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UD 7.2: OTROS MTODOS ESPECTROSCPICOS DE ANLISIS.

Espectroscopia de luminiscenica molecular

1. Introduccin
2. Espectrometra de fluorescencia molecular
a. Fundamento
b. Relacin entre intensidad de fluorescencia y concentracin
c. Factores que afectan a las mediciones fluorimtricas
d. Instrumentacin
e. Aplicaciones clnicas
3. Espectrometra de quimioluminiscencia molecular
a. Fundamento
b. Factores que afectan a las mediciones de quimioluminiscencia
c. Instrumentacin
d. Aplicaciones clnicas

1. Introduccin
La luminiscencia es un fenmeno de emisin de luz debido a un proceso de relajacin
de un estado excitado a un estado de menor energa (generalmente el estado
fundamental)
La espectrometra de luminiscencia molecular (ELM) se basa en la medida de la luz
emitida por molculas. Para que las molculas pasen a un estado excitado ser
necesario aportarles energa y dependiendo de la fuente de energa que utilicemos
para la excitacin distinguimos dos tipos de fenmenos luminiscentes:

Fotoluminiscencia.- Cuando la fuente de energa de excitacin es una


radiacin luminosa (luz). Son fenmenos de este tipo:
o La fluorescencia
o La fosforescencia
La diferencia entre fluorescencia y fosforescencia es que la primera cesa
rpidamente, la luz tiene una vida muy corta (es menor de 10-5 segundos),
es instantnea, mientras que la fosforescencia se mantiene durante un
tiempo mayor tras haber cesado la radiacin, este tiempo es mayor de 10-4
segundos o generalmente 10 segundos o incluso puede durar horas.

o Quimiloluminiscencia.- La energa de excitacin es aportada por una


reaccin qumica. Cuando la quimioluminiscencia tiene lugar en
seres vivos se denomina bioluminiscencia.

2. Espectrometra de fluorescencia molecular

2.1. Fundamento
La fluorescencia y fosforescencia son dos formas de luminiscencia que tienen lugar
cuando una molcula (o tomo) absorbe energa luminosa de una determinada
longitud de onda y cuando vuelve a su estado fundamental reemite esa energa en
forma de luz.
La radiacin de fluorescencia puede ser de la misma longitud de onda que la radiacin
de excitacin, en este caso se denomina fluorescencia resonante o puede ser que la
longitud de onda sea mayor que la radiacin de excitacin y en este caso se llama
fluorescencia no resonante. Esta ltima es la que se produce con mayor frecuencia en
molculas. A este desplazamiento de la longitud de onda de emisin respecto a la de
absorcin se denomina desplazamiento de Stokes.
La energa absorbida por las molculas adems de ser emitida como energa radiante,
energa luminosa, puede ser liberada en forma de calor.
La competencia entre otras formas de desexcitacin y la emisin de energa radiante
es la que va a determinar que una molcula sea fluorescente o no.
Experimentalmente se ha observado que no todos los fotones absorbidos son emitidos
como fluorescencia. Con el fin de relacionar la intensidad de la radiacin emitida con la
intensidad de la radiacin absorbida, se ha definido una constante, , que se
denomina rendimiento cuntico o eficacia cuntica y relaciona el nmero de molculas
que emiten fluorescencia con el nmero de molculas excitadas o lo que es lo mismo,
la intensidad de radiacin emitida en relacin con el nmero de fotones absorbidos.

IF
=
I Ab

El rendimiento cuntico puede tomar valores entre 0 y 1. Aquellas molculas que


presentan una alta fluorescencia tienen una eficacia cuntica prxima a 1, mientras
que aquellos que no tienen una fluorescencia apreciable se aproximan a 0.
Para que una molcula sea fluorescente debe poseer grupos funcionales capaces de
absorber radiacin luminosa y adems esos grupos debern ser capaces de emitir luz
cuando se produce la desexcitacin. A estos grupos funcionales se les denomina
fluorocromos o fluorforos (en general se denomina as a las molculas que poseen
fluorescencia)
Los grupos funcionales que proporcionan una mayor intensidad fluorescente son los
aromticos, pero si existen sustituciones en los anillos aromticos la fluorescencia
puede desaparecer. Tambin, molculas que no son fluorescentes, a travs de
determinadas reacciones qumicas pueden volverse intensamente fluorescentes.
La fluorescencia tambin va a depender de la longitud de onda de la radiacin de
excitacin, en general son mucho ms eficaces las radiaciones U.V. con longitudes de
onda de excitacin superiores a 250 nm.
2.2. Relacin de la concentracin con la intensidad de la fluorescencia

Con intencin de poder determinar concentraciones desconocidas, habr que


encontrar una relacin entre la intensidad de la radiacin fluorescente emitida por una
determinada sustancia y la concentracin de sta.

La intensidad de la emisin fluorescente es proporcional a la intensidad de la radiacin


absorbida.

IF = (Io It)

Donde Io es la intensidad de la luz incidente (excitadora) e It la intensidad de la luz


transmitida. Siendo un factor de proporcionalidad que suele llamarse rendimiento
cuntico. Por otra parte, tengamos en cuenta la ley de Lambert-Beer, ya vista, es decir

A= b c ;

LogT = b c

It
Log = b c ; donde la fraccin de luz transmitida es:
Io
It
= 10 bc
Io
I t = I 0 10 bc ; sustituyendo en la primera ecuacin considerada, obtenemos:

IF = (I (I
0 o 10 bc ))
I F = I 0 (1 10 bc )

I F = I 0 2,3 b c
Si consideramos que Io se mantiene constante a lo largo de toda la prueba y
agrupamos esta ltima junto con las constantes , y b, podremos concluir diciendo
que:

IF = K c

Esto slo se cumple cuando las muestras son soluciones muy diluidas en las que la
intensidad absorbida es inferior a un 2 % de la intensidad inicial de la radiacin.

2.3. Factores que afectan a las mediciones fluoromtricas

- Estructura de la molcula.- Empricamente se encuentra que la fluorescencia est


particularmente favorecida en molculas que poseen estructuras rgidas.
Generalmente son compuestos heterocclicos o hidrocarbonos poliarmaticos.
- Concentracin.- Cuando hay una concentracin alta se producen dos fenmenos:
o Autoabsorcin.- Se produce cuando las longitudes de onda de
emisin y excitacin estn muy prximas. Cuanto mayor concentracin,
mayor ser la autoabsorcin.
o Autoamortiguacin.- Es debido a que con una mayor concentracin
es ms probable que la desexcitacin no sea radiante porque al haber
muchas ms molculas hay muchas ms colisiones y se va a
incrementar el calor (se desexcitan ms por calor y no por la radiacin
fluorescente).
- Temperatura.- En general a mayor temperatura menor intensidad de
fluorescencia.
- pH.- Pequeas variaciones del pH pueden modificar de manera importante la
intensidad de la fluorescencia.
- Disolvente.- Al disminuir la viscosidad del disolvente va a disminuir la intensidad
de fluorescencia porque disminuye el . Adems la presencia de ciertos iones
como cloro, bromo, yodo en el disolvente van modificar de manera apreciable la
intensidad de fluorescencia. Tambin la presencia de molculas que absorben en
las longitudes de onda de excitacin modificar la intensidad de fluorescencia.
- Dispersin de la radiacin.- la radiacin dispersada va a producir un ruido de
fondo.
- Fotodescomposicin.- Se refiere a la descomposicin de la muestra por la luz
que incide sobre ella.

2.4. Instrumentacin Los instrumentos se denominan fluormetros o


espectrofluormetros. Se diferencian en que el fluormetro emplea filtros y el
espectrofluormetro monocromadores. Los componentes de estos instrumentos, son
los siguientes:

Fuente de energa radiante.- Deben de proporcionar una intensidad grande.


Los ms utilizados son:
o Las lmparas de arco de mercurio de baja presin.
o Las lmparas de arco de Xenn de alta presin.
o Y en algunos casos lseres

Sistemas de selectores de longitud de onda.- Situados uno antes de la


muestra y otro despus. Pueden ser filtros de interferencia o absorcin en los
fluormetros o monocromadores de red en los espectrofluormetros. El selector
de emisin y el detector se encuentra formando un ngulo con el haz inicial
(de excitacin), para evitar que la luz procedente de la fuente llegue al
detector. Generalmente este ngulo es de 90 . Ser necesario seleccionar la
longitud de onda de mxima absorcin con el selector primario y la longitud de
onda de mxima fluorescencia con el secundario.
Compartimiento para la muestra.- Pueden ser cubetas rectangulares o
cilndricas, pueden ser de vidrio, cuarzo o slice fundido (vidrio visible,
cuarzo y slice UV).
Detector.- Los ms utilizados son tubos fotomultiplicadores. Tambin se
pueden utilizar detectores de diodos en serie.

Hay fluormetros y espectrofluormetros de haz simple y de doble haz. En los de doble


haz, el haz de radiacin pasa alternativamente por la muestra y por la cubeta de
referencia.
Las medidas de fluorescencia estn sometidas a mltiples variables y es muy difcil
que en el mismo instrumento nos de la misma medida de una solucin de una
concentracin determinada de un da para otro. Hay que calibrarlos con mucha
frecuencia y se realiza la calibracin con una disolucin de un fluorforo estable de
concentracin conocida para las longitudes de onda de emisin o excitacin que se
utilicen.
Con este tipo de patrn ajustamos el aparato a un valor de sensibilidad determinado y
las medidas de la intensidad se harn con relacin a este patrn.
2.5. Aplicaciones clnicas

Mtodos fluorimtricos:

Las ventajas que tienen son que es mucho ms sensible y las desventajas son
que es menos preciso y menos exacto.
En general se utiliza para determinar sustancias que se encuentran en
concentraciones mnimas en lquidos biolgicos (enzimas, hormonas, frmacos,
vitaminas, etc).
Casi todas estas determinaciones se realizan por fluoroinmunoanlisis.

Mtodos fosforimtricos:

Se emplean en la determinacin de cidos nucleicos, aminocidos, enzimas,


etc. Se emplea menos que la fluorimetra.

Ambas tcnicas se utilizan como detectores de los componentes luminiscentes del


eluido de una columna cromatogrfica de HPLC o de electroforesis capilar.

3. Espectroscopia de quimioluminiscencia molecular

3.1. Fundamento
Se produce cuando por medio de una reaccin qumica se genera un producto
intermedio o final excitado que al volver al estado fundamental emite luz.
La reaccin ms sencilla sera:

A + B C * +D C* C + h U

Generalmente las reacciones que se producen son mucho ms complejas.

A+B C+D C+E F*+G

F* F+ h x

La intensidad de la radiacin emitida (que se mide en fotones por segundo, depende


de la velocidad de la reaccin y de la eficacia cuntica o del rendimiento cuntico que
se refiere al nmero de fotones emitidos por molcula que reacciona. Generalmente
los valores de rendimiento cuntico de las sustancias quimioluminiscentes que se
utilizan en anlisis estn entre 0,01-0,2.

I cl = cl d c
dc
Velocidad de reaccin
dt dt

cl Re n dim iento cuntico

En las reacciones quimioluminescentes generalmente la


luz emitida aumenta rpidamente tras la mezcla de los
reactivos, llegando a un mximo, para despus
comenzar a disminuir.
Las medidas generalmente se efectan en la parte descendente de la curva.
Las medidas se pueden efectuar de dos formas:
Medir la intensidad total en un perodo de tiempo determinado.
Medicin instantnea tras haber transcurrido un tiempo tras la incubacin.

Los componentes quimioluminiscentes ms utilizados son:


Luminol y sus derivados
Ester de Acridinio
Esteres de oxalato
Lucigenina

Tambin se pueden utilizar algunos marcadores bioluminiscentes (NAD+/NADH;


FMN/FMNH2, etc.).

3.2. Factores que afectan a la quimioluminiscencia

1. Luz ambiental.- Debe estar cerrado hermticamente para evitar que entre la
luz.
2. Que existan en la muestra otras sustancias que absorban o que emitan luz.
3. La temperatura, el pH del medio y tambin que exista en la muestra otros
componentes que reaccionan directamente en la reaccin de
quimioluminiscencia.
4. Concentracin elevada de sales y tampones, sobre todo en el caso de las
enzimas de los marcadores bioluminiscentes porque se puede inhibir la
reaccin enzimtica.

3.3 Instrumentacin Consta de:


Una cubeta de reaccin adecuada.
Detector.- Tubos fotomultiplicadores.
Sistema de lectura.

A estos aparatos se les suele llamar luminmetros.


En las medidas de quimioluminiscencia es muy importante el tiempo de mezcla de los
reactivos que debe de ser instantneo, para obtener resultados repetibles.

3.4. Aplicaciones clnicas

En bioqumica clnica tienen utilidad para la determinacin de hormonas, drogas


teraputicas y de abuso, marcadores tumorales, etc.
Parte de estos anlisis se realizan por una combinacin de quimioluminiscencia y
tcnicas inmunolgicas.