Sulforaphane diinduksi penangkapan siklus sel pada fase G2 / M

melalui blokade cyclin B1 / CDC2 pada sel kanker ovarium

manusia

Latar Belakang: Tumor ganas adalah penyebab paling umum tunggal kematian dan angka
kematian kanker ovarium adalah yang tertinggi di antara gangguan ginekologi. Eksisi tumor
jinak umumnya diikuti oleh pemulihan lengkap; Namun, aktivitas sel-sel kanker sering
menyebabkan proliferasi cepat bahkan setelah tumor telah dipotong sepenuhnya. Dengan
demikian, pengobatan klinis harus dilengkapi dengan kemoterapi tambahan atau radioterapi.
Sulforaphane (SFN) adalah ekstrak dari keluarga mustard diakui untuk kemampuan anti-
oksidasi, tahap 2 induksi enzim, dan aktivitas anti-tumor.
Metode: Penelitian ini meneliti penangkapan siklus sel di G2 / M oleh SFN dan ekspresi
cyclin B1, Cdc2, dan kompleks cyclin B1 / CDC2 di PA-1 sel menggunakan western blotting
dan co-IP blotting barat.
Hasil: Penelitian ini meneliti efek antikanker dari isothiocyanate diet SFN pada kanker
ovarium, menggunakan sel kanker baris PA-1. sel terakumulasi dalam metafase oleh CDC2
SFN-diperlakukan down-regulasi dan disosiasi kompleks cyclin B1 / CDC2.
Kesimpulan: Temuan kami menunjukkan bahwa, selain efek dikenal pada pencegahan
kanker, SFN juga dapat memberikan aktivitas antitumor pada kanker ovarium didirikan.

Kata kunci: kanker ovarium, Sulforaphane (SFN), siklus sel, Cyclin B1 / CDC2

Latar Belakang
Isothiocyanates (ITC) yang terjadi secara alami komponen-komponen sayuran yang telah menunjukkan aktivitas
biologis terhadap karsinogenesis serta sifat preventif chemopre- [1].Ia telah mengemukakan bahwa dalam
hubungannya dengan kemoterapi, ITC dapat meningkatkan kepekaan obat [2]. Sulforaphane (SFN), yang bisa-
ampuh cer agen pencegahan, adalah isothiocyanate diet ditemukan sebagai glukosinolat prekursor dalam
sayuran seperti kubis Brussel, kembang kol dan brokoli [3]. Tujuan di agen ini telah berkembang dalam
beberapa tahun terakhir karena dampaknya yang diduga menguntungkan farmakologis sebagai antioksidan [4],
anti-inflamasi [5] dan antitumor agen [6].SFN juga pemulung ampuh spesies oksigen reaktif (ROS), termasuk
anion superoksidadan radikal hidroksil [7].Banyak penelitian telah menunjukkan korelasi terbalik antara
konsumsi sayuran dan penurunan kejadian berbagai tumor, termasuk prostat [8], serviks [9], kolorektal [10], dan
paru-paru [11]. Selain menghambat proliferasi sel dan meningkatkan apop- Tosis [10], mekanisme lain juga
telah diusulkan untuk menjelaskan efek anti-karsinogenik dari SFN. Ini termasuk kegiatan anti-inflamasi dan
antioksidan, induksi fase 2 enzim detoksifikasi, penghambatan siklooksigenase 2 (COX-2) [12], dan efek pada
protein kinase [13].
Penelitian ini meneliti pengaruh SFN pada ova- rian lini sel kanker (PA-1) berkaitan dengan proliferasi anti dari
PA-1 sel dan menginduksi penangkapan siklus seldi G2 fase / M. Hasil ini dapat memberikan dukungan untuk
kemoprevensi kanker ovarium.
metode
bahan
Sulforaphane [1-isothiocyanato- (4R, S) - (methylsulfinyl) butana], DMSO (dimetil sulfoksida) dan MTT [3-
(4,5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromida], diperoleh dari Sigma (St Louis, MO). Semua
agen re- lain dan senyawa yang kelas analitis.

Budaya sel
PA-1 sel yang dibeli dari Industri Food Research dan Development Institute (Hsinchu, Taiwan). Sel-sel
dipertahankan di dalam botol yang MEM dilengkapi dengan 10% (v / v) FBS dan berbudaya dalam bator incu-
pada 37 C dengan suasana yang mengandung 5% CO2.

assay proliferasi sel

Sel unggulan ke 96-baik piring budaya di 10.000 sel / baik dan diperlakukan dengan SFN. Satu sampai tiga hari
(0 pM

SFN adalah kelompok kontrol.) MTT pewarna (1 mg / ml) ditambahkan ke masing-masing 4 jam setelah
pengobatan. Tion reaksi dihentikan dengan penambahan DMSO, dan OD540 diukur dengan menggunakan
multi-baik plate reader (Powerwave XS, Biotek).Dengan tidak adanya sel-sel, sorbance latar belakang ab- dari
media itu dikurangi.Hasil dinyatakan sebagai persentase dari kontrol, yang dianggap bersifat 100%. Setiap assay
dilakukan dalam rangkap tiga dan hasilnya dinyatakan sebagai mean (+/- SEM).

Pengukuran apoptosis
PA-1 sel unggulan pertama di 6-baik piring (Oranye Ilmiah, Uni Eropa).Setelah pengobatan dengan SFN selama
empat jam, supernatan dibuang dan sel dipanen dan re-disentrifugasi.Sel kemudian disuspensi / diinkubasi di 1X
annexin mengikat penyangga (5 uL annexin V-FITC [BD PharMingen, BD, USA] dan
1 uL 100 ug / mL PI solusi bekerja) selama 15 menit.

Gambar 1 SFN menengahi kelangsungan hidup PA-1 sel, dan dengan demikian menghambat proliferasi: (A)
Dalam vitro studi dimulai dengan memperlakukan setiap sel PA-1 dengan peningkatan dosis SFN selama 24
sampai 72 jam. Kelangsungan hidup sel kanker SFN-diperlakukan ini kemudian diukur dengan menggunakan
metode MTT; (B) Pengaruh SFN pada apoptosis di PA-1 sel; (C) Jumlah apoptosis di PA-1 sel setelah 4 jam
inkubasi dengan SFN; (D) Caspase-3 aktivasi di PA-1 sel setelah pengobatan SFN. Setelah dirawat dengan SFN,
sel menjalani analisis western blot dan bandintensitas

(Pro-caspase 3) yang diukur menggunakan Li-COR dekat sistem pencitraan inframerah. Analisis statistik
dilakukan dengan menggunakan t-test; simbol *,
& Dan # di setiap kelompok bar menunjukkan bahwa perbedaan yang dihasilkan dari pengobatan dengan SFN
secara statistik signifikan pada P <0,05
Gambar 2 Pengaruh SFN pada siklus sel perkembangan / distribusi di PA-1 sel: (A) analisis siklus sel dari PA-1
sel setelah berbudaya dengan SFN selama 24 jam; (B) SFN diinduksi peningkatan jumlah sel fase G2 / M (%).
Simbol * dan & dalam setiap kelompok bar menunjukkan bahwa perbedaan yang dihasilkan dari pengobatan
dengan SFN secara statistik signifikan pada P <0,05.
Setelah inkubasi, sel-sel diwarnai dianalisis menggunakan aliran cytometry (FACSCalibur, BD, USA).Data
dianalisis menggunakan WinMDI 2.8 perangkat lunak bebas (BD, USA).

analisis siklus sel

analisis siklus sel dilakukan dengan menggunakan fluorescent dye asam nukleat dan propidium iodida (PI)
untuk mengidentifikasi proporsi sel di masing-masing dari tiga tahap interfase. Sel diobati dengan SFN selama
24 jam, dan kemudian dipanen dan tetap dalam 1 ml dingin 70% etanol untuk setidaknya delapan jam pada -20
C. DNA bernoda di PI / solusi RNaseA dan konten DNA dideteksi menggunakan sitometri. Data dianalisis
menggunakan WinMDI 2.8 perangkat lunak bebas (BD, USA).

assay Western blot

Sebanyak 30-50 ug protein dipisahkan oleh 10% SDS- PAGE dan ditransfer ke membran PVDF (Millipore,
USA). Membran diblokir dengan memblokir penyangga (Odyddey, USA) semalam dan kemudian diinkubasi
dengan anti--aktin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), anti-CDC2, anti-caspase 3, dan B1 anti-cyclin (Santa
Cruz bioteknologi, USA) antibodi untuk 1,5 ~ 2 jam. Bercak kemudian dicuci dan diinkubasi dengan tubuh anti
kedua (IRDye Li-COR, USA) pada pengenceran 1 / 20.000 untuk
30 menit.Akhirnya, antigen divisualisasikan menggunakan dekat sistem pencitraan inframerah (Odyssey LI-
COR, USA) dan data dianalisis menggunakan Odyssey 2.1 software.
Gambar 3 Sel siklus penangkapan oleh SFN di PA-1 sel melalui penghambatan CDC2. Sel diobati dengan SFN
diikuti oleh (A) analisis western blot
(B) kuantifikasi intensitas oleh Li-COR dekat sistem pencitraan inframerah. Perbedaan signifikan ditentukan
pada tingkat * P <0,05 dibandingkan kelompok kontrol 0 pM.
Co-immunoprecipitation (co-IP)
Co-IP adalah cara yang efektif untuk mengukur interaksi protein-protein dalam sel. Secara singkat, 500 mg
protein seluler berlabel menggunakan anti-cyclin B1 (Santa Cruz Bioteknologi, USA) setelah inkubasi semalam
di kamar tempe- rature. The immunoprecipitates protein-antibodi dikumpulkan oleh protein A / G plus-agarosa
(Santa Cruz Bio Technology, USA).Setelah mencuci akhir, sampel yang direbus dan disentrifugasi untuk pelet
manik-manik agarosa.analisis Western blot protein CDC2 di supernatan kemudian dilakukan. Antigen
divisualisasikan menggunakan dekat sistem pencitraan inframerah (Odyssey LI-COR, USA) dan data dianalisis
menggunakan Odyssey 2.1 software.

Analisis statistik
Semua data dilaporkan sebagai mean ( SEM) minimal tiga percobaan terpisah. Sebuah t-test atau satu arah
ANOVA dengan uji post-hoc dipekerjakan untuk analisis vertikal statistik yang, dengan perbedaan yang
signifikan ditentukan sebagai P <0,05.

hasil
SFN menghambat proliferasi PA-1 sel
Kami berhipotesis bahwa SFN bisa memediasi kelangsungan hidup PA-1 sel dan dengan demikian menghambat
pertumbuhan mereka. Untuk mengeksplorasi aktivitas anti-tumor dari SFN terhadap PA-1 sel, sebuah studi
viabilitas sel in vitro dilakukan di mana
Gambar 4 Mitosis penundaan oleh SFN di PA-1 sel melalui penghambatan Cdc2-cyclin disosiasi kompleks B1:
Sel diobati dengan SFN diikuti oleh (A) Co-IP dan analisis western blot, dan (B) kuantifikasi intensitas oleh Li-
COR dekat sistem pencitraan inframerah. Perbedaan signifikan ditentukan pada tingkat * P <0,05 dibandingkan
kelompok kontrol 0 pM

masing-masing sampel sel PA-1 diperlakukan dengan dosis peningkatan perkebunan dari SFN (0, 6,25, dan 12,5
M) selama 24 sampai
72 jam. Hasil di (Gambar 1A) menunjukkan bahwa
kelangsungan hidup dan proliferasi PA-1 sel menurun pengobatan dengan SFN dalam tergantung dosis (The
IC50 24 jam 'simvastatin dalam sel kanker PA-1
bertekad untuk menjadi 17,083 pM; y = -2,8213 +
98,199, R2 = 0,9697) (* p <0,05 vs SFN 0 kelompok M) dan waktu-kursus cara (& p <0,05 vs 24 jam
Perlakuan, # p <0,05 vs 48 perawatan jam).

SFN ditekan viabilitas sel PA-1 sel tanpa apoptosis induksi

Sebuah studi pada apoptosis dilakukan untuk lebih menjelaskan
mekanisme anti-kanker SFN di PA-1 sel. Setelah mengobati sel dengan berbagai dosis SFN, usia persentase sel
apoptosis dinilai menggunakan Annexin V FITC dan propidium iodida pewarnaan, diikuti dengan analisis aliran
cytometric (Gambar 1B). Titik-plot Annexin

V-FITC fluoresensi dibandingkan PI fluoresensi juga indikator- kombatan peningkatan tidak signifikan dalam
persentase sel apoptosis diobati dengan SFN. Pada konsentrasi SFN dari 6,25-12,5 pM, tidak ada peningkatan
yang signifikan diamati dalam persentase sel yang mengalami nekrosis dan apoptosis (Gambar 1C) atau aktivasi
caspase 3 (Gambar 1D). Hasil diringkas dalam Gambar 1 menunjukkan bahwa SFN mungkin memediasi
kelangsungan hidup PA-1 sel dan dengan demikian menghambat proliferasi tanpa apoptosis induksi.

pengobatan SFN diinduksi akumulasi G2 fase / M di PA-1 sel

Distribusi sel-siklus SFN-diperlakukan PA-1 sel dianalisis menggunakan aliran cytometry. Sebelum pengolahan
dan analisis, sel-sel yang terkena SFN untuk total
24 jam. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2A, sel-sel terkena SFN menunjukkan peningkatan jumlah sel di
G2 / M fase (& p <0,05 vs SFN 0 M), dibandingkan dengan jumlah sel yang tidak diobati. Ini bisa berarti
bahwaPA-1 sel telah menjalani siklus sel tahanan. Kami juga menemukan bahwa pengobatan dengan SFN
secara bersamaan mengurangi jumlah sel pada fase G1 (* p <0,05 vs SFN 0 M) (Gambar 2B).

siklus sel tahanan oleh SFN di PA-1 sel melalui CDC2 bawah regulasi dan disosiasi dari cyclin B1 / CDC2
kompleks
Gambar 3 menggambarkan immunoblotting protein seluler
dari PA 1-sel diperlakukan dengan SFN, mengungkapkan penurunan CDC2 berikut inkubasi dengan SFN
(Gambar 3A). Cyclin B1 dan ekspresi protein CDC2 dihitung dengan mengukur intensitas relatif. Kami
menemukan bahwa tingkat CDC2 secara signifikan lebih rendah dalam sel diinkubasi dengan konsentrasi SFN
12,5 pM (Gambar 3B). Selain itu, aktivitas cyclin B1 / CDC2 kompleks (penting untuk transisi G2-M selama
siklus sel) ditentukan oleh Co-IP (Gambar 4A) dan dihitung dengan mengukur intensitas pita relatif. Kami
menemukan bahwa cyclin B1 / CDC2 kegiatan yang kompleks secara signifikan ditekan dalam sel diinkubasi
dengan konsentrasi SFN 12,5 pM (Gambar 4B).
Hasil ini menunjukkan peningkatan dari sel populasi tion di G2 / fase M melalui regulasi down dari CDC2 dan
disosiasi dari cyclin B1 / CDC2 kompleks berikut inkubasi dengan SFN di PA-1 sel.

Diskusi
Hasil dikumpulkan dalam penelitian ini menggunakan jalur sel kanker ovarium manusia memberikan bukti
eksperimental yang menunjukkan bahwa SFN dapat menyebabkan siklus sel ireversibel sisanya ar selama G2
fase / M. Ini konstituen diet menunjukkan kemopreventif dan potensi kemoterapi melalui kemampuan mereka
untuk memperbaiki Dampak bagi samping dari kemoterapi konvensional [14].
Penelitian ini meneliti ekspresi in vitro cyclin B1 dan Cdc2 di PA-1 sel. Sel-sel memiliki chanisms saya- untuk
menjaga stabilitas genomik melalui siklus sel tahanan [15]. Setidaknya dua pos pemeriksaan siklus sel berperan
dalam respon seluler, memungkinkan DNA yang akan diperbaiki sebelum duplikasi DNA (G1 / S checkpoint)
atau mitosis (G2 / M checkpoint) [16]. Cdc2 mengatur mitosis dan mengikat cyclin B untuk membentuk faktor
mitosis-mempromosikan (MPF) [17]. Aktivitas MPF diatur oleh fosforilasi / defosforilasi Cdc2 serta akumulasi
cyclin protein B dan p53; GADD45 juga terlibat dalam G2 / M pos pemeriksaan dan mungkin berpartisipasi
dalam regulasi Cdc2 aktivitas kinase [18,19].
jalur lain dari bukti menunjukkan bahwa kerusakan DNA cludes mantan cyclin B1 dari inti, yang
mempromosikan penangkapan G2 [20]. Ada kemungkinan bahwa progresi siklus pos pemeriksaan siklus sel
penundaan sel untuk memberikan waktu tambahan untuk perbaikan kerusakan DNA; Namun, penelitian kami
menemukan bukti Dir dll yang DNA diperbaiki sementara sel-sel ditangkap di pos pemeriksaan.Studi terbaru
menunjukkan bahwa SFN menghambat pertumbuhan prekursor tumor dan tumor pada model tikus saat
pengobatan dimulai pada saat administrasi karsinogen [10]. Co-penghambatan PI3K / AKT dan cara path- ERK
mengaktifkan FOXO faktor transkripsi dan meningkatkan SFN diinduksi FOXO aktivitas transkripsi, yang
mengarah ke penangkapan siklus sel dan apoptosis [21].

kesimpulan
Kami menyimpulkan bahwa G2 delay adalah respons umum dari sel-sel tumor untuk kemoterapi dengan SFN.
Kami lebih lanjut mengusulkan bahwa mekanisme penundaan ini dapat dikurangi ekspresi CDC2 dan disosiasi
kompleks cyclin B1 / CDC2. Oleh karena itu, meskipun efek preventif tertentu chemopre- dari SFN dan terkait
pound com isothiocyanate telah ditetapkan berkaitan dengan sel-sel kanker ovarium, SFN harus diselidiki lebih
lanjut untuk mengkonfirmasi sifat antitumor tambahan yang diusulkan oleh penelitian kami.