban aadir slo 5% de leche de coco al medio
MS para obtener embriognesis somtica de callos de cereal y cultivos en suspensin.
Muchos trabajadores tratan de evitar tener que usar leche de coco en sus protocolos. Es un
suplemento indefinido cuya composicin puede variar considerablemente (Swedlund y Locy,
1988). Sin embargo, la adicin de leche de coco a los medios a menudo proporciona una
manera sencilla de obtener un crecimiento satisfactorio o una morfognesis sin necesidad de
elaborar una formulacin definida adecuadamente. Las sugerencias de que la leche de coco
es esencial para un propsito en particular necesitan ser tratadas con cierta precaucin. Por
ejemplo, en el cultivo del callo embriognico de los explantes de raz y pecolo de Daucus
carota, la leche de coco podra ser reemplazada satisfactoriamente por adenina o cinetina,
demostrando que no aportaba sustancias nicas requeridas para la embriognesis (Halperin y
Wetherell, 1964).
Preparacin. El agua de coco preparada (leche) se puede comprar a algunos proveedores de
productos qumicos, pero el lquido de las nueces frescas (obtenido de la verdulera) es
generalmente perfectamente adecuado. Una nuez suele producir al menos 100 ml. El agua se
drena ms simplemente de cocos deshuesados perforando agujeros a travs de dos de los
micropyles. Slo se debe usar agua normal y no contaminada,
122 Los componentes del medio de cultivo de tejidos vegetales II
Las nueces deben ser extradas una por una, y el endospermo lquido de cada uno examinado
para cerciorarse de que es unfermented antes de la adicin a un suministro a granel. El agua
de los cocos verdes pero maduros puede contener cantidades ligeramente diferentes de
sustancias a las de los frutos secos comprados en el mercado local (Tabla 4.1) y se ha dicho
que es un estimulante ms efectivo en los medios vegetales que en los frutos maduros, pero
Morel y Wetmore (1951) encontr lo contrario. Tulecke et al. (1961) descubrieron que el agua
de cocos muy inmaduros contena cantidades ms pequeas de las sustancias normalmente
presentes en las nueces maduras.
Referencias a la composicin del agua de coco (los nmeros se refieren a las citas de la Tabla
4.1). (1) Dunstan (1906), (2) DeKruijff (1906), (3) McCance y Widdowson (1940), (4)
Vandenbelt (1945), (5) Sadasivan (1951), (6) Shantz y Steward ), (7) Pars y Duhamet (1953),
(8) Shantz y Steward (1955), (9) Wilson y Cutter (1955), (10) Radley y Dear (1958), (11)
Steward y Shantz ), (12) Pollard et al. (1961), (13) Las cifras de Steward et al. (1961), dado
por Raghavan (1977), (14) Tulecke et al. (1961), (15) Steward y Mohan Ram (1961), (16)
Kuraishi y Okumura (1961), (17) Steward (1963), (18) Zwar et al. (1963), (19) Steward et al.
(1964), (20) Letham (1968), (21) Steward et al. (1969), (22) Zwar y Bruce (1970), (23) Mondal
et al. (1972), (24) Letham (1974), (25) Van Staden y Drewes (1975), (26) Van Staden (1976),
(27) Letham (1982), 28 Dix y Van Staden (1982) .
Uso de agua de coco. El agua de coco es usualmente forzada a travs de tela y
desproteinizada por calentamiento a 80-100 C durante aproximadamente 10 minutos
mientras se agita. Despus se deja sedimentar y el sobrenadante se separa de las protenas
coaguladas por filtracin a travs de papel. El lquido se almacena congelado a -20 C.
Borkird y Sink (1983) no hierven el agua de cocos maduros frescos, pero despus de filtrarlo a
travs de varias capas de estopilla, ajust el pH a 10 con NaOH 2 N y luego se mantuvo
durante toda la noche a 4C. Al da siguiente, el pH se reajust a 7,0 con HCl 5 N y la
preparacin se volvi a filtrar antes de ser almacenada congelada a -20C.
Algunos trabajadores autoclavan medios que contienen leche de coco; Otros esterilizan por
filtracin la leche de coco y la aaden a un medio despus de que se haya realizado el
autoclave. Morel y Wetmore (1951) utilizaron la esterilizacin por filtracin, pero encontraron
que la leche perda su potencia si se almacenaba estril (pero presumiblemente sin congelar)
durante 3 meses. Street (1977) abog por el autoclave de la leche de coco despus de haber
sido hervida y filtrada; Se almacen entonces a -20C hasta que se requiriera.
Ingredientes activos. El notable crecimiento estimulante de la propiedad de la leche de coco
ha llevado a intentos de aislar e identificar los principios activos. Esto ha resultado ser difcil
debido a que las fracciones en las que se ha separado la leche de coco poseen slo una
pequea proporcin de la actividad total y los diferentes componentes parecen actuar
sinrgicamente. Las sustancias hasta ahora identificadas incluyen aminocidos, cidos
orgnicos, cidos nucleicos, purinas, azcares, alcoholes de azcar, vitaminas, sustancias de
crecimiento y minerales (Tabla 4.1). La naturaleza variable del producto se ilustra en la tabla
por los resultados analticos obtenidos por diferentes autores.
Actividad de Auxina. Se ha encontrado que el lquido tiene cierta actividad de auxina que se
incrementa en autoclave, probablemente debido a que tales sustancias de crecimiento existen
en una forma unida y son liberadas por hidrlisis. Pero aunque la leche de coco puede
estimular el crecimiento de algunos cultivos in vitro en ausencia de auxina exgena,
normalmente contiene poco de este tipo de regulador de crecimiento y generalmente se
requiere un suministro exgeno adicional. En los medios modernos, donde los compuestos
orgnicos a menudo se aaden en cantidades definidas, el principal beneficio de usar leche
de coco es casi seguro debido a su proporcionar sustancias de crecimiento de la citoquinina
natural altamente activa.
Actividad de la citoquinina. Se ha demostrado que la leche de coco tiene actividad de
citoquinina por Kuraishi y Okumura (1961) y se han aislado sustancias de citoquinina
naturales reconocidas desde entonces [9--D-ribo-furanosil zeatina (Letham, 1968); Zeatina y
varios no identificados (Zwar y Bruce, 1970); N, N'-difenilurea (Shantz y Steward, 1955)], pero
no se han publicado los niveles de estos compuestos en varias muestras de leche de coco. Un
promotor de crecimiento inusual de tipo citoquinina, 2- (3-metilbut-2-enilamino) -purin-6-ona
fue aislado por Letham (1982).
Debido a que la leche de coco contiene citoquininas naturales, su adicin a los medios a
menudo tiene el mismo efecto que la adicin de una citoquinina reconocida. Esto significa que
un efecto beneficioso sobre el crecimiento o la morfognesis depende a menudo de la
presencia de una auxina. Steward y Caplin (1951) demostraron que exista una accin
sinrgica entre el 2,4-D y la leche de coco para estimular el crecimiento del tejido del tubrculo
de la patata. Lin y Staba (1961) encontraron similarmente que la leche de coco dio un
crecimiento de callo significativamente mejorado en explantes de plntulas de menta y
hierbabuena iniciadas por 2,4-D, pero slo mejor ligeramente el crecimiento iniciado por la
auxina 2-BTOA (cido 2-benzotiazoloxiactico) . La presencia de sustancias similares a la
giberelina en la leche de coco tambin ha sido reportada (Radley y Dear, 1958).
Estimulacin e inhibicin subptima. En los casos en que se han determinado
concentraciones ptimas de adyuvantes de crecimiento, se ha encontrado que el nivel de las
mismas o sustancias anlogas en la leche de coco puede ser subptimo. La Motte (1960)
observ que 150 mg / l de tirosina indujo de forma ms efectiva la morfognesis en cultivos de
callos de tabaco, pero la leche de coco aadida al 15% proporcionara slo 0,96 mg / l de esta
sustancia (Tulecke y col., 1961). La leche de coco fresca y autoclavada de nueces maduras ha
demostrado ser inhibidora del crecimiento o morfognesis (Noh et al., 1988) en algunos casos.
No se sabe qu ingredientes causan la inhibicin, pero el crecimiento de embriones cultivados
parece particularmente susceptible de ser prevenido, lo que sugiere que el compuesto
responsable podra ser un factor inductor de latencia natural tal como cido abscsico. Van
Overbeck et al. (1942, 1944) encontraron que un factor estaba presente en la leche de coco
que
Era esencial para el crecimiento de los embriones de Datura stramonium, pero que el
calentamiento de la leche o su reposo podra conducir a la liberacin de sustancias txicas.
stos se pueden eliminar por agitacin con alcoholes o precipitacin con ter o acetato de
plomo. Duhamet y Mentzer (1955) aislaron nueve fracciones de leche de coco por
cromatografa y encontraron que una de ellas era inhibidora de los tejidos de la vescula biliar
de salsifa negra cuando se incorporaba ms de 10-20% de leche de coco en el medio.
Norstog (1965) demostr que la leche de coco autoclavada poda inhibir el crecimiento de
embriones de cebada, pero que la leche esterilizada por filtracin era estimuladora. El agua de
coco inhibi la induccin de embriones somticos en Pinus taeda (Li y Huang, 1996) y tanto la
leche de coco esterilizada en autoclave como la esterilizada por filtracin inhibieron el
crecimiento de los pices de embriones de trigo (Smith, 1967).
CIDOS ORGNICOS
Los cidos orgnicos pueden tener tres funciones en los medios de cultivo de plantas:
Pueden actuar como agentes quelantes, mejorando
Disponibilidad de algunos micronutrientes,
Pueden amortiguar el medio contra el cambio de pH, pueden actuar como nutrientes.
Un efecto beneficioso se limita en gran medida a los cidos
Del ciclo de Krebs. Dougall et al. (1979) encontraron que el succinato, malato o fumarato 20
mM soportaba el crecimiento mximo de las clulas de zanahoria silvestre cuando el medio se
ajust inicialmente a pH 4,5. A pesar de que el glutarato, adipato, pimelato, suberato, azelato o
ftalato 1 mM controlaba el pH del medio, se produjo poco o ningn crecimiento celular.
USO COMO BUFFERS
La adicin de cidos orgnicos a los medios vegetales no es un desarrollo reciente. Varios
autores han encontrado que algunos cidos orgnicos y sus sales de sodio o potasio
estabilizan el pH de las soluciones hidropnicas (Trelease y Trelease, 1933) o medios in vitro
(Van Overbeek et al., 1941, 1942, Arnow et al., 1953) Aunque debe admitirse que no son tan
eficaces como los tampones biolgicos sintticos a este respecto (vase la seccin 5).
Norstog y Smith (1963) descubrieron que 100 mg / l de cido mlico actuaban como un agente
tampn efectivo en su medio para el cultivo de embriones de cebada y tambin parecan
aumentar el crecimiento en presencia de glutamina y alanina. El cido mlico, ahora a 1000
mg / l, se mantuvo en el medio Barley II de Norstog (1973) mejorado. En los experimentos de
Schenk e Hildebrandt (1972), bajos niveles de iones citrato y succinato no impidieron el
crecimiento del callo de una amplia variedad de plantas y parecieron estimulantes en algunas
especies. Los cidos tambin eran tampones eficaces entre pH 5 y pH 6, pero autoclavar un
medio que contena citrato sdico o cido ctrico caus un aumento sustancial del pH.
2.1.1. Complejamiento con metales
Los cidos orgnicos divalentes tales como ctrico, maleico, mlico y malnico (dependiendo
de las especies) se encuentran en la savia del xilema de las plantas, donde junto con los
aminocidos pueden complejarse con iones metlicos y ayudar a su transporte (White et al.,
1981). Estos cidos tambin pueden ser secretados a partir de clulas cultivadas y tejidos en
el medio de crecimiento y contribuirn al efecto acondicionador. Ojima y Ohira (1980)
descubrieron que los cidos mlico y ctrico, liberados en el medio por las clulas de arroz
durante la ltima mitad de un pasaje, fueron capaces de hacer disponible hierro frrico sin
corregir, corrigiendo as una deficiencia de hierro.
2.1.2. Papel nutricional
Como se explica en el captulo 3, la adicin de los cidos orgnicos del ciclo de Krebs al
medio puede mejorar el metabolismo de NH4 +. Gamborg y Shyluk (1970) encontraron que
algunos cidos orgnicos podran promover la utilizacin de amonio y la incorporacin de
pequeas cantidades de piruvato de sodio, cidos ctrico, mlico y fumrico al medio, fue uno
de los factores que permiti a Kao y Michayluk cultivar Vicia hajastana Clulas a baja
densidad. Su mezcla de iones de cidos orgnicos se ha copiado en muchos otros medios
diseados para la cultura de protoplastos. Los cultivos no pueden tolerar la adicin de una
gran cantidad de un cido libre que acidificar el medio. Por ejemplo, el callo de antera
Triticale creci bien en Chu et al. (1975) N6 suplementado con 35 mg / l de una mezcla de
piruvato sdico, cido mlico, cido fumrico, cido ctrico, pero no cuando se aadieron 100
mg / l (Chien y Kao, 1983). Cuando se aaden aniones orgnicos al medio a partir de las sales
de sodio o potasio de un cido, hay cationes metlicos para contrarrestar los aniones
orgnicos y parece ser posible aadir cantidades mayores sin toxicidad. El succinato de
potasio 5 mM (1240 mg / l .3H2O) potenci el crecimiento de embriones de melocotn
cultivados (Ramming, 1990), y aadiendo succinato de sodio 15 mM (4052 mg / 1,4H2O) a
medio MS (al tiempo que aumentaba tambin el contenido de sacarosa de 3% a 6%) aument
el volumen celular y el peso en seco de suspensiones de Brassica nigra en 2,7 veces (Molnar,
1988).
Algunas plantas parecen obtener beneficios nutricionales de la presencia de un cido orgnico
en particular. Murashige y Tucker (1969) mostraron que el zumo de naranja aadido a un
medio que contena sales de MS promova el crecimiento del callo del albedo de Citrus. Los
cidos del ciclo de Malic y de otros Krebs tambin tienen un efecto similar; De estos, el cido
ctrico produce el
Estimulacin pronunciada del crecimiento. Una concentracin de hasta 10,4 mM puede ser
eficaz (Goldschmidt, 1976, Einset, 1978, Erner y Reuveni, 1981). Las plantas suculentas, en
particular las de la familia Crassulaccae, como Bryophyllum y Kalanchoe, fijan cantidades
relativamente grandes de dixido de carbono durante la oscuridad, convirtindolas en cidos
orgnicos, de los cuales el cido mlico es particularmente importante. Los cidos orgnicos
se metabolizan durante las horas diurnas. En tales plantas, se puede esperar que el cido
mlico resulte especialmente eficaz para aumentar el crecimiento si se aade a un medio de
cultivo. Lassocinski (1985) ha demostrado que este es el caso de los cactus deficientes en
clorofila de tres gneros. La adicin de cido L-mlico al medio de Savage et al. (1979)
mejoraron notablemente la tasa de supervivencia y vigor de los pequeos cactus o areolas.
El pretratamiento con cido orgnico (citrato, lactato, succinato, tartrato y oxalato) del callo de
alfalfa redujo drsticamente el crecimiento del callo, pero aument el rendimiento subsiguiente
de embriones somticos y el desarrollo embrionario, as como la conversin a plntulas
(Nichol et al., 1991 ). Sugirieron que los cidos pueden actuar en la seleccin fisiolgica del
callo embriognico, al inducir un crecimiento preferencial de agregados celulares compactos
de crecimiento lento en comparacin con el callo friable de crecimiento ms rpido.
AZUCARES - EFECTOS NUTRICIONALES Y REGULATORIOS
Los carbohidratos juegan un papel importante en cultivos in vitro como una fuente de energa
y carbono, as como un agente osmtico. Adems, se conoce la expresin de genes
modulados con carbohidratos en plantas (Koch, 1996). Las respuestas de los genes de las
plantas al cambio del estado de los carbohidratos pueden variar considerablemente. Algunos
genes son inducidos, otros son reprimidos y otros afectados mnimamente. Como en los
microorganismos, los genes de plantas sensibles al azcar son parte de un antiguo sistema de
ajuste celular a la disponibilidad crtica de nutrientes. Sin embargo, no hay pruebas de que
este papel de los carbohidratos es importante en el crecimiento normal y el desarrollo
organizado en cultivos celulares.3.1. Azcares como fuentes de energa
3.1.1. Autotrofia de carbohidratos.
Slo se han aislado un nmero limitado de lneas celulares de plantas que son autotrficas
cuando se cultivan in vitro. Las clulas autotrficas son capaces de satisfacer plenamente sus
propias necesidades de carbohidratos mediante la asimilacin de dixido de carbono durante
la fotosntesis (Bergmann, 1967, Tandeau de Marsac y Peaud-Lenoel, 1972a, Chandler et al.,
1972, Anon, 1980, Larosa et al. 1981). Muchos cultivos autotrficos slo han sido capaces de
crecimiento relativamente lento (por ejemplo, Fukami y Hildebrandt, 1967), especialmente en
la atmsfera ambiente donde la concentracin de dixido de carbono es baja (vase el
captulo 12). Sin embargo, desde estos primeros ensayos, se estn realizando muy buenos
ensayos con cultivos de fotoautrficos y la micropropagacin fotoautrotrfica es ahora posible
(Kozai, 1991). El xito depende del enriquecimiento de las concentraciones de CO2 en los
vasos durante el fotoperodo, reduciendo o eliminando el azcar del medio y optimizando el
ambiente in vitro.
Sin embargo, para el cultivo normal de clulas, tejidos u rganos, es necesario incorporar una
fuente de carbono en el medio. La sacarosa se usa casi universalmente para propsitos de
micropropagacin ya que es tan generalmente utilizable por cultivos de tejidos. El azcar
blanco refinado blanco es suficientemente puro para la mayora de los propsitos prcticos. La
presencia de sacarosa en medios de cultivo de tejidos inhibe especficamente la formacin de
clorofila y la fotosntesis (ver ms adelante) haciendo que el crecimiento autotrfico sea
menos factible.
ALTERNATIVAS A LA SUCROSE
3.2.1. Otros Azcares.
La seleccin de sacarosa como la fuente de energa ms adecuada para las culturas sigue
muchas comparaciones entre alternativas posibles. Algunos de los primeros trabajos de este
tipo sobre la nutricin de carbohidratos del tejido vegetal fueron realizados por Gautheret
(1945) usando tejido normal de zanahoria. Se encontr que la sacarosa era la mejor fuente de
carbono seguido de glucosa, maltosa y rafinosa; Fructosa era menos eficaz y la manosa y la
lactosa eran las menos adecuadas. Los resultados de este y otros trabajos se resumen en la
Tabla 4.2. La sacarosa casi invariablemente se ha encontrado que es el mejor carbohidrato;
Glucosa generalmente se encuentra para apoyar el crecimiento igualmente bien, y en algunas
plantas puede resultar en mejor en
In vitro que la sacarosa, o promover la organognesis en la que la sacarosa no; Pero siendo
ms costosa que la sacarosa, la glucosa slo ser preferida para la micropropagacin donde
produce resultados claramente ventajosos.
La multiplicacin de Alnus crispa, A. cordata y A. rubra fue mejor en la glucosa, mientras que
la de A. glutinosa fue la mejor en sacarosa (Tremblay y Lalonde, 1984, y Barghchi, 1988). La
formacin de brotes directos a partir de discos de hojas de Capsicum annum en un da de 16
h requiri la presencia de glucosa (Phillips y Hubstenberger, 1985). La glucosa es necesaria
para el cultivo de races aisladas de trigo (Furguson, 1967) y algunas otras monocotiledneas
(Bhojwani y Razdan, 1983). Algunos otros monosacridos tales como arabinosa y xilosa;
Disacridos tales como celobiosa, maltosa y trehalosa; Y algunos polisacridos; Todos ellos
capaces de descomponerse en glucosa y fructosa (tabla 4.2), tambin pueden usarse algunas
veces como reemplazos parciales de sacarosa (Straus y LaRue, 1954, Sievert y Hildebrandt,
1965, Yatazawa et al., 1967, Smith y Stone, 1973, Minocha y Halperin, 1974, Zaghmout y
Torres, 1985). En el callo de Phaseolus, Jeffs y Northcote (1967) encontraron que la sacarosa
podra ser reemplazada por maltosa y trehalosa (los tres azcares tienen un radical alfa-
glucosilo en el extremo no reductor), pero no por la glucosa o la fructosa sola o
En combinacin, o por varios otros azcares diferentes. Se ha dicho que la galactosa es txica
para la mayora de los tejidos vegetales; Inhibe el crecimiento de orqudeas y otras plantas en
concentraciones tan bajas como 0,01% (0,9 mM) (Ernst et al., 1971, Arditti y Ernst, 1984). Sin
embargo, las clulas pueden adaptarse y crecer en galactosa, por ejemplo, clulas de caa de
azcar (Maretzski y Thom, 1978). La clave fue la induccin de la enzima galactosa quinasa,
que convierte galactosa en galactosa-1-fosfato. Ms recientemente, han aparecido otros
informes sobre el uso de galactosa. Promovi el crecimiento del callo en rosa rugosa, pero
inhibi la embriognesis somtica (Kunitake et al., 1993).
La galactosa promovi etapas tempranas de maduracin del embrin somtico en el abeto
plateado europeo (Schuller y Reuther, 1993). Cuando se us en lugar de sacarosa, mejor el
enraizamiento de Annona squamosa microshoots (Lemos y Blake, 1996). Adems, se ha
encontrado que la galactosa reduce o supera la hiperhidricidad en cultivos de brotes (Druart,
1988, vase el volumen 2). Tambin se ha informado que la fructosa es eficaz para prevenir la
hiperhidricidad (Rugini et al., 1987).
Hay algunas situaciones en las que la fructosa apoya el crecimiento tan bien como la sacarosa
o la glucosa (Steffen et al., 1988) y ocasionalmente da mejores resultados. Se ha reportado
que algunas especies de orqudeas crecen mejor con fructosa que con glucosa (Ernst, 1967,
Ernst et al., 1971, Arditti, 1979). La fructosa fue el mejor azcar para la produccin de brotes
adventicios de los ndulos cotilednicos de Glycine max, especialmente si la concentracin de
sales nutritivas suministradas era inadecuada (Wright et al., 1986). Se estimul el crecimiento
de brotes y hojas y la formacin de brotes axilares en cultivos de brotes de Castanea cuando
la sacarosa se sustituy por 30 g / l de fructosa. El crecimiento del callo basal se redujo y se
pudo propagar a partir de explantes maduros de C. crenata, aunque esto no fue posible en el
mismo medio suplementado con sacarosa (Chauvin y Salesses, 1988). Sin embargo, se
inform que la fructosa era txica para el tejido de zanahoria si, como nica fuente de
carbono, se autoclav con medio de White (1943a) A. Cuando se esteriliz por filtracin, la
fructosa soport el crecimiento de cultivos de callo que tenan un peso final del 70% de los
cultivados en sacarosa (Pollard et al., 1961).
La sacarosa en los medios de cultivo se hidroliza generalmente total o parcialmente en los
componentes monosacridos glucosa y fructosa (vase ms adelante), por lo que es lgico
comparar la eficacia de las combinaciones de estos dos azcares con los de la sacarosa.
Kromer y Kukulczanka (1985) encontraron que las puntas meristemticas de Canna indica
sobrevivieron mejor con una mezcla de 25 g / l de glucosa ms 5 g / l de fructosa que con 30 g
/ l de sacarosa. La germinacin de las semillas de orqudeas Paphiopedilum fue mejor en un
medio que contena 5 g / l de fructosa ms 5 g / l de glucosa; Una mezcla de 7,5 g / l de cada
azcar era ptima para el crecimiento adicional de las plntulas (Pierik et al., 1988). A pesar
de su rpida hidrlisis a glucosa y fructosa, la sacarosa parece tener un efecto estimulante
especfico sobre el desarrollo del embrin en el abeto Douglas, lo que no se observ cuando
fue reemplazado por los monosacridos (Taber et al., 1998).
La superioridad general de la sacarosa sobre la glucosa para el cultivo de tejidos vegetales
organizados, como las races aisladas, puede deberse a la mayor
La translocacin efectiva de la sacarosa a meristemas apicales (Butcher and Street, 1964).
Adems, podra haber un efecto osmtico, porque, a partir de un peso igual de compuesto,
una solucin de glucosa tiene casi el doble de la molaridad de una solucin de sacarosa, y
as, en ausencia de inversin del disacrido, inducir un resultado ms negativo Potencial de
agua (ver abajo).
Maltosa. Las especies de plantas varan en su capacidad de utilizar azcares inusuales. Por
ejemplo, aunque Gautheret (1945) pudo cultivar callos de zanahoria sobre la maltosa, Mathes
et al. (1973) obtuvieron un crecimiento mnimo de tejido de Acer en medios suplementados
con este azcar. De forma similar, el crecimiento del tejido de soja sobre la maltosa es
normalmente muy lento, pero se han seleccionado cepas variantes de clulas que pueden
utilizarlas (Limberg et al., 1979), tal vez porque los nuevos genotipos posean una capacidad
mejorada para su transporte activo. Estudios posteriores han dado un papel ms prominente a
la maltosa como componente de los medios de cultivo de tejidos. La maltosa sirve tanto como
una fuente de carbono como como un osmoticum. En comparacin con la sacarosa, hay una
tasa ms lenta de hidrlisis extracelular, se absorbe ms lentamente y se hidroliza
intracelularmente ms lentamente. La maltosa condujo a un aumento sustancial en los
embriones somticos de las anteras de Petunia (Raquin, 1983). Tambin condujo a un
aumento en la induccin de callo y la regeneracin de plntulas durante la andrognesis in
vitro de triticale hexaploide de invierno y trigo (Karsai et al., 1994). La maltosa tambin
aument la induccin del callo en el cultivo de microsporas de arroz, con una aceleracin de
las divisiones celulares iniciales (Xie et al., 1995). Para el cultivo de microesporas de cebada,
la inclusin de maltosa condujo a una mayor frecuencia de plantas verdes (Finnie et al., 1989).
Se ha reportado que la maltosa iguala o sobrepasa la sacarosa en el apoyo a la
embriognesis en varias especies, incluyendo la zanahoria (Verna y Dougall, 1977; Kinnersley
y Henderson, 1988), alfalfa (Strickland et al., 1987), cereza silvestre (Reidiboym-Talleux Et al.,
1999), Malus (Daigny et al., 1996), Abies (Norgaard 1997) y pino loblolly (Li et al., 1998). El
nmero de plantas regeneradas a partir de las variedades indica (Biswas y Zapata, 1993) y
japonica (Jain et al., 1997) tambin fue mayor cuando se cultivaron protoplastos con maltosa
en lugar de sacarosa.
La transferencia de un medio que contiene sacarosa o glucosa a uno suplementado con
maltosa ha sido utilizada por Stuart et al. (1986) y Redenbaugh et al. (1987) para mejorar la
conversin de embriones de alfalfa. De manera similar, la maltosa condujo a una tasa de
germinacin mucho ms alta de los embriones somticos de esprragos que la sacarosa
(Kunitake et al., 1997).
lactosa. El disacrido lactosa se ha detectado en slo unas pocas plantas. Cuando se aade a
medios de cultivo de tejidos, se ha encontrado que inducen la actividad de la enzima -
galactosidasa que puede segregarse en el medio. La hidrlisis de lactosa a galactosa y
glucosa permite entonces el crecimiento de callos de Nemesia strumosa y Petunia hybrida,
suspensiones de pepino (Hess et al., 1979, Callebaut y Motte, 1988), callos de algodn y
suspensiones de clulas (Mitchell et al., 1980) , Y el callo japons de la gloria de la maana
(Hisajima y Thorpe, 1981). La clave para la utilizacin de la lactosa en la gloria matinal
japonesa no fue slo la hidrlisis extracelular de este disacrido, sino la induccin de
galactosa quinasa, que impidi la acumulacin de galactosa txica (Hisajima y Thorpe, 1985).
Rodrguez y Lorenzo Martin (1987) encontraron que la adicin de 30 g / l de lactosa al medio
MS en lugar de sacarosa aument el nmero de brotes producidos por un cultivo de brotes de
Musa accuminata, pero no se produjeron nuevos brotes en la subcultura subsiguiente,
presente.
Adems de la lactosa, se ha demostrado que las clulas vegetales se adaptan y luego crecen
sobre otros oligosacridos que contienen galactosa, incluyendo melibiose (Ritchie et al.,
1981), rafinosa (Wright y Northcote, 1972, Thorpe Y Laishley, 1974, Gross et al., 1981) y
estaquiosis (Verma y Dougall, 1977, Gross et al., 1981).
Jarabes de maz Kinnersley y Henderson (1988) han demostrado que ciertos jarabes de maz
pueden utilizarse como fuentes de carbono en los medios de cultivo de plantas y que pueden
inducir morfognesis que no se provoca mediante la suplementacin con sacarosa. Se indujo
embriognesis en una lnea celular no embriognica de 10 aos de Daucus carota y se
obtuvieron plntulas de anteras de Nicotiana tabacum utilizando jarabes. Los utilizados
contenan una mezcla de glucosa, maltosa, maltotriosa y polisacridos superiores. Su efecto
estimulante fue reproducido por mezclas de maltosa y glucosa.
3.2.2. Alcoholes de azcar.
Se pens que los alcoholes de azcar no eran usualmente metabolizados por los tejidos
vegetales y por lo tanto no estaban disponibles como fuentes de carbono. Por esta razn, el
manitol y el sorbitol se han empleado con frecuencia como osmtica para modificar el
potencial hdrico de un medio de cultivo. En estas circunstancias, tambin debe estar presente
suficiente sacarosa para satisfacer la demanda energtica de los tejidos. Aadir manitol o
sorbitol al medio puede hacer que el boro no est disponible (vase el captulo 3).
Se encontr que el manitol era metabolizado por los tejidos de Fraxinus (Wolter y Skoog,
1966). Posteriormente, los estudios con suspensiones de zanahoria y tabaco y cultivos de
cotiledn de pino radiata mostraron que aunque el manitol se absorba muy lentamente, se
metabolizaba fcilmente (Thompson et al., 1986). Por lo tanto, este alcohol de azcar es slo
de valor como agente osmtico a corto plazo. En contraste, el sorbitol se absorbe fcilmente y
se metaboliza en algunas especies. Se ha encontrado que el crecimiento de callos de
manzana (Chong y Taper, 1972, 1974a, b) y el de otras plantas rosceas (Coffin et al., 1976),
ocasionan ocasionalmente un crecimiento ms vigoroso que el que se puede obtener en
sacarosa . La capacidad de Rosaceae para utilizar sorbitol como una fuente de carbono se
informa que es dependiente de la variedad. Albrecht (1986) encontr que los cultivos de brotes
de una variedad de crabapple requeran sorbitol para crecer y no creceran en sacarosa; Otro
se benefici de ser cultivado sobre una mezcla de sorbitol y sacarosa y el crecimiento de una
tercera sufri si alguna sacarosa fue reemplazada por sorbitol. El patrn de manzana 'Ottawa
3' produjo brotes anormales en sorbitol (Chong y Pua, 1985). La evidencia se est
acumulando para demostrar que los alcoholes de azcar generalmente exhiben papeles no
osmticos en la regulacin de la morfognesis y metabolismo en plantas que no producen
polioles como productos fotosintticos primarios (Steinitz, 1999). Adems de ser
metabolizados en grados variables en cultivos heterotrficos, tales como tabaco, maz, arroz,
ctricos y chichory, los alcoholes de azcar estimulan respuestas moleculares y fisiolgicas
especficas, donde aparentemente actan como seales qumicas.
El alcohol hexahdrico cclico mio-inositol no parece proporcionar una fuente de energa (Smith
y Stone, 1973) y su efecto beneficioso sobre el crecimiento de tejidos cultivados cuando se
utiliza como nutriente complementario debe depender de su participacin en vas biosintticas
(ver vitaminas encima).
Almidn.
Las clulas cultivadas de unas pocas plantas son capaces de utilizar almidn en el medio de
crecimiento y parecen hacerlo mediante la liberacin de amilasas extracelulares (Nickell y
Burkholder, 1950). Las velocidades de crecimiento de estos cultivos se incrementan mediante
la adicin de cido giberlico, probablemente porque aumenta la sntesis o secrecin de
enzimas amilasa (Maretzki et al., 1971, 1974).
3.3. HIDROLISIS DE SACROSE.
El resto de esta seccin sobre los azcares se dedica a los efectos aparentes de la
concentracin de sacarosa en la diferenciacin celular y la morfognesis. Los informes sobre
el tema deben ser templados con el conocimiento de que parte o la totalidad de la sacarosa en
el medio es susceptible de desglosarse en sus azcares de hexosa constituyentes y que dicha
inversin tambin ocurrir dentro de los tejidos de las plantas, donde la reduccin de los
niveles de azcar de al menos Es probable que ocurra un 0,5% (Helgeson et al., 1972).
3.3.1. Autoclave.
Durante el autoclave de los medios de comunicacin (Ball, 1953, Wolter y Skoog, 1966), se
produce una hidrlisis parcial de la sacarosa, siendo mayor cuando el compuesto se disuelve
junto con otros constituyentes del medio que cuando se somete a autoclave en solucin
acuosa pura (Ferguson et al ., 1958). En un medio fngico, no dismil a un medio de cultivo
vegetal, Bretzloff (1954) encontr que la inversin de sacarosa durante el autoclave (15 min a
15 lbs / in2) dependa del pH de la siguiente manera:
PH 3,0 100%
PH 3,4 75%
PH 3,8 40%
PH 4,2 25%
PH 4,7 12,5%
PH 5,0 10%
PH 6,0 0%
Estos resultados sugieren que la proporcin de
La sacarosa hidrolizada por medio de autoclave a niveles de pH convencionales (5,5-5,8)
debe ser despreciable. La mayora de las pruebas sugieren que este no es el caso y que el
10-15% de sacarosa se puede convertir en glucosa y fructosa. Los cultivos de algunas plantas
crecen mejor en medios que contienen sacarosa esterilizada en autoclave (Ball, 1953, Guha y
Johri, 1966, Johri y Guha, 1963, Verma y Van Huystee, 1971, White, 1932), lo que sugiere que
las clulas Se benefician de la disponibilidad de glucosa y / o fructosa. Sin embargo, Nitsch y
Nitsch (1956) observaron que la glucosa slo apoyaba el crecimiento del callo de Helianthus si
se haba autoclavado, y Romberger y Tabor (1971) que el crecimiento de los pices de Picea
era menor cuando el medio contena sacarosa autoclavada separadamente en agua. O
sacarosa esterilizada en autoclave con slo los constituyentes orgnicos del medio) que
cuando todos los constituyentes haban sido sometidos a autoclave juntos. Sugirieron que una
sustancia estimulante podra ser liberada cuando los azcares se autoclavan con agar.
En otras especies no ha habido diferencia entre el crecimiento de los cultivos suministrados
con sacarosa esterilizada en autoclave o filtrada (Mathes et al., 1973) o el crecimiento ha sido
menor en un medio que contiene sacarosa esterilizada con filtro autoclavado (Stehsel y
Caplin, 1969) .
3.3.2. Disminucin enzimtica.
La sacarosa en el medio tambin se invierte en monosacridos durante el cultivo in vitro de
material vegetal. Esto ocurre por la accin de la invertasa localizada en las paredes celulares
de las plantas (Burstrom, 1957, Yoshida et al., 1973) o por la liberacin de enzima extracelular
(King y Street, 1977). En la mayora de las culturas, la inversin de sacarosa en glucosa y
fructosa tiene lugar en el medio; Pero, debido a que la secrecin de enzimas invertasas vara,
el grado en que se produce difiere de un tipo de planta a otro. Despus de 28 das en un
medio que contena 3 o 4% de sacarosa, los explantes individuales de Hemerocallis y
Delphinium haban usado 20-30% del azcar. De lo que quedaba en el medio que haba
soportado Hemerocallis, aproximadamente el 45% era sacarosa, mientras que slo el 5% era
sacarosa en los medios en los que se haba cultivado Delphinium. En ambos casos el resto de
la sacarosa se haba invertido (Lumsden et al., 1990).
La capacidad de inversin de sacarosa de cultivos de raz de tomate fue mayor en medios de
pH 3,6-4,7. La actividad disminuy bruscamente en medios menos cidos (Weston y Street,
1968). Helgeson et al. (1972) encontraron que la omisin de IAA auxina del medio en el que
se cultiv callo del tabaco, provoc un marcado aumento del azcar reductor debido a la
hidrlisis progresiva de la sacarosa, tanto en el medio como en el tejido. Un aumento temporal
en los azcares reductores tambin ocurri al final de la fase de retraso cuando las piezas de
callo recin transferidas comenzaron a crecer rpidamente. Es interesante observar que la
invertasa de la pared celular posee actividad cataltica in situ, independientemente de que se
haya cultivado o no tejido de tabaco en sacarosa (Obata-Sasamoto y Thorpe, 1983).
En cultivos de algunas especies, la absorcin de azcar puede depender de la anterior
hidrlisis extracelular de azcar.
Este es el caso de la caa de azcar (Komor et al., 1981); Y posiblemente tambin en
orqudeas de Dendrobium (Hew et al., 1988) y zanahoria (Kanabus et al., 1986). Casi toda la
sacarosa en cultivos en suspensin de caa de azcar y remolacha azucarera se hidroliz en
3 das (Zamski y Wyse, 1985) y se ha informado que las suspensiones de Daucus carota
hidrolizan toda la sacarosa en el medio (Thorpe, 1982) en las hexosas constitutivas Dentro de
3 das (Kanabus et al., 1986) o dentro de 24 h (Dijkema et al., 1990). Sin embargo, la mayora
de las especies pueden tomar sacarosa directamente como se demostr mediante estudios
con 14C-sacarosa asimtrica (Parr y Edelman, 1975), y metabolizarla intracelularmente.
Dentro de la clula, la invertasa soluble, la fosfato sintetasa de sacarosa y la sacarosa
sintetasa sirven para hidrolizar sacarosa (Thorpe, 1982). Por lo tanto, en Acer (Copping y
Street, 1972), la actividad de la invertasa soluble era paralela a la velocidad de crecimiento,
mientras que en el tabaco (Thorpe y Meier, 1973) y la gloria matinal japonesa (Hisajima et al.,
1978) la sacarosa sintetasa era ms importante. En la ltima especie, el cambio en la
actividad de la sacarosa sintetasa fue mayor que el de la sacarosa fosfato sintetasa, una
enzima no extensamente examinada en clulas cultivadas.
El crecimiento de los brotes de los brotes no latentes de la morera no es promovido por la
sacarosa, slo por la maltosa, la glucosa o la fructosa. Aunque el tejido de mora hidroliz la
sacarosa en monosacridos componentes, no se desarrollaron brotes. En presencia de
fructosa al 3%, la sacarosa era realmente inhibitoria para disparar el desarrollo a
concentraciones tan bajas como 0,2% (Oka y Ohyama, 1982).
3.4. CONSUMO.
La captacin de molculas de azcar en los tejidos vegetales parece estar en parte a travs
de permeacin pasiva y en parte a travs del transporte activo. El alcance de los dos
mecanismos puede variar. La absorcin activa se asocia con la retirada de los protones (H +)
del medio. La compensacin de carga se efecta por la excrecin de un catin (H + o K +)
(Komor et al., 1977, 1981). La glucosa se tom preferentemente por suspensiones de
zanahoria durante los primeros 7 das de un paso de 14 das; Fructosa seguido durante los
das 7 - 9 (Dijkema et al., 1990). A concentraciones por debajo de 200 mM, la glucosa se
absorbi ms rpidamente en discos de fruta de fresa y protoplastos que la sacarosa o la
fructosa (Scott y Breen, 1988).
3.5. CONCENTRACIONES EFECTIVAS.
En la mayora de las comparaciones entre las capacidades nutricionales de los azcares
discutidas anteriormente, el criterio de excelencia ha sido el crecimiento ms rpido de callos
no organizados o clulas cultivadas en suspensin. Para este propsito, la sacarosa al 2% al
4% suele ser ptima. Concentraciones similares tambin se usan en los medios empleados
para la micropropagacin, pero los laboratorios probablemente prestan poca atencin a los
efectos de la sacarosa sobre la morfognesis (ver ms adelante) y el desarrollo de plntulas.
Los niveles de sacarosa en medios de cultivo que dan lugar a un buen crecimiento del callo
pueden no ser ptimos para la morfognesis, y niveles ms bajos o ms altos pueden ser ms
eficaces.
La concentracin ptima de sacarosa para inducir la morfognesis o el crecimiento difiere
entre los diferentes genotipos, a veces incluso entre los que estn estrechamente
relacionados. Por ejemplo, Damiano et al. (1987) encontraron que la concentracin de
sacarosa necesaria para
Producen la mejor tasa de proliferacin de brotes en cultivos de brotes de Eucalyptus gunnii
variados entre clones. La influencia de la concentracin de sacarosa en la formacin directa
de brotes de los explantes de crisantemo vari con el cultivar de la planta (Fig. 4.1).
Experimentos de Molnar (1988) han demostrado que el nivel ptimo de sacarosa puede
depender de las otras enmiendas aadidas a un medio de cultivo. El crecimiento ms rpido
de suspensiones de Brassica nigra en una que contena sales MS (pero menos hierro y
vitaminas B5) se produjo cuando se aadi 2% de sacarosa. Sin embargo, cuando se
suplement con 1-4 g / l de hidrolizado de casena o una mezcla de 3 aminocidos definidos,
el crecimiento se increment en hasta 6% de sacarosa. Se obtuvo un resultado similar si, en
lugar de los aminocidos, se aadi succinato sdico 15 mM. Hubo un perodo de crecimiento
prolongado y el peso seco recogido del cultivo fue 2,8 veces el del medio original con 2% de
sacarosa.
El nivel de sacarosa en el medio puede tener un efecto directo sobre el tipo de morfognesis.
As, la sacarosa (87 mM) favoreci la organognesis, mientras que un nivel ms alto (350 mM)
favoreci la embriognesis somtica de embriones zigticos inmaduros de girasol (Jeannin et
al., 1995). Minicrowns in vitro de los esprragos desarrollaron races de almacenamiento
cortas, espesadas a altas frecuencias cuando la concentracin de sacarosa en el medio se
aument a 6% (Conner y Falloon, 1993). Menores concentraciones de sacarosa, incluso con
la adicin de carbohidratos no metabolizados o mal metabolizados, como celobiosa, maltosa,
manosa, melibiose y sorbitol produjeron finas races fibrosas, lo que indica que la sacarosa
adicional era nutricional en lugar de osmtica.
La tasa de respiracin de los tejidos vegetales cultivados aumenta a medida que aumenta la
concentracin de sacarosa o glucosa aadida. En el callo de trigo, se encontr que alcanz un
mximo cuando se aadi 90 g / l (0,263 M) al medio, aunque 20 g / l produjeron la mayor
tasa de crecimiento y el nmero de brotes adventicios (Galiba y Erdei, 1986) . La absorcin de
iones inorgnicos puede depender de la concentracin de azcar y el beneficio de agregar
cantidades incrementadas de nutrientes a un medio puede no ser aparente a menos que la
cantidad de azcar se incremente al mismo tiempo (Gamborg et al., 1974).
3.5.1. Diferenciacin celular
Formacin de elementos vasculares. Aunque los azcares estn claramente implicados en la
diferenciacin de elementos de xilema y floema en clulas cultivadas, todava es incierto si
tienen un papel regulador aparte de proporcionar una fuente de energa de carbono necesaria
para el metabolismo celular activo. Generalmente se requiere que la sacarosa est presente
adems de IAA antes de que los elementos traquedicos se diferencien en cultivos de tejidos.
El nmero de elementos de tamiz y xilema formados [y posiblemente la proporcin de cada
tipo - Wetmore y Rier (1963); Rier y Beslow (1967)] depende de la concentracin de sacarosa
(Aloni, 1980). En las rebanadas de tubrculos de Helianthus tuberosus, aunque la sacarosa, la
glucosa y la trehalosa fueron las mejores para apoyar la divisin celular y la formacin de
traqueida, la maltosa fue slo una fuente de carbono moderadamente eficaz (Minocha y
Halperin,
1974). Shininger (1979) ha concluido que slo los hidratos de carbono que permiten una
divisin celular significativa son capaces de promover la formacin de elementos traqueales.
La aparicin de lignina en clulas cultivadas no se asocia invariablemente con paredes de
clulas espesadas. Los cultivos de suspensin de sicmoro produjeron grandes cantidades de
lignina cuando se cultivaron en un medio con sacarosa anormalmente alta (ms del 6%) y
niveles de 2,4-D. Se deposit dentro de las clulas y se liber en el medio (Carceller et al.,
1971).
Formacin de clorofila. Los niveles de sacarosa normalmente utilizados para soportar el
crecimiento de cultivos de tejidos son a menudo inhibidores de la sntesis de clorofila (Rier y
Chen, 1964, Edelman y Hanson, 1972), pero el grado de inhibicin vara segn las especies
de plantas de las que se deriv el tejido . En experimentos de Hildebrandt et al. (1963) y
Fukami y Hildebrandt (1967), por ejemplo, la zanahoria y el callo rosa tenan un alto contenido
de clorofila en Hildebrandt et al. (1946) medio de tabaco con 2-8% de sacarosa; Pero el tejido
de endivia, lechuga y espinaca slo produjo grandes cantidades de pigmento en un medio sin
sacarosa aadida (aunque una pequea cantidad de azcar fue suministrada probablemente
por 15-16% de leche de coco).
Las protocormas de Cymbidium contienen altos niveles de clorofila solamente si se cultivan en
medios que contienen 0,2-0,5% de sacarosa. Su grado de ecologizacin disminuye
rpidamente cuando se cultivan en concentraciones de sacarosa superiores a esta
(Vansveren-Van Espen, 1973). Del mismo modo, orqudea protocorm-como los cuerpos no
se convertir en verde y no puede convertirse en plntulas si la sacarosa est presente en el
medio ms all de la etapa de su diferenciacin de los explantes. Cuando la sacarosa aadida
reduce la formacin de clorofila, se cree que la sntesis del cido 5-aminolaevulnico (ALA -un
precursor de las molculas de porfirina de la que est compuesta la clorofila) se reduce debido
a una inhibicin de la actividad de la enzima ALA sintasa (Pamplin Y Chapman, 1975). Los
azcares aparte de la sacarosa no son inhibidores (Edelman y Hanson, 1972, El Hinnawiy,
1974). Se ha dicho que las clulas cultivadas en sacarosa durante perodos prolongados
pueden perder permanentemente la capacidad de sintetizar clorofila (Van Huystee, 1977). Los
plastidios se convierten en amiloplastos envasados con almidn y esto puede cambiar la
expresin del ADN del plstido (Gunning y Steer, 1975) o dar como resultado una reduccin
del ARN plastidio (Rosner et al., 1977).
Una pequea cantidad de fotosntesis puede ser llevada a cabo por brotes cultivados siempre
que no se mantengan en medios que contienen una alta concentracin de sacarosa. La
fotosntesis aument en los cultivos de brotes de Rosa cuando se cultivaron inicialmente en 20
o 40 g / l de sacarosa que se redujo a 10 g / l en subculturas sucesivas (Langford y
Wainwright, 1987). Un aumento de la fotosntesis se produce cuando la sacarosa se omite del
medio en el que las plntulas enraizadas crecen (Short et al., 1987), pero estos tratamientos
no logran asegurar una mayor supervivencia de las plntulas cuando se transfieren extra
vitrum. Un estudio ms reciente tambin mostr la contribucin relativa del metabolismo de
carbono autotrfico y heterotrfico en plantas de papa cultivadas (Wolf et al., 1998). Con un
8% de sacarosa en el medio, el 90% del carbono del tejido era de origen heterotrfico en
plantas de cultivo ligero; Mientras que en sacarosa al 3%, slo el 50% era de origen
heterotrfico.
ACUMULACION Y MORFOGENESIS
3.6.1. Depsito de almidn anterior a la morfognesis.
Las clulas de callos y cultivos en suspensin comnmente acumulan almidn en sus
plastidios y es particularmente prevalente en las clulas en la fase estacionaria. El almidn en
clulas de suspensiones de arroz tena propiedades qumicas diferentes a las del endospermo
de semillas (Landry y Smyth, 1988). Murashige y colaboradores (Murashige y Nakano, 1968,
Thorpe y Murashige, 1968a, b) observaron que el almidn se acumulaba preferentemente en
las clulas situadas donde se formaban finalmente los primordios de los brotes. El almidn se
produce a partir de sacarosa suministrada en el medio de cultivo (Thorpe et al., 1986). Como
resultado de este trabajo, se sugiri que la acumulacin de almidn podra ser un requisito
previo de la morfognesis. En el tabaco, el almidn presumiblemente acta como una reserva
celular directa de la energa requerida para la morfognesis, ya que desaparece rpidamente
cuando se forman meristenoides y primordios de los brotes (Thorpe y Meier, 1974, 1975). La
morfognesis es un
El proceso que exige energa y el callo mantenido en un medio inductor de brotes tiene una
tasa de respiracin mayor que el tejido similar mantenido en un medio no inductivo (Thorpe y
Murier, 1970; Thorpe y Meier, 1972). Se ha encontrado que el callo de formacin de rganos
del tabaco acumula almidn antes de la formacin de brotes o races, mientras que el callo no
capaz de morfognesis no lo hizo (Kavi Kishor y Mehta, 1982).
3.6.2. Morfognesis sin depsito de almidn
Las clulas de otras plantas que se comprometen a iniciar los rganos no acumulan
necesariamente almidn como preliminar a la morfognesis y parece probable que la
aparicin de este fenmeno est relacionada con las especies. La deposicin de almidn se
observ como una manifestacin temprana de la organognesis en los embriones de Pinus
coulteri (Patel y Berlyn, 1983), pero no en los de Picea abies (Von Arnold, 1987). Aunque los
embriones zigticos de esta ltima especie comenzaron inmediatamente a acumular almidn
(particularmente en los cloroplastos de las clulas de la corteza) cuando se colocaron en un
medio que contena sacarosa. Nunca se observ en las clulas meristemticas de la cual se
desarrollaron brotes adventicios (Von Arnold, 1987). Sin embargo, si un papel importante para
la acumulacin de almidn antes del inicio del desarrollo organizado es para la produccin de
energa, este papel sera satisfecho por las reservas de lpidos en embriones zigticos de
conferas (Thorpe, 1982). De hecho, la degradacin rpida y casi lineal de triglicridos durante
el perodo de alta respiracin durante la iniciacin de brotes en cotiledones extirpados de pino
radiata (Biondi y Thorpe, 1982, Douglas et al., 1982) apoyara esta opinin.
Los centros meristemticos en las escalas de bulbo de Nerine bowdenii pueden ser
detectados como grupos de clulas de las cuales el almidn est ausente (Grootaarts et al.,
1981). El almidn no se acumul en el callo caulognico de Rosa persica x R. xanthina
iniciado a partir de cultivos de brotes recin iniciados, pero las clulas acumulaban almidn
cuando la capacidad de formacin de brotes del callo se perda despus de ms de tres
pasadas (Lloyd et al., 1988) . Se observ que el callo derivado de embriones de cebada
acumulaba almidn muy rpidamente y esto se acompaaba de una reduccin de la presin
osmtica dentro de las clulas (Granatek y Cockerline, 1978). El cido giberlico, que en esta
planta podra utilizarse para inducir la formacin de brotes, provoc un aumento de la
osmolaridad celular. Existen otros ejemplos en los que una disminucin de la cantidad de
carbohidrato almacenado en tejidos cultivados ha restablecido o mejorado su capacidad
organognica. Se indujo una lnea tolerante a la sal de clulas de alfalfa que no mostr
capacidad para la regeneracin del brote despus de tres aos y medio de cultivo en sacarosa
al 3% para formar brotes y plntulas cultivndose durante un paso de 24 das con sacarosa al
1% antes de ser Volvi a un medio que contena sacarosa al 3% y un alto nivel de 2,4-D
(Rains et al., 1980, y comunicacin personal). Las clulas que en sacarosa al 3% estaban
llenas de almidn se convirtieron en almidn-agotadas durante el cultivo a un nivel ms bajo
de sacarosa. El nmero de embriones somticos formados por callos anaranjados "Shamouti"
embriognicos aument cuando se omiti sacarosa del medio para un pasaje, antes de ser
devuelto al medio Murashige y Tucker (1969) con 5-6% de sacarosa (Kochba y Button, 1974 ).
3.6.3. Azcares inusuales
En algunas plantas, los azcares inusuales son capaces de regular la morfognesis y la
diferenciacin. La galactosa estimula la embriognesis en cultivos de ctricos (Kochba et al.,
1978) y puede mejorar la maduracin de los embriones de alfalfa. El callo de Cucumis sativus
creci ms rpidamente en la rafinosa y fue capaz de formar races cuando creci en este
azcar; Los embriones somticos slo se diferenciaron cuando el callo fue cultivado en
sacarosa (88-175 mM), pero si se aadi una pequea cantidad de estaquiosa (0,3 mM) a 88
mM de sacarosa, el callo produjo brotes adventicios en su lugar (Kim y Janick, 1989).
Stachyose es el carbohidrato translocated importante en cucurbitceas.
EFECTO OSMTICO DE LOS INGREDIENTES DE LOS MEDIOS
Adems de tener un efecto puramente nutritivo, las soluciones de sales inorgnicas y
azcares, que componen los medios de cultivo de tejidos, influyen en el crecimiento de las
clulas vegetales a travs de sus propiedades osmticas. Una discusin se acomoda ms
convenientemente en este punto, ya que muchos de los artculos publicados sobre el tema
enfatizan los efectos osmticos de los azcares aadidos. POTENCIALES SCTICOS Y
AGUA: UNA INTRODUCCIN GENERAL
El movimiento de agua dentro y fuera de una clula vegetal se rige por las concentraciones
relativas de sustancias disueltas en las soluciones externas e internas, y por la presin
ejercida por su pared celular de contencin. La manera de definir las fuerzas respectivas ha
cambiado en los ltimos aos, y como la terminologa vieja y nueva se encuentran en la
literatura de cultivo de tejidos, la siguiente breve descripcin puede ayudar al lector. Se
pueden encontrar explicaciones ms detalladas en muchos libros de texto sobre fisiologa
vegetal.
En el concepto ms antiguo, se consider que las clulas absorban agua por succin (es
decir, ejerciendo una presin negativa) inducida por la concentracin osmticamente activa de
sustancias disueltas dentro de la clula. La fuerza de succin o presin de succin (SP) se
defini como la resultante de la presin osmtica de la savia celular (OPcs) menos la presin
osmtica de la solucin externa (OPext) y la presin ejercida sobre la pared celular Presin
(TP) - llamada as porque est en un mximo cuando las clulas son turgentes. Esto puede
ser representado por las ecuaciones:
SP = (OPcs - OPext) - TP o SP = OPcs - (OPext + TP).
Estas definiciones ideadas por los botnicos, no son termodinmicamente satisfactorias
porque el agua debe considerarse para moverse abajo de un gradiente de la energa,
perdiendo energa mientras que hace tan. El trmino potencial de agua ( - letra mayscula
griega psi) se utiliza ahora, y se dice que las soluciones de compuestos en el agua ejercen un
potencial osmtico. Como el potencial del agua pura se define como cero, y las sustancias
disueltas hacen que se reduzca, las soluciones tienen potenciales osmticos, s (o - letra
pequea griega pi) que tienen un valor negativo. Se dice que el agua se mueve de una regin
de alto potencial (que tiene un valor menos negativo) a uno que es ms bajo (teniendo un
valor ms negativo). Tanto la presin osmtica como el potencial osmtico se usan como
trminos en la literatura de cultivo de tejidos y son equivalentes excepto que son opuestos en
signo (es decir, un OP de +6 bar equivale a s de -6 bar). Termodinmicamente, la presin de
la turgencia de la clula se define como un potencial de presin positiva (p). El potencial de
agua de una clula (clula) es entonces igual a la suma de sus potenciales osmticos y de
presin ms la fuerza que contiene el agua en los microcapilares o est unida a la matriz de la
pared celular (m):
clula = s + p + m
Las afirmaciones modernas del concepto de presin de succin ms antiguo son, por lo tanto,
que la diferencia en el potencial de agua (es decir, la direccin del movimiento del agua) entre
una celda y una solucin en el exterior est dada por:
= (sinside clula - soutside clula) - p o = clula - outside
Y cuando = 0 (en el equilibrio) outside = clula
La fuerza del movimiento del agua entre dos clulas, "A" y "B", de potencial de agua diferente,
est dada por:
= cellA - cellB
Siendo la direccin del movimiento hacia el potencial de agua ms negativo.
El potencial osmtico (presin) de las soluciones se determina por su concentracin molar y
por temperatura. El potencial hdrico de un medio de cultivo de tejidos vegetales (tcm) es
equivalente al potencial osmtico de los compuestos disueltos (s). No hay potencial de
presin, pero si se aaden sustancias como el agar y el Gelrite aportan un potencial matricial
(m):
tcm = s + m
La presin osmtica y el potencial de agua se miden en unidades de presin estndar as:
1 bar = 0,987 atm
= 106 dinas cm ^ {- 2}
= 105 Pa (0,1 MPa = 1 bar).
Mientras que la molaridad se define como el nmero de gramos
Moles de una sustancia en un litro de solucin (es decir, un litro de solucin requiere menos
de un litro de disolvente), molalidad es el nmero de gramos moles de soluto por kilogramo de
disolvente y, por tanto, a diferencia del potencial osmtico (osmolalidad, medida en Unidades
de presin) es independiente de la temperatura. Por lo tanto, es ms conveniente dar
mediciones de la presin osmtica en unidades de osmolalidad. La osmole (Osm) se define
como:
La unidad de la osmolalidad de una solucin que ejerce una presin osmtica igual a la de
una sustancia no disociante ideal que tiene una concentracin de un mol de soluto por
kilogramo de disolvente.
La osmolalidad de una solucin muy diluida de una sustancia que no se disocia en iones, ser
la misma que su molalidad (es decir, g moles por kilogramo de disolvente). La osmolalidad de
una solucin dbil de una sal,
O sales, que se ha disociado completamente en iones, ser igual a la molalidad total de los
iones.
El potencial osmtico de las soluciones diluidas se aproxima a la ecuacin de Van't Hoff: =
-cRT; dnde
C = concentracin de solutos en mol / litro;
R = la constante de gas y
T = temperatura en K
A partir de la ecuacin anterior, a 0 C, un litro de una
Se podra esperar que la solucin que contenga 1 mol de un compuesto no disociado o 1 mol
de iones tenga una osmolalidad de 1 Osm / kg y un potencial osmtico (agua) de:
\ Delta = -1 (mol) x 0,082054 (atm / mol / C)
X 273,16 ( K) = - 22,414 atm
As, aunque en la prctica la ecuacin de Van't Hoff debe ser corregida por el coeficiente
osmtico, :
= - cRT (Lang, 1967),
Es posible dar cifras aproximadas para convertir la osmolalidad en unidades de presin de
potencial osmtico. Estos se muestran en la Tabla 4.3. Esta tabla tambin puede usarse para
estimar el potencial osmtico de molculas no disociadoras tales como azcares o manitol.
As, a 25C, 30 g / l de sacarosa (peso molecular 342,3) deberan ejercer un potencial
osmtico de:
Captulo 4 133
-2.4789 x
30 = -0,217 MPa 342,3
El potencial observado es de -0,223 MPa (Tabla 4.4).
Una definicion. Las propiedades osmticas de las soluciones pueden ser difciles de describir
sin confusin. En este libro, la adicin de solutos a un disolvente (que hace que el potencial
osmtico o de agua sea ms negativo, pero hace que la osmolalidad de la solucin aumente a
un valor positivo mayor), se ha dicho que reduce (disminuye) el potencial osmtico de las
soluciones . El medio MS que contiene sacarosa al 3% (osmolalidad, aproximadamente 186
mOsm / kg, aproximadamente -461 kPa a 25C) se describe as como con un potencial de
agua menor que el medio de White (1954) suplementado con sacarosa al 2% (osmolalidad ,
Ca. 78 mOsm / kg, aproximadamente -193 kPa a 25 C).
EL POTENCIAL OSMOTICO DE LOS MEDIOS DE CULTURA DEL TEJIDO
4.2.1. El potencial osmtico total de los solutos
El potencial osmtico total aproximado de un
Medio, debido a sustancias disueltas, puede
Estimado de: s = smacronutrients + ssugars
Cuando se aade sacarosa al 3% p / v al medio Murashige y Skoog (1962), la osmolalidad de
una preparacin esterilizada por filtro aumenta de 0,096 a 0,186 Osm / kg ya 25C, el
potencial osmtico del medio disminuye de -0,237 a -0,460 MPa. Por lo tanto, los azcares
son responsables de gran parte del potencial osmtico de los medios de cultivo de plantas
normales. Incluso sin ninguna inversin a los monosacridos, la adicin de sacarosa al 3% p /
v es responsable de ms de cuatro quintos del potencial osmtico total del medio Blanco
(1954), 60% del de Schenk e Hildebrandt
(1972), y por poco menos de la mitad de la MS.
La contribucin del agente gelificante. El potencial hdrico de los medios solidificados con
geles es ms negativo que el de un medio lquido, debido a su potencial matricial, pero este
componente es probablemente relativamente pequeo (Amador y Stewart, 1987). En las
siguientes secciones, el potencial matricial de medios semislidos que contienen aprox. 6 g / l
de agar se ha asumido que es -0,01 MPa a 25 C, pero como agregar agar extra a los medios
de comunicacin ayuda a prevenir la hiperhidricidad, es posible
Que esto es una subestimacin.
La contribucin de las sales nutrientes. Las sales inorgnicas se disocian en iones cuando se
disuelven en agua, de modo que el potencial hdrico de sus soluciones (especialmente
soluciones dbiles) no depende de la molalidad (o molaridad) de los compuestos no
disociados, sino de la molalidad (o molaridad) de sus iones . As, una solucin de KCl con una
molalidad de 0,1 tendr una osmolalidad terica de 0,2, porque en disolucin se disocia en 0,1
moles de K + y 0,1 moles de Cl-. La osmolalidad de una solucin de sales mixtas depende de
la molalidad total de iones en solucin.
La disociacin puede no ser completa, especialmente cuando varios compuestos diferentes se
disuelven juntos como en los medios de cultivo de plantas, lo cual es una razn adicional por
la cual las predicciones calculadas del potencial hdrico pueden ser imprecisas. En la prctica,
los potenciales osmticos deben determinarse mediante medicin real con un osmmetro.
Claramente, el potencial osmtico de un medio de cultivo est relacionado con la
concentracin de solutos, particularmente la de los macronutrientes y el azcar.
De las sales inorgnicas en los medios nutritivos, los macronutrientes contribuyen ms al
potencial osmtico final (agua) debido a su mayor concentracin. La osmolalidad de estas
soluciones relativamente diluidas es muy similar a la osmolaridad total de los iones
constituyentes a 0 C y por lo tanto puede estimarse a partir de la molaridad total de los iones
macronutrientes. As, basndose en su composicin de macronutrientes, un medio lquido
Murashige y Skoog (1962) (sin azcar) con una concentracin total de iones macronutrientes
de 95,75 mg, tendr una osmolalidad de aprox. 0,0958 osmoles (Osm) por kilogramo de
disolvente acuoso (95,8 mOsm / kg), a 25C, un potencial osmtico de aprox. - 0,237 MPa
(237 kPa). Las estimaciones de la osmolalidad derivadas de este modo estn de acuerdo con
mediciones reales de la osmolalidad o osmolaridad para los medios nombrados dados en los
documentos de Yoshida et al. (1973), Kavi Kishor y Reddy (1986) y Lazzeri et al. (1988)
(vase el Cuadro 4.5).
La contribucin de los azcares. La osmolalidad y el potencial osmtico de las soluciones de
sacarosa se pueden leer en la Tabla 4.6. Los de soluciones de manitol y sorbitol de
molaridades equivalentes sern aproximadamente comparables. A concentraciones de hasta
3% p / v, la osmolalidad de la sacarosa es prxima a la molaridad. Se observar que el
potencial osmtico (en MPa) de soluciones de sacarosa a 25 C puede estimarse
aproximadamente multiplicando la concentracin% en peso / volumen por -0,075: la de los
monosacridos fructosa, glucosa, manitol y sorbitol (que tienen un Peso molecular
aproximadamente 0,52 veces el de la sacarosa), multiplicando por -0,14.
Si alguna de la sacarosa en un medio se hidroliza en monosacridos, el potencial osmtico de
los componentes azucarados combinados (sacarosa + glucosa + fructosa), (ssugars), ser
menor (ms negativo) de lo que se estimara a partir de la Tabla 4.5. El efecto se puede ver en
la Tabla 4.6. A partir de estos datos parece que el 40-50% de la sacarosa aadida al medio MS
por Lazzeri et al. (1988) se desglos en monosacridos durante el autoclave. La hidrlisis de
sacarosa por enzimas invertasas derivadas de plantas tambin tendr un efecto similar sobre
el potencial osmtico. En algunos cultivos en suspensin, toda la sacarosa que queda en el
medio se invierte en 24 h. Una solucin de sacarosa completamente invertida tendra casi el
doble del potencial negativo de la solucin original, pero como la aparicin de glucosa y
fructosa por hidrlisis enzimtica usualmente ocurre simultneamente con la absorcin de
azcares por los tejidos, tender a tener un efecto estabilizador sobre la osmtica Potencial
durante el paso de una cultura.
Las mediciones
Osmolalidad del medio MS que contiene 3% de sacarosa, despus del autoclave, son:
230 mOsm / kg (0,65% Phytagar, Lazzeri et al., 1988)
240 20 mOsm / kg (agar 0,6 - 0,925%, Scherer et al., 1988)
230 50 mOsm / kg (0.2-0.4% Gelrite, Scherer et al., 1988)
4.2.2. Disminucin del potencial osmtico con otros osmticos
Mediante la adicin de sustancias solubles en lugar de una parte del azcar en un medio, se
puede demostrar que los azcares no slo actan como una fuente de hidratos de carbono,
sino tambin como osmorregulantes. Osmotica empleado para la modificacin deliberada del
potencial osmtico, debe estar en gran parte carente de otros efectos biolgicos. Los ms
frecuentemente seleccionados son los alcoholes de azcar manitol y sorbitol. Se supone que
las plantas que no tienen un camino nativo para la biosntesis del alcohol de azcar son
tambin deficientes en las vas para asimilarlas. Sin embargo, los alcoholes de azcar suelen
ser translocados y pueden ser metabolizados y utilizados en varios grados (Steinitz, 1999,
para manitol Lipavska y Vreugedenhil, 1996, Tian y Russell, 1999, para sorbitol Pua et al.,
1984). El polietilenglicol puede ser ms til como un osmolito inerte no penetrante, aunque
puede contener contaminantes txicos (Chazen et al., 1995). El manitol puede penetrar
fcilmente en las paredes celulares, pero se considera que el plasmalema es relativamente
impermeable (Rains, 1989), mientras que el polietilenglicol 4000 de alto peso molecular es
demasiado grande para penetrar en las paredes celulares (Carpita et al., 1979, Rains, 1989).
Por lo tanto, un osmolito no penetrante no puede penetrar en las clulas vegetales, pero
inhibe la absorcin de agua. El sulfato de sodio y el cloruro de sodio tambin se han utilizado
en algunos experimentos.
Contribuyente Las clulas de muchas plantas que son nativas de orillas del mar o desiertos
(por ejemplo, muchos cactus) caractersticamente tienen un bajo potencial de agua (clula) y
en consecuencia pueden necesitar ser cultivadas en medios de potenciales osmticos
relativamente bajos (altamente negativos) (Lassocinski, 1985). A veces se ha encontrado que
las concentraciones de sacarosa del 4,5-6% son beneficiosas para tales plantas (Sachar y
Iyer, 1959, Johnson y Emino, 1979, Mauseth, 1979, Lassocinski, 1985).
Las concentraciones de sacarosa por encima de la normalidad pueden a menudo ser
beneficiosas en medios para el cultivo de anteras [por ejemplo 13% de sacarosa en Gamborg
et al. (1968) B5 medium - Chuong y Beversdorf, 1985], y para el cultivo de embriones
inmaduros [p. 10% de sucosa en medio MS - Stafford y Davies (1979); 12,5% en Phillips y
Collins (1979) L2. Medio - Phillips et al. (mil novecientos ochenta y dos)].
Si el potencial osmtico del medio efectivamente influye en el crecimiento de los cultivos de
tejidos, se podra esperar que la concentracin de sacarosa, que es ptima para el
crecimiento, vare de un medio a otro, requirindose ms sacarosa en los medios diluidos que
en los concentrados. Evans et al. (1976) encontraron que esto era as con cultivos de tejido de
soja. Las velocidades mximas de crecimiento del callo se obtuvieron en medios que
contenan:
1. 50-75% de sales basales de MS + 3-4% de sacarosa, o, 2. 75-100% de sales basales de
MS + 2% de sacarosa.
Similarmente, Yoshida et al. (1973) obtuvieron igualmente buenas tasas de crecimiento del
callo de Nicotiana glutinosa con medios nutritivos en los que
1. las sales ejercidas -0.274 MPa y sacarosa -0.223
MPa, o
2. las sales ejercidas -0,365 MPa y sacarosa -0,091
MPa.
Era esencial a~nadir 60 g / l de sacarosa (es decir, sacarosa = -0,461 MPa a 25 C) a las
sales MEDIUM de Fossard et al. (1974) ( = -0.135 MPa) para obtener germinacin y
crecimiento de plntulas de embriones zigticos inmaduros de tomate. Sin embargo, si se
utilizaron las sales "ALTAS" (smedium = -0,260 MPa), 60 g / l de sacarosa dieron un
crecimiento ligeramente superior a 2,1 g / l (ssucrose = -0,156 MPa) (Neal y Topoleski,
1983).
n examen detallado de los efectos osmticos de los medios de cultivo en cultivos de callos fue
realizado por Kimball et al. (1975). Se aadieron varias sustancias orgnicas a un medio Miller
(1961) modificado (que inclua sacarosa al 2%), para disminuir el potencial osmtico (s) de
-0,290 MPa. Sorprendentemente, se dijo que el mayor crecimiento de callo se produca a
-1.290 a -1.490 MPa (potenciales inusualmente bajos que normalmente inhiben el crecimiento
- vase ms adelante) en presencia de
Manitol o sorbitol, y entre -1,090 y -1,290 MPa cuando se aadi extra sacarosa o glucosa. En
el medio estndar, muchas clulas del callo tenan forma irregular; Como el potencial osmtico
de la solucin se redujo haba menos irregularidades y en aproximadamente s = -1,090 MPa
todas las clulas eran esfricas. El porcentaje de materia seca de los cultivos tambin
aument con la disminucin de s.
Doley y Leyton (1970) encontraron que la disminucin del potencial de agua (osmtica) del
Medio Blanco (1963) por -0.100 o -0.200 MPa mediante la adicin de ms sacarosa (y / o
polietilenglicol), caus la tasa de crecimiento del callo del corte De las secciones de vstago
de Fraxinus sean ms bajas que en un medio estndar. Con el potencial de agua reducido, el
callo tena superficies suberizadas y creca a travs de la actividad de un cmbio vascular.
Tambin contena ms xilema y esclerides lignificados. En cada potencial haba una
concentracin ptima de IAA para la diferenciacin del xilema.
Cuando la concentracin de sacarosa en un medio de alta sal como la MS se incrementa por
encima del 4-5 por ciento, comienza a haber una inhibicin progresiva del crecimiento celular
en muchos tipos de cultivo. Esto parece ser un efecto osmtico porque la adicin de otras
sustancias osmticamente activas (tales como manitol y polietilenglicol) al medio provoca una
respuesta similar (Maretzki et al., 1972). Normalmente, las altas concentraciones de sacarosa
no son txicas, al menos no a corto plazo, y el crecimiento celular se reanuda cuando los
tejidos u rganos se transfieren a medios que contienen niveles normales de azcar. Aumento
de s es un mtodo de extender la vida til de las culturas. Pech y Romani (1979)
encontraron que la adicin de manitol 0,4 M al medio MS (orgnicos modificados), fue capaz
de prevenir la rpida lisis celular y la muerte que se produjo cuando se retir el 2,4-D de los
cultivos de suspensin de peras.
La disminucin del potencial osmtico (usualmente mediante la adicin de manitol) junto con
la disminucin de la temperatura se ha utilizado para reducir la tasa de crecimiento para la
conservacin de genotipos valiosos in vitro. Esto se ha informado, entre otros, de la papa
(Gopal et al., 2002), Dioscorea alata (Borges et al., 2003) y enset (Negash et al., 2001).
Contenido de agua en los tejidos
El contenido en agua de los tejidos cultivados disminuye a medida que aumenta el nivel de
sacarosa en el medio. Dunwell (1981) cultiv embriones aislados de cebada en medio MS en
concentraciones de sacarosa de hasta el 12%. El peso seco aument a medida que la
concentracin de sacarosa aument a 6 o 9 por ciento y la longitud de los brotes de algunas
variedades fue tambin mayor que la sacarosa del 3 por ciento. El contenido de agua de las
plntulas en desarrollo fue inversamente proporcional al nivel de sacarosa.
El peso en seco de los bulbos y races de Lilium auratum aument a medida que la
concentracin de sacarosa aument a 90 g / l pero disminuy dramticamente con 150 g / l
debido a que el crecimiento se inhibi. La proporcin de peso fresco / peso seco de ambos
tipos de tejido disminuy una vez ms progresivamente a medida que se a~nada sacarosa al
medio (0 - 150 g / l). En un medio que contena 30 mg / l de sacarosa, el nmero y el peso
fresco de las bulbillas aumentaron a medida que se aumentaba la concentracin de sal de MS
de una octava a dos veces su concentracin normal. Se demostr una interaccin entre las
concentraciones de sal y sacarosa en que se pudo obtener el peso seco ptimo de los bulbos
en MS simple + 120 g / l de sacarosa (osmolalidad, sin inversin de sacarosa =
aproximadamente 492 mOsm / kg, s = aproximadamente -1,22 MPa) o MS de doble fuerza +
60 g / l de sacarosa (osmolalidad, sin inversin de sacarosa = aproximadamente 378 mOsm /
kg, s = -0,94 MPa) (Takayama y Misawa, 1979).
4.3.4. Morfognesis
El efecto osmtico de la sacarosa en las soluciones de cultivo se demostr bien mediante una
serie de experimentos sobre callos del tabaco realizados por Brown et al. (1979): las
velocidades de crecimiento del callo y regeneracin de los brotes que eran ptimas en los
medios de cultivo que contenan sacarosa al 3% Mantenido cuando el azcar fue sustituido
parcialmente por los niveles osmticamente equivalentes de manitol. El ptimo (medio ms
sacarosa) estaba entre -0,4 y -0,6 MPa, y el aumento de los niveles de sacarosa por encima
del 3 por ciento trajo una disminucin progresiva en la regeneracin del brote. Barg y Umiel
(1977) obtuvieron resultados similares, pero cuando mantuvieron el potencial osmtico de la
solucin de cultivo casi constante por adiciones de manitol, las concentraciones de sacarosa
ptimas para el crecimiento del callo del tabaco o la morfognesis no fueron las mismas
(Figura 4.2)
Brown y Thorpe (1980) encontraron posteriormente que el callo de Nicotiana capaz de formar
brotes, tena un potencial de agua () de -0,8 MPa, mientras que el callo no formador de
brotes tena un de -0,4 MPa. Las dos relaciones fueron:
Ciclo de formacin de lanzamiento
s + p + m -0,8 = -1 + 0,4 + 0 MPa Cilindro no formador de brotes clula = s + p +
m -0,4 = -0 + 0,3 + 0 MPa
Corrija el potencial de agua. Una tasa ptima de crecimiento y adventicia formacin de brotes
de callos de trigo se produjo en MS medio que contiene 2%
Sacarosa Slo se produjo un pequeo nmero de brotes en el medio suplementado con
sacarosa al 1%, pero si se aadi manitol de modo que la clula total = s fue la misma que
cuando el 2% de sacarosa estaba presente, se estimul la formacin de brotes adventicios
(Galiba y Erdei, 1986). Resultados muy similares fueron obtenidos por Lapea et al. (1988).
Un pequeo nmero de brotes de brotes se produjeron a partir de Digitalis obscura hypocotyls
en MS medio que contiene 1% de sacarosa: ms del doble de si el medio contena 2% de
sacarosa (total s dado como -0,336 MPa), o 1% de sacarosa ms manitol de nuevo Dan un
s total igual a -0,336 MPa.
El potencial del agua puede modificar el compromiso.
La morfognesis tambin puede ser regulada alterando el potencial hdrico de los medios.
Shepard y Totten (1977) encontraron que callos muy pequeos (aproximadamente 1-2 mm)
formados a partir de protoplastos de mesofilo de la patata no pudieron sobrevivir en 1 o 2% de
sacarosa, y la base de los ms grandes (5-10 mm) Mientras que las porciones superiores se
volvieron verdes pero formaron races y no dispararon. Los callos se volvieron totalmente
verdes slo en 0.2-0.5% de sacarosa. A estos niveles se formaron brotes en presencia de
manitol 0,2-0,3 M. Cuando el nivel de manitol se redujo a 0,05 M, la proporcin de calli
diferenciando brotes cay de 61% a 2%. Se sugiri la posibilidad de un afecto osmtico
porque las concentraciones equimolares de mio-inositol eran igual de eficaces para promover
la regeneracin de los brotes.
Otra forma de modificar la morfognesis es aumentar la concentracin inica del medio. El
callo floemtico del tabaco prolifera en Zapata et al. (1983) MY1 suplementado con 10-5 M
IAA y 2,5 x 10-6 M cinetina, pero forma brotes en Murashige et al. (1972) que contena IAA 10-
5 M y cinetina 10-5 M. Estos dos medios contienen macronutrientes muy similares
(concentraciones inicas totales, 96 y 101mM respectivamente), pero la adicin de sulfato
sdico al 0,5- 1,0% (osmolaridad adicional de 89-130 mOsm / kg) disminuy la formacin de
brotes de callos crecido en la formacin de brotes Medio, pero lo aument en el medio que
anteriormente slo apoyaba la proliferacin del callo (Pua et al., 1985a). El callo cultivado en
presencia de sulfato de sodio conserv su capacidad productora de brotes durante un largo
perodo, aunque el efecto no fue permanente (Chayler et al., 1987). En estos experimentos la
formacin de brotes tambin fue potenciada por cloruro de sodio y manitol.
Aumentar el nivel de sacarosa del 1 al 3 por ciento en medio MS que contena 0,3 mg / l de
AIA, indujo callos del tabaco para formar brotes, mientras que aumentarlo al 6 por ciento dio
lugar a la diferenciacin de las races (Rawal y Mehta, 1982; ). La formacin de brotes
adventicios a partir del callo de la mdula de Nicotiana tabacum se inhibe en un medio con
sales de MS si se aade 10-15% de sacarosa. Las zonas preferentes de divisin celular y
meristemoides producidas en sacarosa al 3% se desorganizan en tejido parenquimatoso
(Hammersley-Straw y Thorpe, 1988).
Debe tenerse en cuenta que la auxina que tiene una influencia muy importante en el
crecimiento y la morfognesis de las clulas vegetales cultivadas, provoca que su potencial
osmtico se altere (Van Overbeek, 1942; Hackett, 1952; Ketellapper, 1953). Cuando el callo
del tabaco se cultiva en un medio que promueve la regeneracin de los brotes, las clulas
tienen una mayor presin osmtica (o ms potencial de agua negativo) que el callo cultivado
en un medio no inductivo (Brown y Thorpe, 1980;
Brotes apogmicos en helechos. Whittier y Steeves (1960) encontraron un efecto muy claro de
la concentracin de glucosa en la formacin de capullos apogmicos en los prothalli del
helecho Pteridium. (Los cogollos apogmicos dan origen a la generacin frondosa y
productora de esporas de la planta que tiene la constitucin gentica haploide del protalo). La
formacin de brotes fue mayor entre 2-3% de glucosa (2.5% ptimo). Los resultados que
confirman esta observacin fueron obtenidos por Menon y Lal (1972) en el musgo
Physcomitrium pyriforme. Aqu los esporofitos apogmicos se formaron ms libremente en
concentraciones bajas de sacarosa (0,5-2%) y condiciones de luz baja (50-100 lux), y no se
produjeron en absoluto cuando los protali se cultivaron en sacarosa al 6% o luz alta (5000-
6000 lux ). Whittier y Steeves (cit. Cit.) Sealaron que no podan obtener la misma tasa de
produccin de brotes apogmicos usando glucosa al 0,25% ms manitol o polietilenglicol; Por
otro lado, aadiendo estos osmotica al 2,5% de glucosa (de manera que el potencial osmtico
de la solucin
Fue equivalente a una con 8% de sacarosa) redujo la formacin de brotes. Por lo tanto,
pareca que el efecto estimulador de la glucosa en la morfognesis se debi principalmente a
su accin como un sustrato respiratorio, pero que la inhibicin podra ser causada por un
excesivamente deprimido potencial osmtico.
Diferenciacin de los brotes florales. Margara y Rancillac (1966) hallaron trozos de raz de
achicoria almacenada en fro para requerir ms sacarosa (hasta 68 g / l; 199 mM) para formar
brotes florales que para producir brotes vegetativos (tan poco como 17 g / l; MM). Tran Thanh
Van y sus colaboradores (Tran Thanh Van y Trinh, 1978) han demostrado de manera similar
que la formacin especfica de brotes vegetativos, capullos florales, callos o races por capas
de clulas delgadas extradas de tallos de tabaco, podra controlarse seleccionando
concentraciones apropiadas de Azcares y de reguladores de crecimiento de auxina y
citoquinina.
Formacin de races y crecimiento radicular. Los medios de pequeo potencial osmtico se
emplean generalmente para la induccin y crecimiento de races en brotes micropropagados.
Los altos niveles de sal frecuentemente son inhibidores de la iniciacin de races. Cuando se
han utilizado tales niveles para la fase II de cultivos de brotes, es comn seleccionar un medio
de baja concentracin (por ejemplo, 1/4 o 1/2 MS), cuando se requiere que los brotes
separados se arraigan en la Fase III. En comparacin con cuatro niveles de sacarosa (1, 2, 3 y
4%), Harris y Stevenson (1979) encontraron cuatro concentraciones de sales de MS (cuarto,
medio, tres cuartos y resistencia total) 1/4 MS) fue ms importante que la concentracin de
sacarosa para la induccin de races en cortes de vid in vitro. El beneficio de bajos niveles de
sal para la iniciacin de las races puede deberse ms a la necesidad de un bajo nivel de
nitrgeno, que a un mayor potencial osmtico. Dunstan (1982) demostr que los microcortes
de varios patrones de rboles frutales arraigados mejor en las sales de MS, pero que en los
medios de estas concentraciones, la cantidad de azcar aadido no era crtica, aunque era
esencial para que haya algunos presentes. Para el mejor enraizamiento de Castanea, fue
importante colocar los brotes en Lloyd y McCown (1981) WPM medio que contiene 4% de
sacarosa (Serres, 1988).
Hay informes de que una concentracin excesiva de azcar puede inhibir la formacin de
races. Los cotiledones verdes de Sinapis alba y Raphanus sativus fueron encontrados por
Lovell et al. (1972) para formar races en sacarosa al 2% en la oscuridad, pero no a la luz de
5500 lux de intensidad luminosa. A la luz, el enraizamiento ocurri si los explantes se
mantenan en agua, o (en menor medida) si se trataron con DCMU (un inhibidor qumico de la
fotosntesis) antes del cultivo en sacarosa al 2%. Los autores de este trabajo sugirieron que
los azcares se producan dentro de los tejidos vegetales durante la fotosntesis, lo que,
sumado a la sacarosa absorbida del medio, proporcionaba una concentracin de azcar total
demasiado grande para el enraizamiento. Rahman y Blake (1988) llegaron a la misma
conclusin en experimentos con Artocarpus heterophyllus. Cuando los brotes de esta planta
se mantienen en un medio de enraizamiento en la oscuridad, el nmero y el peso de las races
formadas en los brotes aumentaron con la inclusin de hasta 80 g / l de sacarosa. La
concentracin ptima de sacarosa fue de 40 g / l si los brotes se hicieron crecer a la luz.
La formacin de races en estacas de aguacate en 0,3 MS de sales [ms Linsmaier y Skoog
(1965)] fue satisfactoria con 1,5, 3 o 6% de sacarosa, y slo se redujo cuando se aadi 9%
de sacarosa (Pliego-Alfaro, 1988).
Aunque el 4% (y ocasionalmente el 8%) de sacarosa se ha utilizado en los medios de cultivo
de raz aislada, el 2% se ha utilizado en la gran mayora de los casos (Butcher and
Street, 1964). En una investigacin sobre los efectos de la concentracin de sacarosa en el
crecimiento de races de tomate, Street y McGregor (1952) encontraron que aunque las
concentraciones de sacarosa entre 1,5 y 2,5% causaron la misma tasa de aumento de peso
de raz fresca, el 1,5% de sacarosa fue ptimo. Produjo la mejor tasa de crecimiento del eje
radicular principal y el mayor nmero y longitud total de las races laterales.
Embriognesis somtica. El potencial osmtico de un medio puede influir en si la
embriognesis somtica puede ocurrir y puede regular el desarrollo adecuado de los
embriones. Como se mostrar a continuacin, un bajo potencial osmtico es a menudo
favorable, pero esto no es siempre el caso. Por ejemplo, los cotiledones inmaduros de Glycine
max produjeron embriones somticos en medio L2 de Phillips y Collins (1979) que contenan
menos del 2% de sacarosa, pero no si la concentracin de azcar aumentaba por encima de
este nivel (Lippmann y Lippmann, 1984).
Colocar tejidos en soluciones con alto potencial osmtico har que las clulas se plasmolicen,
llevando a la ruptura de interconexiones citoplasmticas entre clulas adyacentes
(plasmodesmata). Wetherell (1984) ha sugerido que cuando las clulas y los grupos celulares
de plantas superiores se aslan mediante este proceso, se les permite desarrollar de forma
independiente y expresar su totipotencia. Seal que el aislamiento de las clulas de las
plantas inferiores induce la regeneracin, y la plasmlisis se ha sabido por mucho tiempo para
iniciar la regeneracin en las algas multicelulares, las hojas de los musgos, prothallia de
helechos y gemas de liverworts (Narayanaswami y LaRue, . Los cultivos celulares de
zanahoria pre plasmolizados durante 45 minutos en sacarosa 0,5-1,0 M o sorbitol 1,0 M dieron
lugar a muchos ms embriones somticos cuando se incubaron en medio Wetherell (1969)
con 0,5 mg / l 2,4-D que si no hubieran sido Pretratado de esta manera. Adems, la formacin
de embriones se sincroniz ms estrechamente. Ikeda-Iwai et al. (2003) encontraron que en
Arabidopsis un tratamiento de 6-12 horas con 0,7 M sacarosa, sorbitol o manitol result en
embriognesis somtica.
Los callos derivados de los hipoctilos de Albizia richardiana produjeron el mayor nmero de
brotes adventicios en medio B5 que contena sacarosa al 4%, pero los embriones somticos
crecieron ms fcilmente cuando se aadi sacarosa al 2%. Al menos el 1% de sacarosa era
necesario para cualquier tipo de morfognesis (Tomar y Gupta, 1988). Un resultado similar fue
obtenido por ulafi et al. (1987) con calos de los brotes axilares de Rumex acetosella: se
produjeron brotes adventicios en un medio que contena sales de MS y 2% de sacarosa (s =
aproximadamente -0,39 MPa a 25 C), pero la embriognesis se produjo cuando la
concentracin de sacarosa aument a O si el medio se suplement con 2% de sacarosa ms
21,3 g / l de manitol o sorbitol (que conjuntamente tienen la misma osmolalidad que sacarosa
al 6% de sacarosa), con un contenido de sacarosa al 6% (sacarosa = -0,46 MPa, = 0,70 MPa
a 25 C) ).
Un potencial osmtico bajo (altamente negativo) ayuda a inducir la embriognesis somtica en
algunas otras plantas. Aadir 10-30 g / l de sorbitol a Kumar et al. (1988) L-6 media (iones
macronuciosos totales 64,26 mM, 20 g / l de sacarosa), provoc un alto nivel de
embriognesis en las suspensiones de Vigna aconitifolia y la capacidad de retencin de la
embriognesis en cultivos a largo plazo. La formacin de embriones somticos en el callo
ovrico de Fuchsia hybrida se aceler aadiendo 5% de sacarosa al medio B5 (Dabin y
Beguin, 1987) y la induccin del callo embriognico de Euphorbia longan requiri el cultivo de
fololos jvenes en medio B5 con un 6% Sacarosa (Litz, 1988).
Existen excepciones, en particular con respecto al crecimiento del embrin. La proporcin de
embriones somticos de Ipomoea batatas formando brotes fue mayor cuando un medio que
contena MS inorgnicos contena 1,6%, en lugar de 3% de sacarosa (Che et al., 1990). La
proliferacin de protones de orqudeas es ms rpida cuando se cultiva tejido en altas
concentraciones de sacarosa, pero para el crecimiento de plntulas debe reducirse el nivel de
sacarosa (Homs y Vanseveran-Van Espen, 1973).
La induccin de callos embriognicos a partir de embriones de semilla inmadura de Zea mays
fue mejor en medio MS con 12% de sacarosa (Lu et al., 1982), y Ho y Vasil (1983) utilizaron 6-
10% de sacarosa en medio MS para promover la formacin De pro-embrioides de hojas
jvenes de Saccharum officinarum. Sin embargo, en los experimentos de Ahloowalia y
Maretski (1983), la formacin de embriones somticos a partir del calo de esta planta fue
mejor en medio MS con sacarosa al 3%, pero el crecimiento de los embriones en plntulas
completas requiri que los embriones se cultivaran primero en medio MS Con 6% de sacarosa
y luego con MS con sacarosa al 3%.
El polietilenglicol 4000 (PEG 4000) mejora la aparicin de races y brotes sin limitar la
histodiferenciacin del embrin en los embriones somticos de soja (Walker y Parrott, 2001).
Igualmente en el abeto, se inform que el polietilenglicol podra mejorar la calidad de los
embriones somticos promoviendo la diferenciacin normal del brote embrionario y la raz (por
ejemplo, Stasolla et al., 2003). La osmtica no penetrante como el polietilenglicol no puede
entrar en las clulas vegetales, pero restringe la absorcin de agua y proporciona una sequa
simulada
Durante el desarrollo del embrin. Una combinacin de ABA y un osmoticum impide la
germinacin precoz en el abeto blanco (Attree et al., 1991) y permite el desarrollo del embrin.
Se han descrito efectos ventajosos del polietilenglicol y del ABA en varias especies (Hevea
brasiliensis, Linossier et al., 1997, Picia abies, Bozhkov y Von Arnold, 1998, picea blanca,
Stasolla et al., 2003, Corydalis yanhusuo, Sagare Et al., 2000, y Panax ginseng, Langhansov
et al., 2004).
Cuando se cultiv en Sears y Deckard (1982), la embriognesis en el callo iniciado a partir de
embriones inmaduros de "primavera china" y algunas otras variedades de trigo era incompleta,
porque los pices de los brotes germinaron y crecieron antes de que los embriones se
hubieran formado correctamente. Pueden obtenerse embriones somticos ms tpicos
aadiendo cloruro sdico o potsico 40 mM al medio. Las sales tuvieron que ser removidas
para permitir que las plntulas se desarrollaran normalmente (Galiba y Yamada, 1988). La
transferencia de embriones somticos a un medio de menor (ms negativo) potencial de agua
a menudo es necesario para asegurar su crecimiento y / o germinacin. A menudo se
requieren altos niveles de sacarosa en los medios para el cultivo de embriones zigticos si son
aislados cuando estn inmaduros. A continuacin se indica el uso de 50 - 120 g / l de sacarosa
en medio, siendo las concentraciones ms altas aadidas a mezclas de sales muy dbiles.
Los embriones que estn ms desarrollados cuando se escinden, crecen satisfactoriamente
en un medio con 10-30 g / l de azcar.
Formacin de rganos de almacenamiento. A concentraciones altas, la sacarosa promueve la
formacin de tubrculos, bulbos y bulbos (por ejemplo, Xu et al., 1998, Vreugdenhil et al.,
1998, Ziv 2005, Gerrits y de Klerk 1992). Esta promocin podra estar mediada por ABA ya
que el estrs osmtico induce la sntesis de ABA (Riera et al., 2005) y ABA promueve la
formacin de bulbo (Kim et al., 1994) y tubrculo (Xu et al., 1998). La situacin es, sin
embargo, ms compleja. Suttle y Hultstrand (1994) no encontraron una reduccin de la
formacin de tubrculos en la papa mediante la adicin de fluridona, un inhibidor de la sntesis
de ABA, y Xu et al. (1998) no observaron un mayor nivel de ABA a alta concentracin de
sacarosa. As que en la papa, el efecto de la sacarosa no es probable que sea mediada por
ABA. La ABA exgena no promueve la formacin de cortezas de Gladiolus (Dantu y Bhojwani,
1995), pero la formacin de bulbos del lirio fue completamente inhibida por la fluridona y
restaurada mediante la adicin simultnea de ABA (Kim et al., 1994). Para establecer el efecto
del osmoticum directamente, se han realizado experimentos con adicin de manitol en lugar
de sacarosa. El manitol no promovi la produccin de cormos de Gladiolus (De Bruyn y
Ferreira, 1992) ni la produccin de bulbos en cebolla (Kahane y Rancillac, 1996), pero los
datos de Lily sugirieron que, aunque tuviera un efecto txico, en esta planta el manitol
estimulaba el bulbo Formacin (Gerrits y De Klerk, 1992).
PH DE LOS MEDIOS DE CULTURA DEL TEJIDO
La acidez relativa o alcalinidad de una solucin se evala por su pH. Esta es una medida de la
concentracin de iones hidrgeno; Cuanto mayor es la concentracin de iones H + (en
realidad iones H3O +), ms cido es la solucin. Como el pH se define como el logaritmo
negativo de la concentracin de iones hidrgeno, las soluciones cidas tienen valores de pH
bajos (0-7) y soluciones alcalinas, valores altos (7-14). Las soluciones de pH 4 (la
concentracin de H + es 10-4 mol.l-1) son por lo tanto ms cido que las de pH 5 (donde la
concentracin de H + es 10-5 mol.l-1); Las soluciones de pH 9 son ms alcalinas que las de
pH 8. El agua pura, sin gases disueltos como CO2, tiene un pH neutro de 7. Para juzgar el
efecto del pH del medio, es esencial discriminar entre los distintos sitios donde El pH podra
tener un efecto: (1) en el explante, (2) en el medio y (3) en la interfase entre el explante y el
medio.
El pH de un medio de cultivo debe ser tal que no interrumpa el tejido vegetal. Dentro de los
lmites aceptables el pH tambin:
regula si las sales permanecern en una forma soluble;
influye en la absorcin de ingredientes medios y aditivos reguladores del crecimiento de las
plantas;
tiene un efecto sobre las reacciones qumicas (especialmente las catalizadas por enzimas); y
afecta la eficacia gelificante del agar.
Esto significa que el rango efectivo de pH para los medios est restringido. Como se explicar,
el pH del medio se altera durante el cultivo, pero como regla general, el pH inicial se fija en 5,5
- 6,0. En los medios de cultivo, los efectos perjudiciales de un pH adverso estn generalmente
relacionados con la disponibilidad de iones y la absorcin de nutrientes en lugar de dao
celular.
EL pH DE LOS MEDIOS
5.1.1. Buffering
Los componentes de los medios de cultivo de tejidos comunes tienen poca capacidad de
tamponamiento. Vacin y Went (1949) investigaron el efecto sobre el pH de cada
Compuesto en su medio. Los qumicos que parecan ser los ms instrumentales en el cambio
de pH fueron FeSO4.7H2O y Ca (NO3) 2.4H2O. Sustituyendo la primera por tartrato frrico a
un peso que mantuviera la concentracin molar original de hierro, y sustituyendo Ca3 (PO4) 2
y KNO3 por Ca (NO3) 2,4H2O, encontraron que la solucin fue tamponada ms eficazmente.
Mientras que los aminocidos tambin mostraron promesa como agentes tampn, KH2PO4
fue ineficaz a menos que estuviera en alta concentracin. En algunos experimentos
tempranos se intentaron estabilizar el pH incorporando una mezcla de KH2PO4 y K2HPO4 en
un medio (vase Kordan, 1959, por ejemplo), pero Street y Henshaw (1966) encontraron que
tampn significativo slo se logr mediante fosfatos solubles a niveles Inhibidor del
crecimiento de las plantas. Por esta razn Sheat et al. (1959) propusieron el tamponamiento
de los medios de cultivo de races de plantas con fosfatos de calcio escasamente solubles,
pero desafortunadamente si estos compuestos se autoclavan con otros constituyentes del
medio, absorben micronutrientes que luego se vuelven indisponibles. Un tampn es un
compuesto que puede equilibrar el nivel de pH al Un nivel seleccionado: los tampones
eficaces deben mantener el pH con pocos cambios a medida que avanza el cultivo. Como se
ha sealado anteriormente, los medios de cultivo de tejidos vegetales normalmente estn mal
tamponados. Sin embargo, el pH se estabiliza en cierta medida cuando los tejidos se cultivan
en medios que contienen tanto nitrato como iones amonio. Los agentes gelificantes Agar y
Gelrite pueden tener una ligera capacidad tampn (Scherer, 1988).
cidos orgnicos: Muchos cidos orgnicos pueden actuar como tampones en los medios de
cultivo de plantas. Mediante estabilizacin del pH a aprox. PH 5,5, pueden facilitar la
absorcin de NH4 + cuando sta es la nica fuente de nitrgeno, y por su propio metabolismo,
ayudan a la conversin de NH4 + en aminocidos. Puede haber mejoras en el crecimiento de
la adicin de cidos orgnicos a los medios que contienen NH4 + y NO3-, pero esto no es
siempre el caso. Norstog y Smith (1963) observaron que el cido mlico 0,75 mM era un
tampn eficaz y parecan aumentar el efecto de la glutamina y la alanina que aadan a su
medio. Vyskot y Bezdek (1984) encontraron que la capacidad de amortiguacin del medio MS
se increment aadiendo 1,25 mM de citrato de sodio o 1,97 mM de cido ctrico ms 6,07
mM de fosfato sdico dibsico. Se ha observado que el cido ctrico y algunos otros cidos
orgnicos aumentan el crecimiento del callo de Citrus cuando se aaden al medio
(presumiblemente el de Murashige y Tucker, 1969) (Erner y Reuveni, 1981). Para la
propagacin de varios cactos de yemas axilares, Vyskot y Jara (1984) aadieron citrato de
sodio al medio MS para aumentar su capacidad de amortiguamiento.
Receptores biolgicos reconocidos: A diferencia de los cidos orgnicos, los tampones
convencionales no son metabolizados por la planta, pero pueden ajustar los niveles de pH de
forma muy eficaz. Los compuestos que se han usado en medios de cultivo de plantas para
propsitos crticos tales como aislamiento y cultivo de protoplastos y cultivo de clulas a
densidades de inoculacin muy bajas incluyen:
TRIS, Tris (hidroximetil) aminometano;
Tricina, N-tris (hidroximetil) metilglicina;
MES, cido 2- (N-morfolino) etanosulfnico;
HEPES, 4- (2 - hidroxietil) - 1 - piperazina (cido 2 - etanosulfnico); y
CAPS, cido 3 - ciclohexilamino - 1 - propanosulfnico.
Dichos compuestos pueden tener efectos biolgicos que no estn relacionados con su
capacidad de tamponamiento. Dependiendo de las especies de plantas, se ha sabido que
matan protoplastos o aumentan mucho la velocidad de divisin celular y / o regeneracin de
plantas (Conrad et al., 1981). Los tampones 'biolgicos' MES y HEPES se han desarrollado
para la investigacin biolgica (Good et al., 1966).
MES: MES es uno de los pocos tampones altamente efectivos y comercialmente disponibles
con una capacidad tampn significativa en el rango de pH de 5-6 a los cuales los medios de
cultivo de plantas se ajustan normalmente y tiene slo una baja capacidad para complejarse
con micronutrientes. No es txico para la mayora de las plantas, aunque hay algunas que son
sensibles. Ramage y Williams (2002) informan que la regeneracin de brotes de discos de
hojas de tabaco no se vio afectada por el MES al aumentar la concentracin hasta 100 mM.
De Klerk et al (2007), sin embargo, observaron una disminucin del enraizamiento de rodajas
de manzana con el aumento de la concentracin de MES (ver ms abajo, Fig. 4.4). Este
efecto de MES no se entendi. Slo ocurri durante los primeros das del proceso de
enraizamiento y no se observ durante el
Despus de la formacin de los meristemas.
Durante el cultivo de capas de clulas finas de Nicotiana, Tiburcio et al. (1989) hallaron que el
pH del medio LS poda mantenerse cerca de 5,8 durante 28 das aadiendo 50 mM de MES,
mientras que sin el tampn el pH disminuy gradualmente hasta 5,25. Regulacin del pH con
MES altera el tipo de morfognesis que se producen en este (y otros) tejidos (vase ms
adelante).
Parfitt et al. (1988) encontraron que MES 10 mM era un tampn eficaz en cuatro medios
diferentes usados para cultivos de callos de zanahoria y tomate, y cultivos de durazno y clavel,
aunque el pH estabilizante no produjo un crecimiento superior. Los cultivos de tabaco, durazno
y clavel fueron daados por MES 50 mM. Tris fue txico en todas las concentraciones
ensayadas, aunque Klein y Manos (1960) haban encontrado que la adicin de slo 0,5 mM de
Tris aumentaba efectivamente el peso fresco de callo que se poda cultivar en medio White
(1954) cuando el hierro estaba quelado con EDTA.
MES tambin se ha utilizado con xito para amortiguar muchos cultivos iniciados a partir de
protoplastos individuales (Mller et al., 1983) y su inclusin en el medio de cultivo puede ser
esencial para la supervivencia de clulas individuales y su divisin para formar colonias de
callos (por ejemplo, las de Datura Innoxia - Koop et al., 1983). MES se encontr que era algo
txico para los protoplastos nicos de Brassica napus, pero el "Polybuffer 74 '(PB-74, una
mezcla de poliaminosulfonatos), permiti un excelente crecimiento de microcolonia en el
intervalo de pH de 5,5-7,0
(Spangenberg et al., 1986). Utilizado a 1/100 de la solucin comercialmente disponible, tiene
una capacidad de amortiguacin de un tampn 1,3 mM a su valor pK (Koop et al., 1983).
El homogeneizado de banano es ampliamente utilizado en medios de micropropagacin de
orqudeas. Ernst (1974) seal que pareca amortiguar el medio en el que se cultivaban
plntulas de orqudeas.
5.1.2. La absorcin de iones y molculas
El pH del medio tiene un efecto sobre la disponibilidad de muchos minerales (Scholten y
Pierik, 1998). En general, se favorece la absorcin de iones cargados negativamente
(aniones) a pH cido, mientras que la de cationes (cargada positivamente) es mejor cuando el
pH aumenta. Como se mencion anteriormente, la captacin relativa de cationes nutritivos y
aniones alterar el pH del medio. La liberacin de iones hidroxilo de la planta a cambio de
iones nitrato da lugar a que los medios se vuelvan ms alcalinos; Cuando los iones amonio se
toman a cambio de protones, los medios se vuelven ms cidos (Tabla 4.8).
Nitrato y iones amonio: La absorcin de los iones amonio y nitrato est marcadamente
afectada por el pH. Las races de plantas extirpadas pueden crecer con NH4 + como nica
fuente de nitrgeno, siempre que el pH se mantenga dentro del intervalo de 6,8 a 7,2 y el
hierro est disponible en forma quelatada. A niveles de pH inferiores a 6,4 las races crecen
lentamente en amonio solo y tienen un aspecto anormal (Sheat et al., 1959). Esto concuerda
con los experimentos en plantas intactas donde el amonio como la nica fuente de nitrgeno
se encuentra que se absorbe mal a pH bajo. Se utiliz ms efectivamente en esprragos en
un medio tamponado a pH 5,5. A un pH bajo (aproximadamente 4 o menos), la capacidad de
las races de absorber iones de cualquier tipo puede perjudicar, puede haber una prdida de
constituyentes celulares solubles y el crecimiento tanto del eje principal como de los laterales
es Deprimido (Asher, 1978).
Por otra parte, el nitrato no es fcilmente absorbido por las clulas vegetales a pH neutro o
superior (Martin y Rose, 1976). El crecimiento del callo tumoral de Rumex acetosa en un
medio que contena nitrato fue mayor a pH 3,5 que pH 5,0 (Nickell y Burkholder, 1950),
mientras que Chevre et al. (1983) reportaron que la multiplicacin de brotes axilares en
cultivos de Castanea fue ms satisfactoria cuando el pH de MS se redujo a 4 y las
concentraciones de Ca2 + y Mg2 + se duplicaron.
Estabilizacin del pH: Una de las principales ventajas de tener ambos iones NO3 y NH4 + en
el medio es que la captacin de uno proporciona un mejor entorno de pH para la absorcin del
otro. El pH del medio se estabiliza as. La absorcin de iones nitrato por parte de las clulas
vegetales conduce a un desplazamiento hacia un pH alcalino, mientras que la absorcin de
NH4 + da como resultado un cambio ms rpido hacia la acidez (Street, 1969, Beynard et al.,
1982). Por cada equivalente de amonio incorporado en la materia orgnica, aproximadamente
0,8-1 H + (proton) equivalentes se liberan en el medio externo; Para cada equivalente de
nitrato asimilado, se eliminan del medio medios de 1-1,2 equivalentes de protones (Fuggi et
al., 1981). Raven (1986) calcul que no debera haber cambio de pH
Resultante de la captacin de NO3- o NH4 +, cuando la relacin de los dos a los dos.
Los cambios de pH causados por la absorcin de nitrato y amonio durante el cultivo (vase
ms arriba) pueden conducir a una situacin de deficiencia de nitrgeno si se usa como nica
fuente de nitrgeno sin la adicin de un tampn (vase ms adelante) (Hyndman et al., 1982 ).
La absorcin de NH4 +, cuando sta es la nica fuente de nitrgeno, slo es eficaz cuando un
tampn o un cido orgnico tambin est presente en el medio. En medios que contienen
tanto NO3- como NH4 + con un pH inicial de 5-6, la captacin preferida de NH4 + hace que el
pH caiga durante el crecimiento temprano del cultivo. Esto da como resultado una mayor
utilizacin de NO3 (Martin y Rose, 1976) y un aumento gradual del pH. El pH final del medio
depende de las proporciones relativas de NO3- y NH4 + que se proporcionan (Gamborg et al.,
1968). Despus de 7 das de cultivo de raz, el medio White (1943a) (que contena slo
nitrato), ajustado a pH 4,8-4,9, tena un pH de 5,8-6,0 (Street et al., 1951, 1952), pero Sheat et
al. (1959) podra estabilizar el medio a pH 5,8 por tener un cincuenta de la cantidad total de
nitrgeno como ion amonio, el resto como nitrato. Sin embargo, los cambios en el pH de un
medio varan de un tipo de planta a otro. Ramage y Williams (2002) observaron una
disminucin en el pH cuando los discos de hojas de tabaco se cultivaron con slo nitrgeno
NH4 + mientras que no se observ tal disminucin en medio con NH4 + y NO3-. No se produjo
organognesis cuando el medio con slo NH4 + no fue tamponado, pero la inclusin de MES
result en la formacin de meristemas (pero no brotes).
Los medios que difieren en los niveles de nitrgeno total (pero todos tienen la misma relacin
de nitrato a amonio como medio MS), tuvieron un pH final de aprox. 4,5 despus de ser
utilizado para la iniciacin de la raz de la Etapa III en brotes de rosa, mientras que los que
contenan amonio solo tuvieron un pH final de aprox. 4.1 (Hyndman et al., 1982). Una
observacin similar con el medio MS mismo fue realizada por Delfel y Smith (1980). No
importa cul sea el valor inicial en el rango 4.5-8.0, el pH final despus del cultivo de callo de
Cephalotaxus fue siempre 4.2. El medio de De Jong et al. (1974) siempre tuvieron un pH de
4,8-5,0 despus de cultivar los capullos de Begonia, cualquiera que fuera el pH inicial en el
intervalo 4,0-6,5. Esto no quiere decir que el pH inicial no fuera importante, porque haba un
ptimo para el crecimiento y el desarrollo (vase ms adelante) (Berghoef y Bruinsma, 1979).
Otros compuestos: La disponibilidad y captacin de otros iones inorgnicos y molculas
orgnicas tambin se ve afectada por el pH. Como se ha explicado anteriormente, la
captacin de fosfato es ms eficaz a partir de soluciones cidas. Las clulas de petunia
absorbieron el fosfato ms rpidamente a pH 4 y su absorcin disminuy a medida que se
elevaba el pH (Chin y Miller, 1982). Vacin y Went (1949) observaron la formacin de complejos
de fosfato de hierro en su medio por cambios de pH. Los fosfatos de hierro insolubles tambin
pueden formarse en medio MS a pH 6,2 o superior a menos que se aumente la proporcin de
EDTA a hierro (Dalton et al., 1983).
La absorcin de Cl-iones en las races de cebada es favorecida por el pH bajo, pero Jacobson
et al. (1971) observ que era slo notablemente menor a pH alto en soluciones fuertemente
agitado por aireacin alta. Por lo tanto, sugirieron que los iones H + secretados de las races
de las plantas como resultado de la captacin de aniones, pueden mantener una zona de pH
reducido en la capa de Nernst, una pelcula estacionaria de agua inmediatamente adyacente
al tejido vegetal cultivado (Nernst, 1904). En el cultivo de tejidos vegetales, la captacin de
iones y molculas puede por lo tanto ser ms susceptible de verse afectada por el pH adverso
en medios lquidos agitados que en medios solidificados por agar.
Harrington y Henke (1981) encontraron que la absorcin de lisina en clulas de tabaco era
estimulada por un pH bajo. El efecto del pH en la captacin es especialmente relevante
Para auxinas (por ejemplo, Edwards y Goldsmith 1980). Dependiendo del pH y su pKa, las
auxinas estn presentes como una molcula no disociada o como un anin. Para la afluencia,
la molcula de auxina no disociada puede pasar a travs de la membrana por difusin,
mientras que el anin es tomado por un portador (Delbarre et al., 1996; Morris 2000). La
disociacin depende del pH. En el apoplasto, el pH es bajo, ca. 5. Cuando se toma, la auxina
entra en el citoplasma con pH 7. A este pH, la mayor parte de la auxina est presente como
anin y no puede difundirse. El eflujo del anin es provocado por un sistema portador de
eflujo. Por lo tanto, la captacin neta en las clulas de los reguladores del crecimiento de las
plantas que son cidos lipoflicos dbiles (tales como IAA, NAA, 2,4-D y cido abscsico) ser
mayor, ms cido ser el medio y mayor ser la diferencia entre su pH y La del citoplasma
celular (Rubery, 1980). Shvetsov y Gamburg (1981) encontraron de hecho que la velocidad de
captacin de 2,4-D en las clulas de maz cultivadas aument a medida que el pH del medio
disminuy de 5,5 a 4. Tambin se encontr una mayor absorcin de auxina a pH bajo en
microcuturas de manzana , Tanto para IBA (Harbage et al., 1998) como para IAA (De Klerk et
al., 2007). Como se ha mencionado anteriormente, las auxinas pueden modificar el pH
intracelular y extracelular. La adicin de 2,4-D a un medio aument la absorcin de nicotina en
cultivo de clulas de Acer pseudoplatanus (Kurkdjian et al., 1982).
5.1.3. Seleccin del pH de los medios de cultivo: pH inicial
Muchas clulas vegetales y tejidos in vitro, tolerarn pH en el intervalo de aproximadamente
4,0-7,2; Los inoculados en medios ajustados a pH 2,5-3,0 o 8,0 morirn probablemente
(Butenko et al., 1984). Los mejores resultados se obtienen generalmente en condiciones
ligeramente cidas. En una muestra aleatoria de trabajos sobre micropropagacin, el pH inicial
promedio adoptado para varios medios diferentes se encontr que era de 5,6 (modo 5,7), pero
se haban hecho ajustes de tan slo 3,5 y tan altos como 7,1.
El pH para la mayora de los cultivos de plantas es por lo tanto ms bajo que el que es ptimo
para cultivos hidropnicos, donde las plantas intactas con sus races en solucin aireada
crecen habitualmente ms rpidamente cuando el pH de la solucin est en el intervalo de
6,0-7,3 (De Capite, 1948; Sholto Douglas, 1976, Cooper, 1979).
Las clulas cultivadas en suspensin de Ipomoea crecieron satisfactoriamente en el medio P2
de Rose y Martin (1975) ajustado inicialmente a pH 5,6 o pH 6,3, pero el rendimiento de
clulas secas fue menor en dos extremos (pH 4,8 y pH 7,1). Martin y Rose (1976) supusieron
que un bajo rendimiento de clulas de un cultivo iniciado a pH 7,1 se debi a la incapacidad
del cultivo para utilizar NO3-, pero la causa de una reduccin en el crecimiento a pH 4,8 fue
menos evidente. Podra haber resultado de que la planta tuviera que gastar energa para
mantener un pH fisiolgico apropiado internamente. Kartha (1981) encontr que el pH 5,6-5,8
apoyaba el crecimiento de la mayora de las puntas de los meristemas en cultivo y que los
meristemas de la yuca no crecan durante un perodo prolongado en un medio ajustado a pH
4,8. El pH ptimo (antes del autoclavado) para el crecimiento de puntas de brotes de clavel en
Linsmaier y Skoog (1965), fue de 5,5-6,5. Cuando el medio se suplement con 4 mg / l de
sulfato de adenina y 2 g / l de hidrolizado de casena, el pH ptimo fue de 5 y en los medios
ajustados a 6,0 y 6,5, hubo un crecimiento significativamente menor (Davis y col., 1977). La
proliferacin de brotes en cultivos de brotes de Camellia sasanqua fue mejor cuando el pH de
un medio con sales de MS se ajust a 5-5,5. Slo en estos frascos la capacidad de los
explantes juveniles para producir ms brotes que los adultos realmente pronunciada (Torres y
Carlisi, 1986).
Norstog y Smith (1963) sugirieron que el pH del medio utilizado para el cultivo de embriones
zigticos aislados, no debera ser mayor que 5,2.
Ajuste del pH
Debido a que entonces no hay necesidad de tomar precauciones aspticas especiales, y es
imprctico ajustar el pH una vez que el medio se ha dispensado en lotes pequeos, el pH de
un medio se ajusta habitualmente con cido o lcali antes del tratamiento en autoclave. Segn
Krieg y Gerhardt (1981), el agar se hidroliza parcialmente si se autoclave a pH 6 o menos y no
se solidificar tan eficazmente cuando se enfra. Recomendan que el agar
Los medios para fines bacteriolgicos deben esterilizarse a un pH superior a 6 y, si es
necesario, deben ajustarse a condiciones cidas con cido estril despus de la esterilizacin
en autoclave, cuando se hayan enfriado a 45-50 C. El grado de hidrlisis en medio de cultivo
de plantas autoclavado a pH 5,6-5,7, es presumiblemente pequeo.
Efecto del autoclave: El autoclave cambia el pH del medio (Fig. 4.3). En los medios sin
azcares, el cambio suele ser pequeo a menos que la concentracin de fosfato sea baja,
cuando se produzcan fluctuaciones ms significativas. Los medios autoclavados con sacarosa
generalmente tienen un pH ligeramente inferior al de los autoclavados sin ella, pero si se ha
aadido maltosa, glucosa o fructosa en lugar de sacarosa, el pH post-autoclave se reduce
significativamente (Owen et al., 1991).
El pH de los medios lquidos que contienen sales de MS [p. Se ha encontrado que Linsmaier y
Skoog (1965) o medios de Skirvin y Chu (1979) que contienen 3-3,4% de sacarosa caen
durante el autoclave desde un nivel ajustado de 5,7 hasta pH 5,17 (Singha, 1982) hasta pH
5,5 (Owen Et al., 1991), o a pH 4,6 (Skirvin et al., 1986). La disminucin del pH puede variar
segn el pH al que se ajust inicialmente el medio. En los experimentos de Skirvin et al. (Loc.
Cit.), El pH de un medio ajustado a 5,0, cay a 4,2; Una ajustada a 6,4, cay a 5,1; Que se
ajust a pH 8,5, cay a 8,1.
La mayora de los agares hacen que el pH de los medios aumenten inmediatamente, se
disuelven. Knudson (1946) not que el pH de su medio cambi de 4,6 a 4,7 a 5,4-5,5 una vez
que se aadi agar y se disolvi; Y Singha (1982) descubrieron que el pH no ajustado del
medio MS subi de pH 4 a pH 5,2, dependiendo de la cantidad de agar aadido. Sin embargo,
si un medio que contena agar se ajust a pH 5,7 y luego se someti a autoclave, el medio se
volvi ms cido que si no se hubiese aadido agar, siendo la cada del pH generalmente
proporcional a la cantidad de agar presente.
El efecto del almacenamiento. El pH de los medios de cultivo autoclavados tiende a caer si se
almacenan. Vacin y Went (1949) observaron que el autoclave aceler una cada en el pH del
medio de Knudson (1946) C, ya que las soluciones dejadas en reposo mostraron cambios
similares. La esterilizacin por filtracin (vase ms adelante) no fue una alternativa
satisfactoria, ya que tambin efectu cambios de pH. Se pens que los compuestos
particularmente responsables eran sulfato ferroso no encolado (cuando el pH haba sido
inicialmente establecido entre 3 y 6) y nitrato de calcio (cuando el pH original era de 6 a 9).
Los fosfatos de hierro complejos, no disponibles para las plantas, fueron producidos a partir
del sulfato ferroso, pero si el hierro se agreg como citrato frrico o tartrato frrico (quelatos),
no se produjeron cambios significativos en el pH del autoclave y las plantas no mostraron
sntomas de deficiencia de hierro. Para minimizar un cambio en el pH de los medios
almacenados, se sugiere mantenerlos en la oscuridad: Owen et al., (1991) informaron que el
pH de la MS que contiene sacarosa 0,1 M o Phytagar al 0,8% se mantuvo relativamente
estable despus de autoclavar Si se mantienen en la oscuridad a 4 C, pero bajan hasta 0,8
unidades si se almacenan a la luz a 25 C. De Klerk et al. (2007) utilizando agar BBL, tambin
observ un cambio de pH, pero esto fue insignificante cuando se aadi MES 10 mM (Figura
4.3).
Hidrlisis: Algunos componentes orgnicos de los medios de cultivo pueden ser hidrolizados
por autoclave en medio cido. El grado de hidrlisis de diferentes marcas de agar puede ser
un factor que influye en la incidencia de hiperhidricidad en cultivos de plantas. Los medios de
agar pueden no solidificarse satisfactoriamente cuando el pH inicial se ha ajustado a 4-4,5. La
reduccin del pH que se produce en la mayora de los medios durante el autoclave tambin
puede provocar una gelificacin insatisfactoria del agar que se ha aadido en bajas
concentraciones. Parte de la sacarosa aadida al medio de cultivo vegetal ajustada a pH 5,5
tambin se hidroliza durante el autoclave: la proporcin degradada aumenta si el pH del medio
es mucho menor que ste. Sin embargo, la hidrlisis de sacarosa no es necesariamente
perjudicial.
Carbn activado: La presencia de carbn activado puede alterar el pH de un medio. Al igual
que en la produccin de carbn activado, el pH de un medio puede reducirse mediante
residuos cidos en una etapa lavada con HCl (Owen et al., 1997).
4.1.5. Cambios de pH durante el cultivo
Debido a la captacin diferencial de aniones y cationes en los tejidos vegetales, el pH de los
medios de cultivo no suele permanecer constante, pero cambia a medida que los iones y
compuestos son absorbidos por la planta. Es habitual que los medios que contengan iones
nitrato y amonio disminuyan lentamente en pH durante un paso, despus de haber sido
ajustados inicialmente a pH 5,4-5,7. A veces, despus de una disminucin preliminar, el pH
puede comenzar a subir y volver a un valor prximo o Incluso muy por encima de aquella en la
que se inici el cultivo. El pH del medio de White (1954), que contiene slo nitrgeno N03,
deriv de un 5,0 inicial a un 5,5 hacia la neutralidad cuando se cultiv callo (Klein y Manos,
1960).
Con algunos cultivos, el pH inicial del medio puede tener poco efecto. Los cultivos en
suspensin de clulas de Dioscorea deltoides en el medio de Kaul y Staba (1968) [que
contenan sales de MS], ajustados a un pH de 3,5, 4,3, 5,8 6,3, tenan un pH de 4,6-4,7
dentro de las 10 h de inoculacin. Se produjo una nueva cada a pH 4,0-4,2 en los prximos 2
- 3 das, pero durante los siguientes 15 - 17 das el pH fue de 4,7 - 5,0, finalmente
aumentando a pH 6,0 - 6,3 en aproximadamente el da 19 (Butenko et al. 1984). De manera
similar, Skirvin et al. (1986) encontraron que el medio MS ajustado a pH 3,33, 5,11, 6,63, o
7,98 antes del autoclavado, y luego utilizado para el cultivo de callo de Cucumis melo, tena un
pH despus de 48 h en el intervalo de 4,6-5,0. Visseur (1987) tambin inform que aunque el
pH de su medio (macronutrientes similares a MS pero ms Ca2 + y PO43-) disminuy si se
solidific con agar, pero en un medio de 2 fases, el pH final fue de 6,9 0,4
independientemente de Si era inicialmente 4.8, 5.5 o 6.2.
A pesar de las observaciones anteriores, debe observarse que la naturaleza de la deriva del
pH que se produce en cualquier medio difiere ampliamente de acuerdo con la especie de
planta cultivada sobre ella. El pH del medio que soporta cultivos de Disanthus cercidifolius
cambi de 5,5 a 6,5 durante un perodo de 6 semanas, lo que requiri subcultivos frecuentes
para prevenir el inicio de la senescencia, mientras que en el medio en el que se cultivaron
Lapensia rosea, Inicialmente fijado en 3,5-5,0, slo cambi a 3,8 - 4,1 (Howard y Marks,
1987). Obsrvese tambin que la reversin de los medios a un pH homeosttico puede
deberse a la presencia de iones NO3 y NH4 + (Dougall, 1980). El ajuste de los medios que
contienen slo una de estas fuentes de nitrgeno a un rango de niveles de pH, se espera que
resulte en un conjunto ms variable de valores finales.
A medida que el pH de los medios se desva del nivel de titulacin original, los simples cultivos
no monitorizados pueden no proporcionar el pH ms favorable para diferentes fases de
crecimiento y diferenciacin. En las suspensiones Rosa 'Paul's Scarlet', el pH ptimo para la
fase de divisin celular fue de 5,2-5,4: pH 5,5-6,0 fue el mejor para la fase de expansin
celular (Nesius y Fletcher, 1973). La tasa de crecimiento mximo del callo habituado de
Daucus carota en el medio de White (1954) con hierro como Fe-EDTA, ocurri a pH 6,0 (Klein
y Manos, 1960).
Se ha sugerido que la acidificacin de los medios se debe en parte a la acumulacin de
dixido de carbono en matraces de cultivo hermticamente cerrados (Leva et al., 1984), pero
la disminucin del pH asociada con la incubacin de cultivos de anteras con CO2 al 5% fue
encontrada por Johansson y Eriksson (1984) para ser solamente ca. 0,1 unidades. La
eliminacin del CO _ {2} de un cultivo de Poinsettia en suspensin celular aireada dio como
resultado un aumento de aproximadamente 0,2 unidades de pH (Preil, 1991).
Los reguladores de crecimiento de plantas Auxin promueven el crecimiento celular induciendo
el flujo de iones H + a travs de la pared celular. El flujo de iones de hidrgeno de la clula es
acompaado por el flujo de iones de potasio. Cuando los cultivos se incuban en un medio que
contiene una auxina, el medio se convertir as en ms cido mientras que el pH de la savia
celular aumentar. El alcance de estos cambios fue encontrado por Kurkdjian et al. (1982)
para ser proporcional a la concentracin de auxina (2,4-D).
5.2. CONTROL DE pH EN LA PLANTA
Los diferentes compartimientos de clulas tienen un pH diferente y se mantiene este pH
(Felle, 2001). En el symplasm, el pH del citoplasma es ca. 7 y de la vacuola ca. 5. El
apoplasma tiene un pH de aprox. 5. Las clulas vegetales tpicamente generan un exceso de
compuestos cidos durante el metabolismo que tienen que ser neutralizados (Felle, 1998).
Una de las maneras ms importantes por las que esto se consigue es que H +, o K + sea
bombeado fuera de la clula, a cambio de aniones (por ejemplo OH-), disminuyendo as el pH
extracelular. Las clulas vegetales tambin compensan un exceso de H + por la degradacin
de los cidos orgnicos. La sntesis de cidos orgnicos, como el malato, a partir de
precursores neutros, se utiliza para aumentar la concentracin de H + cuando el pH
citoplasmtico aumenta, por ejemplo si las plantas se cultivan en suelos alcalinos (Findenegg
et al., 1986). En las plantas intactas, normalmente hay un gradiente descendente desde el
bajo pH externo a la clula, hasta niveles de pH ms altos en las partes ms maduras, y esto
permite el transporte ascendente de compuestos no electrolticos tales como azcares y
aminocidos (Bttger
Y Luthen, 1986).
Alteracin del pH de la solucin externa
Las races o clulas circundantes pueden alterar el pH de la clula (Smith y Raven, 1979).
Debido a los controles necesarios, el pH del citoplasma puede estar slo ligeramente alterado,
el de las vacuolas puede mostrar un cambio ms marcado. Al cambiar el pH del medio en el
que se cultivaron suspensiones foto-autotrficas de Chenopodium rubrum de 4,5 a 6,3, el pH
del citoplasma aument de 7,4 a 7,6 y el de las vacuolas celulares aument de 5,3 a 6,6. El
aumento del pH citoplasmtico provoc una marcada desviacin del metabolismo del carbono,
lejos del azcar y el almidn, en la produccin de lpidos, aminocidos y protenas (Hsemann
et al., 1990). El mantenimiento del pH tambin se ilustra en un experimento con hojas
separadas de Vicia faba (Felle y Hanstein, 2002). Cuando las hojas se colocaron en tampn
MES-TRIS 10 mM y se transfirieron a tampn con otro pH, los cambios en el pH del
apoplasma fueron pequeos: con un tampn inicial pH = 4,1 y transferencia a tampn pH =
6,8, el pH apoplstico de Las cavidades subestomticas aumentaron de 4,71 a 5,13 y en la
transferencia inversa disminuyeron de 5,13 a 4,70. Esto indica que el pH del apoplasma no
est fuertemente influenciado por el medio, sino que se mantiene cerca del pH "natural" de
aprox. 5.0. No se dan detalles exactos, pero en este experimento la distancia entre el sitio de
las mediciones de pH y la solucin de MES-TRIS en la que se haban colocado las hojas era
probablemente grande. El symplasm tiene una capacidad mucho ms grande de amortiguar
(Felle, 2001) de modo que su pH sea an menos influenciado por el pH del medio. As, dentro
del explante el pH de ambos apoplasma y symplasm ser afectado slo poco por el pH del
medio. La situacin puede ser diferente en la interfaz entre explante y medio. La influencia del
pH del medio se extender hacia los tejidos internos del explante a medida que se incrementa
la capacidad tamponadora del medio (y por lo tanto supera el tamponaje por el tejido). Dentro
del explante, el pH tambin influir grandemente en el movimiento a travs de las membranas,
es decir, la captacin en las clulas, ya que esto a menudo depende de la disociacin de
compuestos que depende del pH.
El cambio del pH del medio puede por tanto tener un papel regulador en los cultivos de
plantas que es similar al de los productos qumicos reguladores del crecimiento de las plantas,
una de las acciones de la cual es modificar el pH intracelular y la cantidad de iones calcio
libres. Las auxinas pueden modificar el pH citoplsmico activando la liberacin de H + de las
clulas. En el cultivo de tejidos vegetales estos iones pueden acidificar el medio (Kurkdjian et
al., 1982). Se cree que la liberacin de protones es el primer paso en el crecimiento
desencadenado por cido y turgencia (Schubert y Matzke, 1985). Cabe sealar que los
cambios de pH en s mismos pueden actuar como una seal (Felle, 2001).
EL EFECTO DEL pH EN LAS CULTURAS
5.3.1. Cultivos iniciadores a pH bajo
Se ha dicho que las plantas de la familia Ericaceae, que slo crecen bien en suelos cidos
(por ejemplo, rododendros y arndanos), crecen mejor en medios como Anderson (1975),
Anderson (1978, 1980) y Lloyd y McCown (1981) WPM El pH se ajusta primero a aprox. 4.5
(Anderson, 1975; Skirvin, 1981), pero para especies altamente calcifugas como Magnolia
soulangiana, un pH inicial de 3.5 puede resultar en la mayor tasa de proliferacin de brotes en
cultivos de brotes (Howard y Marks, 1987). Chevre et al. (1983) afirman que los cultivos de
castaas crecieron y proliferaron mejor
A pH 4, siempre que el medio MS se modificara duplicando los niveles habituales de calcio y
magnesio.
De Jong et al. (1974), utilizando un medio especialmente desarrollado, encontr que un valor
de pH bajo favoreci el crecimiento de rganos florales. Un resultado similar fue visto por
Berghoef y Bruinsma (1979c) con brotes de Begonia. El crecimiento fue mayor cuando el pH
del medio se ajust inicialmente a cido, siendo 4,5 - 5,0 ptimo. A pH 4.0 los capullos se
volvieron vtreos.
Antes del descubrimiento de agentes quelantes eficaces para cultivos de plantas, los cultivos
de races se cultivaron en medio con un pH bajo. Por ejemplo, las races de tomate no
pudieron crecer en medios similares a los de White (1943a), cuando el pH ascendi a 5,2
(Street et al., 1951). Boll y Street (1951) pudieron demostrar que la depresin del crecimiento
a pH alto se deba a la prdida de Fe del medio y que poda superarse aadiendo una forma
quelatada de hierro (vase el captulo 3). Utilizando FeEDTA, Torrey (1956) descubri que las
races de guisantes aisladas [crecidas en un medio que contena los macronutrientes de
Bonner y Devirian (1939), que no contienen NH4 +], crecieron ptimamente a pH 6,0-6,4, pero
se inhibieron claramente a pH 7,0 o mayor ; Y Street (1969) informaron que el crecimiento de
las races de tomate podra obtenerse entre pH 4,0 y pH 7,2, si EDTA estuviera presente en el
medio. Debido a que el agar no se gelifica adecuadamente cuando el pH inicial del medio se
ajusta a 4, es necesario usar medios lquidos para cultivos de pH bajo; O emplear otro agente
gelificante, o un soporte mecnico. Algunos otros cultivos tambin pueden iniciarse de manera
beneficiosa a pH bajo, lo que puede indicar que los tejidos tienen un requerimiento inicial de
NO3-. Se indujo la embriognesis de Pelargonium ms eficazmente si MS, u otros medios, se
ajustaron a pH 4,5-5,0 antes de autoclavar (en lugar de pH 5,5 y superiores) (Marsolais et al.,
1991).
5.3.2. Diferenciacin y morfognesis
La diferenciacin y la morfognesis son frecuentemente dependientes del pH. La xilognesis
depende del pH del medio (Khan et al., 1986). El crecimiento del callo y la formacin de
rganos adventicios a partir de capas celulares delgadas excisadas de los tejidos superficiales
del inflorescencia rachis de Nicotiana, dependan del pH inicial de Linsmaier y Skoog (1965)
medio que contena IBA 0,5 M y cinetina 3 M (Tabla 4.9) (Mutaftschiev et al., 1987). Pasqua
et al. (2002) informaron muchos efectos cuantitativos del pH durante la regeneracin de capas
de clulas delgadas de tabaco. Los tipos de callos producidos a partir de las plumillas de las
plntulas de Hevea diferan segn el pH del medio ideado por Chua (1966). Calo suave y
esponjoso formado a pH cido (5.4) o alcalino (8.0). Se obtuvo un callo compacto entre pH 6,2
y 6,8. Formacin de races adventicias
Hay varios informes en la literatura que muestran que el pH del medio puede influir en la
formacin de races de algunas plantas in vitro. Un pH ligeramente cido parece ser preferido
por la mayora de las especies. Zatkyo y Molnar (1986), que mostraron una estrecha
correlacin entre la acidez del medio (pH 7,0 a 3,0) y el enraizamiento de los brotes de Vitis,
Ribes nigrum y Aronia melancarpa, sugiere que se debe a que la acidez es necesaria para la
accin de la auxina.
Sharma et al. (1981) encontr ventajoso reducir el pH del medio a 4,5 para inducir el
enraizamiento de brotes de Bougainvillea y se requiri una reduccin del pH del medio MS a
4,0 (acompaada de incubacin en la oscuridad) para la formacin confiable de raz de dos
especies de Santalum (Barlass et al., 1980) y Correa decumbens y Prostanthera striatifolia
(Williams et al., 1984, 1985). Otras especies leosas australianas arraigadas
satisfactoriamente a pH 5,5 y pH 4 fue inhibidora (Williams et al., Loc. Cit.). Los brotes de las
puntas de meristema de clavel se arraigan ms fcilmente a pH 5,5 que pH 6,0 (Stone, 1963)
y el enraizamiento de las yemas de papa extirpadas fue mejor a pH 5,7, la formacin de races
se inhibi a pH 4,8 ya pH 6,2 o superior (Mellor y Stace- Smith, 1969).
La formacin directa de races a partir de las escalas de bulbo de Lilium auratum ocurri
cuando el medio MS se ajust dentro del intervalo 4-7, pero fue ptimo a pH 6. El intervalo de
pH para la formacin de bulbillos adventicia en esta planta fue de 4 a 8, El pH inicial estaba
entre 5 y 7 (Takayama y Misawa, 1979).
Los sustratos que son cidos o demasiado alcalinos pueden afectar negativamente al
enraizamiento ex vitro.
5.3.4. Embriognesis
Smith y Krikorian (1989) descubrieron que los pro-embriones pre-globulares (PGSP) de la
zanahoria podran proliferar a partir de tejidos capaces de formacin directa de embriones, sin
auxina, en un medio que contiene 1-5 mM de NH4 + ). Se formaron embriones somticos
cuando este tejido se traslad al medio MS. El pH del medio amonio-nitrgeno disminuy
de 5,5 a 4,0 en cada perodo de subcultivo, y posteriormente se encontr (Smith y Krikorian,
1990a, b) que el cultivo en un medio de pH bajo era esencial para el mantenimiento de los
cultivos PGSP . El cultivo sostenido a un pH igual o mayor que 5,7, sin auxina, permiti el
desarrollo embrionario somtico. Una observacin similar a la de Smith y Krikorian haba sido
hecha por (Stuart et al., 1987). Aunque el pH de un cultivo en suspensin de clulas de
Regen-S de alfalfa en un medio modificado de Schenk y Hildebrandt (1972) con NH4 + 15 mM
se ajust a 5,8, rpidamente retrocedi a pH 4,4-5,0 en pocas horas. A continuacin, el pH
aument gradualmente a medida que se producan embriones somticos, hasta el da 14 era
5,0. En ciertos cultivos en suspensin, el pH se titul diariamente a 5,5, pero en cada ocasin
pronto regres a casi el mismo pH que en los frascos que no haban sido tocados. Aun as, las
suspensiones ajustadas al pH produjeron ms embriones que los controles.
Se ha encontrado que el ion amonio es esencial para la embriognesis. Es una de sus
funciones reducir el pH del medio a travs de la absorcin y el metabolismo rpidos,
facilitando as la captacin de nitrato, sobre la cual la embriognesis es realmente
dependiente?
Se encontr que la embriognesis de explantes foliares de Ostericum koreanum dependa
fuertemente del pH (Cho et al 2003). Como los explantes se cultivaron continuamente con
NAA, es posible que la relacin observada fuera causada por la absorcin diferencial de NAA.
Esto tambin se sugiere por la menor tasa de desarrollo de embriones visto a pH bajo, porque
esto sera de esperar donde hay una alta concentracin de NAA interno.
MEDIOS LQUIDOS Y SISTEMAS DE SOPORTE
Los requerimientos nutricionales de los cultivos de plantas pueden ser suministrados por
medios lquidos, pero el crecimiento en medio lquido puede ser retardado y el desarrollo
afectado por la privacin de oxgeno y la hiperhidratacin. La concentracin de oxgeno de
medios lquidos es a menudo insuficiente para satisfacer las necesidades respiratorias de
clulas y tejidos sumergidos. Puede aumentarse aumentando la concentracin de oxgeno del
medio o colocando clulas o tejidos en contacto directo con el aire. Si el potencial de agua del
medio es mayor (menos negativo) que el de una clula, el agua fluye hacia la clula y la
vacuola se distende. Las clulas y tejidos afectados de esta forma se describen como
hiperhidrulicos. Los brotes muestran a menudo desrdenes fisiolgicos con sntomas que
pueden ser reconocidos visualmente (Captulo 13) (Debergh et al., 1992, Gaspar et al., Preece
y Sutter, 1991, Ziv, 1991). El trmino hiperhdrico es preferible al trmino usado anteriormente
"vitrificado" por razones explicadas por Debergh et al. (1992). El potencial hdrico se determina
por el potencial osmtico de los solutos en el medio y, en el caso de un medio gelificado, por el
potencial matricial del gel (Seccin 4.1) (Beruto et al., 1995, Fujiwara y Kozai, 1995, Owens y
Wozniak, 1991). Las reducciones en la hiperhidricidad se pueden lograr aumentando las
concentraciones de los solutos y del gel. La hiperhidricidad tambin puede reducirse mediante
la evaporacin del agua de los tejidos si se ponen en contacto con el aire.
El contacto de tejidos cultivados con aire, para aliviar problemas de hiperhidricidad e hipoxia,
puede conseguirse mediante el uso de soportes porosos o semislidos (gelificados). La
ventaja de los soportes, en oposicin a las capas delgadas de medio lquido, es que los tejidos
se pueden colocar en un volumen suficiente de medio para evitar el agotamiento de los
nutrientes y permitir la dispersin de las toxinas que podran ser producidos por los tejidos
vegetales. Las ventajas relativas del medio lquido, soportes slidos o medios gelificados,
varan con el tipo de material que se est cultivando, el propsito del cultivo y la escala de
cultivo, como se discute a continuacin.
6.1. MEDIOS LQUIDOS
El medio lquido, sin estructuras de soporte, se utiliza para el cultivo de protoplastos, clulas o
sistemas radiculares para la produccin de metabolitos secundarios, y la propagacin de
embriones somticos, ndulos meristemticos, microtubrculos y racimos de brotes. En medio
lquido, estos cultivos a menudo dan velocidades de crecimiento ms rpidas que en un medio
solidificado con agar. Los cultivos pueden estar completamente o slo parcialmente
sumergidos en el medio.
La aireacin de medio lquido en placas de Petri estacionarias es a veces adecuada para el
cultivo de protoplastos y clulas debido a la profundidad del medio, pero puede ser todava
subptima. Anthony et al. (1995) de protoplastos cultivados de yuca, en medio lquido en
placas de Petri con una capa subyacente de agarosa en la que se incorporaron barras de
vidrio verticalmente. Se observ una divisin de protoplastos sostenida en los cultivos con
barras de vidrio, pero no en los controles sin barras de vidrio. Los autores sugirieron que las
varillas de vidrio extendan el menisco lquido, donde las colonias celulares se agrupaban lo
que haca que se facilitase el intercambio gaseoso entre el lquido y la atmsfera anterior.
Anthony et al. (1997) protoplastos cultivados de Passiflora y Petunia en frascos de vidrio de 30
ml que contenan suspensiones de protoplastos en alcuotas de 2 ml, ya sea solo o en
presencia de los portadores de oxgeno ErythrogenTM o Perfluorodecalina oxigenada. La
divisin celular en cada una de las dos especies fue estimulada por ambos portadores de
oxgeno.
La experimentacin a escala de laboratorio sobre cultivos inmersos de clulas, tejidos y
rganos puede realizarse en frascos Erlenmeyer de 125 ml o 250 ml. Los cultivos a gran
escala se realizan generalmente en biorreactores con una capacidad de 1 litro o ms. La
concentracin de oxgeno en el medio se eleva por el oxgeno en la fase gaseosa anterior y
las burbujas de aire dentro del lquido. El aumento de la concentracin de oxgeno y la
circulacin del medio se facilita en matraces mediante el uso de sacudidores giratorios y en
biorreactores mediante agitacin y / o burbujeo de aire a travs del medio (Captulo 1).
El uso de biorreactores a menudo implica el ajuste automatizado del medio de cultivo. El
diseo de biorreactores para clulas y rganos de plantas fue revisado por Doran (1993) y
Tautorus y Dunstan (1995) han revisado el uso de frascos de agitacin y biorreactores para la
expansin de cultivos embriognicos en suspensin de plantas. La importancia de la
concentracin de oxgeno en los biorreactores puede ilustrarse mediante una investigacin
sobre el crecimiento de las races pilosas de Atropa belladonna (Yu y Doran, 1994).
Encontraron que no hubo crecimiento en las tensiones de oxgeno de 50% de saturacin de
aire, pero entre 70% y 100% de saturacin de aire, la longitud total de la raz y el nmero de
puntas de raz aument exponencialmente. La hiperhidricidad en cultivos lquidos se puede
evitar aadiendo a los osmorreguladores medios, tales como manitol, maltosa y sorbitol, e
inhibidores de la biosntesis de giberelina incluyendo ancimidol y paclobutrazol (Ziv, 1989).
Las plntulas y los microtubrculos se pueden cultivar por inmersin parcial en medio lquido.
Un mtodo de airear tejidos es mediante la inundacin y evacuacin automatizada de tejidos
por medio lquido. Este mtodo se ha utilizado para producir microtubrculos de papa a partir
de recortes de un solo nudo (Teisson y Alvard, 1999). Un enfoque alternativo a la aireacin es
aplicar el medio lquido sobre los tejidos vegetales como una niebla de nutrientes. Por
ejemplo, Kurata et al. (1991) encontraron que los nudos de papa crecieron mejor en la niebla
de nutrientes que en los cultivos a base de agar.
6.2. APOYO POR MATRICES SEMI-SLIDAS
Los medios gelificados proporcionan matrices de soporte semislidas, que se utilizan
ampliamente para el cultivo de protoplastos, clulas, tejidos y rganos. Se han utilizado agar,
agarosa, gomas gellan y varios otros productos como agentes gelificantes.
6.2.1. Agar
El agar se emplea muy ampliamente para la preparacin de medios de cultivo semislidos.
Tiene las ventajas que lo han hecho tan ampliamente utilizado para el cultivo de bacterias, a
saber: -
Forma geles con agua que derrite a aprox. 100 C y solidificar a aprox. 45 C, y son por lo
tanto estables a todas las temperaturas de incubacin factibles;
los geles no son digeridos por enzimas vegetales;
el agar no reacciona fuertemente con los componentes del medio.
Para asegurar un contacto adecuado entre el tejido y el medio, generalmente se usa una
concentracin ms baja de agar para cultivos de plantas que para el cultivo de bacterias. Los
medios vegetales no estn bien gelificados, sino
semislido. Dependiendo de la marca, generalmente se usan concentraciones de entre 0.5-
1.0% de agar para este propsito. Se cree que el agar se compone de una mezcla compleja
de polisacridos relacionados construidos a partir de galactosa. Estos van desde una fraccin
de polmero neutro no cargado, agarosa, que tiene la capacidad de formar geles fuertes, hasta
polisacridos aninicos altamente cargados, a veces llamados agaropectinas, que dan al agar
su viscosidad. El agar se extrae de especies de Gelidium y otras algas rojas, recogidas del
mar en varios pases diferentes. Vara de naturaleza segn el pas de origen, el ao de
recoleccin y la forma en que se ha extrado y procesado. La proporcin de agarosa a
polisacridos totales puede variar de 50 a 90% (Adrian y Assoumani, 1983). Los agares
contienen pequeas cantidades de macro y microelementos; En particular calcio, sodio,
potasio y fosfato (Beruto et al., 1995), carbohidratos, trazas de aminocidos y vitaminas (Day,
1942) que afectan las caractersticas osmticas y nutrientes de Un gel Tambin contienen
sustancias fenlicas (Scherer et al., 1988) y grados menos puros pueden contener cidos
grasos de cadena larga, inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.
Como el agar puede ser el componente ms caro de los medios vegetales, existe el inters en
minimizar su concentracin. Las concentraciones de agar pueden considerarse inadecuadas
si no soportan explantes o conducen a hiperhidricidad. La hiperhidricidad disminuye a medida
que se aumenta la concentracin de agar pero puede haber una reduccin acompaante en la
velocidad de crecimiento. Por ejemplo, Debergh et al. (1981) encontraron que los cultivos de
brotes de Cynara scolymus eran hiperhdricos en medio que contena 0,6% de agar Difco
'Bacto'. No se produjo hiperhidricidad en medio que contena agar al 1,1%, pero se redujo la
proliferacin de brotes. Del mismo modo, Hakkaart y Versluijs (1983) encontraron que los
brotes de clavel eran hiperhdricos en medio que contena 0,6% de agar mientras que el
crecimiento se reduca severamente en medio que contena 1,2%. Durante estudios para
optimizar la produccin de callos morfognicos a partir de discos foliares de remolacha
azucarera, Owens y Wozniak (1991) encontraron grandes diferencias en el nmero de
embriones y brotes somticos segn el agente gelificante empleado. Encontraron que la
disponibilidad de agua, determinada por el potencial de gel matricial, era el factor dominante
implicado. Cuando se ajustaron las concentraciones de los agentes gelificantes para dar
medios de igual potencial de gel matricial, se encontraron embriones somticos y brotes en
nmeros similares en agar Bacto (0,7%), agarosa HGT (0,46%), Phytagar (0,62%) y Gelrite
0,12%).
Varias marcas y grados de agar estn disponibles comercialmente. Estos difieren en las
cantidades de impurezas que contienen y sus capacidades de gelificacin. La capacidad de
gelificacin de las marcas Difco de agar aument con una pureza creciente, es decir, 'Noble'>
'Purified'> 'Bacto' (Debergh, 1983). Despus de eliminar las impurezas de agar mediante el
sellado del agar en bolsas semipermeables y el lavado en agua desionizada, los potenciales
de agua de geles de tres marcas eran sustancialmente ms bajos que los geles no lavados
(Beruto et al., 1995). Anders et al. Observaron una diferencia de diez veces en la tasa de
regeneracin de la caa de azcar. (1988) sobre los medios gelificados con las mejores y
menos eficaces de siete marcas de agar. Scholten y Pierik (1998) investigaron las diferentes
caractersticas de crecimiento de siete diferentes marcas de agar en el crecimiento de brotes
axilares, brotes adventicios y races adventicias de rosa, lirio y cactus. Llegaron a la
conclusin de que ningn bioensayo individual poda identificar "buenos o malos" agares para
un gran grupo de especies de plantas, pero Merk 1614, Daishin, MC29 y BD Purified dio los
mejores resultados en la mayora de los experimentos. 'Daishin' no mostr variaciones de lote
a lote. No encontraron relacin entre el precio y la calidad de las marcas de agar.
Agarosa. La agarosa es el resto de gel de alta resistencia de agar. Consta de cadenas
polimricas -D (1 3) galactopiranosa y 3,6-anhidro--L (1 4) galactopiranosa de 20-160
unidades monosacrido unidas alternativamente para formar hlices dobles. Existen tambin
diversos productos de agaro-pectina disponibles, que se han extrado del agar y se han
tratado para eliminar la mayor parte de los grupos laterales de sulfato residual (Shillito et al.,
1983). Debido a que la preparacin implica procesos adicionales, la agarosa es mucho ms
cara que el agar y su uso slo se justifica para cultivos valiosos, incluyendo el cultivo de
protoplastos y anteras. Las marcas pueden diferir ampliamente en su idoneidad para estas
aplicaciones. Se usan concentraciones de 0,4 - 1,0%. Existen derivados de agarosa que se
funden y gelifican a temperaturas inferiores a 30 C, hacindolos especialmente adecuados
para ensayar ingredientes de los medios que son termolbiles o para incrustar protoplastos.
La agarosa de bajo punto de fusin se prepara introduciendo grupos hidroxietilo en las
molculas de agarosa (Shillito et al., 1983). Otra ventaja de agarosa sobre agar se encuentra
en la eliminacin de componentes txicos de agar durante su preparacin. Bolandi et al.
(1999) prefirieron incrustar protoplastos en agarosa, en lugar de usar medio lquido, porque en
la agarosa la matriz semislida aplica una presin directa sobre la membrana plasmtica de
los protoplastos. Se mezclaron protoplastos de girasol con 0,5% de agarosa, se pipetearon
50 \ mu l
Gotas de la mezcla en placas de Petri y las cubri con una fina capa de medio de cultivo. Se
utiliz un mtodo similar para cultivar protoplastos de Dioscorea por Tor et al. (1999). El uso de
gotitas tiene la ventaja de que se puede conseguir una elevada densidad de revestimiento en
las gotitas, mientras que se expone a los protoplastos a un depsito ms grande de medio de
cultivo en la fase lquida. Bishoi et al. (2000) cultivaron inicialmente anteras de arroz Basmati
en medio lquido, luego utilizaron agarosa al 1,0% para cultivar callos derivados de
microsporas.
6.2.2. Goma gellan
La goma Gellan es un agente gelificante ampliamente utilizado en el cultivo de tejidos
vegetales, que se comercializa bajo diversos nombres comerciales, incluyendo Gelrite,
Phytagel y Kelcogel. Es un exopolisacrido que encapsula clulas de la bacteria
Sphingomonas paucimobilis (= Auromonas elodea = Pseudomonas elodea), de las cuales se
obtiene por fermentacin industrial. La estructura, las propiedades fisicoqumicas y la reologa
de soluciones de goma gellan y polisacridos relacionados han sido revisadas por Banik et al.
(2000). La goma de Gellan consiste en un tetrasacrido de repeticin lineal de D-glucosa,
cido D-glucurnico, D-glucosa y L-ramnosa. Las soluciones calefactoras de goma de gelano
en soluciones que contienen cationes, tales como K +, Ca2 +, Mg2 +, hacen que el
polisacrido forme un gel en el que los polmeros forman una doble hlice paralela medio
escalonada. El polisacrido comercial desacetilado y purificado forma un gel firme no elstico.
El gel se ajusta rpidamente a una temperatura, determinada por las concentraciones del
polisacrido y el catin, que vara entre 35-50C (Kang et al., 1982). El producto comercial
contiene cantidades significativas de potasio, sodio, calcio y magnesio (Pasqualetto et al.,
1988a, b, Scherer et al., 1988), pero se dice que est libre de las impurezas orgnicas
encontradas en agar. No est claro si estos cationes permanecen o no totalmente disponibles
para los cultivos de plantas. Algunos investigadores (Gawel et al., 1986, 1990, Trolinder y
Goodin, 1987, Umbeck et al., 1987) a~naden un extra de 750 mg l-1 de MgCl2 a un medio que
contiene sales de MS para ayudar a la gelificacin al 1,6% de Gelrite. En la mayora de los
otros informes sobre el uso de Gelrite, los cationes en el medio han sido suficientes para
producir un gel.
Beruto et al. (1995) encontraron que 0,12% de Gelrite y 0,7% de Bacto agar tienen un
potencial matricial equivalente y apoyan la regeneracin adventicia equivalente en discos
foliares de remolacha azucarera. Como la goma gellan se usa en menor concentracin que el
agar, el coste por litro de medio es menor. Produce un gel claro en el cual los tejidos de las
plantas pueden verse ms fcilmente y la contaminacin microbiana se detecta ms
fcilmente que en los geles de agar. Se ha demostrado ser un agente gelificante adecuado
para cultivos de tejidos de muchas plantas herbceas y hay informes de su uso exitoso para el
cultivo de callos, la formacin directa e indirecta de rganos adventicios y embriones
somticos, el cultivo de brotes de especies herbceas y semi-leosas y El enraizamiento de
las plntulas. En la mayora de los casos, los resultados han sido tan buenos, ya veces
superiores, a los obtenidos en medios solidificados con agar. Anders et al. (1988) describieron
la regeneracin de un mayor nmero de plantas de caa de azcar sobre Gelrite que sobre la
marca ms productiva de agar y Koetje et al. (1989) obtuvieron ms embriones somticos de
cultivos de callos de arroz sobre medios solidificados con Gelrite que con Bacto-agar. Los
cultivos de hongos, particularmente de algunas especies leosas, pueden convertirse en
hiperhdricos si Gelrite, como el agar, se usa a una concentracin demasiado baja. Hay
diferencias agudas en la respuesta de diferentes especies a la concentracin de Gelrite.
Turner y Singha (1990) encontraron que la tasa ms alta de proliferacin de brotes en Geum
ocurri en 0.2% y en Malus en 0.4%. Garin et al. (2000) obtuvieron embriones somticos ms
maduros de Pinus strobus sobre goma de gelano a una concentracin del 1% que a un 0,6%.
Pasqualetto et al. (1986a, b) utilizaron mezclas de Gelrite (0,1-0,15%) y Sigma @ agar (0,2-
0,3%) para prevenir la hiperhidricidad que se produjo en cultivos de brotes de Malus
domestica 'Gala' en medio solidificado con Gelrite solo. Nairn (1988) utiliz una mezcla de
Gelrite (0,194%) y agar Difco 'Bacto' (0,024%) para prevenir la hiperhidricidad que se produjo
en cultivos de brotes de Pinus radiata sobre gelificado medio con Gelrite al 0,2% solo.
6.2.3. Alginatos
El cido algnico es un heteropolmero lineal binario cido 1,4--D-manurnico y cido 1,4--L-
gulurnico (Larkin et al., 1988). Se extrae de varias especies de algas marrones. Cuando la
sal sdica se expone a iones de calcio, se produce gelificacin. Los alginatos son
ampliamente utilizados para el cultivo de protoplastos y para encapsular semillas artificiales.
Los protoplastos incrustados en perlas o pelculas delgadas de alginato se pueden depositar
densamente mientras estn expuestos a una gran piscina de medio que diluye inhibidores y
sustancias txicas. Los protoplastos embebidos pueden estar rodeados por clulas
enfermeras, ya sea libres en el medio circundante o separadas por filtros o membranas. El
alginato tiene las ventajas sobre la agarosa de que los protoplastos no tienen que estar
expuestos a temperaturas elevadas cuando se mezclan con el agente gelificante y el gel
puede licuarse aadiendo citrato sdico, liberando
Protoplastos o colonias celulares para su transferencia a otros medios. El mtodo de
incrustacin de protoplastos en perlas tal como se emplea por Larkin et al. (1988) implic
mezclar las suspensiones de protoplastos con una solucin acuosa de alginato sdico y dejar
caer, a travs de una aguja, en una solucin de cloruro clcico. Perlas que contienen los
protoplastos se formaron cuando el alginato hizo contacto con los iones de calcio. Se lavaron
perlas con una concentracin final de alginato sdico al 1,5% y se cultivaron en medio lquido
en un agitador orbital. Los protoplastos tambin pueden ser capturados en capas delgadas de
alginato (Dovzhenko et al., 1998).
Las semillas sintticas (semillas sintticas, semillas somticas) encapsuladas en alginato (Fig.
4.4) pueden prepararse a partir de embriones somticos (Timbert et al., 1995), puntas de
brotes (Maruyama et al., 1998), apicales y axilares Standardi, 1995), nodos individuales
(Piccioni, 1997) y agregados celulares de races peludas (Repunte et al., 1995). Los usos de
semillas sintticas incluyen la siembra directa en el suelo, almacenamiento de tejidos y
transferencia de materiales entre laboratorios en condiciones estriles. Los mtodos de
encapsulacin de embriones somticos de zanahoria fueron descritos por Timbert et al.
(1995). Los embriones en forma de torpedo se mezclaron con una solucin de alginato de
sodio al 1%. La mezcla se dej caer en una solucin de cloruro clcico 100 mM en sacarosa al
10%. Las perlas (3-3,5 mm de dimetro) se aclararon luego en una solucin de sacarosa al
10%.
Almidn
Sorvari (1986a, c) encontr que las plntulas formadas en frecuencias ms altas en otros
cultivos de cebada en un medio se solidificaron con almidn de maz al 5% o almidn de
cebada en lugar de con agar. El almidn de maz slo formaba un gel dbil y era necesario
colocar una red de polister en su superficie para evitar que los explantes se hundieran.
Sorvari (1986b) encontr que tom 5-14 semanas para que brotes adventicios se formaran en
discos de papa en medio solidificado con agar pero slo 3 semanas en medio que contena
almidn de cebada. Henderson y Kinnersley (1988) encontraron que los cultivos de callos de
zanahoria embriognicos crecieron ligeramente mejor en medios gelificados con almidn de
maz al 12% que con agar Difco `Bacto 'al 0,9%.
6.2.5. 'Kappa' - carragenano
El carragenano es un producto de las malas hierbas
El gnero Euchema y la forma kappa tiene fuertes propiedades gelificantes. Al igual que la
goma gellan, la kappa- carragenina requiere la presencia de cationes para la gelificacin. En
el medio de Linsmaier y Skoog (1965) al 0,6% p / v, la resistencia del gel era ligeramente
menor que la del 0,2% de Gelrite o el 0,8% de agar extra puro (Ichi et al., 1986). Chauvin et al.
(1999) encontraron que la regeneracin de cultivos de tulipn, gladiolos y brotes de tabaco era
posible en presencia de 200 mg l-1 de kanamicina, mientras que en varios otros agentes
gelificantes una concentracin de 100 mg l-1 inhiba la regeneracin.
6.2.6. Pectinas
Una mezcla de pectina y agar puede ser un sustituto menos costoso del agar. Por ejemplo, se
emple un medio semislido consistente en 0,2% de agar ms 0,8-1,0% de pectina, para el
cultivo de brotes de fresa y algunas otras plantas (Zimmerman, 1979).
6.2.7. Otros agentes gelificantes
Battachary et al. (1994) encontraron sago (de
Metroxylon sagu) e isubgol (de Plantago ovata) fueron sustitutos satisfactorios de agar a,
respectivamente, una octava y una dcima parte del coste del agar A7921 purificado Sigma.
6.3. SOPORTES POROSOS
La aireacin de los tejidos sobre un sustrato poroso suele ser mejor de lo que sera en agar o
lquido esttico.
Chin et al. (1988) utilizaron una membrana de polipropileno flotante flotando sobre un medio
lquido para cultivar clulas y protoplastos de esprragos. La membrana (Celgard 3500,
Questar Corp., Charlotte, N.C.) tiene un tamao de poro de 0,04 mm y es autoclavable.
Conner y Meredith (1984) encontraron que las clulas crecieron ms rpidamente en papeles
de filtro depositados sobre almohadillas de espuma de poliuretano saturadas con medio que
en agar. Young et al. (1991) soportaron brotes de tomate sobre medio de cultivo lquido sobre
una membrana de polipropileno microporosa flotante y arrastraron los brotes en crecimiento a
travs de redes de polipropileno. Ellos informaron oportunidades para el desarrollo de este
mtodo para la mecanizacin por manipulacin masiva. Las balsas de membrana tambin
fueron utilizadas por Teng (1997) y Watad et al. (1995, 1996).
Cheng y Voqui (1977) y Cheng (1978) usaron velln de polister para apoyar cultivos de abeto
Douglas que fueron irrigados con medios lquidos en placas Petri. Las plntulas que se
regeneraron a partir de explantes de cotiledn se cultivaron en un tejido de 3 mm de espesor.
Cuando se dispers una suspensin de protoplastos sobre tela de 0,5 mm de espesor, se
produjeron numerosas colonias en 12 das, mientras que en ausencia del soporte, las colonias
celulares no proliferaron ms all de la etapa de 20 clulas. Una ventaja importante en el uso
de este tipo de soporte de tela es que los medios se pueden cambiar de forma sencilla y
rpida sin alterar los tejidos. El sistema tambin se ha usado para el cultivo de protoplastos de
otras plantas (por ejemplo, Russell y McCown, 1986).
Heller y Gautheret (1949) encontraron que los tejidos se pueden cultivar satisfactoriamente en
trozos de papel de filtro sin cenizas humedecidos por contacto con un medio lquido. Los
explantes muy pequeos, como las puntas de meristema, que podran perderse si se colocan
en un medio lquido rotado o agitado, pueden cultivarse con xito si se colocan en una tira en
forma de M de papel de filtro (a veces llamada soporte Heller). Cuando el papel plegado se
coloca en un tubo de medio lquido, los brazos laterales actan como mechas (Goodwin,
1966). Este mtodo de soporte asegura una excelente aireacin de los tejidos pero el tiempo
extra requerido para la preparacin e insercin ha significado que las mechas de papel se
usan solamente para propsitos especiales tales como las etapas culturales iniciales de
explantes pequeos individuales que de otro modo son difciles de establecer. Si los explantes
crecen mejor en agar o en soportes de papel de filtro, vara de una especie de planta a otra.
Davis et al. (1977) encontraron que las puntas de brote de clavel crecieron menos bien en
puentes de papel de filtro que en agar al 0,6% pero los explantes de brotes axilares de
Leucospermum sobrevivieron en puentes pero no en agar.
Tambin se us papel para la construccin de tapones (comercializados por Ilacon Ltd,
Tonbridge, UK TN9 1NR) conocidos como Sorbarods (Roberts y Smith, 1990). stos son
cilndricos (20 mm de longitud y 18 mm de dimetro) y consisten en celulosa frisada fra,
plegada longitudinalmente, envuelta en papel de celulosa. El tapn tiene una porosidad
(volumen total - volumen de celulosa) del 94,2% y alta capilaridad, de manera que el medio de
cultivo se extrae eficientemente en el tapn, dejando los lados del tapn en contacto directo
con el aire. Las races permean los tapones y estn protegidas por la celulosa durante la
transferencia al suelo. Las plntulas de crisantemo en Sorbarods formaron tallos ms largos,
hojas ms grandes, ms races, y desarrollaron una mayor masa fresca, pesos secos y
proporciones de masa fresca a seca que las plntulas en medio solidificado con agar (Roberts
y Smith, 1990). La mayor proporcin de masa fresca a seca indica que el contacto con el
medio lquido condujo a una mayor hidratacin de los tejidos. Esto fue posteriormente
controlado por la inclusin de un retardante de crecimiento, paclobutrazol (1 mg l-1), en el
medio de cultivo (Smith et al., 1990a). Otros materiales porosos que se han utilizado para
soportar el crecimiento de plantas incluyen lana de roca (Woodward et al., 1991, Tanaka et al.,
1991), espuma de poliuretano (Gutman y Shiryaeva, 1980; Scherer et al., 1988), vermiculita
(Kirdmanee et al. Al., 1995), una mezcla de vermiculita y Gelrite (Jay-Allemand et al., 1992).
Afreen-Zobayed et al. (2000) batata cultivada, en medio sin azcar en condiciones
autotrficas, en mezclas de pulpa de papel y vermiculita en varias proporciones. Se obtuvo un
crecimiento ptimo sobre una mezcla que contena 70% de pasta de papel. En esta mezcla, la
masa fresca de las plntulas era mayor en un factor de 2,7 que en el medio solidificado con
agar. Las mezclas de pulpa de papel y vermiculita, en proporciones no especificadas, se
preparan en un producto comercial conocido como Florialite (Nisshinbo Industries, Inc.,
Tokyo). Afreen-Zobayed et al. (1999) encontraron que las tasas de crecimiento de las plntulas
de camote cultivadas autotrficamente en Florialite fueron mayores, en orden ascendente, en
agar, goma gellan, vermiculita, Sorbarods y Florialite (mejor). La masa seca de hojas y races
fue mayor por factores de 2,9 y 2,8, respectivamente, sobre Florialita que sobre una matriz de
agar. Estos autores observaron que las races se propagan mejor en Florialite que en
Sorbarods. Lo atribuyeron a la orientacin en forma de red de fibras en Florialite que
contrastaba con la orientacin vertical de las fibras en Sorbarods. Ichimura y Oda (1995)
encontraron tres sustancias que estimularon el crecimiento de las plantas en extractos de
pulpa de papel. Cada una se caracteriz por su bajo peso molecular y su alta polaridad. Es
posible que estas sustancias contribuyan al crecimiento superior observado en sustratos que
contienen pasta de papel.
6.3.1. Oportunidades para mejorar la ventilacin y fotoautotrofa
Cuando las plntulas se cultivan en recipientes que contienen aire a una humedad relativa
(HR) inferior al 100%, ocurre la transpiracin que es un factor importante en la reduccin de la
hiperhidricidad (Gribble, 1999). La humedad relativa en los recipientes de cultivo puede
reducirse mediante la ventilacin, pero los sustratos gelificados son inadecuados debido a que
la absorbancia del agua por las races de una planta transpiradora est impedida por la baja
conductividad hidrulica del gel (Fujiwara y Kozai, 1995) Seca As, una caracterstica comn
de los estudios que utilizan recipientes ventilados ha sido el uso de medio lquido soportado
por materiales porosos.
Por ejemplo, cuando las plntulas de crisantemo se hicieron crecer en Sorbarods en un
recipiente de cultivo con aire HR al 94%, se indic una reduccin en la hidratacin del tejido
mediante una relacin de masa fresca a seca significativamente ms baja que a 100% de HR
(Smith et al., 1990b ) Y aumenta la longitud del tallo y el rea foliar. En esto
, La HR se redujo a 94% por difusin gaseosa a travs de una membrana permeable a los
gases que cubra los orificios perforados en la tapa del recipiente de cultivo. El uso de tales
vasos de cultivo ventilados puede mejorar significativamente el crecimiento de la planta
reduciendo la hiperhidratacin y facilitando el movimiento de solutos a las hojas en la corriente
de transpiracin. Tambin proporciona oportunidades para el crecimiento fotoautotrfico en
medios libres de azcar. Cuando las plntulas se cultivan en recipientes cerrados, las
concentraciones de dixido de carbono caen a niveles bajos en el perodo de luz, como Kozai
y Sekimoto (1988) demostraron en cultivos de plantas de fresa. La fotosntesis requiere un
suministro adecuado de dixido de carbono y una iluminacin adecuada. Se pueden mantener
concentraciones adecuadas de dixido de carbono para fotoautotrofa en recipientes de cultivo
ventilados con (Afreen-Zobayed et al., 1999, 2000) o sin (Horan et al., 1995) niveles elevados
de dixido de carbono en la atmsfera fuera del recipiente de cultivo.
Se puede conseguir una iluminacin adecuada bajo luces que proporcionan un flujo de
fotones fotosintticos de 150 mol m-2 s-1 en una sala de cultivo (Afreen- Zobayed et al.,
1999, 2000) o en luz diurna en un invernadero (Horan et al. , 1995). Los requisitos
ambientales de la fotoautotrofa in vitro han sido revisados por Jeong et al. (1995) y sus
ventajas han sido descritas por Kozai et al. (1995).
6.4. CLULAS INMOBILIFICADAS
Los rendimientos de los metabolitos secundarios suelen ser mayores en clulas diferenciadas
de crecimiento lento que en las clulas no diferenciadas de rpido crecimiento. Al inmovilizar
clulas en una matriz adecuada, su velocidad de crecimiento puede ser retardada y la
produccin de productos secundarios mejorada. Se han empleado varios mtodos ingeniosos
de inmovilizacin. Los ejemplos incluyen la inmovilizacin en algodn enrollado en espiral
(Choi et al., 1995), tejido de fibra de vidrio reforzado con una solucin gelificante de
precursores de SiO2 hbridos (Campostrini et al., 1996), esponja de loofa y espuma de
poliuretano (Liu et al., 1999) Y perlas de alginato (Serp et al., 2000).