MAKALAH BIOTEKNOLOGI

NORTHERN BLOT

Guna Melengkapi Tugas Bioteknologi Farmasi

Dosen Pengampu: Endah Puspitasari, S.Farm., M.Sc., Apt.

Disusun oleh:

Maulidya Barikatul Iftitah (152210101015)

Lilis Sapta Eka Lestari (152210101017)
Irawati Firdiyansari (152210101018)
Livia Primarahayu (152210101020)
Weka Agustin Pratesya (152210101021)
Fitri Nurussani Aulia (152210101023)
Khusnul Khotimah (152210101025)

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2017

Page | 1
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan hidayah-Nya yang
telah diberikan kepada penulis, sehingga dapat menyelesaikan makalah yang berjudul
Northern Blot ini sesuai dengan yang direncanakan.
Penyusunan makalah ini digunakan untuk melengkapi tugas mata kuliah
Bioteknologi. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan
makalah ini. Oleh karena itu, semua bentuk saran dan kritik yang membangun
senantiasa penulis harapkan.
Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada bu Endah Pupitasari, S.Farm.,
M.Sc., Apt. dan pihak-pihak yang memberikan bantuan baik secara langsung maupun
tidak langsung selama proses penyusunan makalah ini.
Akhirnya, penulis berharap semoga penyusunan makalah ini banyak membawa
manfaat bagi pihak-pihak yang terkait.

Jember, 25 Februari 2017

Penulis

Page | 2
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ..................................................................................................................i

KATA PENGANTAR ..............................................................................................................ii

DAFTAR ISI ............................................................................................................................iii

BAB I. PENDAHULUAN ...........................................................................................................1

1.1 Latar Belakang ......................................................................................................................1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................................................................2

1.3 Tujuan ..................................................................................................................................2

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................................3

2.1 Deskripsi Blotting ................................................................................................................ 3

2.1.1Macam-macam Blotting...................................................................................................... 3

2.2 Perbedaan Masing-Masing Blotting ................................................................................... 6

BAB III. PEMBAHASAN ........................................................................................................ 8

3.1Deskripsi Northern Blot..........................................................................................................8

3.2Prinsip dan Tujuan Teknik Northern Blot............................................................................... 9

3.3Tata Laksana Teknik Northern Blot...................................................................................... 10

BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN................................................................................ 16

4.1Kesimpulan.......................................................................................................................... 16

4.2 Saran.......................................................................................................................... 16

DAFTAR PUSTAKA................................................................................................................xvi

Page | 3
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Protein merupakan suatu zat yang terdapat di dalam makanan yang sangat
penting bagi tubuh,karena berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Juga sebagai
sumber asam amino yang mengandung unsur C,H,O dan N yang tidak dimiliki oleh
lemak maupun karbohidrat. Protein memiliki rantai panjang dan dapat mengalami cross
linking. Sehingga protein juga berperan dalam biokatalis suatu reaksi-reaksi kimia
dalam makluk hidup. Berhubungan dengan hal tersebut, jika terjadi suatu kelainan
dalam biokatalis suatu makhluk hidup maka akan terlihat dengan jelas dengan kelainan
proteinnya. Sehingga diperlukan beberapa uji yang dibutuhkan untuk mengetahuinya.
Salah satunya adalah dengan uji Western Blotting untuk mengetahui jenis dan berat
molekul suatu protein. Namun sebelum dilakukan uji diatas harus diterapkan isolasi
protein terhadap sampel yang diambil. Agar protein murni dari sampel bisa didapat
sehingga uji tersebut bisa dilakukan dengan baik dan benar.
Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk
hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim,
alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini,
perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada
ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular,
mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya. Dengan kata lain,
bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang ilmu dalam
proses produksi barang dan jasa.
Blotting adalah suatu teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA, atau
protein ke lembaran tipis atau matriks membran sehingga DNA, RNA, atau protein
tersebut dapat dipisahkan. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis
gel. Blotting terdiri atas berbagai macam diantaranya western blot, northern blot, dan
southern blot. Northern Blot digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis
tertentu molekul RNA sebagai perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari
RNA. Perkembangan bioteknologi ini semakin pesat dan semakin cangkih sehingga
perlu dipelajari lebih lanjut mengenai bioteknologi, khususnya dalam bidang kesehatan.

Page | 4
Oleh karena itu, metode dan berbagai cara analisis asam nukleat dan protein dipelajari
dan perlu pembahasan lebih lanjut.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan beberapa masalah sebagai
berikut :
1.2.1 Bagaimana pengertian dari analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan
metode Northern Blot?
1.2.2 Bagaimana prinsip dasar analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan
metode Northern Blot?
1.2.3 Bagaimana tata laksana kerja dari metode Northern Blot?
1.2.4 Bagaimana perbedaan metode Northern Blot dengan metode analisis berbasis
asam nukleat dan protein yang lain?

1.3 Tujuan
Berdasarkan rumusan masalah tersebut, dapat dirumuskan beberapa tujuan
sebagai berikut:
1.3.1 Mengetahui pengertian dari analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan
metode Northern Blot.
1.3.2 Mengetahui prinsip dasar analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan
metode Northern Blot.
1.3.3 Mengetahui tata laksana kerja dari metode Northern Blot.
1.3.4 Mengetahui perbedaan metode Northern Blot dengan metode analisis berbasis
asam nukleat dan protein yang lain.

Page | 5
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Blotting

Blotting adalah suatu teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA, atau
protein ke lembaran tipis atau matriks membran sehingga DNA, RNA, atau protein
tersebut dapat dipisahkan. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis
gel.
Matriks yang biasa dipakai dapat berupa nitroselulosa (NC). Namun NC juga
memiliki kekurangan, yaitu beberapa komponen yang memiliki afinitas lemah dapat
hilang selama pemrosesan. Matriks lain yang dapat digunakan untuk menutupi
kekurangannya yaitu kertas diazobenzyloxymethyl (DBM). Ada pula kertas lain, yaitu
iazophenylthioeter (DPT).
Keuntungan Teknik Blot:
- Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan
lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau
matriks.
- Reagen yang dibutuhkan lebih sedikit.
- Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat
lebih singkat.
- Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum
dianalisis.
- Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode
analisis yang dipakai.
2.2 Macam-macam Teknik Blotting dan Penjelasannya
2.2.1 Southern Blot
Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975). Teknik ini
mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Caranya
yaitu dengan menempatkan gel elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer
dan berada di atas sesuatu seperti spons yang telah dibasahi dengan buffer. Membran
tersebut diletakkan di atas gel dan ditumpuk pula beberapa kertas peresap di atasnya.
Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan ke membran, demikian pula dengan gel
yang membawa molekul ke kertas membran, sementara gelnya diserap oleh kertas
peresap. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak
biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik

Page | 6
radionukletida. Lokasi sinyal yang terlihat setelah autradiografi membuat kita dapat
menentukan ukuran dari fragmen DNA tersebut.

2.2.2 Northern Blot

Nothern Blot merupakan teknik yang sama dengan Southern Blot, namun
menggunakan kertas DBM dan biasanya mendeteksi RNA. Dalam proses ini RNA
dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian
diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan
melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun hasil yang paling
dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas
band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis.
Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi
gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang
berbeda. Ini adalah salah satu alat yang paling dasar untuk menentukan pada waktu apa,
dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu yang dinyatakan dalam jaringan hidup.

Page | 7
 2.2.3 Eastern Blot
Eastern Blot merupakan teknik yang ditemukan oleh Reinhard dan Malamud
(1982), adalah proses transfer bidirectional dengan menggunakan aliran pelarut protein
dari gel ke NC berdasarkan titik isoelektrik. Teknik Timur blotting adalah untuk
mendeteksi modifikasi pasca-translasi protein. Protein dihapuskan ke PVDF atau
membran nitroselulosa yang diperiksa untuk modifikasi menggunakan substrat tertentu.
2.2.4 Western Blot
Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai Western blot
untuk mengikuti teknik Southern blot yang pertama kali ditemukan. Western blot
adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran. Membran
ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada
membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi
protein pada organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi
primer dan antibodi sekunder. Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan
secara visual dengan pemberian kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara
fluoresensi, reaksi antara antibodi primer dengan antibodi sekunder akan memberikan
hasil fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di
kamar gelap.

Page | 8
2.3 Perbedaan Teknik blothing berdasarkan DNA, RNA, dan Protein
2.3.1 Blotting berbasis DNA
Teknik blotting berbasis DNA menggunakan tenik Southern
Blot.Keuntungan teknik ini adalah selain dapat menunjukkan integrasi gen juga
dapat mengetahui jumlah salinan DNA yang terintegrasi. Analisa Southern Blot
dapat digunakan untuk mengetahui sejumlah salinan gen dan kejadian
transformasi yang berbeda serta membedakan integrasi ekstra kromosomal dan
kromosomal. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan DNA dalam jumlah
banyak dengan kemurnian tinggi serta waktu yang lama.
2.3.2 Blotting berbasis RNA
Hibridasi Northern merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk
identifikasi dan transkrip RNA. RNA tidak dapat berikatan secara efisien pada
membrane, sehingga pada analisis northern digunakan suatu membrane spesifik
dimana RNA dapat berikatan secara kovalen. Dalam analisis northern , sekuen
RNA spesifik dideteksi menggunakan teknik bloting yaitu RNA ditransfer dari
agarose ke membrane. Hasil bloting dianalisis melalui proses hibridisasi dengan
probe RNA. RNA mempunyai bentuk utas tunggal, sehingga dapat membentuk
struktur sekunder melalui pasangan basa intramolekul, sehingga harus
dielektroforasi di bawah kondisi denaturasi.Denaturasi dilakukan dengan
penambahan formaldehid ke gel maupun loading buffer, atau perlakuan glyoxal
dan dimethyl sulfoxide (DMSO) pada loading buffer.
2.3.3 Bloting berbasis protein
Dalam blotting berbasis protein teknik analysis yang digunakan adalah
western blot yang merupakan metode untuk mendeteksi DNA-binding protein.
Dalam metode ini protein dipisahkan dengan elektroforesis dan ditransfer ke suatu
membrane sehingga protein akan terikat secara kovalen. Perinsip dasar western
blot adalah identifikasi pemisahan protein tidak berlabel dengan SDS gel
elektroforesis polyacrylamide (PAGE) yang didasarkan pada
immunoradioaktivitasnya dengan menggunakan antibody monoclonal. Kemudian
protein ditransferke membaran dan diberi perlakuan awal untuk mereduksi ikatan
non spesifik dari antiserum ke membrane. Inkubasi membrane dilakukan denagn

Page | 9
 antiserum spesifik, kemudian diinkubasi dengan antibody yang berkonjugasi
dengan reagen pendeteksi dan berikatan pada antiserum primer. Setelah itu diikuti
deteksi dari immunoreaksi diantara antiserum primer dan target protein spesifik.

Page | 10
 BAB III
PEMBAHASAN

3.1 Pengertian Northern Blot

Northern Blot merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui

konstruksi RNA yang mempunyai barat molekul lebih basar. Analisa dilakukan dengan
cara isolasi RNA dari jaringan yang mempunyai ekspresi gen yang paling tinggi. Untuk
mendapatkan RNA dilakukan dengan denaturasi protein oleh guanidinium
isothiocyanat. Elektroforesis RNA dilakukan dengan gel agarose atau ditreatment
dengan Dimethylsulfoxide (DMSO) kemudian ditransfer pada nitroselulosa atau
saringan nilon ,dan selanjutnya sama dengan pengamatan pada Southern Blot Analysis.
Pembanding yang digunakan primer yang mengadung jumlah, struktur dan rataan dari
sintesis RNA S1 nuklease.
Blot utara digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu
molekul RNA sebagai perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari RNA.
Ini pada dasarnya adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel, dan sebuah
noda. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke
membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan.
Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang
digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA
terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target

Page | 11
dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari
kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak
bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu alat yang paling
dasar untuk menentukan pada waktu apa, dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu yang
dinyatakan dalam jaringan hidup.
3.2 Prinsip dan Tujuan Teknik Northern Blot

Northern blot adalah suatu teknik untuk mendapatkan informasi mengenai

identitas, ukuran dan kelimpaham RNA. Prinsip Nothern blot adalah memisahkan RNA
berdasarkan ukuran dan terdeteksi pada membrane menggunakan probe hibridisasi
dengan urutan basa komplementer untuk semua atau sebagian dari urutan basa mRNA
target.
Teknik ini pada dasarnya hibridisasi asam nukleat, perbedaannya pada RNA
sebagai target. Probe sama dengan southern blot dengan target adalah mRNA. Didalam
eukariot pemilihan mRNA lebih efisien karena genomic DNA tidak mempunyai intron
yang mungkin interference yang mengikat probe untuk mengoreksi sekuen. Dasarnya,
teknik ini menggunakan mRNA sehingga pada agarose gel tidak menggunakan
perlakuan denaturasi dengan asam kuat. Tahapan yang digunakan dalam metode ini
yaitu: pemisahan mRNA dengan elektroforesis, dipindahkan kedalam membrane nylon
dan diinkubasi dengan probe yang utas tunggal. Probe yang sebelumnya dilabel dengan
biotin atau digoxigenin atau radioaktif. Membran kemudian diperlihatkan difilem atau
substrad kromegenic. Variasi dari hibridisasi nortnblot adalah dengan teknik blot titik
dimana sampel tidak diseparasi berdasarkan ukuran. Melalui teknik ini mudah
dilakukan hanya dengan membrane ditetesi dengn mRNA dan probe. Sepertihalnya
sourthern blot DNA harus dibuat utas tunggal sebelum dblot. Sebelum ditetesi dengan
DNA sampel maka probe terlebih dahulu untuk menghibridisasi probe. Kemudian
membrane difisualisasikan di filem. Jika probe dan DNA atau RNA target mirip maka
filem akan berwarna hitam.

Page | 12
3.1 Tata Laksana Northern Blot
1 Menyiapkan sampel RNA
a Menambahkan 10-20 g RNA dalam tabung eppendorf steril
b Menambahkan formamida
Tujuannya adalah formamide akan menurunkan suhu pendinginan dari
interaksi probe-RNA, dan mencegah degradasi RNA oleh suhu tinggi.
c Menambahkan formaldehyde (2.2 M)
Formaldehida digunakan untuk denaturasi agen RNA untuk membatasi
struktur sekunder
d Menambahkan MOPS
MOPS adalah buffer yang paling umum digunakan untuk gel RNA karena
kapasitas buffernya pada pH 7,0.
e Menambahkan pemuat dye
f Memipet larutan
2 Mengisi sampel dalam sumur dan alat dinyalakan pada 100 volt selama 2
jam.
- Sampel RNA yang paling sering dipisahkan pada gel agarosa adalah sampel
yang mengandung formaldehid yang digunakan sebagai agen denaturasi
untuk RNA untuk membatasi struktur sekunder

Page | 13
 3 Visualisasi integritas dari RNA menggunakan UV atau dengan pewarnaan
EtBr
Gel dapat diwarnai dengan ethidium bromide (EtBr) dan dilihat di bawah sinar
UV untuk mengamati kualitas dan kuantitas RNA sebelum blotting.

4 Transfer menuju membrane nilon

Membrane nilon yang paling efektif untuk digunakan dalam northern blotting
adalah yang bermuatan positif karena memiliki afinitas tinggi.
a Menyiapkan pemindahan RNA

Page | 14
 b Tempatkan pada kertas saring whattman berukuran 3mm
c Tambahkan buffer
d Rendam kertas saring tersebut
e Tempatkan kembali kertas saring yang telah direndam
f Hilangkan sisa-sisa gelembung udara yang ada

g Tempatkan gel

h Tempatkan membrane nilon pada gel

i Aliri membrane nilon tersebut dengan larutan buffer
j Hilangkan gelembung-gelembung yang ada
k Tutup dengan menggunakan kertas saring whatman berukuran 3mm
l Tutup pula dengan plastic wrap
m Tumpuk kertas tersebut dengan menggunakan handuk diatas gel

Page | 15
 n Tunggu hingga semalam
5 Membongkar sistem transfer
a Pindahkan handuk dan kertas saring
b Menyiapkan RNA pada membrane nilon menggunakan crosslinker UV

6 Hibridisasi
a Prehibridisasi membrane dalam prehibridisasi buffer
b Inkubasi 2-4 jam

c Buang prehibridisasi buffer

d Tambahkan hibridisasi buffer
7 Penambahan probe

Page | 16
 Probe dari northern blot tersusun atas asam nukleat dengan sequence lengkap
untuk semua atau bagian dari RNA tertentu, bisa DNA, RNA atau
oligonukleotida dengan 25 basa lengkap untuk target sekuen.
Perlakuan :
a Inkubasi semalam dalam hibridisasi chamber
b Setelah inkubasi, buang larutannya
c Tambahkan larutan yang bersih
d Inkubasi pada 52C selama 30 menit dalam hibridisasi chamber

e Pindahkan membrane

f Membrane siap di film

Page | 17
 BAB IV
KESIMPULAN

Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan,
RNA atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein
tersebut mengalami imobilisasi. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan
elektroforesis gel. Blotting terdiri atas berbagai macam diantaranya western blot,
northern blot, dan southern blot. Perbedaan dari masing masing Teknik blothing dilihat
berdasarkan DNA, RNA, dan Protein. Southern blot substansi yang dapat dideteksi
DNA dengan pemeriksaan melibatkan asam nukleat dan aplikasi utamanya denagn
struktur gen, Northern blot pemeriksaannnya sama dengan Southern blot yaitu asam
nuklet ,substansi yang dideteksi RNA denagn aplikasi utamnya ekspresi gen, western
blot substansi yang diamati berupa protein dengan melibatkan antibodi dan aplikasi
utamanya jumlah protein, southwestern blot substansi yang dideteksi protein dengan

Page | 18
bantuan DNA menggunakan aplikasi utama berupa interaksi protein-DNA, sedangkan
Farwestern substansi yang dideteksi berupa protein dan aplikasi utamanya deang
menggunakan protein-protein.
Northern Blot merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui
konstruksi RNA yang mempunyai barat molekul lebih basar. Analisa dilakukan dengan
cara isolasi RNA dari jaringan yang mempunyai ekspresi gen yang paling tinggi.
Dasarnya, teknik ini menggunakan mRNA sehingga pada agarose gel tidak
menggunakan perlakuan denaturasi dengan asam kuat. Tata laksana pada metode
Northern Blot dengan Menyiapkan sampel RNA, Mengisi sampel dalam sumur dan alat
dinyalakan pada 100 volt selama 2 jam, Visualisasi integritas dari RNA menggunakan
UV atau dengan pewarnaan EtBr, Transfer menuju membrane nilon, Membongkar
sistem transfer, Hibridisasi, Penambahan probe.
SARAN
Adapun saran dari penulis antara lain:
- Seirin denagn perkembangan zaman yang semakin pesat dan teknologi yang
semakin canggih perlu dipelajari lebih dalam mengenai teknologi di bidang
kesehatan, terutama dalam bidang bioteknologi guna memajukan ilmu
pengetahuan di bidang kesehatan .
- Sebagai mahasiswa kesehatan, sebaiknya kita terus mengikuti perkembangan
dunia kesehantan yang semakin maju terutama dalam pbidang bioteknologi
aanalisis berbasis asam nukleat dan protein.

Page | 19
DAFTAR PUSTAKA

- Bondioli,K.R, Biery, KA., Hill, KG., Jones, KB. and De Mayo, F.G., 1991. Production
of Transgenic Cattle by Pronuklear Injection in "Transgenic Animals. pp. 265 -273.
- Brown, T.A.1993. Recombination. In Genetics molecular approach.
Chapman & Hall. London. :207-212
- https://listonsiburian.wordpress.com/2012/03/28/southern-blotting-dan-northern-
blotting/ (diakses tanggal 03 maret 2016)
- http://www.webgentech.org/wgte/dokuman/enb.pdf (diaksese tanggal 03 maret
2016)

Page | 20