2.
Aminocidos y protenas
N. Taniguchi
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
Tras leer este captulo, el lector debe ser capaz de:
Clasificar los aminocidos a partir de su estructura qumica
y su carga.
Explicar el significado de los trminos pKa y pI tal como se
aplican a aminocidos y protenas.
Describir los elementos de la estructura primaria,
secundaria, terciaria y cuaternaria de las protenas.
Describir los principios del intercambio de iones y la
cromatografa de filtracin en gel, y la electroforesis
y el isoelectroenfoque. Describir su aplicacin en la
caracterizacin y aislamiento de las protenas.
Explicar el principio del MALDI-TOF y la espectrometra
de masa por ionizacin electrospray y su aplicacin a la
protemica.
INTRODUCCIN
Las protenas son los principales polmeros estructurales y
funcionales en los seres vivos. Cumplen un amplio abanico
de funciones, incluida la catlisis de reacciones metablicas y
el transporte de vitaminas, minerales, oxgeno y combustibles.
Algunas protenas constituyen la estructura de los tejidos, mien-
tras otras funcionan en la transmisin nerviosa, la contraccin
muscular y la motilidad celular, y otras en la coagulacin de la
sangre y las defensas inmunitarias, y como hormonas y mol-
culas reguladoras. Las protenas son sintetizadas como una
secuencia de aminocidos unidos en una estructura poliamida
(polipptido) lineal, pero adoptan estructuras tridimensionales
complejas al realizar sus funciones. Hay presentes alrededor de
300 aminocidos en varios sistemas animales, vegetales y micro-
bianos, pero solamente 20 aminocidos estn codificados por el
ADN para aparecer en las protenas. Muchas protenas tambin
contienen aminocidos modificados y componentes accesorios,
denominados grupos prostticos. Se utilizan diversas tcnicas
qumicas para aislar y caracterizar protenas a partir de diferen-
tes criterios, incluyendo masa, carga y estructura tridimensio-
nal. La protemica es un campo emergente que estudia todas las
formas de expresin de las protenas en una clula u organismo,
y los cambios en la expresin de una protena como respuesta al
crecimiento, a las hormonas, al estrs y al envejecimiento.
2011. Elsevier Espaa, S.L. Reservados todos los derechos
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AMINOCIDOS
Estereoqumica: configuracin
en el -carbono, D- y L-ismeros
Cada aminocido tiene un carbono central, denominado car-
bono , al cual se enlazan cuatro grupos diferentes (fig. 2-1):
Un grupo amino bsico (NH2).
Un grupo carboxilo cido (COOH).
Un tomo de hidrgeno (H).
Una cadena lateral distintiva (R).
Uno de los 20 aminocidos, la prolina, no es un -aminocido
sino un -iminocido (v. ms adelante). Excepto para la glicina,
todos los aminocidos contienen al menos un tomo de carbono
asimtrico (el tomo carbono ), dando dos ismeros que son
pticamente activos, es decir, que pueden desviar el plano de la
luz plana polarizada. De estos ismeros, denominados estereoi-
smeros o enantimeros, se dice que son quirales, una palabra
derivada del trmino griego para mano. Dichos ismeros son
imgenes especulares no superponibles, de forma anloga a lo
que ocurre con la mano derecha y la izquierda, como se mues-
tra en la figura 2-2. Las dos configuraciones de aminocidos
se denominan D (para la dextro o derecha) y L (para la levo o
izquierda). Todos los aminocidos en las protenas son de con-
figuracin L, ya que las protenas son biosintetizadas por enzi-
mas que insertan solamente L-aminocidos en las cadena de
pptidos.
tomo de hidrgeno
H
Grupo Grupo
H2N C COOH
amino bsico carboxilo cido
R
Cadena lateral
Fig. 2-1 Estructura de un aminocido. Excepto para la glicina, cua-
tro grupos diferentes se unen al carbono  de un aminocido. La tabla
2-1 enumera las estructuras de los grupos R.
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 6 Aminocidos y protenas

Imagen Imagen en espejo

Espejo plano
Los 20 -aminocidos especificados por el cdigo gentico
O O O O

Aminocidos Estructura de la porcin R

+ + Aminocidos alifticos
e
H NH3
rponibl H3N H
Glicina (Gly, G) H
supe
No Alanina (Ala, A) CH3

Valina (Val, V) CH3

HO OH CH

CH3
Leucina (Leu, L) CH3

CH2CH

D-serina L-serina CH3
Isoleucina (Ile, I) CH3

Fig. 2-2 Enantimeros. Par de imgenes especulares de los aminoci- CHCH2CH3
dos. Cada aminocido representa una imagen especular no superponi-
Aminocidos que contienen azufre
ble. Las imgenes especulares de los estereoismeros se denominan
enantimeros. Solamente los L-enantimeros se encuentran en las Cistena (Cys, C) CH2SH

protenas. Metionina (Met, M) CH2CH2SCH3

Aminocidos aromticos
Fenilalanina (Phe, F)
Clasificacin de los aminocidos CH2
segn su estructura qumica
Tirosina (Tyr, Y)
CH2 OH
Las propiedades de cada aminocido dependen de su cadena
lateral (R); las cadenas laterales son los grupos funcionales Triptfano (Trp, W) CH2

que determinan la estructura y la funcin de las protenas, as
como la carga elctrica de la molcula. Para comprender los
mtodos de anlisis, purificacin e identificacin de las protenas NH

es importante conocer las propiedades de estas cadenas latera- Iminocido

les. Los aminocidos con cadena lateral con carga polar o hidro- Prolina (Pro, P)
flica normalmente se encuentran expuestos en la superficie de N
las protenas. Los residuos hidrofbicos no polares normalmente COOH
se encuentran enterrados en el interior hidrofbico o ncleo de (Whole structure)
una protena y estn fuera de contacto con el agua. Los 20 ami- Aminocidos neutros
nocidos en las protenas codificadas por el ADN se enumeran Serina (Ser, S) CH2OH
en la tabla 2-1 y se clasifican segn el grupo funcional de su Treonina (Thr, T) CHOH
cadena lateral.

CH3
Asparagina (Asn, N) O

CH2 C

Aminocidos alifticos NH2

Glutamina (Gln, Q) O

CH2CH2 C
Los aminocidos alifticos (alanina, valina, leucina, e isoleu-

NH2
cina) tienen hidrocarbonos saturados como cadenas laterales.
La glicina, que solamente tiene un hidrgeno como cadena Aminocidos cidos
lateral, se incluye tambin en este grupo. La alanina tiene una cido asprtico (Asp, D) CH2COOH

estructura relativamente simple, un grupo metilo como cadena cido glutmico (Glu, E) CH2CH2COOH
lateral, mientras que la leucina y la isoleucina tienen grupos sec-
e iso-butilo. Todos estos aminocidos son hidrofbicos. Aminocidos bsicos
Histidina (His, H) CH2

N
Aminocidos aromticos NH

Lisina (Lys, K) CH2CH2CH2CH2NH2

La fenilalanina, tirosina, y triptfano tienen cadenas laterales Arginina (Arg, R) CH2 CH2 CH2 NH C NH2
aromticas. Los aminocidos no polares alifticos y aromticos
NH
suelen encontrarse enterrados en el interior de la protena y
estn involucrados en interacciones hidrofbicas. La tirosina Tabla 2-1 Los 20 aminocidos encontrados en protenas. Las abre-
tiene un grupo hidroxilo dbilmente cido y puede encontrarse viaturas de tres letras y una letra utilizadas normalmente se muestran
en la superficie de las protenas. La fosforilacin reversible del entre parntesis.

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 Aminocidos 7

grupo hidroxilo de la tirosina en algunas enzimas es impor-

tante en la regulacin de las vas metablicas. Los aminocidos
Aminocidos polares neutros
aromticos son responsables de la absorcin ultravioleta de la
Los aminocidos polares neutros contienen grupos hidroxilo o
mayora de protenas, que presentan una absorcin mxima de
amida en su cadena lateral. La serina y la treonina contienen
unos 280 nm. El triptfano tiene una mayor absorcin en esta
grupos hidroxilo. Estos aminocidos se encuentran a veces en
regin que los otros dos aminocidos aromticos. El coeficiente
los centros activos de protenas catalticas, enzimas (cap. 6). La
de absorcin molar de una protena es til para determinar la
fosforilacin reversible de los residuos de serina y treonina peri-
concentracin de una protena en disolucin mediante espec-
fricos en la molcula enzimtica tambin est involucrada en
trometra. El espectro de absorcin habitual de los aminocidos
la regulacin del metabolismo energtico y del almacn de com-
aromticos y de una protena se muestran en la figura 2-3.
bustible en el organismo (cap. 13). La asparagina y la glutamina
tienen cadenas laterales tipo amida. stas son polares, pero bajo
condiciones fisiolgicas no tienen carga. La serina, la treonina y
AMINOCIDOS QUE NO FORMAN la asparagina son los principales lugares de unin de azcares a
PARTE DE PROTENAS protenas, formando las glucoprotenas (cap. 26).

Algunos aminocidos aparecen en estado libre o combinados,

pero no en protenas. La medicin de aminocidos anormales
en orina (aminoaciduria) es til para el diagnstico clnico
(v. cap. 19). En el plasma, los aminocidos libres normalmente
se encuentran a concentraciones de 10-100 mol/l, incluidos
muchos que no se encuentran en protenas. La citrulina, por
ejemplo, es un importante metabolito de la L-arginina y un pro-
ducto de la xido ntrico sintasa, una enzima que produce
xido ntrico, una importante molcula de sealizacin vasoac-
tiva. La concentracin urinaria de un aminocido se expresa
normalmente en mmol/g creatinina. La creatinina es un ami-
nocido que proviene del msculo y que se excreta en cantida-
des relativamente constantes por unidad de masa corporal por
da. As, la concentracin de creatinina en orina (normalmente
alrededor de 1 mg/ml) puede utilizarse para corregir la dilucin
de la orina. El aminocido ms abundante en la orina es la gli-
cina, que est presente como 400-2,000 g/g creatinina.
Aminocidos cidos
Los cidos asprtico y glutmico contienen cidos carboxlicos
en sus cadenas laterales y estn ionizados a un pH de 7,0 y,
como resultado, presentan cargas negativas en sus grupos car-
boxilo - y -, respectivamente. En el estado ionizado, estos ami-
nocidos se denominan aspartato y glutamato, respectivamente.
Aminocidos bsicos
Las cadenas laterales de la lisina y la arginina estn completa-
mente protonadas a pH neutro y, por tanto, cargadas positi-
vamente. La lisina contiene un grupo amino primario unido al
carbono terminal - de la cadena lateral. El grupo -amino de
la lisina tiene un pKa de aproximadamente 11. La arginina es
el aminocido ms bsico (pKa de aproximadamente 13) y su

1,0 1,0
Triptfano

0,8 0,8

0,6 0,6
Absorbancia
ELSEVIER. Fotocopiar sin autorizacin es un delito.

0,4 0,4
Albmina
Tirosina
0,2 0,2

Fenilalanina
A 0,0 B 0,0
240 260 280 200 250 300 350
Longitud de onda (nm) Longitud de onda (nm)

Fig. 2-3 Espectro de absorcin ultravioleta de los aminocidos aromticos y de la albmina srica bovina. (A) Aminocidos aromticos
como el triptfano, la tirosina y la fenilalanina tienen un mximo de absorbancia a 280 nm. Cada protena purificada tiene un coeficiente
de absorcin distinto alrededor de 280 nm, dependiendo de su contenido en aminocidos aromticos. (B) Una disolucin de albmina srica
bovina (1 mg disuelto en 1 ml de agua) tiene una absorbancia de 0,67 a 280 nm utilizando una cubeta de 1 cm. El coeficiente de absorcin
de las protenas se expresa con frecuencia como E1% (10 mg/ml de solucin). Para la albmina, E1%280 nm = 6,7. Aunque las protenas varan en
su contenido de Trp, Tyr y Phe, las mediciones de absorbancia a 280 nm son tiles para la estimacin de la concentracin de protenas en las
disoluciones.

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 8 Aminocidos y protenas

grupo guanidina existe como un ion guanidinium protonado a
un pH de 7,0.
La histidina (pKa de aproximadamente 6) tiene un anillo imi-
dazlico como cadena lateral y funciona como un catalizador
general cido-base en numerosas enzimas. La forma protonada
del imidazol se denomina ion imidazolio.
polipeptdica, causando algunas veces cambios abruptos en la
direccin de la cadena.
Clasificacin de los aminocidos segn
la polaridad de las cadenas laterales
del aminocido

Aminocidos que contienen azufre
La cistena y su forma oxidada, la cistina, son aminocidos que
contienen azufre y que se caracterizan por su baja polaridad.
La cistena tiene un cometido importante en la estabilizacin
de la estructura de las protenas, dado que puede participar
en la formacin de puentes disulfuro con otros residuos de
cistena para formar residuos de cistina, con lo que las cade-
nas de protenas quedan entrecruzadas y as se estabiliza la
estructura de la protena. Dos regiones de una cadena polipep-
tdica alejadas una de otra en la secuencia pueden estar uni-
das covalentemente a travs de un puente disulfuro (puente
disulfuro intracadena). Los puentes disulfuro tambin pueden
formarse entre dos cadenas polipeptdicas (puente disulfuro
intercadena), formando dmeros proteicos covalentes. Estos
puentes pueden reducirse mediante enzimas o mediante agen-
tes reductores como el 2-mercaptoetanol o dithiotreitol, para
formar residuos de cistena. La metionina es el tercer ami-
nocido que contiene azufre y tiene un grupo metil tioter no
polar en su cadena lateral.
La tabla 2-2 muestra los grupos funcionales de los aminocidos
y su polaridad (hidrofilia). Las cadenas laterales polares pueden
intervenir en la unin de hidrgeno al agua y a otros grupos
polares; normalmente se encuentran en la superficie de la pro-
tena. Las cadenas hidrofbicas contribuyen al plegamiento de
la protena mediante interacciones hidrofbicas y se encuentran
principalmente en el interior de la protena o en superficies que
intervienen en interacciones con otras protenas.
Estado de ionizacin de un aminocido
Los aminocidos son molculas anfteras, es decir, tienen tanto
grupos bsicos como cidos. Los cidos monoamino y mono-
carboxlico en disolucin presentan varias formas de ionizacin
segn el pH de la solucin. A un pH de 7, el zwitterion +H3N
CH2COO es la especie dominante de glicina en disolucin, y
por tanto la molcula es elctricamente neutra. En la titulacin
a pH cido, el grupo -amino es protonado y cargado positiva-
mente, dando el catin +H3NCH2COOH, mientras que la
titulacin con lcali da la especie aninica H2NCH2COO.

H OH
+ +
H3N CH2 COOH H3N CH2 COO
Prolina, un iminocido cclico
H2N CH2 COO
La prolina se diferencia de los otros aminocidos en que el anillo
de pirrolidina de su cadena lateral incluye el grupo -amino y Los valores de pKa para los grupos -amino y -carboxilo y de
el carbono . Este iminocido fuerza un ngulo en la cadena las cadenas laterales de aminocidos cidos y bsicos se mues-

Resumen de los grupos funcionales de aminocidos y su polaridad

Aminocidos Grupo funcional Hidroflico (polar) o hidrofbico (apolar) Ejemplos

cido Carboxilo, COOH Polar Asp, Glu

Bsico Amino, NH2 Polar Lys

Imidazol Polar His
Guanidina Polar Arg

Neutro Glicina, H No polar Gly

Amidas, CONH2 Polar Asn, Gln
Hidroxilo, OH Polar Ser, Thr,
Sulfidrilo SH No polar Cys

Aliftico Hidrocarburo No polar Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro

Aromtico Anillos C No polar Phe, Trp, Tyr

Tabla 2-2 Resumen de grupos funcionales de aminocidos y su polaridad.

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 Aminocidos 9

tran en la tabla 2-3. La carga global de una protena depende de La constante de disociacin (Ka) de un cido dbil se define
la contribucin de los aminocidos bsicos (carga positiva) y ci- como la constante de equilibrio de la reaccin de disociacin (1)
dos (carga negativa), pero la carga real en la protena vara con del cido:
el pH de la disolucin. Para entender cmo las cadenas laterales
afectan a la carga en las protenas, es imprescindible recordar la
[HA][A ]
ecuacin de HendersonHasselbalch. Ka = _______
[HA]
(2)

La concentracin de iones hidrgeno [H+] de una disolucin

Ecuacin de Henderson-Hasselbalch y pKa de un cido dbil puede calcularse como sigue. La ecuacin (2)
puede reordenarse para dar:
La disociacin general de un cido dbil, como el cido carbox-
lico, viene dada por la ecuacin: [HA]
[H+] = Ka ____
[A]
(3)

HA H+ + A (1)
La ecuacin (3) puede expresarse en trminos de un logaritmo
negativo:
Donde HA es la forma protonada (cido conjugado o forma aso-
[HA]
ciada) y A es la forma no protonada (base conjugada o forma log [H+] = log Ka log ____
[A]
(4)
disociada).

Valores de pK y grupos ionizados en protenas

Grupo cido (forma protonada) H+ + Base (forma no protonada) pKa

(cido conjugado) (base conjugada)

Residuo carboxilo terminal COOH (cido carboxlico) COO + H+ (carboxilato) 3,0-5,5

(-carboxilo)

cido asprtico (-carboxilo) COOH COO + H+ 3,9

cido glutmico (-carboxilo) COOH COO + H +

4,3

Histidina (imidazol) 6,0


HN NH N NH  H
(imidazolio) (imidazol)

Amino terminal (-amino) NH3+ NH2 + H+ 8,0

(amonio) (amina)

Cistena (sulfidrilo) SH S + H+ 8,3

ELSEVIER. Fotocopiar sin autorizacin es un delito.

(tiol) (tiolato)

Tirosina (hidroxilo fenlico) 10,1

OH O  H
(fenol) (fenolato)

Lisina (-amino) NH3+ NH2 + H+ 10,5

Arginina (guanidina) NH2 NH2 12,5

NH C  NH C  H
NH2 NH2

(guanidino) (guanidino)

Tabla 2-3 Valores de pKa caractersticos para grupos ionizables en protenas. Valores reales de pKa pueden variar hasta
tres unidades de pH, dependiendo de la temperatura, del tampn, de la unin a ligando y, especialmente, de los grupos
funcionales vecinos en la protena

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 10 Aminocidos y protenas

Dado que el pH es el logaritmo negativo de [H+], es decir,

pH < 2,4 2,4 < pH < 9,8 pH > 9,8
log[H+], y el pKa es igual al logaritmo negativo de la constante
de disociacin para un cido dbil, es decir, logKa, la ecuacin NH+ 3 NH+ 3 NH2
+ OH + OH
de HendersonHasselbalch (5) puede desarrollarse y utilizarse HC CH3 HC CH3 HC CH3
para el anlisis de los sistemas de equilibrio cido-base: + H+ + H+
COOH COO COO

[A ]
pH = pKa + log ____
[HA]
(5)
pH
Catin Neutrn Anin
Para una base dbil como una amina, la reaccin de disociacin 12
puede escribirse como sigue:
10
RNH3+ H+ + RNH2 (6) pKa2 = 9,8

8
Y la ecuacin de Henderson-Hasselbalch se convierte en:

6 pI = 6,1
[RNH2]
pH = pKa + log _______
[RNH +]
(7)
3
4

Desde las ecuaciones (5) y (7) est claro que el grado de

2 pKa1 = 2,4
protonacin de los grupos funcionales cidos y bsicos, y
por tanto la carga neta, variar con el pKa del grupo funcio-
nal y el pH de la disolucin. Para la alanina, que tiene dos
0 0,5 1,0 1,5 2,0
grupos funcionales con pKa = 2,4 y 9,8, respectivamente
(fig. 2-4), la carga neta vara con el pH, desde +1 a 1. En un OH equivalente
punto intermedio entre pKa1 y pKa2, la alanina tiene una
carga neta de cero. Este pH se llama su punto isoelctrico, pI Fig. 2-4 Titulacin de un aminocido. La curva muestra el nmero
(v. fig. 2-4). de equivalentes de NaOH consumidos por la alanina mientras se titula
la solucin desde pH 0 a pH 12. La alanina contiene dos grupos ioni-
zables: un grupo carboxilo  y un grupo amino . A medida que se
aade NaOH, se titulan estos dos grupos. El pKa del grupo -COOH
es 2,4, mientras que el del grupo -NH3+ es 9,8. A pH muy bajo, la
especie inica predominante de la alanina es la forma completamente
protonada:
AMORTIGUADORES O TAMPONES
CH3

Los amortiguadores son soluciones que minimizan un cambio H3N CH COOH
en la [H+], es decir, en el pH, al aadir un cido o una base. Una
disolucin amortiguadora, con un cido dbil o una base dbil En el punto medio de la titulacin del primer estadio (pH 2,4), hay
concentraciones equimolares de las especies donadoras y aceptora de
y un ion de carga contraria, tiene una capacidad de amorti-
protones, lo que proporciona un buen poder de tamponamiento.
guacin mxima a su pKa, es decir, cuando las formas cidas y
bsicas estn presentes a igual concentracin. La forma cida
protonada reacciona con la base aadida y la forma bsica CH3 CH3
no protonada neutraliza el cido aadido, como se muestra a 
H3N CH COOH H2N CH COO
continuacin para un componente amino:
El segundo estadio de la titulacin corresponde a la eliminacin de un
RNH3+ + OH  RNH2 + H2O protn desde el grupo NH3+ de la alanina. El pH en el punto medio
RNH2+ H+  RNH3+ de este estadio es 9,8, igual al pKa para el grupo NH3+. La titulacin
es completa a un pH de alrededor de 12, punto en el que la forma
Una disolucin de alanina (v. fig. 2-4) tiene una capacidad de predominante de la alanina es:
amortiguacin mxima a pH 2,4 y de 9,8, es decir, al pKa de los
grupos carboxilo y amino, respectivamente. Cuando se disuelve CH3
en agua, la alanina existe como un ion dipolar o zwitterion, en
H2N CH COO
el que el grupo carboxilo no est protonado (COO) y el grupo
amino est protonado (NH3+). El pH de la solucin es 6,1 y
El pH en el que una molcula no tiene carga neta se conoce como
el punto isoelctrico, pI, el valor medio entre el pKa de los gru-
punto isoelctrico. Para la alanina, se calcula como:
pos amino y carboxilo. La curva de titulacin de la alanina por
NaOH (v. fig. 2-4) ilustra que la alanina tiene una capacidad de pK pK
a1 a2 2,4 9,8 12,2
amortiguacin mnima a su pI, y una capacidad de amortigua- pI 6,1
2 2 2
cin mxima a un pH igual al pKa1 o al pKa2.

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R1 R2 R1 O R2
H2N CH COOH + H2N CH COOH H2N CH C NH CH COOH
H2O
Aminocidos Dipptido
Fig. 2-5 Estructura de un enlace peptdico.
NH2 H O
N C
HOOC C N COOH
O CH2
H
SH
Fig. 2-6 Estructura del glutatin.
PPTIDOS Y PROTENAS
Estructura primaria de las protenas
La estructura primaria de las protenas
es la secuencia lineal de aminocidos
En las protenas, el grupo carboxilo de un aminocido se une
al grupo amino del aminocido siguiente, formando un puente
amida (pptido), en la reaccin se elimina agua (fig. 2-5). Las
unidades de aminocidos de una cadena de pptidos se deno-
minan residuos de aminocidos. Una cadena peptdica consis-
tente en tres residuos de aminocidos se denomina tripptido,
por ejemplo, el glutatin de la figura 2-6. Por convencin, el
amino terminal (N-terminal) se considera el primer residuo y
la secuencia de aminocidos se escribe de izquierda a derecha.
Cuando se escribe la secuencia de pptidos, se utilizan las abre-
viaciones de los aminocidos de tres letras o de una letra, como
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu o D-R-V-Y-I-H-P-F-H-L
(v. tabla 2-1). Este pptido es la angiotensina, una hormona pep-
tdica que afecta la presin sangunea. El residuo aminocido
que tiene un grupo amino libre al final del pptido (Asp) se deno-
mina el aminocido N-terminal (amino terminal), mientras que
el residuo que tiene un grupo carboxilo libre en el otro extremo
(Leu) se denomina aminocido C-terminal (carboxilo terminal).
Las protenas contienen entre 50 y 2.000 residuos de aminoci-
ELSEVIER. Fotocopiar sin autorizacin es un delito.
dos. La masa molecular media de un residuo aminocido es de
alrededor de 110 unidades dalton (Da). Por tanto, la masa mole-
cular de la mayora de protenas est entre 5.500 y 220.000 Da.
La anhidrasa carbnica humana I, una enzima que tiene
un cometido fundamental en el equilibrio cido-base en la
sangre (v. cap. 24), es una protena con un peso molecular de
29.000 Da (29 kDa).
Carga y polaridad caractersticas
de una cadena peptdica
La composicin de aminocidos de una cadena peptdica tiene
un profundo efecto en sus propiedades fsicas y qumicas. Las
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Pptidos y protenas 11
GLUTATIN
El glutatin (GSH) es un tripptido con la secuencia L--gluta-
mil-L-cisteinil-glicina (fig. 2-6). Si el grupo tiol de la cistena est
oxidado, se forma el disulfuro GSSG. El GSH es el principal pp-
tido presente en la clula. En el hgado, la concentracin de
GSH es aproximadamente de 5 mmol/l. El GSH tiene un come-
tido principal en el mantenimiento de los residuos de cistena
de las protenas en su forma reducida (sulfidrilo) y en las defen-
sas antioxidantes (cap. 37). La enzima -glutamil transpeptidasa
participa en el metabolismo del glutatin y es un biomarcador
plasmtico para algunas enfermedades del hgado, entre ellas el
carcinoma hepatocelular y la hepatopata alcohlica.
protenas ricas en grupos amino alifticos o aromticos son rela-
tivamente insolubles en agua y se encuentran probablemente
en las membranas celulares. Las protenas ricas en aminocidos
polares son ms solubles en agua. Las amidas son componentes
neutros ya que el esqueleto amida de una protena, que incluye
los grupos -amino y -carboxilo que lo forman, no contribuye
a la carga de la protena. En cambio, la carga de la protena
depende de los grupos funcionales de la cadena lateral de los
aminocidos. Los grupos de aminocidos con cadena lateral
cida (Glu, Asp) o bsica (Lys, His, Arg) conferirn una carga
y una capacidad de amortiguacin a la protena. El equilibrio
entre cadenas laterales cidas y bsicas en una protena deter-
mina su punto isoelctrico (pI) y la carga neta en disolucin. Las
protenas ricas en lisina y arginina son bsicas en disolucin y
tienen carga positiva a pH neutro, mientras que las protenas
cidas, ricas en aspartato y glutamato, son cidas y tienen carga
negativa. Debido a los grupos funcionales de su cadena lateral,
todas las protenas estn ms cargadas positivamente a pH cido
y ms cargadas negativamente en pH bsico. Las protenas son
una parte importante de la capacidad de tamponamiento de las
clulas sanguneas y de los lquidos biolgicos.
La estructura secundaria est determinada
por las interacciones de enlace o puente
de hidrgeno del grupo carbonilo y
residuos de amida en el esqueleto del
pptido
La estructura secundaria de una protena se refiere a la estruc-
tura local de la cadena polipeptdica. Esta estructura est deter-
minada por las interacciones mediante enlaces o puentes de
hidrgeno entre el oxgeno del grupo carbonilo de una cadena
peptdica y el hidrgeno de amida de otra cadena peptdica pr-
xima. Existen dos tipos de estructura secundaria: la hlice  y la
hoja plegada .
Hlice
La hlice  es una estructura en forma de varilla con la cadena
peptdica fuertemente enrollada y con las cadenas laterales
1/18/11 6:24:30 PM
 12 Aminocidos y protenas

A B
O
R
N C
C
H N O H O H
O
O H C
R C C N C C N
C C R
O C N C N C C N C
C H
N H O H O
R C H O
N C O H O H
R
H C O
C C N C C N
O N C C N C C N C
C H C R
H O H O
N
R C
H
C N

Puente de hidrgeno Puente de hidrgeno

Fig. 2-7 Motivos de la estructura secundaria de las protenas. (A) Una estructura secundaria helicoidal . Los puentes hidrgeno entre el
esqueleto de los grupos amida NH y C = O estabiliza la hlice . Los tomos de hidrgeno de los grupos OH, NH o SH (donadores de hidrgeno)
interactan con los electrones libres de los tomos aceptores como el O, N o S. Aunque la energa de los enlaces es menor que la de las uniones
covalentes, los enlaces o puentes de hidrgeno tienen un cometido fundamental en la estabilizacin de molculas proteicas. La cadena lateral R
de los aminocidos se extiende hacia fuera de la hlice. Se muestran tambin el modelo de bolas y varillas, y el modelo compacto. (B) La estruc-
tura secundaria de hoja plegada  paralela. En la conformacin de hoja plegada , el esqueleto de la cadena polipeptdica se extiende en una
estructura en zigzag. Cuando las cadenas polipeptdicas en zigzag estn empaquetadas, forman una estructura que se parece a una serie de
pliegues. Se muestran tambin el modelo de bolas y varillas y el modelo compacto.

de los residuos aminocidos extendindose fuera del eje de la COLGENO

espiral. Cada grupo carbonilo amdico est unido mediante
un puente de hidrgeno al hidrgeno del grupo amida de una
Los defectos genticos que afectan al colgeno ilustran la
cadena peptdica que est alejado cuatro residuos a lo largo de
estrecha relacin entre secuencia de aminocidos y su estruc-
la misma cadena. Hay un promedio de 3,6 residuos de amino-
tura tridimensional. Los colgenos son la familia de protenas
cidos por vuelta de hlice y la hlice gira hacia la derecha (en
ms abundante en los mamferos, llegan a representar cerca de
sentido de las agujas del reloj) en la mayora de las protenas
un tercio de las protenas corporales. Son un componente fun-
naturales (fig. 2-7A).
damental del tejido conectivo, como el cartlago, los tendones,
la matriz orgnica de los huesos y la crnea.

Hoja plegada Comentario. El colgeno contiene un 35% de Gly, un 11% de

Si los enlaces de H se forman entre enlaces peptdicos de dife-
rentes cadenas, las cadenas se ordenan de forma paralela o
antiparalela en una disposicin que se suele denominar hoja
plegada . La hoja plegada  es una estructura extendida,
a diferencia de la hlice , que est enrollada. Est plegada
porque los enlaces carbono carbono (CC) son tetradricos
y no pueden existir en una configuracin plana. Si la cadena
polipeptdica discurre en la misma direccin, forma una
hoja  paralela (fig. 2-7B), pero si sigue la direccin opuesta,
forma una estructura antiparalela. El giro  se refiere al seg-
mento en el que el polipptido gira y cambia abruptamente
de direccin. Los residuos de glicina (Gly) y de prolina (Pro)
con frecuencia aparecen en giros  sobre la superficie de las
protenas globulares.
Ala y un 21% de Pro e Hyp (hidroxiprolina). La secuencia de ami-
nocidos en el colgeno generalmente es una unidad tripeptdica
repetida (Gly-Xaa-Pro o Gly-Xaa-Hyp), donde Xaa puede ser cual-
quier aminocido, e Hyp = hidroxiprolina. Esta secuencia repetida
adopta una estructura helicoidal levgira con tres residuos por
vuelta. Tres de estas hlices se enrollan una alrededor de la otra
formando una triple hlice dextrgira. La molcula de tres fila-
mentos resultante se denomina tropocolgeno. Las molculas de
tropocolgeno se autoensamblan formando fibrillas de colgeno y
se empaquetan para formar fibras de colgeno. Existen alteracio-
nes metablicas y genticas que son el resultado de alteraciones
del colgeno. El escorbuto, la osteognesis imperfecta (cap. 28)
y el sndrome de EhlersDanlos son el resultado de defectos en la
sntesis del y/o entrecruzamientos del colgeno.

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1. Puentes disulfuro Cys S S Cys
2. Puentes de hidrgeno Ser O H O = C Gln
NH2
O que sustentan el cristalino, es rica en residuos de cistena. Se
+
3. Puentes de sal Glu C O NH3 Lys
Val
CH3
H3C CH3
Phe
4. Interacciones hidrofbicas CH3
HC
CH3
CH2
Leu
Fig. 2-8 Elementos de la estructura terciaria de las protenas.
Ejemplos de las interacciones de las cadenas laterales de los aminoci-
dos que contribuyen a la estructura terciaria.
La estructura terciaria resulta del
plegamiento de la cadena peptdica
La conformacin tridimensional, plegada y biolgicamente
activa de una protena es propia de su estructura terciaria. Esta
estructura refleja la forma global de la molcula. La estructura
terciaria de las protenas se ha determinado mediante cristalo-
grafa de rayos X y espectroscopia de resonancia magntica. La
conformacin plegada de las protenas que contienen ms de
200 residuos consiste en varias unidades ms pequeas plega-
das denominadas dominios.
La estructura terciaria tridimensional de una protena est
estabilizada por interacciones entre grupos funcionales de las
cadenas laterales: puentes disulfuro covalentes, enlaces de hidr-
geno, puentes salinos e interacciones hidrofbicas (fig. 2-8). Las
cadenas laterales de triptfano y arginina sirven como donado-
ELSEVIER. Fotocopiar sin autorizacin es un delito.
res de hidrgeno, mientras que la asparagina, la glutamina, la
serina y la treonina pueden servir tanto de donadores como de
aceptores de hidrgeno. La lisina, el cido asprtico, el cido glu-
tmico, la tirosina y la histidina tambin pueden servir de dona-
dores y de aceptores en la formacin de pares inicos (puentes
salinos). Dos aminocidos de carga opuesta, como el glutamato
con un grupo carboxilo  y la lisina con un grupo amino , pue-
den formar un puente salino, principalmente en la superficie de
las protenas (v. fig. 2-8).
Algunos componentes como la urea y el cloruro de guanidi-
nio causan con frecuencia la desnaturalizacin o la prdida de
la estructura secundaria y terciaria cuando se encuentran pre-
sentes a concentraciones elevadas como, por ejemplo, 8 mol/l de
urea. Estos reactivos se denominan desnaturalizantes o agentes
caotrpicos.
C0010.indd 13
Pptidos y protenas 13
DISLOCACIN DEL CRISTALINO
EN LA HOMOCISTINURIA
(INCIDENCIA: 1 EN 350.000)
La manifestacin ocular ms frecuente de la homocistinuria
(cap. 19) es la dislocacin del cristalino que tiene lugar alrede-
dor de los 10 aos. La fibrillina, que se encuentra en las fibras
necesitan los puentes disulfuro entre estos residuos para el
entrecruzamiento y estabilizacin de la protena y de la estruc-
tura del cristalino. La homocistena, un homlogo de la cis-
tena, puede alterar estos puentes mediante un intercambio de
disulfuro que depende de la homocistina.
Otra alteracin igualmente infrecuente causada por altera-
ciones de aminocidos es la deficiencia de sulfito oxidasa. Se
asocia tambin con dislocacin del cristalino por un mecanismo
similar (normalmente se presentan al nacer, con convulsiones
precoces resistentes al tratamiento). El sndrome de Marfan,
asociado tambin con dislocacin del cristalino, guarda relacin
con mutaciones en el gen de la fibrillina (cap. 28).
Fig. 2-9 Estructura tridimensional de una protena dimrica.
Estructura cuaternaria de la Cu-Zn-superoxidodismutasa de las espinacas.
La Cu,Zn superoxidodismutasa tiene una estructura dimrica, con un
monmero de masa molecular 16.000 Da. Cada subunidad est cons-
tituida por ocho hojas  antiparalelas denominada estructura en barril ,
por su similitud con motivos geomtricos encontrados en tejidos y alfare-
ra griega y de los nativos americanos. Cortesa del Dr. Y. Kitagawa.
La estructura cuaternaria est formada por
interacciones entre cadenas de pptidos
La estructura cuaternaria corresponde a un complejo o un
ensamblaje de dos o ms cadenas de pptidos que se mantienen
unidas por interacciones no covalentes o, en algunos casos,
covalentes. En general, la mayora de protenas mayores de
50 kDa constan de ms de una cadena y se conocen como pro-
tenas dimricas, trimricas o multimricas. Muchas protenas
que contienen varias subunidades estn compuestas de dife-
rentes tipos de subunidades funcionales, como las subunidades
reguladoras y las catalticas. La hemoglobina es una protena
tetramrica (cap. 5) y la ATPasa mitocondrial del corazn
de vaca tiene 10 protmeros (cap. 9). La unidad menor se
1/18/11 6:24:31 PM
 14 Aminocidos y protenas

A C Fig. 2-10 Estructuras primaria, secundaria,

terciaria y cuaternaria. (A) La estructura pri-
maria est compuesta de una secuencia lineal
H H O H H O H de residuos de aminocidos de protenas. (B) La
NCCNCCN estructura secundaria indica la disposicin espa-
cial local del esqueleto polipeptdico dando una
R R hlice - o la estructura de hoja plegada  como
est representada por la cinta. Los puentes de
hidrgeno entre los esqueletos amida NH y
CO estabilizan la hlice. (C) La estructura
B O D terciaria ilustra la conformacin tridimensional
R de una subunidad de la protena, mientras que
N C
C la estructura cuaternaria (D) indica el ensamblaje
H N de mltiples cadenas de polipptidos en una pro-
H C O tena tetramrica intacta.
O
R
C C R
O C N
C H
N
R C H O
N C R
H C O

O N C
C H C R

N
H2N
H

denomina monmero o subunidad. La figura 2-9 reproduce

la estructura de la protena dimrica Cu,Zn (superxido dis-
mutasa). La figura 2-10 muestra una perspectiva global de las
estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de una
protena tetramrica.
PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN
DE LAS PROTENAS
Los procedimientos de purificacin proteica permiten la sepa-
racin de las protenas basndose en la carga, el tamao, las
propiedades de unin y las de solubilidad. La completa carac-
terizacin de la protena requiere conocer la composicin de
sus aminocidos y su completa estructura primaria, secunda-
ria, terciaria (para las protenas multimricas) y su estructura
cuaternaria (para las protenas multimricas).
Para caracterizar una protena, primero es necesario purificar
la protena separndola de los otros componentes en mezclas
biolgicas complejas. La fuente de las protenas normalmente es
la sangre o tejidos, o clulas microbianas tales como bacterias y
levaduras. Primero, las clulas o tejidos, se rompen por troceado
u homogeneizacin en disoluciones isotnicas tamponadas,
comnmente a pH fisiolgico y a 4 C para minimizar la desna-
turalizacin de la protena durante la purificacin. El extracto concentracin elevada de sal. Cuando el sulfato de amonio, una
crudo conteniendo orgnulos tales como el ncleo, mitocon-
drias, lisosomas, microsomas y fracciones citoslicas puede
fraccionarse posteriormente mediante centrifugacin a alta
velocidad o ultracentrifugacin. Las protenas que se unen fuer-
temente a otras biomolculas o membranas pueden solubilizarse
utilizando disolventes orgnicos o detergentes.
MODIFICACIN POSTRADUCCIONAL
DE LAS PROTENAS
La mayora de protenas sufren alguna forma de modificacin
enzimtica despus de la sntesis de la cadena peptdica. Las
modificaciones postraduccionales se realizan mediante enzimas
procesadoras en el retculo endoplasmtico, el aparato de
Golgi, los grnulos secretores y el espacio extracelular. Las
modificaciones incluyen la fragmentacin proteoltica, la gluco-
silacin, la lipidacin y la fosforilacin. La espectrometra de
masas (ms adelante), una herramienta basada en las diferen-
cias en la masa molecular (v. cap. 33) permite detectar estas
modificaciones.
Fraccionamiento mediante sulfato
de amonio
La solubilidad de una protena depende de la concentracin de
las sales disueltas y la solubilidad puede incrementarse con la
adicin de sal a baja concentracin o reducirse mediante una
de las sales ms solubles, se aade a una disolucin de una pro-
tena, algunas protenas precipitan a una concentracin dada de
sal, mientras que otras no. Las inmunoglobulinas sricas huma-
nas son precipitables con un (NH4)2SO4 saturado al 33-40%,
mientras que la albmina permanece soluble. El sulfato de
amonio saturado est alrededor del 4,1 mol/l. La mayora de

C0010.indd 14 1/18/11 6:24:31 PM

 Purificacin y caracterizacin de las protenas 15

protenas precipitarn en una disolucin de (NH4)2SO4 saturado
al 80%.
Separacin basada en el tamao
Dilisis y ultrafiltracin
Las molculas pequeas como las sales pueden separarse de las
disoluciones de protenas por dilisis o ultrafiltracin. La dili-
sis se realiza aadiendo la disolucin protena-sal a un tubo de
membrana semipermeable (normalmente una membrana de
nitrocelulosa o colodin). Cuando el tubo se sumerge en una
disolucin tamponada diluida, las molculas pequeas pasarn
a travs y las molculas proteicas grandes se retendrn en el
tubo, dependiendo del tamao del poro de la membrana de di-
lisis. Este procedimiento es particularmente til para separar el
(NH4)2SO4 u otras sales durante la purificacin de la protena,
dado que las sales interferirn con la purificacin de las prote-
nas por cromatografa de intercambio inico (v. ms adelante).
La figura 2-11 ilustra la dilisis de protenas.
La ultrafiltracin ha reemplazado en gran medida a la dilisis
para la purificacin de protenas. Esta tcnica utiliza la presin
para forzar el paso de una disolucin a travs de una mem-
brana semipermeable de tamao de poro definido y homogneo.
Seleccionando el valor adecuado de corte del peso molecular
que atraviesa el filtro, el disolvente y los solutos de bajo peso
molecular podrn atravesar la membrana, formando el filtrado,
mientras que las protenas de mayor peso molecular quedarn
retenidas en la solucin. La ultrafiltracin puede utilizarse para
concentrar disoluciones de protenas o complementar la dilisis
mediante el continuo reemplazo del tampn en el comparti-
mento de retencin.
Gel de filtracin (tamizacin molecular)
La cromatografia de filtracin en gel usa una columna de pol-
meros insolubles muy hidratados, como los dextranos, la aga-
rosa o la poliacrilamida. La cromatografa de filtracin en gel
depende de la diferente migracin de solutos disueltos a travs
de geles que tienen poros de tamaos definidos. Esta tcnica se
utiliza con frecuencia para la purificacin de protenas y para el
desalado de disoluciones de protenas. La figura 2-12 describe
A B
Antes de la dilisis Despus de la dilisis
Tampn
Recipiente de cristal
Tubo de dilisis
Barra de agitacin
Agitador
magntico
Fig. 2-11 Dilisis de protenas. Las protenas y los compuestos de
masa molecular baja son separadas por dilisis segn su tamao.
(A) Una disolucin de protenas con sales se coloca en un tubo de
dilisis en un recipiente y se dializa con agitacin frente a un tampn
apropiado. (B) La protena se retiene en el tubo de dilisis, mientras
las sales se intercambiarn a travs de la membrana. Si se utiliza un
gran volumen de tampn externo, mediante la sustitucin del tampn
en varias veces, la protena tambin ser intercambiada en la solucin
amortiguador externo.

Fig. 2-12 Fraccionamiento de

las protenas por el tamao:
Solucin de protenas
cromatografa de las protenas
por cromatografa de filtracin
en gel. Las protenas con tamaos
Pr1 Pr2 Pr3 Sal
moleculares diferentes son sepa-
radas por gel filtracin segn su
tamao relativo. La protena ms
Molculas pequea entra ms fcilmente
A280
pequeas en las bolas de polmeros, mien-
pasando a travs tras que las protenas ms grandes
lentamente
ELSEVIER. Fotocopiar sin autorizacin es un delito.

pueden ser completamente exclui-

das. Las molculas ms grandes
Gotas Volumen de elucin
fluyen ms rpidamente a travs
de polmero de esta columna, consiguindose
en gel un fraccionamiento en base al
Molculas grandes tamao molecular. El cromato-
pasando a travs grama de la derecha muestra un
rpidamente fraccionamiento terico de tres
protenas, Pr1-Pr3, de peso molecu-
lar decreciente.

1 5 10
Nmero de fraccin

C0010.indd 15 1/18/11 6:24:31 PM

 16 Aminocidos y protenas
el principio de la filtracin en gel. Existen en el mercado geles
elaborados con bolas de polmeros de carbohidratos diseados
como dextrano (series de Sephadex), poliacrilamida (series de
BioGel P) y agarosa (series de Sepharose), respectivamente.
Los geles varan en el tamao del poro y se pueden escoger los
materiales de filtracin en gel de acuerdo con el intervalo de
peso molecular deseado en el fraccionamiento.
Separacin basada en la carga:
cromatografa de intercambio inico
Cuando un ion o molcula cargada con una o ms cargas posi-
tivas se intercambia con otro compuesto cargado positivamente
unido a una fase inmovilizada cargada negativamente, el pro-
ceso se denomina intercambio catinico. El proceso inverso se
denomina intercambio aninico. El intercambiador de cationes,
la carboximetilcelulosa (OCH2COO), y el intercambiador
de aniones, la dietilaminoetil (DEAE) celulosa (OC2H4
NH+[C2H5]2) se utilizan con frecuencia para la purificacin de
protenas. Considrese la purificacin de una mezcla de prote-
nas que contiene albmina e inmunoglobulina. A un pH de 7,5,
la albmina (con un pI de 4,8), est cargada negativamente; la
inmunoglobulina con un pI de aproximadamente 8 est cargada
positivamente. Si la mezcla se aplica a una columna de DEAE a
pH 7, la albmina se une a la columna de DEAE cargada posi-
tivamente mientras la inmunoglobulina pasa a travs de la
columna. La figura 2-13 ilustra el principio de la cromatografa
de intercambio de iones. Como con la cromatografa de filtracin
en gel, las protenas pueden separarse partiendo de las pequeas
diferencias en su pI. Las protenas adsorbidas son eluidas nor-
malmente con un gradiente formado a partir de dos o ms diso-
+ + +
+ lgico. Diferentes protenas solubles se movern a velocida-
+ Mezcla
de protenas
+ +
+
+ +
+ +
+
+ + + +
+ +
+
+
+ +
+ +
+ + +
Gotas con
carga positiva
Protenas cargadas
positivamente fluyen + + +
a travs de la comuna + +
+
+ +
Fig. 2-13 Fraccionamiento de protenas por la carga: cromato-
grafa de intercambio inico. Las mezclas de protenas pueden
separarse por cromatografa de intercambio inico segn sus cargas
netas. Las bolas que tienen enlazados grupos con carga positiva se
denominan intercambiadores de aniones, mientras que las que tienen
grupos con carga negativa son intercambiadores de cationes. Esta
figura muestra una columna de intercambio de aniones. Las protenas
cargadas negativamente se unen a bolas cargadas positivamente y las
protenas cargadas positivamente fluyen a travs de la columna.
C0010.indd 16
luciones con diferente pH y/o concentraciones de sal. De esta
forma, las protenas son gradualmente eluidas de la columna y
se resuelven segn su pI.
Cromatografa de afinidad
La cromatografa de afinidad es un mtodo prctico y especfico
para la purificacin de protenas. Una columna de cromato-
grafa con una matriz porosa es derivatizada con un ligando que
interacta con o se une a una protena especfica en una mezcla
compleja. La protena de inters se unir selectiva y especfica-
mente al ligando, y las otras pasarn a travs de la columna. La
protena unida se puede eludir posteriormente mediante una
alta concentracin de sal, una desnaturalizacin suave o por
una forma soluble del ligando o ligandos anlogos (cap. 6).
Determinacin de la pureza
y del peso molecular de las protenas
por electroforesis en policrialamida
y dodecil sulfato sdico (SDS-PAGE)
La electroforesis puede utilizarse para separar una amplia varie-
dad de molculas cargadas, incluidos aminocidos, polipptidos,
protenas y ADN. Cuando se aplica una corriente a molcu-
las disueltas en disoluciones tampn, las molculas con una
carga neta negativa al pH seleccionado migran hacia el nodo,
y las que tienen una carga neta positiva, hacia el ctodo. Para
minimizar la difusin y conveccin, normalmente se utiliza
un soporte poroso, como papel, acetato de celulosa o un gel
polimrico.
Como la cromatografa, la electroforesis puede utilizarse
para el fraccionamiento preparativo de protenas a pH fisio-
des diferentes en el campo elctrico, dependiendo del valor
del cociente carga/masa para cada molcula. Un detergente
desnaturalizante, el dodecil sulfato de sodio (SDS), suele utili-
zarse en un sistema de electroforesis con gel de poliacrilamida
+
(PAGE) para separar y resolver subunidades proteicas segn
su peso molecular. La preparacin proteica suele tratarse
+
con SDS y un reactivo tiol tal como el -mercaptoetanol para
+
CROMATOGRAFA LQUIDA
DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)
La HPLC es una tcnica cromatogrfica til para la separacin
de alta resolucin de protenas, pptidos y aminocidos. El
principio de separacin puede estar basado en la carga, el
tamao o la hidrofobia de las protenas. Las columnas son muy
estrechas y son empaquetadas con una matriz no comprimible
de bolitas de slica gel rodeada por una fina capa de fase esta-
cionaria. Se aplica una mezcla de protenas a la columna y a
continuacin los componentes son eluidos por cromatografa
isocrtica o de gradiente. Los eluidos se monitorizan mediante
absorcin ultravioleta, ndice de refraccin o fluorescencia. Esta
tcnica proporciona una separacin de alta resolucin.
1/18/11 6:24:31 PM
 Anlisis de la estructura proteica 17

A B C D E pH = 4 pH = 7
IEF

kDa

94

67
SDS
PAGE

43

30

Fig. 2-15 Electroforesis de gel bidimensional. Un extracto crudo

Fig. 2-14 SDS-PAGE. La electroforesis en gel de poliacrilamida en
presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) se usa para separar
protenas segn sus pesos moleculares. Las molculas ms grandes se
retrasan en la matriz del gel, mientras que las menores se mueven ms
rpidamente. El carril A contiene protenas estndar con masas molecu-
lares conocidas (indicadas en kDa a la izquierda). Los carriles B, C, D y E
muestran los resultados del anlisis por SDS-PAGE de una protena en
varios estadios en purificacin. B: protena total aislada; C: precipitado
de sulfato de amonio; D: fraccin de la cromatografa de filtracin en
gel; E: protena purificada de una cromatografa de intercambio inico.
de hgado de rata fue sometido primero a un isoelectroenfoque (IEF)
en un gel cilndrico en un intervalo de pH de 4-7. Despus el gel se
coloc horizontalmente en un segundo bloque de gel y fue sometido
a una separacin por SDS-PAGE segn la masa molecular. El gel fue
teido finalmente con Coomassie Blue.
Homogeneizacin/extraccin
Echar sal fuera/dilisis y concentracin

reducir los puentes disulfuro. Debido a que la unin del SDS es Intercambio de iones y cromatografa de filtracin en gel
proporcional a la longitud de la cadena peptdica, cada mol-
cula proteica tiene la misma razn masa/carga y la movilidad
relativa de la protena es proporcional a la masa molecular de SDS-PAGE
la cadena polipeptdica. La variacin del estado de entrecruza-
miento del gel de poliacrilamida proporciona selectividad para
las protenas de diferentes pesos moleculares. Una prepara-
cin de protena purificada puede analizarse inmediatamente Degradacin proteoltica
para determinar su homogeneidad en SDS-PAGE mediante
tincin con colorantes sensibles y especficos, como el azul de
Coomassie o mediante la tcnica de tincin con plata, como se Purificacin y secuenciacin de pptidos
muestra en la figura 2-14.
Fig. 2-16 Estrategia para la purificacin de protenas. La purifi-
cacin de una protena conlleva una secuencia de pasos en los que
ELSEVIER. Fotocopiar sin autorizacin es un delito.

Isoelectroenfoque (IEF) las protenas contaminantes se eliminan a partir de la diferencia de

El isoelectroenfoque (IEF) se utiliza para separar protenas a
partir de su pI, realizndose la electroforesis en un sistema
microcanal o un gel que contiene un gradiente de pH. Una
protena aplicada al sistema resultar cargada positiva o nega-
tivamente, segn su composicin de aminocidos y el pH del
ambiente. Bajo la aplicacin de una corriente, la protena se
mover hacia el nodo o hacia el ctodo hasta encontrar la
parte del sistema que corresponde a su pI, donde la protena
no tiene carga y dejar de migrar. El IEF se usa en conjuncin
con el SDS-PAGE para la electroforesis en gel bidimensional
(fig. 2-15). Esta tcnica es particularmente til para el fraccio-
namiento de mezclas complejas de protenas para el anlisis
protemico (v. ms adelante).
tamao, de carga y de hidrofobicidad. La purificacin se monitoriza
por SDS-PAGE (v. fig. 2-14). La secuencia primaria de la protena se
determina por la degradacin de pptidos de Edman automatizada
(v. fig. 2-18). La estructura tridimensional de la protena puede deter-
minarse por cristalografa de rayos X.
ANLISIS
DE LA ESTRUCTURA PROTEICA
Los pasos caractersticos en la purificacin de una protena se resu-
men en la figura 2-16. Una vez purificada, para la determinacin
de su composicin de aminocidos, una protena es sometida a

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 18 Aminocidos y protenas
Met Ile
Leu
Asn
Thr
Fluorescencia relativa
Ser
His
Phe
Glu
Arg
Gly
Val
Ala
Tyr
Lys
NH3
0 20 40 60 80
Tiempo de retencin (min)
Fig. 2-17 Cromatograma caracterstico de un anlisis de amino-
cidos por cromatografa de intercambio de iones. Una protena
hidrolizada se aplica a la columna de intercambio de iones en un tam-
pn diluido a pH cido (3,0), al cual todos los aminocidos estn car-
gados positivamente. Los aminocidos son diluidos por un gradiente
creciente de pH y de concentracin de sales. La mayora de amino-
cidos aninicos (cidos) eluyen primero, seguidos por los aminocidos
neutros y bsicos. Los aminocidos son derivatizados mediante una
reaccin poscolumna con un componente fluorognico, como el
o-ftalaldehdo.
hidrlisis, normalmente en HCl 6 mol/l a 110 C en un tubo sellado
y al vaco durante 24-48 h. En estas condiciones, el triptfano, la
cistena y la mayora de la cistina son destruidos, y la glutamina
y asparagina son desaminadas cuantitativamente para dar gluta-
mato y aspartato, respectivamente. La recuperacin de la serina
y la treonina es incompleta y disminuye con el incremento del
tiempo de hidrlisis. Pueden utilizarse procedimientos de hidrlisis
alternativos para la medicin del triptfano, mientras que la cis-
tena y la cistina pueden convertirse en cido cisteico estable antes
de la hidrlisis. Tras sta, los aminocidos libres se separan en un
analizador automtico de aminocidos utilizando una columna de
intercambio inico, o despus de la derivatizacin precolumna con
reactivos coloreados o fluorescentes por HPLC en fase reversa. Los
aminocidos libres fraccionados por la cromatografa de intercam-
bio inico son detectados por reaccin con un reactivo cromog-
nico o fluorognico como la ninhidrina o el cloruro de dansilo, el
reactivo de Edman (v. ms adelante) o el o-ftalaldehdo. Estas tc-
nicas permiten la medicin de cada aminocido en cantidades tan
pequeas como 1 pmol. En la figura 2-17 se muestra un patrn de
elucin habitual de los aminocidos en una protena purificada.
Determinacin de la estructura primaria
de las protenas
La informacin sobre la secuencia primaria de una protena es
esencial para comprender sus propiedades funcionales, la identifica-
cin de la familia a la que pertenece la protena y la caracterizacin
de las protenas mutantes que causan la enfermedad. Una protena
puede escindirse primero mediante digestin por endoproteasas
especficas, como la tripsina (cap. 6), la proteasa V8 o la lisil endo-
peptidasa, para obtener fragmentos peptdicos. La tripsina escinde
enlaces peptdicos en los que el fragmento C-terminal es aportado
por la arginina y la lisina, siempre que el prximo residuo no sea
prolina. La lisil endoproteasa tambin se utiliza con frecuencia para
escindir el fragmento cuando el C-terminal es la lisina. La escisin
mediante reactivos qumicos, como el bromuro de ciangeno,
tambin resulta til. El bromuro de ciangeno escinde el fragmento
C-terminal de los residuos de metionina. Antes de la escisin,
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PROTEOMA
El proteoma es el conjunto completo de protenas producidas
por un genoma particular: en respuesta a seales hormonales
durante el desarrollo y al estrs ambiental, tienen lugar cambios
en proteomas hsticos y celulares. La protemica se define como
la comparacin cualitativa y cuantitativa de los proteomas bajo
100 diferentes condiciones. En un abordaje para analizar el pro-
teoma de una clula, las protenas son extradas y sujetas a elec-
troforesis bidimensional de gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Las
marcas proteicas individuales se identifican mediante tincin, y
posteriormente se extraen y se digieren con proteasas. Los pp-
tidos pequeos obtenidos en el gel se secuencian mediante
espectrometra de masas, permitiendo la identificacin de la
protena. En la figura 2-15 se muestra el anlisis caracterstico
del extracto de hgado de rata. En la electroforesis de gel en 2D
(DIGE) pueden compararse dos proteomas marcando sus prote-
nas con diferentes tinciones fluorescentes, por ejemplo rojo y
verde. Las protenas marcadas se mezclan y se fraccionan por
2D-PAGE. Las protenas presentes en los dos proteomas apare-
cern como manchas amarillas, mientras que las protenas ni-
cas sern rojas o verdes, respectivamente (v. cap. 36).
(Ala)
O
H2N-CH-C Ser Leu Thr Pptido
CH3
N C S
PITC
O
NH C HN-CH-C Ser Leu Thr
S CH3
Derivatizado PTC Hidrlisis cida
(Ser) O
PTH Ala + H2N-CH-C Leu Thr
CH2
OH
Fig. 2-18 Pasos de la degradacin de Edman. El mtodo de degra-
dacin de Edman extrae secuencialmente un residuo cada vez desde
el amino terminal de un pptido. El fenilisotiocianato (PITC) convierte
el grupo amino N-terminal del pptido inmovilizado en un derivado
del feniltiocarbamil (aminocido PTC) en disolucin alcalina. El trata-
miento con cido extrae el primer aminocido en forma de derivado
feniltiohidantona (PTH), el cual se identifica por HPLC.
las protenas con residuos de cistena y cistina son reducidas por
2-mercaptoetanol y tratadas con yodoacetato para formar residuos
de carboximetilcistena. Esto evita la formacin espontnea de enla-
ces disulfuro inter o intramolecular durante el anlisis.
Posteriormente los pptidos escindidos son sujetos a HPLC de
fase reversa para purificar los fragmentos peptdicos y luego se
pasan a un secuenciador automtico de protenas, utilizando
la tcnica de degradacin de Edman (fig. 2-18). La secuencia
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 Anlisis de la estructura proteica 19

Cromatografa lquida (LC)

Detector
Columna
Espectrometra de ionizacin
de masa por electrospray (ESI MS)

Trampa Detector
Ionizacin
1.000 para iones
Absorbancia
a 220 nm

500

0 Cromatograma inico
x 107
40 50 60 70 2
Tiempo (min)

Intensidad
1

0
40 50 60 70
Tiempo (min)
Secuencia de aminocidos de la haptoglobina
MSALGAVIALLLWGQLFAVDSGNDVTDIADDGCPKPPEIA HGYVEHSVRYQCKNYYKLRT
EGDGVYTLNDKKQWINKAVGDKLPECEADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYQCKNYYKLRTE
GDGVYTLNNEKQWINKAVGD KLPECEAVCG KPKNPANPVQ R ILGGHLDAK GSFPWQAKMV
SHHNLTTGAT LINEQWLLTTAKNLFLNHSE NATAKDIAPTLTLYVGKKQLVEIEKVVLHP
NYSQVDIGLIKLKQKVSVNERVMPICLPSK DYAEVGRVGYVSGWGRNANFKFTDHLKYVM
LPVADQDQCIRHYEGSTVPEKKTPKSPVGVQPILNEHTFCAGMSKYQEDTCYGDAGSAFA Espectro MS/MS
VHDLEEDTWYATGILSFDKSCAVAEYGVYV KVTSIQDWVQ KTIAEN
35 x 10 3
30 4 I L G G H L D A K
Nmero de marcas

25 3 b7
Intensidad

20 b5
2
15 b6
Bsqueda de la
10 base de datos 1 b2 b3 b4 b8
b1 b9
5 Haptoglobina

0 0 200 400 600 800 1.000

m/z
0 200 400 600 800 1.000
Puntuacin sesgada basada
en la probabilidad

Fig. 2-19 Identificacin de protenas por espectrometra de masas por cromatografa liquida de ionizacin con electrospray (HPLC-
ESI-MS/MS). La protena es digerida con tripsina y los pptidos trpticos son fraccionados en un sistema de HPLC de fase reversa, utilizando un
gradiente de concentracin creciente de un disolvente orgnico en agua. La calidad del fraccionamiento del pptido es monitorizada por deteccin
ultravioleta, midiendo la absorbancia de la unin del pptido (220 nm). Los pptidos (en disolucin) se inyectan directamente en el espectrme-
tro de masas. La interfase ESI tiene un sistema de entrada de lquido al vaco en el que la mayora de los disolventes se evaporan rpidamente
y se aplica un voltaje para ionizar los pptidos. Los iones peptdicos se concentran en una trampa de iones y posteriormente son extrados de
acuerdo con su peso molecular (m/z = razn masa/carga). A continuacin son fragmentados por colisin con molculas de gas y los fragmentos
ELSEVIER. Fotocopiar sin autorizacin es un delito.

se analizan de nuevo en un segundo mdulo de espectrmetro de masas, un proceso conocido como espectrometra de masas en tndem (MS/
MS). Dado que los enlaces peptdicos se fragmentan de una manera caracterstica a la derecha e izquierda del carbono , se obtienen fragmentos
que difieren en su peso molecular de acuerdo con la secuencia de aminocidos del pptido. Los b-iones mostrados aqu representan las series de
fragmentos obtenidos por rotura del amino terminal. Se obtiene una serie complementaria de y-iones en la fragmentacin del carboxilo terminal.
La masa de los pptidos y el patrn de fragmentos inicos se analizan para obtener la secuencia de aminocidos, que se compara entonces con la
base de datos de la protena (v. webs al final del captulo). En el ejemplo mostrado, el pptido se identifica como ILGGHLDAK, que se encuentra
en la molcula de haptoglobina. Para la identificacin de una protena se suele utilizar ms de un pptido.

de pptidos superponible se utiliza entonces para obtener la
estructura primaria de la protena. La espectrometra de masas
actualmente se usa ms para obtener simultneamente la masa
y la secuencia molecular de polipptidos (v. ms adelante).
Estas tcnicas pueden aplicarse directamente a protenas y
pptidos recuperadas de la electroforesis SDS-PAGE o de la elec-
troforesis bidimensional (IEF ms SDS-PAGE). Una vez se obtiene
la secuencia parcial de aminocidos, se puede determinar la
secuencia de nucletidos del ADN que codifica el segmento
polipeptdico. Despus de la sntesis qumica de este ADN, puede
usarse para identificar y aislar el gen que contiene su secuencia
de nucletidos (cap. 34).
La secuenciacin e identificacin de protenas puede tambin
hacerse mediante espectrometra de masas aplicando la tcnica
de ionizacin por electrospray (HPLC-ESI-MS/MS) (fig. 2-19).
Esta tcnica es suficientemente sensible para que las protenas

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 20 Aminocidos y protenas
Muestra
Aceleracin de iones
Lser
Intensidad relativa
Tiempo o masa
PLEGAMIENTO DE PROTENAS Y
ENFERMEDAD DE PLEGAMIENTO
Para que las protenas funcionen correctamente deben ple-
garse en la forma correcta. Las protenas se han desarrollado
de manera que un plegado es ms favorable que todos los
dems, ste es el llamado estado nativo. Numerosas protenas
asisten a otras protenas en el proceso de plegamiento. Estas
protenas, llamadas chaperonas, incluyen las protenas de
choque trmico HSP 60 y HSP 70, y la protena disulfuro
isomerasa. Una enfermedad del plegamiento de las protenas
se asocia con la conformacin anormal de una protena. Esto
ocurre en enfermedades crnicas asociadas con el envejeci-
miento, como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral
amiotrfica y la enfermedad de Parkinson.
aisladas por 2D-PAGE (v. fig. 2-15), generalmente menos de 1 g
de protena por mancha, puedan ser digeridas con tripsina in
situ, luego extraerse del gel e identificadas segn su secuencia de
aminocidos. Esta tcnica, as como una tcnica complementa-
ria llamada MALDI-TOF MS/MS (del ingls, Matrix-assisted Laser
Desorption Ionization-time of flight) (fig. 2-20), puede aplicarse
para determinar el peso molecular de las protenas intactas, as
como para el anlisis de la secuencia de pptidos, llevando a una
identificacin no ambigua de una protena.
Determinacin de la estructura
tridimensional de las protenas
La cristalografa por rayos X y la espectroscopia NMR son de uso
comn para la determinacin de la estructura tridimensional
de las protenas. La cristalografa de rayos X se basa en la difrac-
cin de los rayos X por los electrones de los tomos que forman
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Fig. 2-20 Desorcin/ionizacin lser asis-
tida por matriz (MALDI-TOF MS, del ingls
matrix-assisted laser desorption ioniza-
tion-time of flight mass spectrometry).
Las protenas o pptidos se mezclan con un
material matricial y se secan en una placa;
la matriz se disea para absorber luz a una
longitud de onda lser especfica, generando
calor. Las protenas o pptidos son ionizados
y desorbidos por un pulso de irradiacin lser
y las partculas ionizadas son aceleradas en
un gradiente de voltaje a una velocidad que
Detector depende de la razn masa/carga (m/z). Cada
ion alcanza el detector despus de un tiempo
(TOF) que est directamente relacionado con
su masa molecular. Entonces estos iones pue-
den fragmentarse para obtener la formacin
de la secuencia de aminocidos.
ENFERMEDAD DE
CREUTZFELDT-JAKOB
Un ganadero de 56 aos se presenta en el servicio mdico con
ataques epilpticos y demencia, el diagntico es enfermedad
de Creutzfeld-Jakob, una enfermedad humana causada por
priones. Las enfermedades por priones se conocen tambin
con el nombre de encefalopatas espongiformes transmisibles.
Se trata de enfermedades neurodegenerativas que afectan
tanto a humanos como a animales. En las ovejas y cabras reci-
ben el nombre de encefalopata espongiforme ovina, y en las
vacas se denomina encefalopata espongiforme bovina (enfer-
medad de las vacas locas). Estas patologas se caracterizan por
la acumulacin de una isoforma anormal de una protena codi-
ficada por el husped, una forma celular de una protena pri-
nica (PrPc), en el cerebro de los afectados.
Comentario. Los priones parecen estar compuestos solamente
de molculas de PrPSc (forma ovina), que son molculas con
una conformacin anormal de la protena normal codificada
por el husped. La PrPC tiene un alto contenido de hlice  y
est desprovista de hojas plegadas , mientras la PrPSc tiene
un alto contenido de hoja plegada . La conversin de PrPC en
PrPSc representa un profundo cambio conformacional. La pro-
gresin de las enfermedades por infeccin por priones parece
conllevar una interaccin entre PrPC y PrPSc, que induce un
cambio conformacional de la PrPC rica en hlice  a la forma
PrPSc rica en hojas plegadas . La enfermedad prinica deri-
vada de PrPSc puede ser gentica o infecciosa. Las secuencias
de aminocidos de PrPCs de diferentes mamferos son similares
y la conformacin de la protena es virtualmente la misma en
todas las especies de mamferos.
la molcula. Sin embargo, dado que la difraccin de los rayos X
causada por una molcula individual es difcilmente medible, la
protena debe encontrarse en forma de cristal bien ordenado en el
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 Pginas web 21

que cada molcula tiene la misma conformacin en una posicin

y orientacin especficas en una red tridimensional. A partir de la
difraccin de un haz de luz colimada de electrones, puede calcu-
larse la distribucin de la densidad de electrones, y por tanto, la
localizacin de los tomos en el cristal con el fin de determinar la
estructura de la protena. Para la cristalizacin de las protenas,
el mtodo ms usado es el de la gota colgante, para el que se nece-
sita un aparato simple que permite a una pequea porcin de
una disolucin de protena (generalmente, una gotcula de 10 l
con un contenido de 0,5-1 mg/protena) evaporarse gradual-
mente para alcanzar el punto de saturacin en el que la protena
empieza a cristalizar. La espectroscopia NMR se suele emplear
para el anlisis estructural de compuestos orgnicos pequeos,
pero la NMR de alto campo tambin es til para la determinacin
de la estructura de una protena en una disolucin y para com-
plementar la informacin obtenida por cristalografa de rayos X.
Lecturas recomendadas
Dominguez DC, Lopes R, Torres ML. Proteomics: clinical applications. Clin Lab Sci
2007; 20: 245248.
Frydman J. Folding of newly translated proteins in vivo: the chaperones. Annu Rev
Biochem 2001; 70: 603647.
Imai J, Yashiroda H, Maruya M, Yahara I, Tanaka K. Proteasomes and molecular
chaperones: cellular machinery responsible for folding and destruction of
unfolded proteins. Cell Cycle 2003; 2: 585590.
Kovacs GG, Budka H. Prion diseases: from protein to cell pathology. Am J Pathol
2008; 172: 555565.
Marouga R, David S, Hawkins E. The development of the DIGE system: 2D
fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem 2005; 382:
669678.
Matt P, Fu Z, Ru Q, Van Eyk JE. Biomarker discovery: proteome fractionation and
separation in biological samples. J Physiol Genomics 2008; 14: 1267.
Shkundina IS, Ter-Avanesyan MD. Prions. Biochemistry (Moscow) 2007; 72:
15191536.
Valentine JS, Hart PJ. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic lateral sclerosis. Proc
Natl Acad Sci USA 2003; 100: 36173622.

Resumen Walsh CT. Posttranslational modification of proteins: expanding natures inventory

3rd edn. Colorado: Roberts & Co. 2007.

Existen miles de protenas diferentes en las clulas, y cada protena

tiene una estructura y una funcin diferentes. La estructura de
orden superior de una protena es el producto de su estructura Pginas web
primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. La purificacin y
Aminocidos: www.owlnet.rice.edu/bios301/Bios301/lecture/301_4_2006.pdf
la caracterizacin de las protenas es esencial para dilucidar
Estructura de las protenas (grficos, vdeos, general): www3.interscience.wiley.
su estructura y funcin. Segn las diferencias en su tamao, com:8100/legacy/college/boyer/0471661791/structure/jmol_intro/sec_str.
solubilidad, carga y propiedades de unin a ligandos, las protenas htm
pueden purificarse hasta la homogeneidad utilizando varias Visualizacin de las molculas: http://molvis.sdsc.edu/index.htm
tcnicas cromatogrficas y electroforticas. La masa molecular y la Colgenos: www.messiah.edu/departments/chemistry/molscilab/Jmol/collagen/
chapter1.htm
pureza de una protena, as como su composicin en subunidades, Bases de datos de protenas: www.pdb.org y http://www.expasy.org
pueden determinarse por SDS-PAGE. La estructura primaria
puede determinarse por hidrlisis de una protena y degradacin
automatizada de Edman. Descifrando las estructuras primaria
y tridimensional de una protena por anlisis de rayos X o por
espectroscopia de NMR se llegan a comprender las relaciones
estructura-funcin en las protenas. La espectrometra de masas
se ha convertido en una tcnica poderosa para esclarecer la
estructura de las protenas, las modificaciones qumicas, su
funcin y homologa.

APRENDIZAJE ACTIVO

1. El anlisis de sangre, orina y tejidos por espectrometra de

masas se aplica actualmente para el diagnstico clnico.
ELSEVIER. Fotocopiar sin autorizacin es un delito.

Comentar los mritos de esta tcnica con respecto a la

especificidad, sensibilidad, rendimiento e intervalo de
anlisis, incluyendo el anlisis protemico para fines
diagnsticos.
2. Revisar la importancia del plegamiento de las protenas y
su depsito en los tejidos en las enfermedades crnicas
relacionadas con el envejecimiento.

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