en analyse environnementale
du Qubec
Mthode danalyse
Dnombrement des salmonelles :
mthode par tubes multiples
Exemple de numrotation :
Numro de l'dition
Numro de la mthode
Identification du paramtre
00 - Gnral
01 - Air ambiant
02 - Rejets atmosphriques
03 - Eau potable, eaux naturelles, etc.
04, 14, 15 - Eaux uses (municipales, industrielles, etc.)
05, 10, 16 - Sols ou sdiments
06 - Tissus vgtaux
07 - Tissus animaux
08, 09, 13 - Rsidus (dchets, huiles, boues, etc.)
17 - Prcipitations acides
Mthode
d'analyse
approuve
100 - Proprits
200 - Mtaux
300 - Matires inorganiques non-mtalliques
400 - Matires organiques
500 - Toxicologie
700 - Microbiologie
800 - Biologie
900 - Terrain
1000 - Agricole
DITION APPROUVE LE : 29 avril 1999
Historique de la mthode
L'approche employe dans cette mthode est similaire l'approche prsente dans le document
Control of Pathogens and Vector Attraction in Sewage Sludge (USEPA, 1999) dans la section
Appendix F Sample Preparation for Fecal Coliform Tests and Salmonella sp. Analysis. Dans
ce document, l'USEPA reproduit une mthode de Kenner et Clark (1972) qui utilise le milieu de
culture DSE pour lenrichissement, le milieu XLD pour lisolement des colonies probables des
salmonelles et divers tests biochimiques pour la confirmation des salmonelles.
Cette dition rvise de la mthode ne contient pas de modification dans la procdure analytique;
les modifications apportes lhistorique et la bibliographie constituent les seuls changements
effectus ldition originale du 29 avril 1999.
INTRODUCTION 7
1. DOMAINE DAPPLICATION 7
2. PRINCIPE ET THORIE 7
3. FIABILIT 8
3.1. Interfrences 8
3.2. Limite infrieure de quantification 8
3.3. Limite suprieure de quantification 8
3.4. Fidlit 8
3.5. Pourcentage de rcupration 9
4. PRLVEMENT ET CONSERVATION 10
5. APPAREILLAGE 10
7. PROTOCOLE DANALYSE 14
7.1. Prparation de lchantillon 14
7.2. Analyse de lchantillon 14
7.3. Observation des rsultats 15
7.4. Confirmations biochimiques 16
7.5. Dtermination du pourcentage de matires sches 16
9. CRITRES DACCEPTABILIT 18
10. BIBLIOGRAPHIE 19
En avril 1997, le document Critres provisoires pour la valorisation des matires rsiduelles
fertilisantes (pandage, entreposage temporaire, compostage, fabrication et utilisation de
terreaux) a t produit par le Service de lassainissement agricole et des activits de
compostage de la Direction des politiques des secteurs agricole et naturel du ministre de
lEnvironnement et de la Faune. Ce document dfinit, entre autres, des critres de rfrence
microbiologiques pour lutilisation des matires rsiduelles fertilisantes. Un de ces critres est
bas sur le dnombrement des salmonelles, un groupe de microorganismes pathognes.
Les salmonelles appartiennent au groupe des Entrobactries; elles sont en forme de btonnets
Gram ngatifs et sont anarobies facultatives. Les salmonelles sont pathognes pour lhumain et
peuvent causer des fivres entriques, des gastroentrites et des septicmies.
Habituellement, dans une matrice comme leau de consommation, un dnombrement nest pas
ncessaire dans le cas des microorganismes pathognes; seul un test prsence-absence suffit.
Dans le document intitul Critres provisoires pour la valorisation des matires rsiduelles
fertilisantes (pandage, entreposage temporaire, compostage, fabrication et utilisation de
terreaux) , la norme pour les salmonelles est de < 3 NPP/4 g de matire sche, et donc une
mthode de dnombrement est ncessaire. La mthode dcrite dans ce document utilise le
principe de croissance en tubes multiples et est inspire du document publi par lUSEPA
Control of pathogens and vector attraction in sewage sludge .
1. DOMAINE DAPPLICATION
Cette mthode consiste dnombrer les salmonelles par croissance en tubes multiples.
Elle sapplique aux rsidus des fabriques de ptes et papiers, aux composts domestiques ainsi
qu toutes les matrices solides ou liquides.
Cette mthode peut tre utilise galement comme test prsence-absence dans les cas o
seulement un dpistage est requis. Habituellement, 25 g dchantillon sont alors incubs dans
225 ml du bouillon denrichissement. Il est repiqu par la suite sur la glose slective. Sil y a
des colonies caractristiques, les confirmations biochimiques sont effectues et nous pouvons
ainsi dterminer sil y a prsence de salmonelles dans 25 g dchantillon.
2. PRINCIPE ET THORIE
Le principe de la mthode NPP (NPP signifie nombre le plus probable) consiste ensemencer de
nombreux volumes ou des dilutions dun mme chantillon dans des tubes de bouillon
denrichissement et par la suite confirmer la prsence de salmonelles par repiquage des tubes
sur glose slective.
3.1. INTERFRENCES
Les chantillons doivent tre en suspension dans leau tamponne strile (suspension de dpart)
le moins longtemps possible, de prfrence moins de 20 minutes, car il peut en rsulter un
changement de la population bactrienne initiale.
Une bonne agitation de la suspension de dpart et des tubes contenant lchantillon est
importante pour viter une sous-valuation du rsultat final.
Dans le cas dchantillons liquides, les bouteilles dchantillonnage de 250 ml remplies pleine
capacit doivent tre rejetes, car elles ne permettent pas dagiter lchantillon de faon
disperser uniformment les bactries prsentes dans tout le volume initial. Le rejet dune
portion aliquote de lchantillon au laboratoire risquerait de modifier la concentration initiale des
bactries par unit de volume dchantillon et de fausser le rsultat. Lanalyse de tels
chantillons doit faire lobjet dune remarque cet effet sur le rapport danalyse.
Pour chaque chantillon, un tube de chacune des dilutions de lchantillon est inocul avec des
concentrations variant entre 10 et 100 UFC viables dune souche de rfrence de salmonelles
afin de vrifier la prsence de substances inhibitrices (contrle positif).
Pour les chantillons ayant un pourcentage de matires sches infrieur 23 %, il faut augmenter
la quantit dchantillon et de milieu de culture afin de pouvoir respecter le critre de
< 3 NPP/4 g dchantillon sec en cas dabsence de salmonelles.
La limite suprieure de quantification est de 640 NPP/4 g dchantillon humide. Cependant, les
rsultats tant exprims en NPP/4 g dchantillon sec, cette limite peut varier. Par exemple, un
chantillon ayant un pourcentage de matires sches de 30 % a une limite suprieure de
quantification de 21 000 NPP/4 g dchantillon sec.
3.4. FIDLIT
3.4.1. Rplicabilit
3.4.2 Rptabilit
Les valeurs de la rptabilit se trouvent dans le tableau suivant.
Nombre de
Matrice Rptabilit
donnes
7 NPP/ml une concentration de
Lisier de porc (liquide) n = 10
28 NPP/ml
9 NPP/g humide une concentration
Compost (solide) n = 10
de 24 NPP/g humide
3 NPP/g humide une concentration
Boue municipale (solide) n = 10
de 8 NPP/g humide
Boue de fabrique de ptes et papiers 3 NPP/g humide une concentration
n = 10
(solide) de 9 NPP/g humide
Nombre de
Matrice Pourcentage de rcupration
donnes
Lisier de porc (liquide) n=6 92,9 %
Compost (solide) n = 11 100 %
Boue municipale (solide) n=9 91 %
Boue de fabrique de ptes et papiers
n = 10 100 %
(solide)
5. APPAREILLAGE
5.2. Autoclave
5.6. pH-mtre
5.17. Dessiccateur
Tous les ractifs commerciaux utiliss sont de qualit A.C.S. moins dindication contraire.
Leau utilise pour la prparation des milieux de culture et des ractifs est de leau distille,
dminralise ou ultra-pure. Les marques de commerce apparaissant ci-dessous ne sont
mentionnes qu titre de renseignement.
Dissoudre 40,0 g de NaOH (cf. 6.2) dans environ 800 ml deau, laisser refroidir et complter
1 000 ml avec de leau. Cette solution se conserve la temprature de la pice.
Dissoudre 34,0 g de KH2PO4 anhydre (cf. 6.1) dans environ 500 ml deau, ajuster le pH
7,2 avec une solution de NaOH 1 N (cf. 6.10) et complter 1 000 ml avec de leau. Cette
solution se conserve 4 C.
Ajouter 1,25 ml de la solution tampon phosphate (cf. 6.11) par litre deau. Rpartir en
volumes suffisants pour avoir 99 ml 2 ml, 90 ml 2 ml et 450 ml 5 ml aprs
strilisation. Leau tamponne de dilution se conserve deux mois 4 C.
Dissoudre les ingrdients dans leau par agitation sans chauffer. Ajuster le pH 7,0 0,2.
Porter bullition, ne pas autoclaver. Rpartir en volumes de 10 ml dans des tubes
borosilicate 18 x 150 mm striles. Ce bouillon se conserve une semaine 4 C. Ce produit
nest pas disponible dans le commerce.
Dissoudre les ingrdients dans leau par agitation sans chauffer. Ajuster le pH 7,0 0,2.
Porter bullition, ne pas autoclaver. Rpartir en volumes de 10 ml dans des tubes de
borosilicate 18 x 150 mm striles. Ce bouillon se conserve une semaine 4 C. Ce produit
nest pas disponible dans le commerce.
Peptone no 3 1,6 g
Extrait de levure 3g
L-Lysine 5g
Xylose 3,75 g
Lactose 7,5 g
Saccharose 7,5 g
Citrate dammonium ferrique 0,8 g
Thiosulfate de sodium 6,8 g
Chlorure de sodium 5g
Agar 18 g
Phnol rouge 0,08 g
Dans un erlenmeyer de 2 000 ml, peser 18,2 g de milieu dshydrat et dissoudre dans
1 000 ml deau. Chauffer le milieu au point dbullition sur une plaque chauffante jusqu
dissolution complte en remuant avec un agitateur magntique. Refroidir et rpartir dans
des bouteilles de verre. Striliser 121 C pendant 15 minutes. Le pH doit tre de 7,2 0,2
25 C. Les bouteilles de milieu se conservent pendant un mois 4 C. Ce milieu de
culture est disponible dans le commerce.
Diluer la culture obtenue 10-7 dans de leau tamponne strile (cf. 6.12). Utiliser 0,1 ml de
cette dilution pour ensemencer les tubes de bouillon denrichissement contenant
lchantillon (contrles positifs).
7. PROTOCOLE DANALYSE
Inoculer 1 tube de chacune des 3 sries avec la suspension dilue de salmonelles (cf. 6.21)
et agiter au Vortex. Ce sont les contrles positifs.
Incuber galement un tube de bouillon dulcitol slnite sans chantillon. Ceci est le
contrle ngatif.
Aprs lincubation, faire un prlvement avec un fil boucle dans chacun des tubes de
bouillon dulcitol slnite et inoculer pour chacun des tubes une glose XLT4 (cf. 6.17).
Faire les inoculations de faon obtenir des colonies isoles. Bien identifier chacune des
gloses avec le numro dchantillon, lidentification du tube ainsi que la dilution.
Inoculer galement des gloses XLT4 avec les tubes de contrle positifs et ngatifs.
Aprs la priode dincubation, sortir et ranger les gloses par ordre de numro
dchantillon, de tubes et de dilutions.
Examiner les gloses. Les colonies caractristiques des salmonelles sont noires, roses
avec ou sans centre noir ou jaunes avec centre noir sur la glose XLT4, alors que les
autres bactries forment des colonies jaunes sans centre noir. Les rares espces de
salmonelles qui ne produisent pas de sulfure dhydrogne (H2S ngative) formeront des
colonies roses rose-jaune. Ceci est une identification prsomptive.
Repiquer sur glose infusion coeur-cervelle incline (cf. 6.18) les colonies typiques des
salmonelles trouves sur la glose XLT4.
Faire une galerie didentifications Microscan Gram ngatives (cf. 6.14) pour chacune des
colonies oxydase ngatives. Pour lutilisation des galeries didentifications Microscan,
voir les instructions du fabricant.
On peut galement obtenir le srotypage des salmonelles lorsque cela est ncessaire dans
un laboratoire de rfrence.
A
P= 100
B
o
P : pourcentage de matires sches contenues dans lchantillon (%);
A : poids de lchantillon sec (g);
B : poids de lchantillon humide (g).
Noter le nombre de tubes positifs de chaque srie dans lesquels il y a prsence de salmonelles.
Consulter la table NPP (tableau 1) afin dobtenir le nombre le plus probable.
Lorsquon a utilis plus de trois sries de tubes, choisir la plus petite quantit dchantillon
donnant un certain nombre de rsultats positifs ainsi que les deux sries de tubes prcdents (voir
exemples A et B, tableau 2). Multiplier lindice lu dans la table NPP par le facteur de dilution
utilis pour obtenir lestimation du nombre dorganismes prsents dans le volume de rfrence.
Si moins de trois sries de tubes donnent des rsultats positifs, utiliser la srie comportant la plus
forte concentration en chantillon et les deux suivantes (exemple D, tableau 2). Situation
identique si aucune srie de tubes nest positive.
Si une seule des sries de tubes donne un rsultat positif, utiliser cette dilution et celle
immdiatement suprieure et infrieure (exemple E, tableau 2).
Tableau 2 - Exemples de dduction du NPP partir du nombre de rsultats positifs dans des
sries de 5 tubes en utilisant le tableau 1
Puisque les rsultats des tableaux 1 et 2 sont exprims en NPP/g humide, faire le calcul pour
avoir un rsultat final en NPP/4 g sec selon la formule suivante :
140
100 4 = 1750 NPP / 4 g sec
32
9. CRITRES DACCEPTABILIT
10. BIBLIOGRAPHIE
USEPA, Control of Pathogens and Vector Attraction in Sewage Sludge, EPA/625/R-92/013, rev.
October 1999.