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Hibridomas y

Anticuerpos
Monoclonales
Dra. Ivette Lorenzana de Rivera
Generalidades de los Molcula de
anticuerpos Anticuerpo
Los Anticuerpos son:
protenas producidos
por el sistema
inmunolgico de los
seres vivos, para
defenderse de
elementos extraos,
que llamamos
antgenos.

Los que produce el cuerpo son Policlonales


Desventajas

Producidos por diferentes clones de


clulas B que tienen diferentes
especificidades, esto reduce la
sensibilidad hacia un Ag particular y
puede conllevar a reacciones cruzadas.

Acs Policlonales
El organismo contiene muchos clones de
linfocitos B cada uno de los cuales
sintetiza un nico Ac. especfico.
El encuentro de uno de estos clones con
el Ag apropiado da lugar a la proliferacin
o generacin de clones, que dan lugar a
clulas plasmticas secretoras del mismo
tipo de anticuerpo que la clula original

Seleccin Monoclonal
Anticuerpo Monoclonal (AcMo) se usa
para referirse a una poblacin de
molculas de Ac, todas idnticas porque
fueron producidas por un mismo clon de
clulas .
Al no ser producidas por diferentes clones
de clulas B, el chance de obtener falsos
positivos, en una prueba analtica, es
mucho menor cuando se usan reactivos
monoclonales.

Anticuerpos Monoclonales
Bsicamente consiste en lograr la
inmortalizacin de las clulas plasmticas
productoras de Acs, mediante fusin con
una lnea tumoral que si es inmortal

Estas clulas hibridas pueden ser clonadas


para producir lneas celulares que
producen Acs. homogneos (de un solo
tipo), estas clulas inmortalizadas son
conocidas como Hibridomas.

Tcnica de Acs Monoclonales


Un hibridoma es una lnea celular hbrida
obtenida mediante la fusin de un linfocito
B productor del anticuerpo especfico de
inters, con una lnea celular de mieloma
(linfocito B canceroso) que no produce
una inmunoglobulina propia. Se obtiene
as una lnea celular inmortal capaz de
producir el anticuerpo monoclonal de
inters, que puede recuperarse del medio
de cultivo donde crecen las clulas.
(1) Inmunizacin de un
ratn
(2) Aislamiento de linfocitos
B del bazo
(3) Cultivo de clulas de
mieloma
(4) Fusin de mieloma y
clulas B
(5) Separacin de las lneas
celulares
(6) Screening de las lneas
celulares que producen el
anticuerpo adecuado (a) y
desecho del resto (b)
(7) Proliferacin in vitro (a)
or in vivo (b)
(8) Harvesting.cosecha

PROCESO DE PRODUCCION
Produccin de anticuerpos
Monoclonales

Este proceso toma de 4-6 meses dividido en 3 fases;


la cantidad de material necesario para inmunizacin
de 5 o ms ratones 1mg o 1.5mg de Ag
Fase 1
Inmunizacin de 5 BALB/c con preinyeccin en cola,
inyeccin antgeno/adyuvante despus hacer ELISA
para determinar ttulos altos para ser usados en la
fusin de clulas.
Tiempo estimado 2 meses con un costo de $1,800
El proceso de produccin de anticuerpos monoclonales es complejo.
Primero se disgrega el bazo del ratn inmunizado, donde se acumulan los
linfocitos B que tienen una escasa viabilidad en cultivo, y se fusionan con
clulas de mieloma deficientes en enzimas implicados en la sntesis del
nuevo ADN como la timidina quinasa (TK) o la hipoxantina guanina
fosforibosil transferasa (HGPRT). Los productos de la fusin celular
(hibridomas) son cultivados en medio HAT (de Hipoxantina, Aminopterina
y Timidina) donde las clulas mielmicas son eliminadas. Solamente
pueden crecer en el medio de cultivo HAT las clulas que son producto de
la fusin entre un linfocito y una clula de mieloma.
Las clulas hbridas obtenidas tras el proceso de fusin contienen un
nmero elevado de cromosomas (72 del mieloma y 40 del linfocito B) que
en las sucesivas divisiones celulares se irn perdiendo hasta oscilar entre
los 70 y los 80 cromosomas. Como consecuencia de dicho proceso,
algunas clulas pierden la capacidad de secrecin de anticuerpos o bien
funciones bsicas para la viabilidad celular. Por ello tan pronto como se
identifica como positivo un pocillo se somete a un proceso de clonacin
para evitar el crecimiento de clulas no productoras que al ser
metablicamente ms eficientes acabaran por dominar el cultivo.
Las clulas hibridas fusionadas (hidridomas) siendo
clulas en parte cancergenas, se multiplicaran
rpido e indefinidamente y producirn grandes
cantidades de los anticuerpos deseados, estas tienen
que ser seleccionadas y subsecuentemente clonadas
por diluciones limitadas.
Los costos de produccin de un AcMo es de $8,000
a $12,000 por lnea celular.
El uso de mielomas que no secretan sus propios
anticuerpos y de esa manera no interfieren con la
produccin del anticuerpo deseado.
Fase 2
Fusin de esplencitos con la lnea celular del mieloma,
usando una placa de 96 pocitos y determinar por la prueba
ELISA la expresin de los anticuerpos al antgeno, despus de
seleccionar los anticuerpos estos se depositan en una placa de
24 pocitos, una parte para expandirla y la otra congelarla.
Tiempo estimado 3-4 semanas con un costo de $2,900
Fase 3
Se clonaran los positivos por lo general 5 dependiendo y se
har por dilucin limitada, los clones sern expandidos y sern
los seleccionados sern congelados.
Tiempo estimado 1.5 -3 meses con un costo de $2,800
Costo total del proyecto $7,500
La seleccin ocurre de las clulas fusionadas de
hibridoma colocadas en medios selectivos,
especialmente medios conteniendo HAT por 10 a 14
das.
Despus de usar HAT (Hipoxantina, Aminopetrina y
Timidida) es por lo general usar HT dentro del
medio.
Clonar ocurre despus de la identificacin de clulas
positivas del hibridoma. Se producen los clones por
dilucin limitada.
Hay que hacer al cultivo de clonaje en la placa, el
screening para determinar que clones en los pocillos
producen AcMo.
Encontrar una lnea celular apropiada como
pareja de fusion de las clulas plasmticas.

El uso de recursos eficientes para la fusin de los


dos tipos de clulas parentales.

El uso de un sistema selectivo para desechar las


clulas que no han conseguido fusionarse.

Identificacin de aquellas clulas hbridas


capaces de secretar los Acs deseados.

Puntos clave a seguir


Los mielomas son
tumores originados por
clulas B y son estas las
que se utilizan en el
proceso de fusin para
la obtencin de acs
monoclonales.

Lnea celular para fusionar


con las clulas plasmticas.
Deben tener un marcador o un sistema
que permita separar las fusionadas de las
no fusionadas.
Se utilizan variedades que no secretan
Acs.

Propiedades requeridas de los


mielomas
Mtodos de fusin:

1. Fusin con polientilenglicol (PEG)


2. Fusin por medio de un fuerte campo
elctrico
3. Tratamiento con virus Sendai

Uso de recursos para fusionar


las dos clulas parentales
Uso de un sistema
para desechar las
clulas que no se
Medio HAT: Este medio se fusionaron
utiliza para seleccionar los
hibridomas y contiene
aminopterina, hipoxantina
y timidina.
Los esplenocitos se
mueren a los pocos dias.
Los mielomas no pueden
utilizar la hipoxantina
exgena para producir
purina. La aminopterina
bloquea la sntesis
endgena de nucletidos
y las celulas mueren.
Esto se logra aislando clulas nicas a
partir de una poblacin mixta por medio
de diluciones a densidades muy bajas,
seguido por el sembrado de alcuotas en
pocillos separados. A una dilucin
apropiada solamente una fraccin de los
pocillos recibir una clula.

Identificacin las clulas


hbridas que sintetizan el Acs
deseado
Regimn de
inmunizacin

Test de
produccin de Acs
por los ratones

Fusin y seleccin

Investigacin de
los productos de
hibridoma y
clonacin
Se investiga la
produccin de los
Acs deseados por
medio de ELISAs.
Los hibridomas se
conservan
congelados en
nitrgeno lquido o
se mantienen vivos
en ratones.
Producidos por Ingeniera Gentica.

Anticuerpos Quimricos
Anticuerpos Humanizados

Anticuerpos de segunda
generacin
Molcula artificial que
incorpora una parte
animal y una parte
humana.
Parte animal de la
molcula (hipervariable)
Indispensable para que
el Ac reconozca el
antgeno.
Parte humana (Fc)
encargada de la
fisiologa catabolismo y
las funciones efectoras
de los Acs. Evita el
rechazo.
Acs Quimricos
Significa que contiene un 90% de material
humano, lo que reduce la inmunogenicidad de
los anticuerpos (rechazo del sistema
inmunolgico).
La humanizacin es una tcnica que se basa
en mantener la estructura terciaria del sitio
de combinacin con el antgeno donde existen
unas regiones responsables de la unin al
antgeno.

Anticuerpos Humanizados
Una vez que se han producido anticuerpos
monoclonales que se unen a determinadas
sustancias, estos pueden ser usados para
detectar la presencia y cantidad de esta
sustancia, gracias a las tcnicas como:

Western blot
ELISA
Inmunofluorescencia
EIA
Inmunoprecipitacin e Inmuno-cromatografa.

Aplicaciones de los
Anticuerpos Monoclonales
Los anticuerpos monoclonales muestran una serie de ventajas
sobre los anticuerpos policlonales como:

Mayor homogeneidad.
Reproducibilidad de sus efectos, como consecuencia de su
homogeneidad.
Mayor capacidad de seleccionar los mejores anticuerpos en
afinidad, tipo de reconocimiento
Mayor Especificidad

Los Anticuerpos Monoclonales se utilizan en muchos


campos como:
La investigacin biomdica.
Diagnstico de enfermedades
Reacciones de Catlisis
En Biosensores
Tratamiento de enfermedades

Aplicaciones
Produccin de Mabs
segn clulas husped
Los Mabs se producen de las siguientes maneras
Murinos de 100% protena de ratn
Quimrico de aprox. 65% prot. humana y 35% de ratn
Humanizados de 95% de humana y 5% de ratn
Humanos completos 100% prot. humana
Desde su descubrimiento los AcMo han evolucionado a una velocidad
vertiginosa, habindose logrado mejorar todas sus caractersticas y su
adaptacin para servir tanto en el rea diagnstica como teraputica.
El uso de AcMo en el futuro evolucionar acorde a las necesidades del
hombre y a su creatividad:
Radioistopos + AcMo.
Inmunotoxinas (Pseudomonas, Ricina, etc.)
Agentes Citotxicos ( Doxorubicina)
Enzimas activadoras de drogas.
Transportador de elementos intracelulares TERAPIA GNICA.etc.

Anticuerpos monoclonales: El
futuro
Gracias por su Atencin!!