ESCUELA

DE MICROBIOLOGA MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL

Manual de prcticas Ingeniera Gentica

PRCTICA 4. AMPLIFICACIN POR PCR DE UNA SECUENCIA ITS EN EL rDNA

1. INTRODUCCIN
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR, por su nombre en ingls Polymerase Chain
Reaction) descrita inicialmente por Kary Mullis en 1986, ha permitido avanzar a pasos
agigantados en el desarrollo de la ingeniera gentica moderna. Esta tcnica se basa en la
capacidad de las enzimas polimerasas de construir una cadena de ADN a partir de una
cadena molde y una secuencia iniciadora. Estas secuencias llamadas primers son
olignonulceotidos de 17-30 bases que se hibridan a una secuencia complementaria de
ADN y determinan el tamao y especificidad del fragmento amplificado. Los componentes
de la PCR incluyen una enzima ADN polimerasa que sintetiza la cadena complementaria,
esta enzima debe ser estable a altas temperaturas para resistir la temperatura de
desnaturalizacin del ADN (95C); los deoxinucleotidos (dNTPs), constituyen el sustrato
para la polimerizacin; los primers, iniciadores u oligonucletidos determinan el
fragmento a amplificar, anclndose a regiones especficas en la cadena molde, y los iones
como el Mg2+ actan como Cofactores de la enzima ADN polimerasa.
La PCR se fundamenta en la amplificacin in vitro de una molcula de ADN a travs de
ciclos repetidos de:
Desnaturalizacin: se da la ruptura de los puentes de hidrgeno que mantienen la
estructura de doble cadena del ADN, por medio de un tratamiento trmico a 95C.
Alineamiento: Los primers se hibridan a una secuencia complementaria en el DNA
molde. Generalmente la temperatura de alineamiento se encuentra entre 50 y
60C dependiendo de la secuencia de los primers.
Elongacin: La enzima ADN polimerasa cataliza la incorporacin de cada uno de los
dNTPs de acuerdo a la secuencia de la cadena molde. Este proceso se lleva a cabo
a una temperatura de 72C.

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De sta manera, la amplificacin se logra a travs de ciclos repetidos (30-35) de
desnaturalizacin, hibridacin de los primers y elongacin de la cadena complementaria.
El xito de una amplificacin por medio de PCR depende de la calidad de ADN utilizado
como templado o molde, la mezcla exacta de reactivos, el diseo de los primers y la
temperatura de alineamiento de stos ltimos.
Una vez completado los ciclos de la PCR, los productos amplificados son analizados por
electroforesis en gel de agarosa, que permite la separacin del ADN de acuerdo a su
tamao.
Existen diferentes variaciones de la PCR convencional de acuerdo a las necesidades
propias de cada investigacin, entre las ms usadas estn: PCR anidada, PCR mltiple, PCR
en tiempo real, RT-PCR, etc.

2. OBJETIVOS
Objetivo general
Amplificar por medio de la reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR) un fragmento de
inters especfico.

Objetivos especficos
Amplificar especficamente un fragmento conservado de una secuencia de un
espaciador interno (ITS) localizado en la regin del rDNA.
Identificar la funcin de cada uno de los reactivos en la reaccin de amplificacin.
Desarrollar habilidades y destrezas para la amplificacin de un fragmento de ADN
mediante PCR.

3. MATERIALES Y EQUIPOS
Enzima Taq polimerasa
Buffer de PCR 10X
MgCl2
dNTPs

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Primers forward y reverse
Agua desionizada esteril
ADN genmico
Micropipetas de 1, 10 y 100 l
Puntas estriles para micropipetas
Tubos de PCR de 0.2 ml
Termociclador

4. METODOLOGA
a. En condiciones de completa esterilidad preparar la mezcla de reaccin adicionando
los reactivos que se presentan en la tabla 1.


Tabla 1. Composicin de la mezcla de reaccin de la PCR

Componente Cinicial Creaccin Vrequerido(L)

Agua - -
Buffer de reaccin 10X 5 5
MgCl2 25 mM 4 3
dNTPs 10 mM 2 1
Primer ITS-4 10 M 2 1
Primer ITS-1 10 M 2 1
Taq Polimerasa 5 U/L 0.4 0.4
DNA molde -- -- 500 ng 1000 ng
Volumen final 50

a. Asegurarse que todos los reactivos y el ADN molde estn en solucin y en el fondo del
tubo, adems debe evitar la formacin de burbujas.

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b. Incubar los tubos en el termociclador con el siguiente programa:

Paso N ciclos Temperatura Tiempo

Desnaturalizacin inicial 1 95C 6 min
Desnaturalizacin 35 94C 20 seg
Hibridizacin 35 54C 20 seg
Elongacin 35 72C 1 min
Elongacin final 1 72C 5 min
Incubacin 1 4C 60 min

c. Almacenar a 0C hasta su visualizacin por electroforesis.

5. PREGUNTAS
Cules son las polimerasas ms utilizadas para la PCR y describa sus principales
caractersticas?
Cules son los aspectos a tener en cuenta para el diseo de primers?
Describa cual es el fundamento de la PCR en tiempo real para ser catalogada como
una tcnica cuantitativa

6. REFERENCIAS
Ausbel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman J.G., Smith J.A. and
Struhl, K. Current protocols in molecular biology. 1994-20051 - USA 5 vols. Different
Chapter.
Primrose S.B, Twyman R.M. Principles of gene manipulation and genomics. Edition 17.
Blackwell Publishing.2007.

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Sambrook, J.F. & Rusell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3 edition Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA. 2001; vol 1.
http://www.protocol-online.org