Manuallab Biote Ambiental2011

MANUAL DE PRCTICAS
BIOTECNOLOGA
Dra. Ins Garca AMBIENTAL
Dra. Estela Flores Gmez
M. en C. Jessica Batalla
1er Revisin
2011
[http://planetabeta.com/aprendiendo-cuidar-ambiente]
NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO
El laboratorio de biotecnologa es un lugar adecuado para llevar a cabo prcticas de las

diversas reas de trabajo, cuenta con material de vidrio, equipo bsico de laboratorio, as
como reactivos y medio de cultivo.
Es necesario cumplir con los REQUISITOS BSICOS:
1. Pase de lista a los 10 min de la hora de entrada.

2. Traer lo indispensable para su trabajo dentro del laboratorio (cinta maskin,
encendedor, plumon indeleble, tijeras, franela limpia, etc) de no ser as se le
bajaran 5 puntos de su trabajo de laboratorio cada vez que carezca de material de
trabajo.
3. Evitar la contaminacin con microorganismos ajenos a nuestro sistema de estudio
Para mantener ests condiciones tambin es necesario respetar una serie de NORMAS
DE SEGURIDAD:
1. Entrar con la bata puesta, abotonada y limpia. si va a trabajar extra clase avisar al
profesor que este en clase que actividad realizar y quin es su profesor.
2. No comer dentro del laboratorio.
3. Limpiar mesa con franela limpia y de su propiedad.
4. Checar al inicio del laboratorio la tarja que le corresponde, no deber existir
material roto o sucio, si no es reportado dicho material ser su responsabilidad
lavarlo y/o pagarlo.
5. En caso de que exista material limpio y seco, este ser guardado inmediatamente
en su lugar asi prevenimos que se rompa el mismo.
6. Dejar limpio su lugar de trabajo en la parte superior e inferior.
7. Colocar su mochila en la parte inferior de la mesa de trabajo de lo contrario se le
quitaran 5 ptos de trabajo de laboratorio cada vez que se le llame la atencin.
8. No est permitido abrir sus maquinas porttiles para realizar tareas ajenas al
laboratorio, de lo contrario se le recoger y se entregara al final de la sesin del
laboratorio.
9. No est permitido contestar llamadas de celular durante la discusin de lo
contrario se quedar con cero.
10. Se les asignara una gaveta y un lugar en el refrigerador por grupo, mismos que
tendrn que mantenerse limpios y ordenados.
11. Se deber mantener una conducta adecuada dentro del laboratorio, se hablarn
con respeto y manteniendo un nivel ptimo de sonido.
12. Etiquetar todo su material y reactivos con plumn indeleble o se desechara.
13. Usar agua destilada para preparar soluciones y/o enjuagar material, sta agua se
tomar del rea de bioingeniera ya que el equipo dentro del laboratorio nos
proporciona agua desionizada y miliQ misma que ser usada segn se requiera.
14. Si va a utilizar la campana de extraccin colocar un papel en la base para evitar
que se manche el acero con los diferentes reactivos.
15. Cuando requiera trabajar extra clase, lo har en la parte del fondo del laboratorio y
pedir acceso al profesor que se encuentre en ese momento, solo tiene que decir:
EXTRACLASE del profesor ______________
Manual de Prcticas Biotecnologa

Ambiental |2011
EVALUACIN
INICIO DE PRCTICA:
1. Se entregar bitacora con diagrama de flujo metodologa y cuestionario contestado

al inicio de cada sesion, misma que ser presentada en una libreta exclusiva de la
materia. o bien hojas sueltas que al final de la materia se mostrarn engargoladas
con las 6 prcticas realizadas junto con reporte c/u.
2. Como parte de su trabajo de laboratorio se le preguntar al alumno la metodologa

a realizar y en caso de que no sepa se le descontarn 5 puntos.
3. El laboratorio de biotecnologa ambiental tiene un valor de 30 % de la calificacin

final que se califican de la siguiente manera:
bitcora 10% diagrama flujo metodologa y cuestionario

examen 20% escrito
trabajo experimental 35% desempeo global en el laboratorio
discusin 10% ser realizada por los alumnos
informe de la prctica 25% se entregar en la libreta u hojas sueltas
consta: ttulo, objs. y antecedentes; resultados y anlisis, conclusiones y ref.
4. Se requiere de un mnimo de 80% de asistencia a las sesiones prcticas para

acreditar el laboratorio.
5. Recuerde que si no acredita laboratorio no puede acreditar la teoria.
FINAL DE PRCTICA:
1. Al final de cada sesin se entregar mesa y material limpio.
2. Al final del semestre se entregar una libreta con las bitcoras y/o las hojas
engargoladas y se anexarn sus reportes de cada prctica.
3. Al final del semestre durante la ltima sesin de laboratorio se entregar su gaveta

y lugar de refrigerador vacio y limpio.

Ambiental |2011
INDICE
Prctica 1. Extraccin de ADN genmico de suelo

Prctica 2. RAPD
Prctica 3. Degradacin de fenoles

Dra. Ins Garca
Prctica 4. Produccin de Metano

Prctica 5. Produccin de bioetanol

Dra. Ins Garca
Prctica 6. Determinacin del Kla por el mtodo del sulfito

M. en c. Jessica Batalla Mayoral
Prctica 7. Biodisel
Prctica 8. Prctica de Campo

Dra. Ins Garca

Ambiental |2011
Prctica 1. EXTRACCIN Y ANLISIS ADN genmico de suelo
I. INTRODUCCIN
Podemos considerar el ADN o cido desoxiribonucleico, como el }cerebro~ celular que

regula el nmero y naturaleza de cada tipo de estructura y composicin celular,
transmitiendo la informacin hereditaria y determinando la estructura de las protenas, que
a travs de enzimas determinar el resto de funciones celulares. A finales del siglo pasado
se descubri tambin la existencia de una segunda clase de cido nucleico, denominado
cido ribonucleico (ARN). El ARN se encuentra tanto en el ncleo (concretamente en el
nuclolo) como en el citoplasma de las clulas de manera abundante.
Ambos tipos de cido nucleico, ADN y ARN, se encuentran simultneamente en

organismos eucariotas (con clulas de ncleo diferenciado) y procariotas (bacterias, etc.),
y slo uno de ellos en los virus.
Para una extraccin de ADN efectiva se deber conocer las caractersticas bsicas de la
muestra con la que trabajar, se debe conocer si el ADN a ser extrado proviene de una
clula procaritica o eucaritica dado que los componentes que forman la pared y
membrana celular de estos organismos es distinta. Existen diversos mtodos de
extraccin de ADN que se ajustan a las necesidades de cada tipo de muestra, estos
incluyen tratamientos fsicos, qumicos, enzimticos o una combinacin de los mismos.
Por otro lado, la Ingeniera Gentica (IG) es una herramienta que trabaja bsicamente con
cidos nucleicos. Su anlisis, manipulacin o clonaje requieren poder disponer de una
cantidad adecuada de material y en estado suficientemente puro para su utilizacin con
garantas; en general, se podra definir como un conjunto de metodologas que permite
transferir genes de un organismo a otro y expresarlos (producir las protenas para las
cuales estos genes codifican) en organismos diferentes al de origen. El ADN que combina
fragmentos de organismos diferentes se denomina ADN recombinante. As, es posible no
slo obtener protenas recombinantes de inters sino tambin mejorar cultivos y animales.
Los organismos que reciben un gen que les aporta una nueva caracterstica se
denominan organismos genticamente modificados (OGM) o transgnicos. A su vez, la IG
es lo que caracteriza a la biotecnologa moderna que implementa estas tcnicas en la
produccin de bienes y servicios tiles para el ser humano, el ambiente y la industria.
El objetivo general de sta prctica es la extraccin de ADN genmico de suelo, y como

objetivos especficos, determinar la calidad del material gentico extrado mediante una
electroforesis en gel de agarosa as como la estimacin de la concentracin y pureza del
mismo.
II. MATERIAL Y REACTIVOS
- Micropipeta 1 ml, 200 y 20 ul

Ambiental |2011
- Puntas para micropipeta 1 ml, 200 ul y 20 ul estriles
- Tubos de plstico de 5 ml estriles
- Tubos para microcentrifuga eppendorf 2 ml
- Un cuadrito de parafilm
- 300-400 mg de suelo.
- Guantes
EQUIPO
- Microcentrfuga
- Espectrofotmetro
- Celdas de cuarzo.
- Cmara de Electroforesis
- Campana de extraccin
REACTIVOS
-Buffer de extraccin CTAB
- Cloroformo:Octanol (24:1)
- Fenol:Cloroformo (1:1)
- Isopropanol fro
- NaCl 5.0 M pH 5.2
- EtOH
- Solucin de lavado 1: 76% EtOH, 0.2 M NaOAc
- Solucin de lavado 2: 76% EtOH, 10 mM NH4OAc
- Buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0)
- Buffer de corrimiento TAE 50X (Trisbase, Ac. actico glacial, Na2EDTA pH 8.0)

Ambiental |2011
- Buffer de carga (Tris, azul de bromofenol y glicerol)
- Bromuro de Etidio.
- Marcador de peso molecular como control.
- RNAsa (10mg/ml)
III. METODOLOGIA
3.1 Extraccin de ADN genmico de suelo
1. PONTE TUS GUANTES
2. Pesar 300-400 mg de suelo en un tubo de centrifuga de polipropileno de 15 ml.
3. Adicionar 9.0 ml de CTAB precalentado (65C) al suelo y mezclar suavemente por

inversin varias veces.
Nota: Se recomienda distribuir el suelo a lo largo del tubo antes de aadir el buffer, para
evitar el aglutinamiento del suelo en el fondo del tubo.
4. Incubar 60-90 min a 65 C con agitaciones continuas.
5. Sacar los tubos de la incubadora y esperar de 45 min que se enfren, y despus

adicionar 4.5 ml cloroformo:octanol (24:1). Cerrar el tubo para mezclar de 5-10 min.
6. Centrifugar por 10 min a 3200 rpm a Temperatura Ambiente (TA).
OJO: debajo de 15C el complejo CTAB/ADN puede precipitar, por lo tanto evitar esta
condicin.
7. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo de 15 ml. Adicionar 4.5 ml de

cloroformo/octanol y mezclar suavemente por 5-10 min.
8. Centrifugar por 10 min a 3200 rpm a TA.
9. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo de 15 ml que contenga 30 ul de RNAsa

(10mg/ml) precalentada. Mezclar por inversin e incubar 30 min a TA.
10. Adicionar 6 ml de isopropanol (2-propanol). Mezclar suavemente por inversin.

Ambiental |2011
11. Remover el ADN precipitado con una varilla de vidrio en forma de gancho o bien
centrifugar para obtener la pastilla de ADN.
Extraccin con Fenol para obtener ADN de alta pureza
sta opcin es altamente recomendada para anlisis de ADN basados en la

reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), as como RAPDs.
12. Colocar el ADN en un microtubo eppendorf de 2 ml que contenga previamente 1 ml de

TE; suavemente girar el gancho hasta depositar el ADN del paso anterior. Tapar los tubos
y mezclar, dejar toda la noche a que se disuelva el ADN a TA.
13. Aadir 1 vol de fenol:cloroformo en relacin 1:1. Centrifugar los tubos a 3200 rpm
durante 10 min.
14. Transferir la fase acuosa a un tubo eppendorf nuevo estril de 2 ml. Extraer el ADN
con 1 ml (1X volumen TE original) de cloroformo:octanol. Centrifugar la muestra 10 min a
3000-3200 rpm.
15. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo eppendorf de 2ml estril.
Precipitacin con Etanol
16. Precipitar el ADN adicionando 50 ul de NaCl 5 M y despus 1 ml de EtOH absoluto.

Mezclar suavemente por inversin.
17. Centrifugar a 12000 rpm, 1 min para recuperar la pastilla de ADN.
Lavados de la pastilla
18. Aadir 2 ml solucin de lavado 1. Dejar la pastilla 10-20 min agitando suavemente de
manera continua.
19. Centrifugar a 12000 rpm, 1 min para recuperar la pastilla y decantar sobrenadante.
20. Adicionar la solucin de lavado 2 y enjuagar la pastilla de ADN. Centrifugar para

recuperar la pastilla de ADN 12krpm, 1 min.
21. Decantar la solucin de lavado 2 y dejar secar la pastilla.

Ambiental |2011
22. Adicionar 0.3 a 0.5 ml de TE al tubo eppendorf hasta que se disuelva la pastilla de
ADN. Tapar el tubo y dejar toda la noche disolver el ADN a TA. Almacenar las muestras a
4 C.
3.2 Electroforesis en gel de agarosa.
La calidad de ADN se determina mediante una corrida de electroforesis en gel de

agarosa al 1%.
1. Pesar 1 gr de agarosa y aadir Buffer TAE 1X para completar 100 ml.

2. Se funde en un horno de microondas y se aaden 5 ul de BrET
Nota: La adicin del BrEt puede hacerse de diferentes formas.
3. Se deposita en el carro con peine para el gel.

4. Se deja solidificar en una campana de extraccin.
5. Se desmonta y se coloca en la cmara de corrimiento con Buffer TAE 1X
que tape el gel de agarosa.
6. Para cargar la muestra, se coloca 5 ul de ADN y una gota de buffer de
carga sobre un cuadrito de parafilm, se mezclan y se cargan en el gel.
Nota: se puede colocar marcador de peso en el primer carril (1Kb).
7. Se carga el gel de agarosa.
8. Se conecta la fuente de poder y se corre el gel a un voltaje de 70-90 V
segn el tamao de la cmara.
9. Una vez que se separaron los dos colorantes y estos llegaron partes del
gel, se saca el gel de la cmara de corrimiento y se observa en el
transiluminador con la luz UV.
3.3 Estimacin de la concentracin de ADN
a. Diluir 20 l de muestra de ADN en 980 l de agua desionizada y estril

(dilucin 1/50)
b. Medir absorbancia por espectrofotometra a una DO 260 nm usando celdas de
1 ml de cuarzo.
c. La concentracin de ADN a DO260 = 1.0 en una celda de 1 cm equivale a 50 g
de ADN por ml de agua. Para calcular la concentracin de la muestra:

Ambiental |2011
Concentracin de ADN [ug/ul] = 50 g / ml x DO260 x 50 (factor de dilucin)
1000
[ADN total] = [ADN] x volumen eludo en ml
3.4 Estimacin de la pureza del ADN
El grado de pureza o ausencia de protenas y otros contaminantes de una disolucin de

ADN puede estimarse calculando el cociente A260/A280.
Cuando este se encuentra entre 1.8-2.0 la muestra contiene casi exclusivamente ADN.
IV. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS
a) Discute los resultados obtenidos en tu prctica:
Obtencin de ADN
Electroforesis en gel (FOTO GEL con ubicacin de tu carril de corrimiento)
Espectrofotometra (Concentracin y pureza del ADN)
b) Elabore un dibujo de la cmara de electroforesis donde muestras el corrimiento de tu

gel y las caractersticas de la corrida.
CUESTIONARIO
1. Lleve a cabo un diagrama de flujo del procedimiento efectuado y coloca del lado
derecho la funcin de cada solucin utilizada en el proceso de obtencin de ADN.
2. Qu aplicacin ambiental tendra el ADN extrado de bacterias del suelo?
3. Qu carga posee el ADN y a que se debe?
4. Para que se usa el buffer de corrimiento TAE?

Ambiental |2011
5. Cuales son las caractersticas del buffer de carga (componentes)?
6. Cmo funciona el Rojo Texas?
7. Existen otros colorantes adems del Rojo Texas para hacer visible el ADN en el gel de
agarosa?
8. Por qu se utilizan celdas de cuarzo y no de plstico para leer ADN en el

espectrofotmetro?
9. Por qu se lee el ADN a una absorbancia de 280 para valorar su pureza?
10. Qu es un marcador de peso molecular?
V. REFERENCIAS
- Perera J, Tormo A y Garca JL. 2002. Ingeniera Gentica (Vol.1): Preparacin, anlisis,
manipulacin y clonaje de ADN. Ed. Sntesis, S.A. Madrid, Espaa.
- Hoisington D, Khairallah M. y Gonzlez de Len D. 1994. Laboratory Protocols CIMMYT

Applied Molecular Genetics Laboratory. Second edition. Mxico, D.F.:CIMMYT
- www.cuadernosdebiotecnologia.ar Cuaderno No 4

Ambiental |2011
http://blogs.ua.es/vichi10/files/2009/10/genoma-humanoCHISTE.jpg
Practica 2.RAPD

Ambiental |2011
Prctica 3. Degradacin de contaminantes: cinticas de
crecimiento y degradacin.
Introduccin
Los compuestos fenlicos forman una parte importante de la gran fraccin de

contaminantes que ingresan al medio ambiente da a da. Las aguas residuales generadas
por las industrias qumicas, petroqumicas y del acero contienen con mucha frecuencia altas
concentraciones de compuestos fenlicos [11], los cuales representan un serio problema
ecolgico debido a su uso extenso, a su toxicidad y a que tambin se generan a travs de los
procesos aerobios en el ambiente [21]. Los fenoles son intermediarios en la produccin de
algunos otros qumicos, la produccin global de resinas fenlicas en el ao 2001 fue
estimada de 2.9 millones de toneladas. Tambin se desechan en las corrientes acuosas de las
industrias refineras de petrleo, obtencin y conversin de carbn, plantas qumicas,
fundidoras de metal y plantas de papel [2, 17,48].
Los compuestos fenlicos se utilizan para diversos propsitos en muchas reas, por ejemplo
los compuestos fenlicos clorados se utilizan especficamente como preservativos de la
pintura, cuero, mercancas textiles y como agentes antimicrobianos. Se producen en plantas
petroqumicas y procesos de blanquear corteza durante la produccin de papel [52]. Debido
al tratamiento incorrecto de estos materiales, se han contaminado extensamente el suelo y el
agua subterrnea y su toxicidad afecta seriamente organismos vivos. Estos son agentes
carcingenos y se sospecha como precursores de la dioxina [10].
Los compuestos fenlicos clorados y otros derivados son usados extensamente como
insecticidas, fungicidas y herbicidas por la industria y usos agrcolas alrededor del mundo.
Estos compuestos tienden a incrementar su toxicidad con el aumento del grado de
cloracin. Algunos clorofenoles tienden a ser bioacumulables dentro del medio ambiente
pudiendo llegar a ser un peligro pblico [26].
Algunos procesos de refinera producen pequeos volmenes de agua, con altas

concentraciones de fenoles y alquilfenoles, los datos reportados son de 16.3 g/L y 20.1 g/L,
donde regularmente el 75% es fenol y el 10% son compuestos alquilos-sustituidos, como lo
son los cresoles, xilenos y etilfenoles [24].
Ambiental |2011
El fenol es un agente potencialmente carcingeno humano y es de considerable
preocupacin para la salud, aun a concentraciones bajas. En Mxico en la NOM-127-SSA1-
1994 el lmite mximo permisible de fenol es de 0.001 mg/L en agua potable. Por lo tanto,
el tratamiento de las aguas residuales que contienen fenol es una necesidad.
Se han investigado muchas tecnologas para la remocin y/o desintoxicacin de los

compuestos fenlicos en aguas residuales, esta puede llevarse a cabo mediante distintos
procesos fsicos, qumicos o biolgicos entre los que se Incluyen, la adsorcin [42], la
biodegradacin [35], UV/Fe+3 [52], extraccin por membrana lquida [32] y oxidacin
[5,15,46]. El reto para la biotecnologa es generar mtodos de bioremediacin con altas
eficiencias, relacin costo-efectividad y ambientalmente seguros, para reemplazar la
tecnologa existente y promover soluciones para la remediacin de sitios contaminados.
Los tratamientos enzimticos son una tecnologa relativamente nueva en el tratamiento de
aguas residuales y promueven una alternativa ambiental para el sanamiento de efluentes
peligrosos o contaminantes orgnicos xenobioticos [27].
Para tratar compuestos fenlicos, los mtodos biolgicos muestran algunas ventajas sobre
los mtodos fsicos y qumicos, ya que estos son econmicos y no generan subproductos.
Muchos estudios apoyan el tratamiento biolgico de aguas residuales o del agua
subterrnea. Los microorganismos usados son generalmente aerobios, incluyendo
Pseudomonas sp. [13,16, 23], Alcaligenes sp. [22,47], Azotobacter sp. [31], Rhodococcus
sp. [3,40], Phanerochaete sp. [30,41], y Cryptococcus sp. [37]. Estos cultivos aerobios son
ms eficientes en degradar compuestos txicos debido a que crecen ms rpidamente que
los anaerobios y transforman generalmente los compuestos orgnicos a compuestos
inorgnicos (CO2, H2O).
La diferencia de la estructura y de la toxicidad entre los compuestos fenlicos requiere que

varias bacterias tengan cualidades especficas para degradar cada compuesto y un cultivo
mixto puede ser aplicado. El cultivo mixto significa que varias clases de microorganismos
son cultivados simultneamente. El cultivo mixto se divide en tipos indefinidos y definidos.
Los lodos activados constituyen un ejemplo de un cultivo mixto indefinido. El lodo

Ambiental |2011
activado es un grupo complejo de microorganismos que pueden oxidar las aguas residuales
bajo condiciones aerobias. Para tratar aguas residuales especiales, incluyendo compuestos
muy txicos y recalcitrantes mediante un lodo activado, la adaptacin es generalmente
necesaria. Si se agregan los microorganismos que pueden degradar estos materiales, el
tiempo de la adaptacin puede ser reducido y las eficiencias se pueden incrementar. Para
hacer esto, un estudio de cultivos puros o cultivos mixtos definidos es importante.
Las clulas inmovilizadas han sido bien definidas como clulas que son atrapadas,
asociadas a una matriz insoluble. Mattiasson [33] discuti varios mtodos de
inmovilizacin: pares covalentes, adsorcin, atrapamiento en una red de polmero
tridimensional, confinamiento en una emulsin liquido-liquido, y atrapamiento con una
membrana semipermeable. Bajo algunas condiciones, las clulas inmovilizadas, tienen
ventajas sobre las clulas libres y enzimas inmovilizadas. El uso de clulas inmovilizadas
permite la operacin de bioreactores a flujos que son independientes de la velocidad de
crecimiento de los microorganismos empleados [39]. La estabilidad cataltica puede ser
mas grande por las clulas inmovilizadas que por las clulas libres, y algunos
microorganismos inmovilizados son tolerantes a las altas concentraciones de compuestos
txicos en comparacin con las clulas libres [19, 29]
La degradacin del fenol por microorganismos puros y consorcios mixtos ha sido

extensamente estudiada. [1,11,14,21,43,44]. La mayora de los cultivos evaluados son
capaces de degradar el fenol en bajas concentraciones.
Un gran nmero de los estudios en la degradacin del fenol se han realizado con cepas
puras de bacterias, principalmente del gnero de las Pseudomonas. [1.21.51] Un gran
numero de levaduras y hongos filamentosos tienen una capacidad que degradar fenol.
Entre los tipos de levaduras, la Candida tropicalis ha sido la ms estudiada. C. tropicalis es
una levadura hidrocarbonoclastica capaz de degradar el fenol, derivados del fenol y
compuestos alifticos, en concentraciones relativamente altas (<3,000 ppm). [11,43] Sin
embargo, como en muchos otros microorganismos, el fenol inhibe el crecimiento de la C.
tropicalis y pueden tambin causar lisis.[43]

Ambiental |2011
Existen tambin algunos estudios llevados a cabo con cultivos mixtos. Morsen y Rehm [36]
estudiaron un cultivo mixto de Psuedomonas putida y Cryptococcus elinovii para degradar
fenol. Oh et al.[38] reportan un cultivo mixto de una bacteria conocida y un lodo para el
tratamiento de aguas residuales. Tambin, Wiesel et al. [50] usaron 5 tipos de bacterias para
tratar hidrocarburos aromticos policclicos. En estos estudios varias interacciones entre
estos microorganismos pudieron ser analizadas
Arthrobacter chlorophenolicus A6 es un actinobacterium Gram positivo que fue aislado

previamente de una mezcla del suelo enriquecida con el aumento de concentraciones de 4-
clorofenol (4CF) [49]. Esta bacteria puede degradar concentraciones inusualmente altas de
4-CF hasta 2.7 mM y otros fenoles p-substituidos, tales como 4-nitrofenol y 4-bromofenol
[49]. Adems, A. chlorophenolicus A6 puede degradar 4-CF a bajas temperaturas (5C) y
durante fluctuaciones entre 28C y 5C [6]. La A6 fue marcada previamente con los genes
del marcador que codificaban la protena fluorescente verde (gfp) o luciferasa (luc) para
establecer especficamente su capacidad de sobrevivir en suelo no estril degradando 4-CP
[20]. Las clulas marcadas con luciferasa sobrevivieron bien y eran metablicamente
activas en el suelo contaminado con 4-CP [20,25]. Una fraccin importante de la poblacin
microbiana se mantuvo viable despus de la incubacin en suelo a 5C [7].
Objetivos.
Observar, describir y analizar la degradacin de fenoles en cultivo en lote con un consorcio

microbiano especializado.
Durante la prctica se podr evaluar la degradacin de un contaminante orgnico como el

fenol.
Se describir y analizar la cintica de crecimiento bacteriano a diferentes concentraciones

de fenol (50, 100, 150 y 200 mg/L).
Metodologa
Inoculo y medio de cultivo.
El consorcio microbiano fue donado de la UAM-I de un proyecto de degradacin de

solventes orgnicos. Como medio de cultivo se utiliz medio mineral basal, con las
siguientes componentes (por litro de agua destilada): NH4SO2, 3g; KH2PO4 0.60 g; K2HPO4

Ambiental |2011
2.4 g; MgSO4 1.5 g; FeSO4 0.03 g/L. El medio ser inoculado con 10% de del consorcio
microbiano.
La prctica se llevara a cabo en matraces de 200 o 250 mL a los cuales se les agregaran 100
mL de medio de cultivo estril. Cada equipo preparara una concentracin diferente de
contaminante. Se tomaran muestras diarias durante una semana para determinar el
crecimiento y la degradacin.
Tcnicas analticas
Determinacin de consumo de sustrato. Espectrofotometra UV.
Los compuestos fenlicos seran analizados con una previa filtracin a travs de un filtro de
membrana de celulosa de 0.45 m con el fin de capturar material biolgico para que no
exista interferencia en las lecturas por espectrofotometra usando espectrofotmetro UV
Beckman DU 650 y UNICO. La absorbancia sera medida a una longitud de onda de 254
nm.
La biomasa producida se determinara en la regin visible a 650 nm.
Se determinara la concentracin final de CO2 por cromatografa de gases.
Cuestionario.
1. Por que se requiere degradar compuestos fenolicos?

2. Cul es el principio que se utilizara para la determinacin del consumo de sustrato?
3. Cul es el modelo de crecimiento bacteriano ms conocido?
4. Describa los parmetros de dicho modelo.

Ambiental |2011
Prctica 4. PRODUCCIN DE BIOCOMBUSTIBLES
I.INTRODUCCIN
Qu son los biocombustibles?
A diferencia de los combustibles fsiles que provienen de la energa almacenada durante largos
perodos en los restos fsiles, los biocombustibles provienen de la biomasa, o materia orgnica
que constituye todos los seres vivos del planeta. La biomasa es una fuente de energa
renovable, pues su produccin es mucho ms rpida que la formacin de los combustibles
fsiles.
Entre los cultivos posibles de utilizar para la elaboracin de biocombustibles, estn los de alto
tenor de carbohidratos (caa de azcar, maz, mandioca), las oleaginosas (soja, girasol, palmas)
y las esencias forestales (eucalipto, pinos).
La siguiente tabla resume los biocombustibles, que se pueden obtener a partir de la

biomasa:
Tipos de combustibles obtenidos de la biomasa
Slidos Lquidos Gaseosos
Paja Alcoholes Gas de Gasgeno
Lea sin procesar Biohidrocarburos Biogs
Astillas Aceites vegetales y steres derivados Hidrgeno
Briquetas Aceites de pirolisis
Carbn vegetal
Fuente: http://usuarios.lycos.es/biodieseltr/hobbies4.html
En gran parte del mundo, la lea (o carbn vegetal) que se obtiene a partir de la madera sigue
siendo el principal biocombustible empleado para la cocina, la calefaccin y la luz. Esta fuente
de energa es un recurso renovable si se obtiene a partir de bosques convenientemente
reforestados. Asimismo, muchos vehculos utilizan biocombustibles a base de metanol y etanol
mezclado con gasolina. Se puede obtener etanol a partir de la caa de azcar, de la remolacha
o el maz. En algunos pases como la India y la China producen biogs a partir de la
fermentacin natural de desechos orgnicos (excrementos de animales y residuos vegetales).
La obtencin de biocombustibles
Segn la naturaleza de la biomasa y el tipo de combustible deseado, se pueden utilizar
diferentes mtodos para obtener biocombustibles: procesos mecnicos (astillado, trituracin,

Ambiental |2011
compactacin), termoqumicos (combustin, pirolisis y gasificacin), biotecnolgicos (micro
bacterianos o enzimticos) y extractivos. En la siguiente tabla se presenta una sntesis de
estos principales procesos de transformacin y de los biocombustibles derivados, as como las
aplicaciones ms frecuentes en cada uno de ellos. Cada uno de estos procesos se inicia con la
biomasa vegetal que se forma a partir del proceso de fotosntesis, con el aporte de la energa
solar que captan y transforman estos organismos.
Proceso de obtencin de biocombustibles
Mecnicos
Termoqumicos Biotecnolgicos Extractivos
Astillado Pirolisis Gasificacin Fermentacin Digestin Extraccin
Tcnicas anaerobia fsico- qumica
Trituracin
Compactacin
Productos Leas Carbn Gas de gasgeno Etanol Biogs Aceites
Astillas Aceites Varios Co2, CH4 steres
Briquetas Hidrocarburos
Aserrn
Aplicaciones Calefaccin Calefaccin Calefaccin Transporte Calefaccin Transporte
Electricidad Electricidad Electricidad Industria Electricidad Industria

qumica qumica
Transporte Transporte
Industria qumica Industria qumica
Fuente: http://usuarios.lycos.es/biodieseltr/hobbies4.html
Cada tcnica depende del tipo de biomasa disponible. Si se trata de un material seco puede
convertirse en calor directo mediante combustin, el cual producir vapor para generar energa
elctrica. Si contiene agua, se puede realizar la digestin anaerbica que lo convertir en
metano y otros gases, o fermentar para producir alcohol, o convertir en hidrocarburo por
reduccin qumica. Si se aplican mtodos termoqumicos es posible extraer metanol, aceites,
gases, etc. El mtodo de la digestin por el cual se obtiene biogs es el ms empleado.
El Biogs
Casi tres mil millones de personas en el mundo emplean todava la lea como fuente de
energa para calentar agua y cocinar, lo que provoca, entre otros efectos, la prdida
de millones de hectreas de bosques tropicales y zonas arboladas.

Ambiental |2011
En respuesta a esta situacin surgen otras alternativas para obtener energa, entre
ellas, la produccin de biogs a partir de la fermentacin de la materia orgnica. Para
la obtencin de biogs se puede utilizar como materia prima la excreta animal, la
cachaza de la caa de azcar, los residuales de mataderos, destileras y fbricas de
levadura, la pulpa y la cscara del caf, as como la materia seca vegetal.
Esta tcnica permite resolver parcialmente la demanda de energa en zonas rurales,

reduce la deforestacin debida a la tala de rboles para lea, permite reciclar los
desechos de la actividad agropecuaria y, es un recurso energtico limpio y renovable.
El biogs que se desprende de los tanques o digestores es rico en metano que puede
ser empleado para generar energa elctrica o mecnica mediante su combustin, sea
en plantas industriales o para uso domstico.
Digestor domstico Digestor industrial

Las fotografas muestran digestores de uso domstico y otros industriales para la
obtencin de biogs. La primera instalacin domstica para producir biogs se habra
construido en la India alrededor del 1900. Actualmente funcionaran en ese pas
alrededor de 200 mil biodigestores, y en China alrededor de 6 millones. Las
instalaciones industriales de produccin de biogs emplean tanques de metal que
sirven para almacenar la materia orgnica y el biogs por separado. Debido al gran
volumen de materia orgnica que necesita para garantizar la produccin de biogs y la
cantidad de biofertilizante que se obtiene, se disea con grandes estanques de
recoleccin y almacenamiento construidos de ladrillo u hormign.

Ambiental |2011
Fuente:
http://www.cubasolar.cu/biblioteca/energia/Energia22/HTML/articulo04.htm
El biogs se obtiene al descomponerse la materia orgnica debido a la accin de cuatro

tipos de bacterias, en ausencia de oxgeno:
a. las hidrolticas, que producen cido actico, compuestos monocarbonados,

cidos grasos orgnicos y otros compuestos policarbonados;
b. las acetognicas, productoras de hidrgeno;
c. las homoacetognicas, que pueden convertir una cantidad considerable de
compuestos carbonados en cido actico;
d. las metanognicas, productoras del gas metano, principal componente del
biogs, con una proporcin de 40 a 70 % de metano (CH 4).
Algunas ventajas del empleo de biogs:

1. Permite disminuir la tala de los bosques al no ser necesario el uso de la lea para cocinar.
2. Presenta diversidad de usos: alumbrado, coccin de alimentos, produccin de energa
elctrica, transporte automotor y otros.
3. Produce biofertilizante rico en nitrgeno, fsforo y potasio, capaz de competir con los
fertilizantes qumicos, que son ms caros y daan el medio ambiente.
4. Elimina los desechos orgnicos, por ejemplo, la excreta animal, contaminante del medio
ambiente y fuente de enfermedades para el hombre y los animales.
Materiales y Mtodo: Produccin de biogs.
Actividad adaptada de El Libro de la Naturaleza y la tecnologa 8, EGB. Editorial

Estrada (1998), y Biologa II. Polimodal. Ecologa y Evolucin. Editorial Estrada (2001)
visto en cuadernos de biotecnologa No 58
(http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_58.asp?
cuaderno=58)
El biogs es un gas producido por la accin de microorganismos sobre materia orgnica

de desecho, por ejemplo restos vegetales (cscaras de frutas, hojarasca, etc.) o
estircol (excremento de animales). Durante este proceso de transformacin de la
materia los microorganismos obtienen energa mediante diferentes procesos. Algunos
de los microorganismos liberan dixido de carbono en el proceso de respiracin, que

Ambiental |2011
otros microorganismos emplean en la fermentacin y producen metano que liberan al
entorno.
El metano producido por este mtodo es una fuente de energa alternativa,

denominada bioenerga, que puede reemplazar a las fuentes tradicionales de energa.
Propsito de la actividad
La experiencia consiste en la construccin de un digestor de materia orgnica, donde

se podr comprobar la produccin de biogs por la accin de los microorganismos
anaerobios (bacterias metangenas), que estn presentes en los desechos orgnicos.
Mediante esta experiencia es posible demostrar la accin de un tipo de
microorganismos que se incluye en el grupo de los extremfilos: las bacterias
metangenas que viven en ausencia de oxgeno.
Construccin del digestor de materia orgnica
1. Materiales
botella plstica de dos litros de capacidad, con tapa

manguera de goma

Ambiental |2011
pinza o llave para cerrar la manguera
tapn agujereado por donde atravesar la manguera de goma o un tubo de vidrio al
que se unir la manguera de goma
mechero
caja de cartn, de madera
lmpara de 60-75 watt que proveer de calor al sistema
estircol de caballo, de vaca o de aves y restos vegetales
agua hervida (sin cloro)
agua de cal (se utiliza para comprobar la presencia de dixido de carbono).
2. Armado del digestor
colocar los restos orgnicos dentro de la botella hasta la mitad de su capacidad;

llenar la botella con agua hasta cubrir la materia orgnica (y un poco ms);
cerrar la botella con el tapn que ya tiene atravesada la manguera o el tubo de
vidrio;
adems de poner el tapn se puede sellar la botella con una resina o con la misma
tapa a rosca de la botella (que debe estar perforada para que entre el tapn) para
evitar la fuga de gas o que el tapn se libere (ya que puede ser despedido por la
presin que ejerce el gas que se acumula en la botella);
unir la manguera al mechero y cerrarla con la pinza;
colocar la botella dentro de la caja junto con la lmpara que debe permanecer
encendida todo el tiempo para mantener la temperatura a 40 oC aproximadamente.
3. Desarrollo
Al cabo de 7 - 10 das, aproximadamente, el lquido de la botella tendr burbujas. al

tocar la manguera que la cierra, es posible comprobar que la presin es diferente a
ambos lados de la llave.
Colocar el extremo de la manguera dentro de un recipiente con agua de cal. Abrir la
manguera para dejar salir el gas acumulado en la botella. Si el agua se pone turbia
indica que la manguera despidi dixido de carbono que se produjo en la botella.
Estrangular la botella para sacar la mayor cantidad posible de dixido de carbono.
Volver a cerrar la llave de la manguera.
A partir de este momento, habiendo poco oxgeno en la botella (consumido en una
primera etapa por la respiracin de algunos microbios) se intensifica la produccin
de gas metano por otro tipo de bacterias que no necesitan oxgeno. La produccin
de biogs (metano) lleva varios das y, a medida que se produce, la botella
estrangulada se hincha.

Ambiental |2011
Para comprobar la produccin de biogs abrir la llave de la manguera y prender el
mechero.
Aclaracin: hay que tener en cuenta que se trabaja con microorganismos que, como
otros seres vivos, necesitan condiciones adecuadas para cumplir con sus actividades.
Puede ocurrir que haya fluctuaciones en las condiciones de la experiencia y que la
produccin de biogs sea escasa. En ese caso, se debe probar nuevamente hasta que
se encuentren las condiciones adecuadas.
Preguntas para el anlisis de la experiencia

a) Cul es el significado del trmino bioenerga?
b) Cmo se denomina al tipo de bacteria responsable de la produccin de metano?
Respuesta: metangenas. Esta pregunta se relaciona con la nota analizada en la
pregunta anterior.
c) Por qu ser necesaria una temperatura de 40oC para lograr la produccin de biogs?
d) Se obtendran los mismos resultados si se realizara esta experiencia a 0C o a 100C?
Por qu?
e) A qu se debe la aparicin de burbujas en el lquido y la presin que se siente en la
manguera a los 7-10 das de la experiencia?
f) Por qu se debe eliminar del digestor el dixido de carbono que se genera en
la primera etapa?
g) Cul es la ventaja de la utilizacin del biogs como fuente de energa?

Ambiental |2011
PRACTICA 5. PRODUCCIN DE ETANOL A
PARTIR DE COMPUESTOS
LIGNOCELULSICOS.
OBJETIVOS
General:
Se evaluar la capacidad de la levadura Saccharomyces cerevisiae de

producir etanol a partir de diferentes compuestos.
Especficos:
Preparar diferentes medios de cultivo variando la fuente de carbono para

el crecimiento de la levadura S. cerevisiae en un sistema de lote.
Monitorear la cintica de crecimiento de la levadura S. cerevisiae y la

produccin de etanol en los diferentes medios preparados.
Comparar los rendimientos obtenidos en cada ensayo
INTRODUCCIN
La creciente demanda energtica por parte de la poblacin mundial ha

alcanzado niveles que no pueden ser mantenidos con las actuales reservas de
combustibles fsiles. De acuerdo al informe de Fatih Birol, economista jefe de
la Agencia Internacional de la Energa (AIE), durante el World Energy Outlook
2007 (WEO 2007), [] La demanda energtica mundial se incrementar en un
55%, con los combustibles fsiles cubriendo el 84% de dicho aumento [...], lo
cual [...] se traducir para el 2030 en un aumento del 57% de las emisiones
de CO2. Ante esto, la bsqueda de fuentes alternativas de energa
ambientalmente sostenibles y econmicamente rentables ha pasado ser el eje
central de diversas investigaciones. La CONAE ha realizado estudios en los

Ambiental |2011
cuales describe la situacin actual de las diversas fuentes de energa alternas,
que se resumen en la tabla 1.1:
Tabla 1.1. Fuentes alternas de Energa (CONAE, 2005)
Por su impacto mundial la CONAE ubica a las energas elica, de biomasa y

geotrmica como las ms prometedoras. De estas, la energa proveniente de
biomasa tiene como principal inconveniente su alto costo.
Los autotransportes cubren gran parte del consumo de energticos derivados

del petrleo. Los alcoholes han sido utilizados como combustibles a partir de la
crisis del petrleo en los 70s, por lo que diversos pases implementaron
programas para el desarrollo de nuevos combustibles a partir de materias
primas econmicas, accesibles y renovables. As, desde 1980 el etanol es
usado como un combustible alterno en diferentes pases. Existen tres mtodos
principales para la produccin de etanol (Morrison & Boyd, 1983). Estos son: (a)
hidratacin de alcanos provenientes del cracking del petrleo; (b) hidrlisis
quimica de compuestos celulsicos ya sea en medios cidos o bsicos; y (c)
Fermentacin de carbohidratos. Estos mtodos pueden clasificarse en
sintticos /qumicos (a, b) y biolgicos (b, c), siendo este ltimo grupo el que
Ambiental |2011
reporta menor impacto ambiental. De esta forma, al etanol producido por estas
vas se le conoce como bioetanol.
La transformacin de azucares a etanol mediada por microorganismos

ha sido ampliamente estudiada, se lleva a cabo principalmente por levaduras y
bacterias acido-lcticas. Microorganismos como Saccharomyces cerevisiae,
Zymomonas mobilis y Escherichia coli han sido utilizados como modelos para
estos anlisis, siendo la primera la levadura mas usada. El siguiente esquema
muestra de forma general la asimilacin de azucares y su transformacin a
etanol (fermentacin alcohlica):
Figura 1.1 Mapa metablico general para la produccin de etanol. (a)

Ciclo de las pentosas fosfato; (b) Glucolisis; (c) Ciclo Entner-Doudorof
(Zaldivar, 2001)
Como se aprecia en el esquema, la fermentacin de azucares simples es

proceso relativamente sencillo, siendo glucosa, xilosa, manosa, arabinosa y
galactosa los azucares asimilados ms fcilmente por las clulas. Las levaduras
poseen una maquinaria metablica capaz de asimilar azucares complejos como
dmeros (galactosa, sacarosa) o polmeros (celulosa, celobiosa, almidn),
mediante la sntesis de enzimas llamadas celulasas.

Ambiental |2011
Dentro de las diversas formas de biomasa, la biomasa lignocelulosica es
considerada una excelente fuente de energa (y de carbono) debido a su gran
disponibilidad y bajo costo. En Mxico, la industria azucarera genera alrededor
de 6.5 km de toneladas mtricas de bagazo de caa, compuesto
lignocelulsico considerado subproducto del proceso y utilizado comnmente
como combustible en los ingenios azucareros. Comparando el rendimiento
energtico del bagazo de caa contra el de etanol producido a partir del mismo
as como el impacto ambiental originado por la combustin de estos
compuestos, el etanol resulta ms conveniente.
En una fermentacin alcohlica, es posible obtener tericamente 51.4 g

de etanol a partir de 100 g de glucosa 1 (Demirba, 2005), algunos estudios
reportan rendimientos porcentuales en base al terico desde 10.6%
(Tantirungkij et al., 1993) hasta 102% (Ohta et al.,1991). Sin embargo, han sido
pocos los estudios realizados utilizando fuentes de carbono complejas y
organismos diferentes a S. cerevisiae, Z. mobilis o E. coli.
La produccin de etanol se da bajo condiciones de anaerobiosis dentro

de un cultivo, aunque se ha comprobado la produccin del alcohol en
condiciones aerobias muy especificas.
MATERIALES Y METODOS
Se conseguir una cepa de S. cerevisiae comercial o de resiembra. Esta ser

activada en medio complejo PDA. Se prepararn 100 mL de medio PDA y se
vaciaran las cajas (5). Sembrar la levadura por tcnica de estra cruzada, a fin
de obtener colonias aisladas y asegurar la axena de los experimentos. Incubar
a 30C hasta el inicio de las fermentaciones.
Para la produccin de etanol, se probaran diferentes sustratos. Como base, se

usar glucosa, que servir como referencia, y bagazo de caa. Se podrn
elegir disacridos y polisacridos dependiendo de la disponibilidad de los
mismos: xilosa, lactosa, sacarosa, etc. La composicin del medio de cultivo en
1
Cuando se trata de compuestos lignocelululsicos, se consideran los equivalentes de
glucosa de acuerdo al nmero de monmeros contenidos en el polmero.
Ambiental |2011
g/L es: 20 fuente de carbono, 2 (NH 4)2SO4, 0.4 MgSO4 7H2O, 5 KH2PO4, 1
extracto de levadura.
La produccin ser por duplicado para cada fuente de carbono en matraces de

500 mL, cada uno con 250 mL de medio. Esterilizar en autoclave a 121C por
15 min. En condiciones estriles, inocular los matraces con al menos 3
colonias de la levadura previamente reactivada e incubar a 30C y 150 rpm
durante una semana. Diariamente tomar al menos 3 muestras para evaluar el
estado del cultivo.
Se determinar el crecimiento celular por absorbancia a 620 nm, usando como

blanco agua. El etanol producido ser cuantificado por tcnica de
microdifusin.. El ensayo se realizara en dos tubos colocados uno dentro del
otro. En el compartimiento exterior (tubo ancho) se colocar 0.5 ml de solucin
saturada de carbonato de potasio que causar que el alcohol sea menos
soluble en la solucin acuosa. Por otro lado se prepara el compartimiento
interior (tubo angosto) que contendr 1.0 ml de solucin de dicromato de
potasio 0.145 % en cido sulfrico 10 N y se coloca dentro del tubo ancho con
la ayuda de una pinza; en presencia de esta solucin el etanol es oxidado a
cido actico y el Cromo pasa a Cr3+ cambiando su color de amarillo
anaranjado a transparente. Una vez preparado el dispositivo se agrega al
compartimiento exterior 0.1 ml de solucin standard o muestra y se tapa con
un tapn de goma. Se incuba 60 min a 45C, se saca el tubo angosto y se le
agrega 0.5 ml de agua destilada y se mide la absorbancia a 450 nm.
Reportar el rendimiento de produccin de etanol para cada una de las fuentes

de carbono y elaborar un anlisis de resultados detallado, en el que se
comparen los resultados obtenidos y las conclusiones respectivas.
CUESTIONARIO
1. Cul es la importancia de obtener etanol a partir de compuestos

lignocelulsicos?
2. En qu consiste la tcnica de microdifusion de Conway?

Ambiental |2011
3. Describa el proceso de fermentacin alcohlica y mencione por que no se
requiere oxigeno para este ensayo.
4. Qu desventaja tiene la produccin de alcoholes a partir de biomasa

lignocelulosica? Cmo se puede resolver este problema?
5. Investigue los rendimientos reportados en la produccin de etanol a partir de

distintos sustratos como los usados en esta prctica.
REFERENCIAS
- Gong, C.; Chen, L; Flickinger, M; et al. 1981. Production of Ethanol

from D-Xylose by Using D-Xylose Isomerase and Yeasts. Applied
and Environmental Microbiology. 14 (2): 430-436.
- Alterthumb, F and Ingram, L. 1989. Efficient Ethanol Production from
Glucose, Lactose, and Xylose by Recombinant Escherichia coli.
Applied and Environmental Microbiology. 55 (8): 1943-1948.
- Himmel, M. and Sheehan, J. 1999. Improved Cellulases for
Bioethanol Production. Biotechnology Center for Fuels and Chemicals.
- P. Escalante-Minakata 1 , H.P. Blaschek 2 , A.P. Barba de la Rosa 1 , L.
Santos 1 and A. De Len-Rodrguez 1. Identification of yeast and
bacteria involved in the mezcal fermentation of Agave salmiana.
Letters in Applied Microbiology. Volume 46 Issue, Pages 626 - 630
- Ostergaard, S., Olsson, L., Nielsen, J. Metabolic engineering of
Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. MolBiol. Rev. 64 (2000) 34-50.
- Walker, G.M. Yeast Physiology and Biotechnology. John Wiley and Sons,
Chichester, 1997.
- Demirba, A. 2005. Bioethanol from Cellulosic Materials: A
Renewable Motor Fuel from Biomass. Energy Sources, 21:327-337.
- Zaldivar, J.; Nielssen, J.; and Olsson, L. 2001. Fuel ethanol production
from lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and
process integration. Appl Microbiol Biotechnol. 56:1734.
- Sun, Y.; Cheng, J. 2002. Hydrolysis of lignocellulosic materials for
ethanol production: a review. Bioresource Technology. 83 : 111.

Ambiental |2011
Prctica 6. DETERMINACIN DEL KLA POR EL MTODO
DEL SULFITO
OBJETIVO GENERAL: Conocer y entender los principios bsicos del coeficiente

de transferencia de oxgeno (Kla) en los cultivos aerobios en suspensin.
OBJETIVOS ESPECFICOS:
Analizar el mtodo para determinacin del Kla por el mtodo del sulfito.
Analizar y discutir los mtodos indirectos y directos que se utilizan en la
determinacin del Kla.
Estimar el Kla por el mtodo del sulfito.

Ambiental |2011
I. INTRODUCCIN
La concentracin de oxgeno disuelto en una suspensin de microorganismos

aerbicos depende de diferentes factores:
Velocidad de transferencia de oxgeno de la fase gaseosa al

lquido.
Velocidad a la cual el oxgeno es transportado a las clulas

(donde este es consumido).
La concentracin de oxgeno utilizado por los microorganismos

para el crecimiento, mantenimiento y produccin.
Los biorreactores de tanque agitado y las columnas burbujeadas son los

biorreactores ms utilizados en bioprocesos.
Los biorreactores agitados mecnicamente presentan altos

valores de transferencia de masa y energa, as como excelente
mezclado.
Velocidad de agitacin
Tipo y nmero de agitadores
Flujo de gas
Las columnas burbujeadas y airlift presentan bajos esfuerzos

de corte lo cual es importante para aqullos cultivos sensibles
a los esfuerzos de corte (clulas filamentosas).
La transferencia de materia gas-lquido en un bioproceso est fuertemente

influenciada por las condiciones hidrodinmicas del biorreactor que
principalmente dependen de la disipacin de la energa:
Condiciones de operacin
Propiedades fisicoqumicas del cultivo
Parmetros geomtricos del biorreactor
Ambiental |2011
Presencia de oxgeno consumido por las clulas

Ambiental |2011
La transferencia de oxgeno frecuentemente es el paso limitante en los
bioprocesos aerbicos debido a su baja solubilidad en el medio de cultivo.
Las correctas mediciones y/o predicciones del coeficiente volumtrico de

transferencia de masa (kla) es un paso crucial en el diseo, operacin y
escalamiento de biorreactores.
La concentracin de saturacin de oxgeno se sita en las condiciones

normales de cultivo alrededor de 10 mg/L, concentracin de todo insuficiente
para abastecer un proceso aerobio.
La ecuacin bsica para describir el transporte entre fases considera que la

densidad de flujo de propiedad (en este caso transporte de oxgeno) es
proporcional al gradiente de concentraciones quedando definido un coeficiente
individual de transferencia de materia entre fases kL segn:
NO2=KL (CL-Ci)
NO2=Densidad de flujo de oxgeno entre fases, moles/s m2.
CL=Concentracin de oxgeno en la fase lquida.
Ci=Concentracin de oxgeno en la interfase.
Si se utiliza el coeficiente global KL y se expresa la velocidad de transferencia

de oxgeno por unidad de volumen de reactor NO2 la ecuacin se transforma
en:
NO2=kLa (CL-C*)
C*= Concentracin de oxgeno en la fase lquida correspondiente a la

saturacin.
a= Relacin rea interfacial/Vlumen de reactor (m2 de interfase/m3 reactor)

Ambiental |2011
En cuanto al consumo del oxgeno por parte de la biomasa se define la
velocidad especfica de consumo de oxgeno QO2, como el oxgeno consumido
por unidad de biomasa y de tiempo.
En un cultivo en estado estacionario han de igualarse las velocidades de

consumo y transferencia, por tanto:
NO2=QO2 .X
X=Concentracin celular
La velocidad de consumo puede expresarse en funcin de la velocidad

especfica de crecimiento: Mx y del rendimiento biomasa/oxgeno, Y X/O de
forma que:
Kla (CL-C*)=Mx . X/Yx/o
Esta ecuacin relaciona la capacidad de transferencia del reactor (Kla) con las
velocidades especficas de crecimiento que se pueden alcanzar en su interior.
La determinacin del coeficiente ser pues esencial para establecer la

eficiencia de aireacin y cuantificar los efectos que las variables de operacin
tienen sobre el transporte de oxgeno.
MTODOS INDIRECTOS PARA LA DETERMINACIN DEL KLA
La determinacin del coeficiente en las condiciones reales de operacin del

biorreactor, que contiene el medio de cultivo, la poblacin celular etc., implica
una serie de requerimientos experimentales (preparacin de medios,
inoculacin, prevencin de la contaminacin, control del proceso a nivel
Ambiental |2011
celular etc) que pueden obviarse si se trabaja con un sistema sinttico libre de
clulas, que reproduzca lo ms fielmente posible el sistema real.
El objetivo del mtodo indirecto es encontrar el valor del coeficiente de

transferencia y su dependencia de las condiciones hidrodinmicas en el
biorreactor, utilizando un sistema que tenga las mismas propiedades
reolgicas que el sistema real, las mismas tendencias en la formacin de
interfases y los mismos valores para la difusividad y solubilidad del
oxgeno.
La fiabilidad del valor del coeficiente depender de en qu medida se
haya conseguido esta similitud. Estos mtodos utilizan la ecuacin del
balance sin el trmino del consumo.
dC/dt=Kla (C*-C)
As se puede establecer la capacidad de un biorreactor para la absorcin de

oxgeno, haciendo burbujear aire a travs de una solucin a la que previamente
se le ha eliminado el oxgeno por desplazamiento de nitrgeno como se
esquematiza en la siguiente figura.

Ambiental |2011
MTODO DE SULFITO PARA LA DETERMINACIN DE KLA
Este mtodo est basado sobre la reaccin del sulfito de sodio, un agente
reductor, con el oxgeno disuelto para producir sulfato en la presencia de un
catalizador (usualmente un catin divalente de Cu++op Co++, la ecuacin
puede ser expresada de la siguiente manera:

Ambiental |2011
II. MATERIAL Y REACTIVOS
Soluciones:
1. Solucin de Na2SO3 0.03 M Considerando una pureza del 98.3%, adicionar

3.78 g de Na2SO3 a un litro de agua destilada.
2. Solucin de catalizador, CoSO4 La concentracin final de catalizador tiene

que ser de 2.5 x 10-4 mol Co++/L. Para esto se debe preparar una solucin
stock de CoSO4. Adicionar 0.736 g CoSO4 en 100 mL. Adicionar 5 mL de la
solucin stock a 1 L de reactor. Esta solucin se puede guardar.
3. Solucin de yodo (preparar justo antes de realizar la determinacin de

sulfito) En 50 mL de agua destilada adicionar 0.9 g de KIO3, 0.5 g de KI y 1.5
mL de H2SO4. Agitar vigorosamente y dejar sedimentar. Evitar tomar residuos
de las sales formadas.
4. Solucin de Na2S2O3-5H2O 0.02 M En 500 mL de agua destilada disolver

2.48 g de Na2S2O3-5H2O (4.96 g/L). 5. Solucin de almidn 1% Adicionar 1 g
de almidn de papa a 100 mL de agua destilada, hervir por 2 minutos y dejar
enfriar. Preparar justo antes de realizar la determinacin de sulfito.
EQUIPO
- Agitadora orbital
Ambiental |2011
- Bureta
- Soporte Universal
III. METODOLOGIA
1. Una vez que los matraces contengan la solucin de sulfito (50 y 100 mL
segn corresponda en cada uno), se inicia la agitacin/aireacin a 100 rpm y a
200 rpm. Se permite la saturacin. Detener la agitacin/aireacin, y tomar una
muestra de 1 ml.
2. Mezclar la muestra inmediatamente con 0.2 mL de solucin de yodo. La

reaccin de oxidacin de sulfito se detiene.
3. Titular la muestra con la solucin de tiosulfato de sodio hasta que el lquido

se torne amarillo claro. Aadir 1 mL de una solucin de almidn (la solucin se
tornar azul oscuro). Continuar la titulacin hasta que la solucin quede
incolora.
4. Registrar los mililitros de tiosulfato utilizados y hacer los clculos

correspondientes para determinar la concentracin de sulfito remanente.
IV. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS
Discuta los resultados obtenidos:
Obtencin del kla por el mtodo del sulfito.

Estime el kla por este mtodo
Dibuje el diagrama para obtencin del kla por este mtodo
Explique el fundamento de la tcnica

Ambiental |2011
V. REFERENCIAS
Cooper C.M., Fermstrom G.A., Millar S.A. 1944. Performance of agitated gas-
liquid contactors. Industrial and Engineering Chemistry. 36:504-509.

Ambiental |2011
Kensy F., Zimmermann H.F., Knabben I., Anderlei T., Trauthwein H., Dingerdissen
U., Bchs Jochen. 2005. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter
plates: determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification
by real-time measurement during microbial growth. Biotechnology and
Bioengineering. 89: 698-708.
Zhao S, Kuttuva SG, Ju LK. 1999. Oxygen transfer characteristics of multiple-

phase dispersions simulating water-in-oil xanthan fermentations. Bioprocess
Engineering. 20: 313-323.
Prctica 7. BIODISEL

Ambiental |2011
Prctica 8. CAMPO
BIOAUMENTACION
BIOPILAS

Ambiental |2011
ETCPEDIR A ELOY

Ambiental |2011

Manuallab Biote Ambiental2011

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Manuallab Biote Ambiental2011

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

MANUAL DE PRCTICAS

El laboratorio de biotecnologa es un lugar adecuado para llevar a cabo prcticas de las

Es necesario cumplir con los REQUISITOS BSICOS:

1. Pase de lista a los 10 min de la hora de entrada.

Manual de Prcticas Biotecnologa

1. Se entregar bitacora con diagrama de flujo metodologa y cuestionario contestado

2. Como parte de su trabajo de laboratorio se le preguntar al alumno la metodologa

3. El laboratorio de biotecnologa ambiental tiene un valor de 30 % de la calificacin

bitcora 10% diagrama flujo metodologa y cuestionario

4. Se requiere de un mnimo de 80% de asistencia a las sesiones prcticas para

5. Recuerde que si no acredita laboratorio no puede acreditar la teoria.

1. Al final de cada sesin se entregar mesa y material limpio.

3. Al final del semestre durante la ltima sesin de laboratorio se entregar su gaveta

Manual de Prcticas Biotecnologa

Prctica 1. Extraccin de ADN genmico de suelo

Prctica 3. Degradacin de fenoles

Prctica 4. Produccin de Metano

Prctica 5. Produccin de bioetanol

Prctica 6. Determinacin del Kla por el mtodo del sulfito

Prctica 8. Prctica de Campo

Manual de Prcticas Biotecnologa

Podemos considerar el ADN o cido desoxiribonucleico, como el }cerebro~ celular que

Ambos tipos de cido nucleico, ADN y ARN, se encuentran simultneamente en

El objetivo general de sta prctica es la extraccin de ADN genmico de suelo, y como

II. MATERIAL Y REACTIVOS

- Micropipeta 1 ml, 200 y 20 ul

Manual de Prcticas Biotecnologa

- Tubos de plstico de 5 ml estriles

- Tubos para microcentrifuga eppendorf 2 ml

-Buffer de extraccin CTAB

- NaCl 5.0 M pH 5.2

- Solucin de lavado 1: 76% EtOH, 0.2 M NaOAc

- Solucin de lavado 2: 76% EtOH, 10 mM NH4OAc

- Buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0)

Manual de Prcticas Biotecnologa

- Marcador de peso molecular como control.

3.1 Extraccin de ADN genmico de suelo

1. PONTE TUS GUANTES

2. Pesar 300-400 mg de suelo en un tubo de centrifuga de polipropileno de 15 ml.

3. Adicionar 9.0 ml de CTAB precalentado (65C) al suelo y mezclar suavemente por

4. Incubar 60-90 min a 65 C con agitaciones continuas.

5. Sacar los tubos de la incubadora y esperar de 45 min que se enfren, y despus

6. Centrifugar por 10 min a 3200 rpm a Temperatura Ambiente (TA).

7. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo de 15 ml. Adicionar 4.5 ml de

8. Centrifugar por 10 min a 3200 rpm a TA.

9. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo de 15 ml que contenga 30 ul de RNAsa

10. Adicionar 6 ml de isopropanol (2-propanol). Mezclar suavemente por inversin.

Extraccin con Fenol para obtener ADN de alta pureza

sta opcin es altamente recomendada para anlisis de ADN basados en la

12. Colocar el ADN en un microtubo eppendorf de 2 ml que contenga previamente 1 ml de

15. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo eppendorf de 2ml estril.

Precipitacin con Etanol

16. Precipitar el ADN adicionando 50 ul de NaCl 5 M y despus 1 ml de EtOH absoluto.

17. Centrifugar a 12000 rpm, 1 min para recuperar la pastilla de ADN.

20. Adicionar la solucin de lavado 2 y enjuagar la pastilla de ADN. Centrifugar para

21. Decantar la solucin de lavado 2 y dejar secar la pastilla.

Manual de Prcticas Biotecnologa

3.2 Electroforesis en gel de agarosa.

La calidad de ADN se determina mediante una corrida de electroforesis en gel de

1. Pesar 1 gr de agarosa y aadir Buffer TAE 1X para completar 100 ml.

Nota: La adicin del BrEt puede hacerse de diferentes formas.

3. Se deposita en el carro con peine para el gel.

3.3 Estimacin de la concentracin de ADN