Anda di halaman 1dari 26

TEKNIK ANALISIS SEL

PUTRI RATNA SARI


1506675831
ABSTRAK
Berbagai macam metode digunakan untuk menganalisis sel seperti teknik flow cytometry,
teknik analisis sel tunggal, teknik analisis sel dalam jaringan, dan teknik analisis sel dengan
spektrofotometer/konvensional. Analisis sel dengan teknik flow cytometry memanfaatkan
metode pengukuran sel yang disertai dengan aliran cairan melalui suatu celah yang ditembus
dengan sinar laser. Teknik analisis sel tunggal menggunakan mikroskop baik dari jenis
mikroskop yang paling sederhana, sampai mikroskop yang modern dan canggih untuk melihat
heterogenitas dalam sel. Teknik analisis sel dalam jaringan menggunakan teknik analisis sitologi
dan sitokimia untuk mengidentifikasi komponen kimiawi dalam sel. Teknik analisis
spektofotmeter/konvensional memanfaatkan cahaya dalam hal absorbansinya yang berkaitan
dengan konsentrasi atau kandungan suatu sel.
Kata Kunci : cytometry, aliran, laser, mikroskop, heterogenitas, sitologi, sitokimia,
spektofotmeter, absorbansi.
I. TEKNIK FLOW CYTOMETRY
I.1 Pengertian dan Kegunaan Teknik Flow Cytometry
Flow cytometry adalah metode pengukuran (metri) jumlah dan sifat-sifat
sel (cyto) yang dibungkus oleh aliran cairan (flow) melalui celah sempit yang
ditembus oleh seberkas sinar laser. Setiap sel yang melewati berkas sinar laser
menimbulkan sinyal elektronik yang dicatat oleh instrumen sebagai karakteristik
sel bersangkutan. Setiap karakteristik molekul pada permukaan sel maupun yang
terdapat di dalam sel dapat diidentifikasi dengan menggunakan satu atau lebih
probe. Oleh karena itu, instrumen dapat mengidentifikasi setiap jenis aktivitas sel
dan menghitung jumlah masih-masing dalam suatu populasi campuran.
Setiap sel yang melewati berkas sinar laser akan menyebabkan sinar laser
terpencar (scattered) ke dua arah, yaitu forward scatter (FSC) yang pararel dengan
arah sinar dan side scatter (SSC) yang arahnya tegak lurus pada arah sinar laser.
Besarnya FSC berbanding lurus dengan atau menggambarkan volume atau ukuran
sel. Sel yang mati (walaupun penampakan mikroskopis sebaliknya), terlihat lebih
kecil dibanding sel hidup. Sel darah merah juga berbeda dengan sebenarnya,
umumnya lebih kecil dari semua sel darah. Adapun SSC ditentukan oleh
morfologi dan emisi sinar fluoresen yang dipancarkan oleh fluorokrom yang
digunakan untuk mewarnai sel. Sinyal-sinyal itu dikonversikan menjadi angka
digital dan diperlihatkan pada suatu histogram yang dapat dianalisis untuk
memperoleh informasi tentang karakteristik sel bersangkutan.
Gambar 1. Pancaran Sinar Laser saat Sel Melewati Berkas Sinar Laser
(Ormerod, M. G., 1998. Flow Cytometry: A Practical Approach. Edisi kedua)
Untuk identifikasi antigen, dapat digunakan berbagai zat pewarna
fluorokrom. Fluorokrom merupakan suatu senyawa fluoresein yang dapat
berpendar saat mengalami eksitasi oleh sinar dengan panjang gelombang tertentu.
Berikut beberapa fluorokrom yang sering digunakan dalam flow cytometry, yaitu
fluorescein isothyocyanate (FITC) yang memancarkan sinar hijau-kuning dengan
emisi 519 nm, 4,6-Diamidino 2-Phenylinidole (DAPI) dengan emisi 455 nm,
propidium iodide (PI) dengan emisi 617 nm dan phycoeritrin (PE) yang
memancarkan sinar merah-orange dengan emisi 578 nm.
I.2 Kegunaan Flow Cytometry
Flow cytometry merupakan sebuah metode yang secara luas digunakan
untuk meneliti ekspresi permukaan sel dan molekul sellular, menggolongkan dan
mendeskripsikan tipe sel yang berbeda dalam populasi sel yang heterogen,
menaksirkan kemurnian subpopulasi yang terisolasi, dan menganalisis ukuran dan
jumlah sel. Flow cytometry dengan cell sorting (fluorescence activated cell sorter,
FACS) memiliki aplikasi dalam sejumlah bidang, termasuk biologi molekuler,
patologi, imunologi, biologi tanaman, dan biologi kelautan. Beberapa di
antaranya, meliputi:
a. Analisis dan pemisahan subpopulasi limfosit dengan menggunakan
antibodi monoklonal terhadap antigen permukaan yang diberi label dengan
zat warna fluorokrom.
b. Pemisahan limfosit yang memproduksi berbagai kelas imunoglobulin
dengan menggunakan antibodimonoklonal terhadap kelas dan subkelas Ig
spesifik dan tipe L-chain.
c. Memisahkan sel hidup dari sel mati.
d. Analisis kinetik atau siklus sel dan kandungan DNA atau RNA.
I.3 Flow cytometer
Flow cytometer merupakan salah satu instrumen yang menggunakan
metode flow cytometry. Alat tersebut memiliki kemudahan serta keunggulan
dibanding dengan cara konvensional. Selain dapat mengukur berbagai macam
karakteristik sel dalam waktu yang cepat secara simultan, teknologi ini juga
memiliki ketepatan dan ketelitian yang tinggi. Flow cytometer pada dasarnya
adalah mikroskop yang dilengkapi dengan komponen yang berfungsi untuk
melalukan individu sel secara sekuensial melalui berkas cahaya (laser) yang akan
dianalisis. Komponen penyusunnya terdiri atas tiga sistem, yaitu fluida, optik, dan
elektronik.
Sistem fluida

Gambar 2. Cara Kerja Sistem Fluida


(Ormerod, M. G., 1998. Flow Cytometry: A Practical Approach. Edisi kedua.)
Sistem fluida mengarahkan sel melalui cahaya (laser) untuk dianalisis, terdiri
dari sheath fluid dan central channel. Tenaga hidrodinamik mengakibatkan sel
satu per satu melewati central channel. Fluida merupakan bagian yang paling
sensitif pada flow cytometer. Jika terjadi kesalahan, semuanya akan salah dan
fatal. Masalahnya sebagai berikut:
a. Clogs, celah pada aliran larutan sangat kecil.
b. Gelembung udara, akan mengganngu aliran dan yang akan
diinterpretasikan sebagai sel.
c. Leaks, kurangnya tekanan udara dalam sistem akan mengganggu aliran
selular dan akan memengaruhi hasil.
d. Errors, yang paling umum memengaruhi fluida adalah:
Clumps of cells. Hal ini akan clog mesin dan berakibat kesulitan utama
dan headaches. Kejadian ini dapat diatasi dengan pre-filtrasi populasi sel
tidak lebih besar dari 50 um filter. Konsentrasi sel yang tidak sesuai.
Semua larutan memiliki proporsi partikel debu yang rendah. Suatu flow
rate yang lebih besar sekitar 4.000 sel/sekon meningkatkan resiko pada
pengukuran multiple cell secara simultan.
Sistem optik
Sistem optik terdiri atas laser sebagai sumber cahaya dan mengeksitasi
(fluorokrom) sel dalam aliran sampel, serta filter optik untuk mengarahkan sinyal
cahaya yang dihasilkan ke detektor yang sesuai.
Alasan penggunaan laser, karena kemampuannya untuk difokuskan menjadi
berkas cahaya elliptis. Ini terkait dengan komponen-komponen fluida terkait.
Laser memancarkan cahaya koheren dan merupakan berkas sangat pararel. Hal ini
memungkinkan dasar pengukuran yang berbasis pada gangguan berkas (beam
disturbance) dapat dilakukan (forward scatter, side scatter). Penggunaan berkas
terfokus yang elliptis dapat menghasilkan hanya cahaya fluoresensi dari single
cell (size dependent) yang dapat diukur setiap saat.
Pengukuran sel pada flow cytometer menggunakan prinsip pendar cahaya
(light scattering). Prinsip light scattering adalah metode di mana sel dalam suatu
aliran melewati celah di mana berkas cahaya difokuskan ke sel (sensing area).
Apabila cahaya tersebut mengenai sel, akan dihamburkan, dipantulkan, atau
dibiaskan ke semua arah. Beberapa detektor yang diletakkan pada sudut-sudut
tertentu akan menangkap berkas-berkas sinar sesudah melewati sel. satu detektor
diletakkan berhadapan dengan sumber sinar (FSC), beberapa diletakkan dengan
membentuk sudut (SSC), dan detektor fluoresen. FSC berkorelasi dengan volume
atau ukuran sel, sedangkan SSC berhubungan dengan kompleksitas bagian dalam
partikel, seperti ukuran nukleus, tipe granula sitoplasma, dan kekasaran membran
plasma.
Deteksi sinyal dilaksanakan dengan menggunakan kombinasi
photomultiplier (cathode-ray) dan rangkaian elektronika. Sinyal yang
dibangkitkan oleh setiap sel pada dasarnya merupakan oscilloscope trace. Dengan
melakukan integrasi sinyal ini, akan dihasilkan suatu nilai numerik bagi
fluoresensi maupun nilai SSC.
Sistem Elektronik
Sistem elektronik berfungsi untuk mendeteksi cahaya dan mengubahnya
ke bentuk sinyal digital. Data yang dihasilkan oleh flow cytometer dapat diplot
dalam satu dimensi, untuk menghasilkan histogram atau dalam dua dimensi plot
titik, atau bahkan dalam tiga dimensi. Plot sering dibuat pada skala logaritmik,
karena emisi pewarna fluoresen yang berbeda. Data akumulasi menggunakan flow
cytometer dapat dianalisis menggunakan perangkat lunak komputer, seperti
WinMDI Flowjo, FCS Ekspres, VenturiOne, CellQuest Pro, atau Cytospec.

Gambar 3. Grafik Representasi Data Flow Cytometry


(Ormerod, M. G., 1998. Flow Cytometry: A Practical Approach. Edisi kedua.)
I.4 Sejarah dan Perkembangan Flow Cytometry
Pada 1934, Moldavan pertama kali memperkenalkan alat hitung sel darah
otomatik dengan metode flow through. Kemudian, pada 1950 dikomersialkan alat
dengan metode impedansi, tetapi masih menggunakan pengenceran bahan di luar
alat. Sepuluh tahun kemudian, pengenceran tidak dilakukan di luar alat, tapi
secara otomatis. Pada 1953, Crossland and Taylor memperkenalkan teknik
penghitungan sel darah, di mana sel dialirkan dalam saluran tunggal,
menggunakan bahan cair sebagai laminar sheat flow, dan sel diperiksa dengan
metode pendar cahaya. Pada 1965, diperkenalkan pengukuran sel dengan pendar
cahaya yang ditangkap oleh detektor di lebih dari satu sudut dan menggunakan
sinar dengan intensitas kuat, yaitu sinar laser. Sinar ini oleh sel itu dapat
dipantulkan, dibias, bahkan tembus ke dalam sel, sehingga dapat mendeteksi
intrasel.
Metode flow cytometry terus berkembang dengan perkembangan elektrik
komputer dan reagen, termasuk digunakannya monoklonal antibodi. Sampai saat
ini, pengukuran dengan metode flow cytometry menggunakan label fluoresensi,
selain mengukur jumlah, ukuran sel, juga dapat mendeteksi petanda dinding sel,
granula intraselular, struktur intra sitoplasmik, dan inti sel.

I.5 Aplikasi Flow Cytometry dengan Flow Cytometer FACS Calibur


1. Analisis DNA (Pengukuran kinetik sel )
Pengukuran kinetik pertumbuhan sel diperlukan untuk menentukan
prognosis kanker, mengetahui dinamika sel T pada infeksi HIV, dan
sebagainya. Kinetik sel dapat dipelajari dengan berbagai cara, salah satunya
adalah dengan mengukur indeks proliferasi. Pengukuran indeks proliferasi sel
dapat dilakukan dengan menentukan proporsi atau fraksi sel dalam fase-S
(yaitu: suatu fraksi dari populasi sel total dalam siklus sel) dan mengukur
kandungan DNA. Salah satu metode yang dapat digunakan adalah metode
flow cytometry. Prinsip metode ini adalah mengukur emisi fluoresen
fluorokrom yang terikat pada DNA dalam sel apabila sel itu dilewatkan berkas
sinar dengan panjang gelombang yang sesuai (laser). Zat warna fluorokrom
dapat mengikat DNA secara stokiometris. Pengikatan zat warna fluorokrom
pada DNA dapat memberikan informasi tentang kandungan DNA total dan
fraksi sel yang berada pada siklus sel secara cepat, akurat, dan praktis.
Fluorokrom yang digunakan untuk kuantifikasi DNA adalah propidium iodide
(PI) dan ethidium bromida. Interkalasi fluorokrom ini di antara pasangan basa
dsDNA atau RNA menghasilkan suatu kompleks dengan fluoresensi efisien
yang dapat dideteksi dengan sinar laser dengan kekuatan relatif rendah.
Kandungan DNA relatif (status ploidi) dari satu populasi sel dinyatakan
dengan indeks DNA dalam fraksi Go/G1 populasi sel bersangkutan
dibandingkan terhadap populasi sel kontrol diploidi. Indeks DNA populasi sel
normal ploidi adalah 1.0. Sel ganas, walaupun tidak selalu, biasanya
menunjukkan kandungan DNA abnormal (aneuploidi) dan pada histogram,
populasi abnormal akan menunjukkan puncak ekstra (hiperdiploidi). Fraksi sel
yang berada pada fase Go/G1, S dan G2M dapat dihitung dari distribusi DNA.
2. Analisis DNA (Analisa status ploidi tanaman)
Analisa ploidi tanaman dapat dilakukan dengan menggunakan flow
cytometry. Sampel dapat berupa jaringan daun tanaman yang kemudian
dilisiskan dalam larutan buffer pelisis dan DAPI (4,6-diamidino-2-
phenylindole). Selanjutnya larutan difiltrasi untuk memisahkan debris. Filtrat
kemudian dideteksi kandungan DNA-nya dengan flow cytometry. Ploidi dari
tanaman ditentukan dengan mengamati peak atau puncak yang ditunjukkan
pada layar monitor.
3. Uji fungsi neutrofil
Uji fungsi neutrofil merupakan parameter penting dalam menganalisis
respon imun seluler nonspesifik. Pengujian ini dapat dilakukan dengan cara
uji fagositosis partikel bakteri dan uji aktivitas phagocyte respiratory burst
menggunakan metode flow cytometry. Prinsip uji fagositosis adalah
menganalisis jumlah neutrofil yang mengandung bakteri berlabel yang
dibubuhkan.
Pengukuran fungsi fagositosis dan respiratory burst secara simultan
dapat dilakukan menggunakan darah yang diinkubasi dengan kuman
Stafilococcus aureus atau E coli yang telah diberi label fluorescein FITC
selama waktu tertentu (biasanya 60 menit) guna menganalisis proporsi sel
yang berisi bakteri. Fungsi respiratory burst dievaluasi dengan mengukur
banyaknya ethidium bromide (EB) berfluoresensi merah yang dihasilkan oleh
oksidasi hidroethidin yang terjadi akibat dibentuknya produk oksidatif oleh
PMN atas rangsangan bakteri yang difagositosis. Jadi, yang diukur oleh flow
cytometer adalah proporsi sel yang berisi bakteri yang berfluoresensi hijau
dan intensitas fluoresensi merah yang dihasilkan EB dalam sel PMN
bersangkutan. Fluorokrom yang dapat digunakan, antara lain propidium iodide
yang berfluoresensi merah untuk melabel Stafilococcus dan dihidrorhodamine
123 yang akan berubah menjadi rhodamine 123 yang berfluoresensi hijau
setelah dioksidasi.
4. Monitoring penderita terinfeksi virus HIV (Pengukuran limfosit T)
Monitoring status imunologi pada infeksi HIV bisa dilakukan dengan
metode flow cytometry. Pemeriksaan menggunakan flow cytometer yang
berbasis flow cytometry merupakan pemeriksaan yang paling baik untuk
limfosit T helper/inducer (CD4+) atau limfosit T supressor/cytotoxic (CD8+).
Virus HIV menginfeksi limposit T helper atau melalui antigen CD4+.
Limposit yang terinfeksi ini kemudian lisis ketika virion baru dilepaskan atau
dipindahkan oleh sistem imun selular. Pada infeksi HIV yang progresif,
jumlah CD4+ dan limposit T menurun. Jumlah absolut CD4+ merupakan
pengukuran yang penting untuk memprediksi, menentukan derajat, dan
monitoring progresivitas serta respons terhadap pengobatan pada infeksi HIV.
Pemeriksaan jumlah virus melengkapi pemeriksaan laboratorium untuk
monitoring penyakit. Besarnya berbanding terbalik dengan jumlah CD4+.
Jadi, jumlah CD4+ dan jumlah virus secara langsung menunjukkan status
imun penderita. Ini berguna untuk menentukan diagnosa, prognosa, dan
manajemen pengobatan pada penderita yang terinfeksi HIV.
Nilai normal limfosit T
Dewasa:
- Limfosit T CD4 absolut :lebih besar dari 500/cmm3
- Limfosit T CD4 % :lebih besar dari 25%
Bayi 12 bulan:
- Limfosit T CD4 absolut :lebih besar dari 1.500/cmm3
- Limfosit T CD4 % :lebih besar dari 25%
Anak-anak 1-5 tahun:
- Limfosit T CD4 absolut :lebih besar dari 1.000/cmm3
- Limfosit T CD4 % :lebih besar dari 25%
Contoh pemeriksaan laboratorium
a. Persiapan sampel : 3 ml darah vena dimasukkan ke dalam tabung
vakum K3EDTA dan ditutup rapat (pada suhu kamar, sampel stabil
<30 jam). Jika tidak langsung digunakan, dapat disimpan terlebih
dahulu dalam styrofoam. Pada penyimpanan lebih dari 48 jam sampel
darah dapat membeku (hemolisis).
b. Memasukkan 20 L reagen BD Trites CD3/CD4/CD45 dan 50 L
sampel darah ke dalam tabung BD Trucount. Tabung BD Trucount
berisi lycophilized pellet yang akan melepaskan fluorescent beads
yang diketahui jumlahnya apabila ke dalam tabung ditambahkan
reagen monoklonal antibodi dan darah EDTA, gunanya adalah untuk
menghitung jumlah absolut leukosit. Reagen BD Tritest
CD3/CD4/CD45 terdiri dari CD4+ FITC/ CD8+ PE/ CD3+ per CP.
Reagen tersebut merupakan reagen imunofluoresen tiga warna untuk
identifikasi absolut limfosit T CD4, limfosit T CD3+CD4+, dan
limfosit T CD3+ CD8+.
c. Campuran tersebut di-vortex dan diinkubasi selama 15 menit pada
suhu kamar (di tempat gelap).
b. Menambahkan 450 L lysing solution ke dalam campuran, kemudian
di-vortex dan diinkubasi kembali selama 15 menit pada suhu kamar.
c. Dibaca dengan flow cytometer FACS Calibur.
II. ANALISIS SEL TUNGGAL
II.1 Pengertian
Analisis-sel tunggal mengacu pada studi dari sel-sel individual diisolasi
dari jaringan pada organisme multisel .Analisis sel tunggal adalah langkah alami
dalam pendekatan reduksionis untuk mempelajari organisme. Dengan
mempelajari satu sel tertentu hasilnya juga akan bersifat spesifik pada sel
tertentu .Sebelum analisis sel tunggal dikenal,bidang mikrobiologi secara
tradisional terfokus pada studi pada tingkat populasi. Informasi tentang
bagaimana sel merespon lingkungan mereka, berinteraksi satu sama lain, atau
menjalani proses yang kompleks seperti diferensiasi selular atau ekspresi gen
telah diperoleh sebagian besar oleh kesimpulan dari data tingkat populasi.
Apresiasi baru bagi keberadaan dan pentingnya heterogenitas selular, ditambah
dengan kemajuan terbaru dalam teknologi, telah mendorong pengembangan alat-
alat baru dan teknik untuk studi sel mikroba individu. Akibatnya, para ilmuwan
telah mampu mencirikan mikroorganisme dan kegiatan mereka di tingkat belum
pernah terjadi sebelumnya yaitu di tingkat sel.
Teknik analisis sel tunggal telah digunakan untuk lebih menggambarkan
distribusi lingkungan dan aktivitas mikroorganisme, telah menjadi elemen kunci
dalam mengungkapkan proses yang tak terlihat seperti transfer gen antarspesies
dan komunikasi kimia, dan t digunakan untuk detail interaksi fisikokimia diskrit
antara mikroba dan permukaan mereka menjajah. Metode-sel tunggal juga telah
penting untuk pemahaman kita tentang hubungan antara biokimia seluler dan
perilaku dan basis selular tingkat populasi fenomena.
Penelitian dilakukan pada tingkat sel tunggal tidak dipengaruhi pada efek
rata-rata karakteristik curah fase metode populasi, mereka menawarkan tingkat
pengamatan mikroba diskrit yang tidak tersedia dengan metode mikrobiologi
tradisional. Teknik analisis sel tunggal merupakan kunci dalam menyelidiki
fenomena viabilitas mikroba yang berada di luar resolusi pendekatan berbasis
budaya dalam menjelaskan mekanisme patogenesis , dan dalam mengukur
motilitas dan pasukan invasif sel individu atau hifa.
II.2 Prinsip Dasar
Prinsip dasar pada analisis sel tunggal adalah mengamati makhluk hidup
berukuran kecil tak kasat mata dengan menggunakan mikroskop untuk
mendapatkan data berupa informasi tentang topografi (permukaan objek),
morfologi (bentuk dan ukuran partikel-partikel yang menyusun objek), komposisi
(elemen dan komponen yang membangun objek), dan crystallographic informasi
(bagaimana atom-atom disusun menjadi sebuah obyek).
II.3 Sejarah dan Perkembangan
Sejarah mikroskop sejalan dengan perkembangan penelitian terhadap
mikrobiologi, yaitu penelitian terhadap makhluk-makhluk yang berukuran sangat
kecil sehingga tidak dapat dilihat oleh mata telanjang. Makhluk-makhluk tersebut
baru dapat dilihat jika menggunakan alat. Alat inilah yang dikemudian hari dienal
dengan mikroskop. Orang pertama yang dapat melihat mikroorganisme adalah
seorang pembuat mikroskop amatir berkebangsaan Jerman, yaitu Antoni Van
Leeuwenhoek (1632-1723). Dia melihat mikroorganisme tersebut menggunakan
mikroskop dengan konstruksi yang sederhana. Konstruksi mikroskop yang
sederhana itulah yang menjadi dasar konstruksi mikroskop yang lebih canggih.
Sebenarnya sebelum Antonio Van Leeuwenhoek, pada tahun 1611
Keppler telah mencoba untuk merancang mikroskop. Lalu Robert Hooke sudah
berhasil melihat bagian-bagian terkecil dari makhluk hidup dengan menggunakan
mikroskop rancangan Keppler. Dia menamai bagian tersebut dengan sel. Hanya
kedua ilmuwan tadi belum dapat mendeteksi keberadaan mikroorganisme. Oleh
karena itu, dalam sejarah mikroskop, Van Leeuwenhoek lebih diakui sebagai
penemu mikroskop.

Gambar 4. Perkembangan Mikroskop


(http://www.academia.edu)
1. Mikroskop Optik
Mikroskop cahaya juga disebut mikroskop optik. Ini juga merupakan jenis
mikroskop senyawa yang digunakan untuk melihat mikroorganisme.
Mikroskop cahaya memiliki lensa yang berbeda yang membantu memperbesar
gambar dari mikroorganisme atau spesimen dimuat di atas panggung. Para
eyepieces memiliki kekuatan perbesaran 10x atau 16x. Para mikroskop cahaya
adalah jenis mikroskop yang digunakan dalam anatomi dan fisiologi untuk
mengamati binatang kecil, tanaman, sampel logam, dan mikroorganisme
seperti bakteri secara rinci. Mikroskop cahaya dapat memperbesar spesimen
tentang 1500x dan digunakan dalam banyak bidang biologi, anatomi dan
fisiologi.
Mikroskop ini menggunakan cahaya tampak dan sistem lensa untuk
memperbesar gambar manifold sampel. Jenis dasar dari mikroskop optik atau
cahaya sangat sederhana. Namun, desain yang kompleks telah diciptakan yang
membantu memberikan resolusi gambar yang lebih baik. Dengan demikian,
mikroskop cahaya telah dibagi menjadi dua konfigurasi yang berbeda:
mikroskop sederhana (satu lensa) dan mikroskop majemuk.
Gambar 5. Mikroskop Cahaya
(http://www.biologi-sel.com)
2. Mikroskop UV
Sebuah mikroskop UV menggunakan sinar UV untuk menghasilkan
gambar yang dua kali resolusi terlihat di mikroskop cahaya tampak. Mercury
arc atau xenon burner digunakan sebagai sumber sinar UV. Karena sinar UV
berbahaya bagi mata manusia, sensor digital atau film fotografi adalah
menghasilkan untuk membantu mengamati gambar.

Gambar 6. Mikroskop UV
(http://www.zeiss-campus.magnet.fsu.edu)
3. Mikroskop Fluoresens
Mikroskop fluoresensi menggunakan energi tinggi, pendek-panjang
gelombang cahaya yang menggairahkan elektron dari molekul tertentu hadir
dalam sampel. Hal ini menyebabkan elektron untuk pindah ke orbit yang lebih
tinggi dan ketika mereka kembali ke tingkat semula energi, mereka
memancarkan energi yang rendah, sinar gelombang panjang. Lampu ini
berada dalam spektrum terlihat yang membantu dalam pembentukan gambar.
Mikroskop ini banyak digunakan dalam mikrobiolgi dan imunologi, dan telah
dikembangkan untuk mendeteksi antigen mikroba pada bahan pemeriksaan
dengan jalan mewarnainya dengan antibodi spesifik yang telah diberi
tanda/label dengan zat warna fluoresen (immunofluorescence).
Gambar 7. Unit Mikroskop Fluorescence
(http://www.zeiss-campus.magnet.fsu.edu)
4. Mikroskop Elektron
Mikroskop elektron (EM) adalah salah satu mikroskop paling canggih
digunakan saat ini. Mikroskop ini didukung oleh berkas elektron dengan
panjang gelombang yang sangat pendek. Elektron ini menyerang obyek yang
datang di jalan dan membantu meningkatkan resolusi mikroskop. Mikroskop
elektron adalah salah satu jenis mikroskop yang digunakan untuk mempelajari
sel-sel seperti sel virus kecil serta molekul yang lebih besar. Ada berbagai
jenis mikroskop elektron yang dijelaskan di bawah ini:
a. Tranmission Electron Miscroscope
Transmission Electron Microscopei (TEM) digunakan untuk
mempelajari sel. Ultrathin irisan mikroorganisme seperti virus
ditempatkan pada grid kawat. Kemudian, sel-sel ini diwarnai dengan emas
atau paladium dan kemudian digunakan untuk mengamati di bawah
mikroskop elektron transmisi. Berkas elektron dibelokkan pada bagian
dilapisi padat dari sel dan gambar diamati pada latar belakang gelap dan
terang.

Gambar 8. Transmission electron micrograph of epithelial cells from a rat


small intestine (scale bar = 5 mm)
b. Scanning Electron Microscope
Scanning Electron Microscope (SEM) juga merupakan jenis
mikroskop elektron dengan kekuatan perbesaran rendah dari mikroskop
elektron transmisi. Namun, mikroskop ini membantu dalam melihat
gambar tiga dimensi dari mikroorganisme dan spesimen lainnya. Emas
dan paladium digunakan untuk noda spesimen dipasang pada mikroskop
elektron scanning.

Gambar 8. Unit Scanning Electron Microscope


(http://www.biologi-sel.com)
c. Mikroskop Pemindai Transmisi Elektron (STEM)
STEM merupakan salah satu tipe yang merupakan hasil
pengembangan dari mikroskop transmisi elektron (TEM). Pada sistem
STEM ini, electron menembus spesimen namun sebagaimana halnya
dengan cara kerja SEM, optik elektron terfokus langsung pada sudut yang
sempit dengan memindai objek menggunakan pola pemindaian dimana
objek tersebut dipindai dari satu sisi ke sisi lainnya (raster) yang
menghasilkan lajur-lajur titik (dots)yang membentuk gambar seperti yang
dihasilkan oleh CRT pada televisi / monitor.

Gambar 9. Unit STEM


(http://www.biologi-sel.com)

d. ESEM (Environtmental Scanning Electron Microscope)


Mikroskop ini adalah merupakan pengembangan dari SEM, yang
dalam bahasa Inggrisnya disebut Environmental SEM (ESEM) yang
dikembangkan guna mengatasi objek pengamatan yang tidak memenuhi
syarat sebagai objek TEM maupun SEM. Obyek yang tidak memenuhi
syarat seperti ini biasanya adalah bahan alami yang ingin diamati secara
detail tanpa merusak atau menambah perlakuan yang tidak perlu terhadap
objek yang apabila menggunakat alat SEM konvensional perlu
ditambahkan beberapa trik yang memungkinkan hal tersebut bisa
terlaksana. Cara kerja, pertama-tama dilakukan suatu upaya untuk
menghilangkan penumpukan elektron (charging) di permukaan objek,
dengan membuat suasana dalam ruang sample tidak vakum tetapi diisi
dengan sedikit gas yang akan mengantarkan muatan positif ke permukaan
objek, sehingga penumpukan elektron dapat dihindari. Hal ini
menimbulkan masalah karena kolom tempat elektron dipercepat dan ruang
filamen di mana elektron yang dihasilkan memerlukan tingkat vakum
yang tinggi. Permasalahan ini dapat diselesaikan dengan memisahkan
sistem pompa vakum ruang objek dan ruang kolom serta filamen, dengan
menggunakan sistem pompa untuk masing-masing ruang. Di antaranya
kemudian dipasang satu atau lebih piringan logam platina yang biasa
disebut (aperture) berlubang dengan diameter antara 200 hingga 500
mikrometer yang digunakan hanya untuk melewatkan elektron , sementara
tingkat kevakuman yang berbeda dari tiap ruangan tetap terjaga.

Gambar 10. ESEM


(http://www.belajarbiologi.com)
II.4 Analisis Sentriol
Sel hewan memiliki sepasang sentriol dalam sentrosom, daerah di dekat
nukleus tempat mikrotubula sel berawal. Sentriol masing-masing berdiameter 250
nm (0,25 um), disusun saling tegak lurus, dan masing-masing terdiri dari 9 set,
masing-masing set terdiri atas 3 mikrotubula (TEM). Proteomika merupakan
kajian secara molekular terhadap keseluruhan protein yang dihasilkan
dari ekspresi gen di dalam sel, terutama mengenai struktur dan fungsinya.
Keseluruhan protein di dalam sel dinamakan proteom. Dengan protein labelling,
diketahui bahwa sentriol sebenarnya terdiri atas komponen tubulin dan komponen
non tubulin. Namun dengan studi proteomika belum diketahui bagaimana cara
komponen tubulin dan komponen non-tubulin ini mengikat membentuk struktur
triplet sentriol.
Berikut ini tahap analisis Analsis Sentriol dengan Mikroskop Elektron
Cryo Tomography.

Sentriol diisolasi

Identifikasi bentuk dengan


tomogram
Pemodelan struktur atom
dan pewarnaan
Diketahui bentuk 3D &
kedalaman sentriol
Setelah diketahui triplet mikrotubulus terdapat langkah-langkah sebagai
berikut

Gambar 11. Model 3 Dimensi dari analisis Cryo- Tomogram


(http://pdbj.org/emnavi/emnavi_detail.php?id=2329)
II.5 Analisis Ribosom
Mikroskop cryo-elektron (cryoEM) adalah sebuah ensemble teknik yang
memungkinkan pengamatan spesimen biologi di lingkungan asli mereka pada
suhu kriogenik di EM (-180 C untuk tahap nitrogen cair, -269 C ). Tahapan
pertama dalam analisis ribosom adalah persiapan sampel. Untuk pengamatan di
cryoEM, sampel biologis yang diawetkan beku-terhidrasi dengan mencelupkan
secara cepat sampel berkurang menjadi film cairan yang sangat tipis kedalam
penangas etana cair. Operasi ini bisa melalui suatu peralatan otomatis
dikendalikan komputer seperti Vitrobot. Selanjutnya adalah menangkap gambar,
Gambar yang dihasilkan dua dimensi (2D), terkait dengan proyeksi potensi dalam
objek biologi. Detektor elektron dapat emulsi fotografi, CCD atau kamera CMOS.

III. ANALISIS SEL DALAM JARINGAN


III.1 Pengertian
Analisis sel dalam jaringan yaitu suatu metode yang melakukan analisis
satu atau lebih sel di dalam suatu jaringan. Salah satu contoh yang menggunakan
metodeanalisis sel dalam jaringan adalah imunohistokimia. Imunohistokimia
merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau
kadar antibody atau antigen dalam sediaan jaringan. Nama imunohistokimia
diambil dari nama immune yang menunjukkan bahwa prinsip dasar dalam
proses ini ialah penggunaan antibodi dan histo menunjukkan jaringan
secara mikroskopis. Dengan kata lain, imunohistokimia adalah metode
untuk mendeteksi keberadaan antigen spesifik di dalam sel suatu jaringan
dengan menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi (Ab) dan antigen (Ag)
pada jaringan hidup. Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan
jumlah dan ketebalan yang bervariasi tergantung dari tujuan pemeriksaan.
III.2 Prinsip Dasar
Klasifikasi cara mempelajari sel dapat dipandang dari sifat selnya,
misalnya adalah cara mempelajari sel hidup dan cara mempelajari sel yang mati.
Bisa juga dipandang dari teknik bagaimana sel itu dipelajari. Dalam uraian ini
adalah teknik analisis yang dipakai dalam menganalisis sel dalam jaringan.
1. Teknik Analisis Sitologi dan Sitokimia
Sitologi berasal dari akar kata cytos yang artinya cel dan logos artinya
ilmu pengetahuan. Jadi sitologi berarti ilmu yang mempelajari tentang sel.
Tujuan utama mempelajari sitokimia adalah untuk identifikasi dan lokalisasi
komponen kimiawi sel, baik yang sifatnya kualitatif maupun kuantitatif.
Selain itu juga adalah untuk mempelajari dinamika perubahan dan dinamika
organisasi sitokimianya yang terjadi atas perbedaan fungsinya. Dengan
demikian, dapat diharapkan ditemukan peran perbedaan komponen selular
dalam proses metabolik sel. Sitokimia modern, mengikuti tiga metode
pendekatan utama, yaitu:
Metode fraksionasi
Metode fraksionasi ialah teknik untuk memisahkan bagian-bagian sel.
Secara umum, teknik ini melibatkan homogenisasi, yaitu pemecahan sel
secara halus, dan sentrifugasi, yaitu pemisahan komponen-komponen sel oleh
gaya sentrifugal dalam alat sentrifuge. Sentrifuge ialah instrumen tempat
sampel cair diputar (disentrifugasi) mengelilingi sumbu vertikal. Sampel
diletakkan di dalam wadah plastik atau gelas yang ditempatkan pada rotor
yang menempel pada suatu poros vertikal yang dikendalikan oleh motor.
Rotasi rotor membuat sampel mengalami percepatan sentripetal dan gravitasi
buatan yang biasanya dinyatakan dalam perkalian percepatan gravitasi bumi.
Mesin yang paling canggih, yang disebut ultrasentrifuge, dapat berputar
secepat 80.000 rotasi per menit (rpm) dan memberikan gaya pada partikel-
partikel sampel hingga 500.000 kali gaya gravitasi bumi (500.000 g). Cara ini
meliputi homogenasi dan dekstruksi sel, melalui prosedur kimiawi maupun
mekanik, diikuti pemisahan fraksi selular tergantung pada massa, permukaan,
gravitasi spesifik.
Mikrokimia dan Ultra Mikrokimia
Banyak cara untuk menganalisis mikro dan ultramikrokimia, antara lain
dengan mikrokalorimeter, mikrospetrometrik, dsb. Cara-cara tersebut
memiliki sensitifitas tinggi sehingga dapat digunakan untuk membedakan
enzim dan koenzim. Misal, mikrokalorimeter adalah metode dengan cara
menggunakan panas yang diproduksi oleh proses katabolisme
mikroorganisme saat proses pertumbuhan. Caranya dengan membuat korelasi
antara jumlah absolute sel mikroorganisme dengan termogram.
Pewarnaan Sitokimia dan Histokimia
Istilah histokimia dan sitokimia terutama digunakanuntuk menunjukkan
metode penetapan lokasi struktur sel dalam sediaan jaringan dengan
menggunakan aktivitas enzimatik yang khas distruktur. Untuk
mempertahankan enzim-enzim tersebut, prosedur histokimia biasanya
diterapkan pada jaringan yang tidak terfiksasi atau sedikit terfiksasi. Syarat
yang perlu dipenuhi untuk keperluan determinasi sitokimia dan histokimia
adalah:
Substansi tidak boleh bergerak dari lokasi semula
Substansi harus diidentifikasi dengan prosedur yang spesifik untuk zat
itu
2. Pembuatan sediaan (preparat)
Histologi adalah ilmu yang mempelajari tentang struktur jaringan secara
detail menggunakan mikroskop pada sediaan jaringan yang dipotong tipis,
sangat menggantungkan diri pada penggunaan mikroskop dan teknik
penyediaan contoh jaringan. Cara pembuatan sediaan histologis disebut
mikroteknik. Pembuatan sediaan dari suatu jaringan dimulai dengan operasi,
biopsi, atau autopsi. Jaringan yang diambil kemudian diproses dengan fiksatif
yang akan menjaga agar sediaan tidak akan rusak (bergeser posisinya,
membusuk, atau rusak). Fiksatif yang paling umum digunakan untuk jaringan
hewan (termasuk manusia) adalah formalin (10% formaldehida yang
dilarutkan dalam air). Larutan Bouin juga dapat digunakan sebagai fiksatif
alternatif meskipun hasilnya tidak akan sebaik formalin karena akan
meninggalkan bekas warna kuning dan artefak. Artefak adalah benda yang
tidak terdapat pada jaringan asli, namun tampak pada hasil akhir sediaan.
Artefak ini terbentuk karena kurang sempurnanya pembuatan sediaan. Sampel
jaringan yang telah terfiksasi direndam dalam cairan etanol (alkohol)
bertingkat untuk proses menghilangkan air dalam jaringan (dehidrasi).
Selanjutnya sampel dipindahkan ke dalam toluena untuk menghilangkan
alkohol (dealkoholisasi). Langkah terakhir yang dilakukan adalah
memasukkan sampel jaringan ke dalam parafin panas yang menginfiltrasi
jaringan. Selama proses yang berlangsung selama 12-16 jam ini, jaringan yang
awalnya lembek akan menjadi keras sehingga lebih mudah dipotong
menggunakan mikrotom. Pemotongan dengan mikrotom ini akan
menghasilkan lapisan dengan ketebalan 5 mikrometer. Lapisan ini kemudian
diletakkan di atas kaca objek untuk diwarnai. Pewarnaan perlu dilakukan
karena objek dengan ketebalan 5 mikrometer akan terlihat transparan
meskipun di bawah mikroskop. Pewarna yang biasa digunakan
adalahhematoxylin dan eosin. Hematoxylin akan memberi warna biru pada
nukelus, sementara eosin memberi warna merah muda pada sitoplasma. Masih
terdapat berbagai zat warna lain yang biasa digunakan dalam mikroteknik,
tergantung pada jaringan yang ingin diamati. Ilmu yang mempelajari
pewarnaan jaringan disebut histokimia.
III.3 Metode Analisis
1. Metode Backpropagation
Perambatan galat mundur (Backpropagation) adalah sebuah metode
sistematik untuk pelatihan multiplayer jaringan saraf tiruan. Metode ini
memiliki dasar matematis yang kuat, obyektif dan algoritma ini mendapatkan
bentuk persamaan dan nilai koefisien dalam formula dengan meminimalkan
jumlah kuadrat galat error melalui model yang dikembangkan (training set).
a. Dimulai dengan lapisan masukan, hitung keluaran dari setiap elemen
pemroses melalui lapisan luar.
b. Hitung kesalahan pada lapisan luar yang merupakan selisih antara data
aktual dan target.
c. Transformasikan kesalahan tersebut pada kesalahan yang sesuai di sisi
masukan elemen pemroses.
d. Propagasi balik kesalahan-kesalahan ini pada keluaran setiap elemen
pemroses ke kesalahan yang terdapat pada masukan. Ulangi proses ini
sampai masukan tercapai.
e. Ubah seluruh bobot dengan menggunakan kesalahan pada sisi masukan
elemen dan luaran elemen pemroses yang terhubung.
2. Carcinoembryonicantigen (CEA) (Digunakan untuk identifikasi
adenocarcinoma)
CEA merupakan antigen spesifik untuk adenocarcinoma pada saluran
cerna yang ditemukan pada tahun 1965. Kadar CEA pada serum perokok lebih
tinggi dibandingkan bukan perokok. Beberapa kelainan nonmalignansi yang
kadar CEA tinggi adalah sirosis, hepatitis, ikterusobstruktif, colitis ulserativa,
bronchitis dan emfisema. Kadar CEA mempunyai korelasi dengan respons
pengobatan Small Cell Lung Cancer (SCLC) maupun Non Small Cell Lung
Cancer (NSCLC).Neuron Spesific Enolase subunit terdapat dalam
konsentrasi tinggi pada sel neuron, sel neuroen dokrin dan tumor neurogenik.
Selain itu juga terdapat pada jaringan otot polos, trombosit, selepitel Henle,
sel macula den saginjal, sel epitel bronchus dan pneumocytetipe 2.
Peningkatan kadar NSE dalam serum ditemukan pada 75% kasus SCLC dan
14% kasus NSCLC. Pemantauan kadar NSE serum secara berkala selama dan
setelah pengobatan dapat memberikan gambaran perkembangan kanker atau
kekambuhan. Tissue Polypeptide Antigen (TPA) merupakan produk degradasi
dari sitoskeleton yang dulu disebut sebagai sitokeratin. Pemeriksaan TPS
menilai kadar cytokeratin fragmen 8, 18 dan 19. CYFRA 21-1 adalah fragmen
CK19 merupakan marker sitoskeleton yang banyak digunakan saat ini. TPS
dan CYFRA 21-1sangat bermanfaat dalam mengelola kasus NSCLC.
Penelitian Mumbarkar dkk pada 133 kasus NSCLC mendapatkan nilai
sensitivitas TPS, CYFRA21-1 dan NSE sebesar 94% sedangkan sensitivitas
CEA sebesar 54%. Spesifisitas TPS, CYFRA 21-1 dan NSE sebesar 95%
sedangkan spesifisitas CEA hanya 56%. Lim dkk (2009) menyimpulkan
sekalipun CEA tidak spesifik ataupun akurat untuk skrining namun dalam
penelitiannya pada 217 pasien asimptomatik yang kadar CEA tinggi diikuti
selama 2 tahun ternyata 7,4% menderita berbagai keganasan. Berbagai
penelitian menyimpulkan bahwa CYFRA21-1 merupakan petanda ganas yang
dapat digunakan untuk pemantauan pengobatan dan prognosis penyakit.
III.4 Perkembangan Metode
1. Perkembangan Histologi
Histologi adalah ladang penelitian yang sangat gencar dilakukan pada
abad ke-19, yang sebelumnya telah dirintis oleh Malpighi dan Bichat.
Marcello Malpighi (1628-1694), seorang ahli anatomi dari Italia atau yang
sering disebut sebagai bapak anatomi mikroskopis ini adalah orang pertama
yang menjelaskan alveolus paru-paru, kapiler, sel-sel limpa, sel-sel ginjal, dan
lapisan kulit malpighi yang merupakan unit sebenarnya pembentuk jaringan
tubuh. Dimana penelitian itu dilakukannya menggunakan mikroskop
primitif.
Marie Franois Xavier Bichat (1771-1802), seorang ahli patologi Perancis,
atau yang sering disebut bapak histologi ini adalah orang pertama yang secara
sistematis mempelajari jaringan yang dianggap sebagai blok penyusun unsur
tubuh. Namun, dalam penelitiannya Bichat tidak menggunakan mikroskop
melainkan pembedahan/ pemotongan dan berhasil mengidentifikasi 21
jaringan yang kemudian disebut sebagai 21 jaringan Bichat. Akan tetapi,
histologi modern kini lebih mengenal empat macam jaringan, yaitu jaringan
ikat, otot, saraf, dan epitel.
Tujuh belas tahun setelah kematian Bichat, 1819, August Mayer(1787-
1865) menciptakan istilah histologi yang berarti studi tentang jaringan tubuh
yang berasal dari bahasa Yunani yaitu histos (jaringan) dan logos (ilmu).
Kemudian Richard Owen (1804-1892), seorang palaentologis Inggris
merekomendasikan agar penggunaan istilah histologi digunakan secara
meluas.
Perkembangan selanjutnya, pada tahun 1852 Rudolph von Klliker (1817-
1905), seorang profesor anatomi Swiss menjadi orang pertama yang
mempublikasikan buku tentang histologi yang berjudul Handbuch der
Gewebelehre.
2. Perkembangan Imumohistokimia
Prinsip dasar imunohistokimia telah diketahui sejak sekitar tahun 1930,
namun penggunaanya mulai meluas mulai tahun 1942 ketika studi pertama
mengenai imunihistokimia dilaporkan. Coons et al. (1942) menggunakan
antibodi berlabel FITC untuk mengidentifikasi antigen Pneumococcal dalam
jaringan yang terinfeksi. Sejak saat itu, pengembangan semakin dibuat dalam
protein konjugasi, metode fiksasi jaringan, label deteksi, dan mikroskopi. Hal
itu membuat imunohistokimia menjadi rutinitas dan esensial dalam diagnosa
dan riset pada laboratorium. Imunohistokimia berkembang dengan
ditemukannya Indirect method, kemudian ditemukan adisi horseradish
peroxidase. Setelah itu teknik peroxidase dan anti-peroxidase ditemukan pada
tahun 1979. Kemudian penggunaan Avidin & Biotin complex pada awal tahun
1980an.
3. Perkembangan Teknik Analisis sel dengan teknik Instrumental
Dua sifat sel yang menjadi dasar pengembangan teknik analisis
instrumental pada sel, ialah ukuran sel dan sifat sel yang tembus cahaya. Sel
mempunyai ukuran yang sangat kecil yang dinyatakan dalam micron (1
mikron =1/1000 mm = 1/25.400 inci). Sel hewan terkecil mencapai 4 mu
(milimikron). Meskipun demikian, ada beberapa sel protozoayang mempunyai
ukuran mencapai beberapa mm, misalnya spirostomum dari golongan ciliata
mencapai ukuran 3 mm (Storer dan Usinger, 1957:247). Pada hal daya mata
manusia untuk membedakan antara objek tidak mampu melebihi jara 0,1 mm
(100u).
Oleh karena itu, diperlukan teknik instrumental yang mampu
membesarkan obyek mampu membesarkan obyek untuk mempelajari sel,
berupa mikroskop, yang macam-macamnya telah disebutkan. Setiap jenis
mikroskop mempunyai kelebihan dan kekurangannya masing-masing.
Misalnya electron mikroskop mampu untuk mengenal bagian sel sampai pada
tingkatan molekul, tetapi tidak dapat digunakan untuk mempelajari sel hidup
karena terlalu tebal. Untuk mengatasi sifat kedua dari sel, yaitu sifatnya yang
tembus cahaya, dibutuhkan alat yang dapat meningkatkan kontras. Sel
memiliki sifat tembus cahaya, menurut De Reberties (1975 : 82) Karena sel
mengandung banyak air, bila telah kering sifat kontrasnya meningkat. Teknik
lain untuk meningkatkan kontras sel adalah dengan teknik pewarnaan.
Masalahnya teknik pearnaan ini tidak dapat digunakan untuk meningkatkan
kontras pada sel hidup. Karena mewarnai sel memerlukan serangkaian teknik,
mulai dari fiksasi, dehidrasi embedding, dan pemotongan atau seksi serta
pewarnaan. Unutk meningkatkan sifat kontras pada sel hidup dapat digunakan
mikroskop fase kontras dan mikroskop interferensi (De Reberties, dkk. 1975 :
82).
3.6 Contoh Analisis Sel dalam Jaringan (Imunohistokimia)
Pemeriksaan imunohistokimia dapat memberi informasi mengenai
kandungan berbagai unsur molekul didalam sel normal maupun sel neoplastik.
Dasar dari pemeriksaan ini adalah pengikatan antigen (yang terkandung dalam
sel) dengan antibodi spesifiknya yang diberi label chromogen. Teknik ini diawali
dengan prosedur histoteknik yaitu prosedur pembuatan irisan jaringan (histologi)
untuk diamati di bawah mikroskop. Irisan jaringan yang didapat kemudian
memasuki prosedur imunohistokimia.
Interaksi antara antigen dan antibodi adalah reaksi yang tidak kasat mata.
Oleh karena itu, diperlukan visualisasi adanya ikatan tersebut dengan molekul
antibodi yang digunakan dengan enzim atau fluorokrom. Enzim (yang dipakai
untuk molekul) selanjutnya direaksikan dengan substrat chromogen (yaitu substrat
yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut) yang dapat diamati
dengan mikroskop bright fiekl (mikroskop bidang terang). Imunohistokimia yang
menggunakan fluorokrom untuk molekul antibodi, dapat langsung diamati
dibawah mikroskop fluorescence.
Berbagai jenis molekul yang yang terkandung dalam sel dapat dideteksi
dengan teknik ini, termasuk berbagai jenis reseptor, onkoprotein, faktor
pertumbuhan dan protein-protein lainnya. Dengan ditemukannya teknik ini maka
berbagai pemahaman-pemahaman baru di bidang penyakit, termasuk onkologi,
menjadi semakin baik sehingga telah membawa dunia kedokteran kepada era
yang baru.
Imunohistokimia menjadi teknik pilihan untuk menentukan petanda-
petanda biologik tersebut karena relatif mudah, murah dan dapat diterapkan pada
sediaan rutin histopatologik. Namun demikian perlu diperhatikan sejumlah faktor
yang dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan, dimana pengaruh faktor-faktor
tersebut dimulai dari tahap pembedahan, pengolahan jaringan hingga penilaian
hasil pulasan. Untuk dapat menagani penderita secara lebih sempurna,
seyogyanya pemeriksaan ini dijadikan pemeriksaan rutin bagi setiap penderita
kanker.
IV. TEKNIK ANALISIS SPEKTROFOTOMETRI SEL/KONVENSIONAL
IV.1 Pengertian
Spektrofotometri adalah metode yang menggunakan gelombang (terutama
gelombang cahaya) untuk menentukan kandungan/karakteristik dari suatu sampel.
Metode ini menggunakan hubungan antara energi yang dibawa oleh gelombang
cahaya dan zat yang terkandung dalam sampel.
Spektrofotmetri secara umum dibagi menjadi 2, yaitu spektrofotometri absorbsi
(AAS), dan emisi (AES). Pada AAS, suatu sampel akan ditembakkan dengan
gelombang cahaya, dan sebagian dari cahaya yang lewat akan terserap energinya
oleh sampel, dan sisanya akan diteruskan ke spektrometer. Dengan mengukur
perbedaan antara jumlah gelombang per satuan panjang dari sumber dengan
jumlah gelombang per satuan panjang pada spektrometer, dapat ditentukan berapa
banyak gelombang cahaya yang diserap (absorb) oleh sampel. Sementara itu,
konsep yang digunakan pada AES adalah bahwa setiap zat mengeluarkan (emisi)
gelombang cahaya pada panjang gelombang yang berbeda-beda jika elektronnya
mengalami eksitasi. Dengan mengamati warna (panjang gelombang) yang
diemisikan oleh sampel dan membandingkannya dengan referensi, dapat
diketahui kandungan sampel tersebut.
Sel adalah sekumpulan besar molekul-molekul yang terstruktur, kedua
metode yang telah disebutkan sebelumnya dapat diaplikasikan untuk mengetahui
kandungan suatu sel. Spektrofotometri yang biasa dilakukan pada sel adalah
spektrofotometri fluoresens dan spektrofotometri inframerah.
IV.2 Prinsip Dasar
Fluoresens adalah peristiwa emisi cahaya oleh suatu zat yang menyerap
energi dari cahaya atau radiasi elektromagnetik. Fluoresens hanya akan
berlangsung selama zat yang memancarkan cahaya menerima energi terus
menerus dan akan berhenti memancarkan cahaya jika sumber energinya hilang. Di
alam, ada zat yang memiliki sifat fluoresens alami. Jika zat ini terdapat di dalam
makhluk hidup, fenomena fluoresens ini disebut juga biofluoresens.
Konsep dasar dari spektrofotometri fluoresens adalah mendeteksi emisi
fluoresens dari suatu zat. Hal ini dapat dilakukan dengan mudah jika zat yang
akan dideteksi dapat mengemisikan fluoresens dengan sendirinya, tetapi untuk zat
yang tidak mengemisikan fluoresens, harus ada metode tambahan yang dilakukan.
Zat sampel ini akan diberikan fluorophore, atau molekul yang memiliki
kemampuan untuk mengemisikan fluoresens. Beberapa molekul non-fluoresens
yang dapat ditandai dengan fluorophore misalnya DNA-RNA, lipid, dan protein.
Dalam sel, spektrofotmetri fluoresens ini dilakukan dalam metode
fluorescent microscopy. Metode ini dilakukan dengan menandai molekul yang
akan dianalisis dengan fluorophore jika diperlukan, lalu mendeteksi keberadaan
dan kondisi molekul tersebut dengan mengikuti emisi fluoresens yang muncul.
Sebagai contoh, suatu fluorophore etidium bromide, akan mengemisikan
fluoresens jika berikatan dengan molekul DNA, sehingga jika florophore ini
disebar pada suatu sampel, kita dapat menemukan rantai-rantai DNA yang
terdapat pada sampel dengan mencari titik-titik fluoresens.
Gambar 12. Bagan Spektrofotometri Fluoresens
(http:// www.tissuegroup.chem.vt.edu)
Untuk spektrofotometri inframerah, prinsip dasarnya adalah adanya
perbedaan daya absorbsi inframerah tiap molekul. Inframerah akan ditembakkan
dari sumber dengan jumlah gelombang per satuan panjang (wavenumber) tertentu
melalui sampel, lalu dideteksi menggunakan spektrometer. Setiap molekul akan
menyerap inframerah pada wavenumber yang berbeda, sehingga dengan
mencocokkan dengan data referensi dapat ditentukan kandungan suatu molekul.
Metode spektrofotometri inframerah yang digunakan untuk menganalisis
sel biasanya adalah Fourier Transform Infrared (FT-IR). FT-IR ini menggunakan
inframerah, kristal, dan barisan detektor berisi piksel yang disebut Focal Plane
Array (FPA). Sinar inframerah akan ditembakkan pada sampel yang terletak di
bagian atas kristal dengan sudut di atas sudut kritis. Sampel akan menyerap
sebagian sinar inframerah dan kristal akan meneruskan sinar yang tidak terserap
ke detektor. Detektor kemudian akan mendeteksi wavenumber yang diteruskan
oleh kristal di setiap pikselnya. Hasil yang didapat oleh detektor akan berbentuk
seperti gambar yang menunjukkan spektrum cahaya yang diteruskan kristal di
setiap pikselnya.

Gambar 13. Bagan FT-IR


(Fourier Transform Infrared Spectroscopic Imaging of Live Cells, Jennifer A.
Dougan and Sergei G. Kazarian of Imperial College)
IV.3 Perkembangan Alat dan Metode Analisis Spektrofotometri Fluoresens
Otto Heimstaedt dan Heinrich Lehmann pada tahun 1911-1913
mengembangkan mikroskop fluoresens pertama yang dapat mengamati
autofuluoresens bakteri dan organisme-organisme lain. Pada 1914, Stanislav Von
Prowazek menggunakan mikroskop fluoresens untuk mempelajari pengikatan zat
warna pada sel. Kemudian, pada tahun 1941, Albert Coons dapat menandai
antibody dengan fluorescein isothiocyanate (FITC), membuka jalan untuk
perkembangan imunofluoresens.
Sekarang, mikroskopi fluorsens telah mencapai skala lebih dalam, skala
nano berkat penemuan Eric Betzig, William Moerner dan Stefan Hell super-
resolved fluorescence microscopy, dimana ketiganya memenangkan hadiah
Nobel di bidang Kimia untuk penemuannya. Bidang imunofluoresens dapat
menandai antibodi-antibodi sehingga dapat diamati dan bahkan dihitung
jumlahnya. Pada contoh sebelumnya telah disebutkan bahwa keberadaan DNA
pada sampel dapat dideteksi dengan menggunakan fluorophore tertentu.
Penyusunan DNA juga dapat dilakukan dengan bantuan fluorophore dengan
menandai setiap jenis basa Nitrogen dengan fluorophore yang berbeda.
Persebaran suatu organisme dalam daerah dapat dideteksi dengan mengamati
fluoresens alami yang dibawanya dan memetakannya.
Spektrofotometri FT-IR
FT-IR pertama dikembangkan setelah ditemukannya interferometer oleh
Albert Abraham Michelson pada tahun 1880, dimana Michelson kemudian
memenagkan hadiah Nobel pada 1907 setelah interferometernya dapat mengukur
panjang gelombang cahaya. Pada awalnya, interferometer ini sangat suit untuk
digunakan sebagai alat FT-IR karena masih menggunakan interferogram manual.
Setelah adanya computer, FT-IR dikembangkan lagi oleh J.W. Cooley dan J.W.
Tukey yang membuat Fast Fourier Transform, yaitu algoritma yang dapat
menjalankan metode Fourier Transform dengan cepat menggunakan computer.
Baru pada akhir 1960an mulai dibuat alat FT-IR yang bisa banyak digunakan.
Pada 1980an, muncul mikroskop FT-IR pertama yang membuat analisis sel
menjadi lebih mudah karena sampel yang digunakan bisa semakin spesifik,
dimana ukuran sampel bisa hanya seukuran 10 mikron. Kini, mikroskop FT-IR
dapat digunakan untuk menganalisis sampel yang berjumlah bahkan kurang dari
100 pikogram (100 x 10-12 g) dengan bantuan cryogenic trapping.
IV.4 Contoh Analisis oleh Spektrofotometer/Konvensional

Gambar 14. Fluoresensi etidium bromide-DNA dibawah sinar UV (warna oranye


menandakan adanya molekul etidium bromide-DNA
(Regulatory genomics research group at the University of Otago)
Gambar 15. Imunofluoresens anti-IgA pada spesimen kulit manusia (warna hijau
menyala IgA)
(www.library.med.utah.edu)

Gambar 16. Pemetaan persebaran tanaman darat dengan fluoresens (ditandai


dengan warna merah)
(NASA)

Gambar 17. Mikroskopi FT-IR


(http://www.photonics.com)
DAFTAR PUSTAKA
Bendersky, Leonid A. and Gayle, Frank W.2001. Electron Diffraction Using
Transmission Electron Microscop. National Institute of Standards
and Technology,Gaithersburg, MD 20899-8554.
Campbell, N.A., Reece, J.B., Mitchell, L.G. 2002. Biologi. Alih bahasa lestari, R. et
al. safitri, A., Simarmata, L., Hardani, H.W. (eds). Erlangga,
Jakarta.
Fritschy, Jean-Marc; Hrtig, Wolfgang .2001. "Immunofluorescence". ELS.
Hercules, D.M. 1965. Fluorescence and phosphorescence analysts, Editor Wiley-
Interscience Publishers, New York, London, Sydney.
Interpreting Infra-RedSpectra. 2015. interpreting infra-red spectra. [ONLINE]
Tersedia: http://www.chemguide.co.uk/analysis/ir/interpret.html.
[Diakses 2 November 2016].
Karlk, Miroslav.2001, Lattice Imaging In Transmission Electron Microscopy.
Kresno, S. B. 2003. Imunologi: Diagnosis dan Prosedur Laboratorium.
Balai Penerbit FKUI: Jakarta.
Rietdorf, J .2005. Microscopic Techniques. Advances in Biochemical Engineering /
Biotechnology. Berlin: Springer
Mengenal mikroskop elektron - Praktikum Biologi. 2015. Mengenal mikroskop
elektron - Praktikum Biologi. [ONLINE] Tersedia:
http://praktikumbiologi.com/mengenal-mikroskop-
elektron/. [Diakses 02 November 2016].
Mikroskop Elektron - Biologi sel dan Molekuler. 2015. Mikroskop Elektron - Biologi
sel dan Molekuler. [ONLINE] Tersedia: http://www.biologi-
sel.com/2013/03/mikroskop-elektron.html. [Diakses 02 November
2016].
Sibilia, John P. 1988. A Guide to Matterials Characterization and Chemical Analysis.
VCH, New York, USA
What is Flow Cytometry? . 2016. What is Flow Cytometry? . [ONLINE] Tersedia:
http://www.news-medical.net/health/What-is-Flow-
Cytometry.aspx. [Diakses 02 November 2016].
Single Cell Analysis - Meetings. 2015. Single Cell Analysis - Meetings. [ONLINE]
Tersedia: https://commonfund.nih.gov/singlecell/snapshot.
[Diakses 02 November 2016].
Single cell analysis of circadian dynamics in tissue explants . 2016. Single cell
analysis of circadian dynamics in tissue explants . [ONLINE]
Tersedia:
http://www.molbiolcell.org/content/early/2016/02/011/mbc.E15-06-
0403.full.pdf+html. [Diakses 02 November 2016].
Single Cell Analysis | Thermo Fisher Scientific. 2015. Single Cell Analysis | Thermo
Fisher Scientific. [ONLINE] Tersedia:
https://www.thermofisher.com/id/en/home/life-science/cell-
analysis/single-cell-analysis.html. [Diakses 02
November 2016].