Anda di halaman 1dari 11

Jurnal Reading

DNA Methyltransferases: Facts, Clues, Mysteries

oleh:
Yohanes Cakrapradipta Wibowo
G9911214

Pembimbing
Dr. Pradipto Subiantoro, drg., Sp.BM

KEPANITERAAN KLINIK BAGIAN GIGI DAN MULUT


FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET
RSUD DR.MOEWARDI
2016
1. Pendahuluan

Metilasi DNA merupakan salah satu proses epigenetik yang utama. Metilasi DNA
merupakan modifikasi kimiawi DNA yang terjadi post-replikasi, reversibel dan dapat
diturunkan yang melibatkan regulasi pada proses biologis yang luas baik pada
vertebrata, tumbuhan dan jamur. Bagian ini akan membahas mengenai metilasi DNA
pada mamalia dan khususnya pada mania dan mencit.

Pada mamalia, metilasi DNA terjadi terutama pada residu sitosin yang terletak
dalam dinukleotida CpG dan berhubungan dengan gene silencing. Distribusi dari
dinukleotida CpG pada genom mamalia tidak merata namun tidak acak. DNA yang
termetilasi paling banyak ditemui pada heterokromatin yang mengandung sejumlah
besar DNA seperti sekuens parasitik, retrotransposons dan berbagai macam element
berulang. Sebagian besar dinukelotida CpG yang tidak termetilasi di temukan dalam
CpG islands misalnya DNA yang kaya akan CpG ditemukan pada regio regulasi 5
pada hampir setengah dari gen dalam suatu genom.

Metilasi DNA memiliki peran penting pada perkembangan normal mamalia dan
ekspresi gen, inaktivasi kromosom X pada wanita dan genomic imprinting. Metilasi
DNA juga berperan terhadap stabilisan dan integritas genom dengan meninaktivasi
sebagian besar DNA. Pola metilasi yang berubah dengan hipometilasi pada genom
secara luas dan hipermetilasi yang didapatkan secara spesifik pada regio tertentu
sering ditemukan pada kanker.

Bagaimana metilasi DNA menyebabkan gene silencing?Bagaimana pola metilasi


DNA yang di bentuk dan dipertahankan? Pertanyaan ini merupakan beberapa
pertanyaan yang sering di tanyakan pada bidang ilmu mengenai metilasi DNA.
Tilikan dari pertanyaan ini datang dari identifikasi dan karakterisasi beberapa enzim
yang dikenal sebagai DNA metiltransferase (DNMT). Enzim ini merupakan regulator
kunci metilasi DNA yang akn menjadi fokus pembahasan pada bagian ini yang akan
membuat pembaca pada jalur permulaan dari stiktur protein ini dan proses serta
mekanisme di mana enzim ini dapat menahan transkripsi dan apa yang dapat kita tahu
mengenai targetnya pada suatu sekuens DNA. Perhatian ditunjukan kepada bukti yang
muncul yang mengaitkan antara DMNT dengan struktur kromatin.
2. DMNT: Mug Shots dan Knockout

DMNT mengkatalisasi metilasi pada posisi 5 pada cincin sitosin dengan


menggunakan S-adenosis-metionin sebagai donor metil. Menurut homologi sekuens
dasar, DNMT diibagi menjadi 3 famili: DMNT1, DNMT2 dan DNMT3. Famili
ketiga ini memiliki 3 anggota lagi yaitu: DNMT3A, DNMT3B dan DNMT3L.
Stuktur dan aktivitas enzimatik dari protein ini di tinjau pada bagian berikut.

Gambar 1. DNMT pada mamalia. Terdapat 3 kelas dari DNMT yang diketahui,
Sebagian besar dari protein ini memiliki domain regulasi N-terminal dan sebuah
domain katalis C-terminal, namun DNMT2 memiliki domain regilasi yang kurang
dan DNMT3L secara katalis tidak aktif. Panjang dari setiap protein berdasarkan asam
amino yang menyusunnya. Kolom ketiga merupakan gambara fenotipe yang muncul
pada mencit dengan knocout Dnmt. Aktifitas metitransferassi pada setiap DNMT
dideskripsikan pada kolom terakhir.

2.1. Struktur DNMT

Sebuah DNMT secara umum terdiri atas dua domain: domain katalis pada
bagian Carboxyl-terminal dari protein dan domain regulasi pada rgio amino-terminal.
Dnmt1 merupakan enzim pertama yang diisolasi sebagai DNMT mamalia dan
merupakan satu-satunya yang diidentifikasi dengan pendekatan biokimia. Protein ini
memiliki domain amino-terminal yang paling besar diantara DNMT lainnya. Protein
ini bertanggung jawab untuk masuk ke nukleus dan untuk ikatan zinc dan juga
memediasi interaksi antar protein.

Ekspresi gen Dnmt1 sangat tinggi pada sel yang aktif membelah pada sel
somatik Selama gametogenesis, ekspresi gen dari promoter epsifik dan 5 exon
menghasilkan isoform Dnmt spesifik jenis kelamis yang secara fungsi biologis masih
kabur. Pada tikus, sebuah isoform Dnmt1 yang disebut Dnmt10, sebagai oocyte-
spesific diekspresikan oleh oosit dan embrio pre-implantasi. Protein ini sepertinya
dibutuhkan hanya selama fase S tunggal pada embrio tikus untuk menjaga pola
metilasi.

Pengamatan bahwa metilasi terdapat pada stem sel embrionik tikus yang
kekurangan gen Dnmt1 membawa peneliti untuk berhipotesis bahwa DNMT lainnya
pasti ada. Skrining pada database expressed sequence tag (EST) mennghasilkan
temuan tiga gen lain yaitu: Dnmt2, Dnmt3a dan Dnmt3b.

Dnmt2 mengandung hanya satu motif DNMT dan saat gennya


diekspresikan, meskipun hanya pada kasar yang rendah, didapatkan pada sebagian
besar jaringan tubuh pada manusia dan tikus. Peran dari protein ini masih belum
banyak diketahui.

Gen Dnmt3a dan Dnmt3b menunjukkan ekspresi yang sangat tinggi selama
embriogenesis dan gametogenesis namu rendah saat diferensiasi sel. Dua isoform
Dnmt3a dan tjuh isoform Dnmt3b telah diteliti dan memiliki pola ekspresi spesifik
selama perkambangan da pada jaringan dewawa. Sangat sedikirt informasi yang
diketahui mengenai pentingnya isoform protein ini. Untuk menjelaskan fungsi
spesifik dari setiap isoform Dnmt3a dan Dnmt3b, perlu dilakukan analisis genetik
berdasarkan intervensi pada gen yang mengekspresikan isoform tersebut secara
spesifik.

Secara struktur, DNmt3a dan Dnmt3b memiliki, sebagai tambahan dari


bagian katalis pada regio-C-terminal, dua domain pada amino-terminal: domain
PWWP yang kaya proline dan triptopan serta demoain PHD yang kaya sistein.
Domain PWWP diteukan pada 60 protein eukariot dan memiliki fungsi
regulasi transkripsi serta pengaturan kromatin. Stuktur dari domain PWWP Dnmt3b
tikus sudah diketahui. Domain ini mungkin menyebabkan target dari Dnmt3a dan
Dnmt3b ke arah heterokromatin perisentrik karena protein ini bisa berikatan pada
kromosom selama metafase dan meingkatkan metilasi dari DNA. Domain PWWP
dari Dnmt3b berikatan secara nonspesifik pada DNA di mana Dnmt3a menunjukkan
kemampuan ikatan dengan DNA yang minima;.

Kedua domain regio N-terminal, domain PHD, terdapat juga pada famili
ketiga DNMT3m, Dnmt3L. Domain PHD dari protein ini sebagian besar mirip
dengan motif PHD yang tidak sempurna yang ditemukan pada ATRX, sebuah protein
famili SNF2 yang meruoakan protein remodeling kromatin yang bergantung ATP.
Sebuah gen ATRX yang bermutasi ditemukan pada beberapa retardasi mental yang
berkaitan dengan kromosom X. Domain PHD memediasi interaksi antar protein dan
berfungsi sebagai domain represor transkripsi.

2.2. Knockout Dnmt pada mencit

Metilasi DNA berubah secara teratur pada perkembangan mencit. Halk ini
melibatkan demetilasi genom secara luas atau spesifik pada gen tertentu dan juga
metilasi de novo. Seperti yang telah disebutkan di atas, metilasi DNA sangat
diperlukan pada tahap perkembangan mamalia. Hal ini digambarkan oleh hilangnya
gen DNMT pada mencit akan menyebabkan mortalitas embrionik atau post-kelahiran.

Pada mencit dengan genotipe Dnmt -/- akan mati saat fase embrionik, pada
awwal permulaan gastrulasi. Analisis pada embrio yang mati menunjukkan demetilasi
genom secara luas, ekspresi biallelic pada beberapa gen imprinting dan terganggunya
ekspresi Xist, sebuah RNA non koding yang panjang yang terlibat dalam inaktivasi
kromosom X pada wanita.

Mencit dengan genotipe Dnmt3a -/- mati pada 4 minggu setelah lahir dan mencit
ini menunjukkan defek instentinal yang parah dan gangguan pada spermatogenesis.
Adapun mencit Dnmt3b -/- menunjukkan demetilasi pada DNA satelit minor, defek
neural tube yang ringan dan mortalitas embrio pada E14.5-E18.5. Ketika kedua
Dnmt3a dan Dnmt3b di hilangkan dari genom mencit, embrio mencit akan memiliki
fenotipe yang mirip dengan embrio mencit Dmnt1 -/- yang menunjukkan berhentinya
proses perkembangan dan neural tube yang berubah pada E8.5
Mencit dengan gen Dnmt2 yang terganggu akan tetap hidup dan fertil namun
dengan beberapa defek minor. Hal ini sesuai dengan hasil yang diperoleh dari
percobaan Dnmt2 -/- pada stem sel embrionik. Sel ini akan tetap hidup dan tidak ada
perubahan signifikan dari pola metilasi DNA nya. Seperti yang akan disebutkan pada
bagian selanjutnya, fenotipe Dnmt2 -/- kemungkinan berhubungan dengan aktivitas
enzimatik protein DNMT2 yang sangat rendah.

Mencit dengan nmt3L -/- akan hidup namun pada mencit jantan akan steril
danprogeny heterozigot dari mencit wbetina homozigot akan mati saat dikandungan
dan menujukkan genomik imprinting maternal menyeluruh. Fenotipe ini tidak dapat
dipisahkan dari mencit yang memiliki gen Dnmt3a yang terganggu pada sel germinal
saja. Hal ini menjjelaskan peran penting dari Dnmt3L dan Dnmt3a dalam proses
imprinting maternal. Sebuah penelitian juga menyebutkan bahwa Dnmt3L merupakan
kofaktor penting untuk Dnmt3a. Dnmt3L dapat terlibat dalam proses silencing
retrotransposo selama proses scanning genom premeiotik pada sel germinal jantang,
oleh karena delesi Dnmt3L pada sel germinal diawal akan mencegah metilasi de novo
pada retrotranspososn yang tersebar dan akan menyebatkan kegagalan meiotik pada
spermatosit.

2.3. Aktivitas metitransferasi DNMT: sebuah proses yang kompleks

DNMT secara umum di klasifikasikan sebagai metitransferase maintenance


(DNMT1) atau de novo (DNMT3). Klasifikasi ini didasarkan pada temuan bahwa
Dnmt1 berinteraksi dengan proliferating-cell nuclear antigen (PCNA), sebuah
kimponen pada kompleks replikasi DNA dan berada pada fokus replikasi. Saat ini, hal
ini baru saja diketahui bahwa klasifikasi tersebut jauh dari kata sederhana.

Pada sel kanker kolorektal manusia misalnya, terdapat bukti bahwa pola metilasi
DNA dipelihara tidak hanya oleh DNMT1 aja namun juga dengan kerjasama antara
DNMT1 dan DNMT3B. Efek dari hilangnya Dnmt3a dan Dnmt3b pada sel emrionik
mengindikasikan Dnmt3a dan Dnmt3b sama-sama terlibat dalam menjaga pola
metilasi DNA. Dnmt1, di samping itu, menunjukkan aktivitas metilasi de novo sedikit
atau tidak sama sekali secara in vivo. Li dan rekan-rekannya baru saja mengajukkan
model dari proses ketiga DNMT: DNMT1 berfungsi sebagai enzim yang memelihara,
bertikdak dengan efisiensi tidak namun tidak dengan akurasi sempurna. DNMT3A
dan DNMT3B melalui ativitas de novo mereka bertidak sebagai proofreader,
menyebabkan metilasi CpG pada daerah yang tidak tersentuh oleh DNMT1.

DNMT3L tidak menunjukkan aktivitas metitransferasemeskipun begitu terlibat


dalam proses metilasi DNA. Seperti yang disebutkan di atas, protein ini berkontribus
khususnya pada genomik imprinting selama gametogenesis.. Protein ini akan muncul
sebagai kofaktor Dnmt3a meningkatkan aktivitas de novo.

Meskipun DNMT2, seperti yang disebutkan di atas hanya memiliki satu domain
dengan karakterisDNMT, domain metitransferase, protein ini tidak menujukkan
aktivitas apa-apa sampai aktif secara katalis. Hal ini juga menujukkan spesifisitas
sekuens tertenti pada struktur sentromer. Temuan ini akan meningkatkan ketertarikan
terhadap famili DNMT yang masih menjadi misteri ini.

3. Bagaimana DNMT mempengaruhi transkripsi?

DNMT terlibat dalam silencing gen, tetapi bagaimana? Hal ini telah diketahui
selama baertahun-tahun bahwa metilasi DNA dan struktur kromatin saling berkaitan.
Pada genom mamalia misalnya, metilasi DNA dengan kadar yang tinggi terdapat pada
regio heterokromatik. Dan CpG islan yang termetilasi terdapat berdekatan dengan
kromatin yang secara transkripsi terhenti dengan histone yang terdeasetilasi, dimana
CpG island yang tak termetilasi pada promoter gen secara transkripsi menuntungkan
dan memiliki stuktur kromatin terbuka dengan histone yang terasetilasi.

Proses yang mendasari hubungan antara metilasi DNA dan struktur kromatin
masih belum dapat di jelaskan secaa pasti namun terdapat beberapa penelitian yang
melaporkan bagaimana struktur kkromati memodulasi transkripsi gen. Hal ini di
gambarkan di bawah pada bagian 3.2 dengan berfokus pada DNMT yang sekarang
lebih jelas bahwa metilasi DNA dan struktur kromatin berkerja sama untuk
menghentikan ekspresi gen.

3.1. Cross-talk dan Transcriptional Silencing

Laporan penelitian dari A. Bird dan A. Wolffe merupakan yang pertama yang
menjelaskan hubungan antara DNA dan modifikasi histone. Mereka menunjukkan
bahwa domain protein pengikat metil-CpG yang secara selektif mengenali
dinukleotida CpG yang termetilasi, merupakan komponen dari complek histone
deacetylase (HDAC). HDAC menghilangkan gugus asetil dari ekor histone dan
membantu menjaga nicleosome tetap dalam stuktur aslinya, terbungkam secara
transkripsi.

Lebih lanjut lagi, hubungan langsung antara metilasi CpG dan deasetilasi telah
diidentifikasi: DNMT tampak menghambat transkripsi dengan membawa bhistone
deacetylase. Fakta bahwa DNMT berhaitan dengan HAC menimbulkan pertanyaan:
Mengapa hubu8ngan ini diperlukan? Satu bocoran yang dapat menjelaskan adalah
kemapuan DNMT untuk bertindak sebagai metitransferase pemelihara dan/atau de
novo. Sebuah tantangan untuk sel adalah untuk mengembalikan dalam DNA yang
baru saja direplikasi, struktur kromatine diperlukan untuk menjaga aktifitas transkripsi
setelah modifikasi kromatin. Pada kasus ini, paling tidak satu enzime pemelihara,
DNMT1, hubungannya dengan HDAC sangat menarik: enzim ini muncul terutama
pada fokus relikasi saat akhir fase S dan ketika sebagian besar heterokromatin di
duplikasi. DMT1 selanjutnya dibutuhkan untuk memastikan histone yang membentuk
nukelosome yang terkumpul pada sisi replikasi awal terdeasetilasi.

Sebuah temuan yang tidak diperkirakan membuktikan bahwa interaksi DNMT-


HDAC di mediasi oleh bagian N-terminal non katalis DNMT. Silencing transkripsi
tidak diperlukan untuk menjaga aktivitas enzimatik DNMT. Sebagai tambahan,
Dnmt3L masih dapat membawa HDAC di saat kekurangan aktivitas DNMT.

Hal ini selanjunya membuktikan bahwa DNMT dapat menyebabkan beberapa


fungsi yang berkaitan dengan HDAC yang secara bebas dari kemampuan mereka
untuk memetilasi bagian CpG. Meskipun temuan ini masih baru dikonfirmasi secara
in vivo, hal ini cenderung membuat spekulasi bahwa DNMT lebih kompleks di
banding dugaan awal. Dengan katan lain, mereka protein multifungsi yang mdi
sampinh fungsi utamanya dalam metilasi dinukelotida CpG.

Temuan terbaru mengemukakan bahwa DNMT berperan dalam penghambatan


transkripsi yang terkait kromatin lainnya, melibatkan metilasi histone H3 pada reside
lisin 9. Hubungan ini pertama kali di buktikan pada jamur askomikota Neurospora
crassa dan pada tumbuhan Arabidopsis thaliana. Temuan ini menunjukkan bahwa
mutasi gen dim-5 dari Neurospora dan kryptonite dari Arabidopsis menghasilkan
hilangnya metilasi DNA. Menariknya temuan ini mengemukakan bahwa gen yang
mengekpresikan metitransferase histone K3-K9.
Mekanisme yang menghubungkan metilasi DNA dengan metilasi histone masih
belum jelas dan sepertinya terdapat beberapa proses yang menghubungkan atara
kedua proses epigenetik ini. Pada Arabidopsis, potein adaptor LHP1 tidak dibutuhkan
untuk menjaga metilasi DNA dan paling tidak HDA6 deasetilase masih dibutuhkan.
Pada Naurospora, protein HP1 dapat menjadi penghubung yang mungkun antara DNA
dan metilasi histone. Berdasarkan temuan terakhir, metilasi H3-K9 oleh DIM5
membentuk sturktur ikatan dengan HP1. Protein ini selanjutnya dapat membawa
DIM2 DNMT. Pada proses ini metilasi histone dapat mempengaruhi metilasi DNA.

Mungkinkah model tersebut berlaku pada mamalia? Adakah cross-talk pada


mamalia antara histon dan DNA dan apakah DNMT terlibat? Temuan terakhir
mengindikasikan hal tersebut. DNMT muncul dan berhubungan dengan aktivitas
metitransferase histon yang memodifikasi lisin 3 pada H3. Interaksi dengan
metitransferase histone Suv39h dapat terlibat. Kontak antara DNMT dan protein Hp1
alfa dan HP1 beta juga telah dilaporkan. Akhirnya, hasil yang didapat dari micel stem
sel embrionik Duv39h-double-null mengindikasikan bahwa trimatilasi H3-K9 yang
dimediasi Duv39h berpengaruh membuat pengaruh langsung dari Dnmt3b terhadap
heterokromatin perisentrik. Seperti pada penelitian dengan Neurospora, DNMT pada
mamalia juga dapat berinteraksi denga protein adaptor HP1 dan dapat berada dalam
proses yang melibatkan kromatin yang menganding histone termetilasi yang akhirnya
menyebabkan metilasi CpG dan silencing gen.

Oleh karena mamalian memiliki beberapa metitransferase H3-K9, perubahan


metilasi sepertunya lebih kompleks pada mamalia di banding Neurospora. Pandangan
ini di dukung oleh penelitian pada sel Suv39h-double-null yang menggunakan
antibodi spesifik yang membedakn antara dimetilasi dan rimetilasi H3-K9. Pada
penelitian ini, satelit perisentrik utama menunjukkan trimetilasi H3-K9 yang
bergantung pada Suv39h, ketika saatelit sentrometrik inor menunjukkan dimetilasi
H3-K9 yang tidak bergantung pada Suv39h. Oleh karena metilasi DNA yang
bergantung pada Dnmt3b pada satelit minor tidak terganggu padaa jenis sel tersebut,
maka daoat diperkirakan bahwa dimetilasi H3-K9 di katalisasi olh beberapa enzim
yang masih belum di ketahuin. Metiltransferase H3-K9 lain seperti G9a atau SETDB1
dilaporkan meregulasi metilasi DNA yang memfasilitasi silencing gen tetapi apakah
enzim ini berhubungan langsung dengan DNMT yang menpengaruhi metilasi CpG
perlu di tinjau kembali.
3.2. Histon dan Metilasi DNA: Peningkatan Mutual dan Lingkaran Umpan
Balik
Hasli pengamatan yang baru saja dijelaskan menunjukkan adanya garis lurus
dari metilasi H3-K9 terhadap metilasi DNA. Hasil tersebut konsisten dengan bukti
sebelumnya yang menunjukkan bahwa hanya gen yang dibungkam oleh mekanisme
lain mampu diatur metilasi CpG, yang dengan demikian akan menjadi peristiwa
sekunder dalam pembungkaman gen (Bird 2002). Data terbaru menunjukkan bahwa
metilasi DNA mungkin pada gilirannya dapat memberikan suatu efek umpan balik
pada metilasi lisin, yang mengarah ke penguatan kedua lapisan metilasi yang berbeda
ini.
Penelitian pada protein MBD mendukung pandangan ini. Di lokasi gen
termetilasi yang mengatur, MECP2 diketahui memfasilitasi metilasi histon H3 di lisin
9, yang kemungkinan dikatalisasi oleh enzim Suv39h (Fuks et al, 2003b; Data kami
yang belum terpublikasikan). Selain itu, metilasi oleh enzim H3-K9 SETDB1
menunjukkan ketergantungan pada MBD1 dan metilasi DNA pada lokus spesifik
(Sarraf dan Stancheva, 2004).
Mekanisme DNMT mengatur metilasi histone secara langsung belum dilaporkan
sampai saat ini, namun penelitian terhadap Arabidopsis mungkin akan mengawali
penelitian selanjutnya. Analisis mutasi menunjukkan bahwa MET1, yang homolog
dengan DNMT1 pada mamalia, mempengaruhi metilasi H3-K9 (Soppe et al, 2002).
Oleh karena itu, sementara masih banyak penelitian yang diperlukan untuk
memperluas hasil penelitian ini terhadap kondisi lainnya, akan terlihat bahwa
informasi epigenetik, yang diwujudkan dalam tingkat residu metilasi, dapat mengalir
dari histon ke DNA dan sebaliknya. Hal tersebut akan sama dengan aliran informasi
antara histon deasetilasi dan DNA termetilasi, yang melibatkan asosiasi fisik MBD
dan DNMT dengan HDAC dan akan menghasilkan lingkaran umpan balik (Jaenisch
dan Bird, 2003).
Keseluruhan ini menunjukkan bahwa metilasi DNA dapat menyebabkan
pembungkaman gen sebagai bagian dari program epigenetik yang dilakukan melalui
interaksi yang diilustrasikan pada Gambar 2. Pada tahap awal, DNMT terikat ke
molekul adaptor seperti HP1 dan akan menambah kelompok metil DNA hanya pada
kromatin yang termetilasi pada lisin 9 dari histon H3. Hubungan antara DNMT
dengan metiltransferase H3-H9 (misalnya, Suv39h) akan memastikan dampak
langsung oleh status metilasi H3-K9 pada DNMT. Hal tersebut juga menimbulkan
kontak dengan HDAC. Hal ini akan menyebabkan pembungkaman gen parsial. Pada
tahap selanjutnya, DNA yang termetilasi oleh DNMT akan menyebabkan pengikatan
MBD terhadap DNA. Ikatan MBD akan berinteraksi dengan metiltransferase H3-K9
dan memfasilitasi metilasi lisin. Deasetilasi histon H3 di lisin 9 diperlukan untuk
keberlangsunganmetilasi pada residu ini (Rea et al. 2000), deasetilasi histon H3 di
lisin 9 akan diikuti oleh metilasi histone, yang pada gilirannya mungkin
mengakibatkan perekrutan protein seperti HP1.
Hal ini merupakan hal penting di masa depan untuk mengungkap lebih detail
urutan kejadian yang tepat. Beberapa mekanisme yang mungkin berkontribusi pada
pembentukan dan pemeliharaan terhadap pembungkaman epigenetik. Namun
demikian, model di atas menarik karena menunjukkan bahwa metilasi DNA mungkin
bertindak bersama-sama dengan deasetilasi histone dan metilasi H3-K9 untuk
menghasilkan siklus penguatan diri, dan dengan demikian dapat menjaga dan
mempertahankan penekanan kromatin.