Bioteknologi Laporan 10 (2016) 56-65

Isi daftar tersedia di ScienceDirect

bioteknologi Laporan
homepage jurnal: www.elsevier.com/locate/btre

konjugasi dari titik-titik kuantum luminescent biotin-dilapisi dengan domain tunggal

antibodi-rhizavidin fusi

Jinny L. Liua, Scott A . Walpera, Kendrick B. Turnera, Audrey Brozozog Leeb, Igor L. Medintza,
Kimihiro Susumuc, Eunkeu OHC, dan Zabetakisa, Ellen R. Goldmana, George P. Andersona, *

Laboratorium Penelitian Angkatan Laut, Pusat Bio / Ilmu Molekuler dan Rekayasa , 4555 Overlook Ave SW, Washington DC
20375, USA b NOVA Research Inc., 1900 Elkin St Suite 230, Alexandria, VA 22308, USA c Sotera Pertahanan Solutions, Inc.,
7230 Lee DeForest drive, Columbia, MD 21046, USA

ARTICLEINFO

Pasal sejarah: Diterima 4 November 2015 Diterima dalam bentuk direvisi 29 Februari 2016 Diterima 1 Maret 2016 Tersedia
online 3 Maret 2016

Keywords: antibodi domain Tunggal Rhizavidin Quantum dots permukaan plasmon resonansi

ABSTRAK

metode langsung dan efektif diperlukan untuk bioconjugation protein pada permukaan dan partikel. Sebelumnya kami
menunjukkan bahwa fusi antibodi domain tunggal dengan biotin mengikat rhizavidin molekul tersedia metode lancar untuk
melapisi biotin-dimodifikasi permukaan dengan antibodi yang sangat aktif dan berorientasi. Di sini, kami membangun fusi
antibodi-rhizavidin domain tunggal yang sama serta rhizavidin disatukan dengan-tag-Nya. The rhizavidin disatukan diproduksi
secara efisien dan utilitas untuk pengembangan assay ditunjukkan di permukaan percobaan plasmon resonansi. The fusi antibodi-
rhizavidin domain tunggal yang digunakan untuk titik-titik mantel kuantum yang telah disiapkan dengan biotin permukaan.
Persiapan antibodi dilapisi titik-titik kuantum dengan cara ini ditemukan untuk menjadi mudah dan efektif. The siap tunggal
domain antibodi-quantum dot reagen ditandai dengan plasmon resonansi permukaan dan diterapkan untuk deteksi toksin dalam
format penginderaan fluoroimuno//.

Diterbitkan oleh Elsevier ini adalah sebuah artikel akses terbuka di bawah CC BY-NC-ND lisensi (http:
creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

1. Pendahuluan

Satu domain antibodi (sdAbs), berasal dari rantai berat hanya antibodi yang ditemukan di camelids (yaitu unta, llama, dan
alpacas), sering memiliki afinitas tinggi dan kemampuan untuk melipat kembali dan mengikat antigen setelah denaturasi panas
[1-4]. Karena unsur-unsur yang mengikat ini diproduksi rekombinasi, mereka dapat disesuaikan melalui rekayasa protein untuk
aplikasi khusus. SdAbs, secara umum, menghasilkan sangat baik di Escherichia coli; sdAb konstruksi fusi juga menghasilkan
lebih mudah daripada antibodi tradisional mengikat fragmen-fragmen yang meliputi rantai baik berat dan ringan. Misalnya,
ekspresi sdAbs sebagai fusi genetik dengan peptida, atau protein temperatur leleh tinggi adalah rute terbukti menuju
menghasilkan molekul yang sangat stabil dengan peningkatan utilitas [10/05]. Fusions telah digunakan untuk berbagai tujuan
termasuk: menyediakan produksi sitoplasma peningkatan sdAbs stabil, meningkatkan kelarutan sdAbs, serta menyediakan
berorientasi capture reagen [5,7,11,12]dari.

Kami baru-baru menggambarkan produksi dan karakterisasi fusion genetik antara sdAb dan rhizavidin (RZ) [10], sebuah
biotin binding protein (berasal dari simbiosis nitrogen

bakteri Rhizobium etli CFN42) [13]. Tidak seperti streptavidin, RZ putatively membentuk homodimer bukannya tetramer
[13,14]. RZ memiliki suhu leleh lebih dari 100 C di hadapan biotin, dan $ 75 C dalam ketiadaan. The sdAb-RZ fusion tersedia
karakteristik yang diinginkan sama, seperti memberikan capture berorientasi, sebagai fusi dengan protein streptavidin inti [11].
Yang penting, produksi protein ditingkatkan oleh sekitar 20 kali lipat dibandingkan dengan sdAb-streptavidin inti fusion [10].

Titik-titik kuantum bercahaya (qds) memberikan fluorophores kuat yang telah dimasukkan untuk aplikasi termasuk biosensing
dan pencitraan [15,16]. Konjugat dari sdAbs dengan qds, yang beberapa stabil unsur pengakuan dengan fluorophores kuat, telah
dijelaskan untuk deteksi, pencitraan dan aplikasi diagnostik [17-23]. Beberapa metode untuk bioconjugation protein untuk qds
telah dijelaskan; misalnya, kita telah sebelumnya digunakan konjugasi arah dari sdAbs untuk qds melalui histidin poli ekor
diperpanjang [17,20,24]. Salah satu generasi sebelumnya reagen sdAb-QD yang diuji didasarkan pada qds membuat air yang
kompatibel melalui capping dengan asam dihydrolipoic (DHLA). Qds fungsional-ized dengan DHLA-PEG berbasis ligan yang
tidak setuju untuk konjugasi melalui histidin ekor panjang, namun mereka menawarkan fungsionalitas dan stabilitas pada rentang
pH yang lebih luas [17,25]. Sebuah

* Penulis SesuaiE-mail:..

Alamat George.anderson@nrl.navy.mil (GP Anderson)

keuntungan dari sdAbs adalah kemampuan mereka untuk berfungsi melalui berbagai kondisi [26,27] termasuk intraseluler [28].
Oleh karena itu

http://dx.doi.org/10.1016/j.btre.2016.03.001 2215-017X / Diterbitkan oleh Elsevier ini adalah akses artikel terbuka di bawah CC
BY-NC-ND lisensi (http: // creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

diinginkan untuk memiliki sistem lancar untuk konjugasi arah dari sdAbs untuk qds difungsikan dengan DHLA-PEG ligan yang
memberikan biokompatibilitas meningkat. Perkembangan terbaru dari DHLA-PEG capped qds dengan porsi tutup difungsikan
dengan biotin [29,30], dalam hubungannya dengan fusi dari sdAbs dengan RZ memberikan rute alternatif untuk konjugat arah
dari sdAbs di qds. Sebuah Ilustrasi skematis baik konjugat sdAb-QD dibentuk menggunakan qds DHLA-capped dengan lampiran
dari sdAb melalui ekor histidin diperpanjang dan konjugat sdAb-QD memanfaatkan DHLA-PEG qds terbiotinilasi dan perpaduan
genetik sdAb-RZ ditunjukkan pada Gambar. 1. Memiliki berbagai metode untuk membentuk efektif konjugat sdAb- QD adalah
menguntungkan karena menyediakan peneliti kemampuan untuk memilih metode konjugasi yang paling tepat untuk pengujian
atau pencitraan kondisi mereka.

Pekerjaan saat ini berfokus pada deteksi risin. Risin adalah kDa racun 60-65 yang sangat ampuh yang terdiri dari subunit A
dan B. A subunit adalah bagian enzimatik bertanggung jawab untuk inaktivasi ribosom, sedangkan B subunit mengikat sel untuk
memfasilitasi masuknya toksin [31]. Untuk mendeteksi risin yang sdAb, D12f, yang memiliki baik afinitas tinggi dan stabilitas
termal yang baik (Tm = 78 C) [32], diproduksi sebagai fusi dengan RZ. D12f baik melengkapi stabilitas tinggi RZ daripada yang
asli C8 sdAb anti risin digunakan sebagai mitra fusi dengan RZ, yang mengikat epitop yang sama dan memiliki afinitas tinggi
untuk risin, tapi mencair $ 60 C. Selain itu, karena kami telah mengamati sporadis degradasi konstruksi yang digunakan engsel
atas llama berat rantai antibodi sebagai linker, kita beralih ke asam generic10-amino Gly-Ser linker untuk bergabung D12f untuk
RZ. Kami juga menyiapkan disatukan RZ dengan tag hexa histidin C-terminal (RZh), dievaluasi karakteristik biofisik dan
menunjukkan utilitas untuk digunakan sebagai ligan regenerable melalui plasmon resonansi permukaan (SPR) menggunakan
HTE (6x-Nya mengikat) chip sensor. Namun demikian, tujuan utama mendemonstrasikan kegunaan fusi sdAb-RZ oleh
pembentukan bioconjugate antara D12f-RZ dan qds yang memiliki biotin didirikan pada sebagian dari ligan capping mereka.
Berorientasial.
JL Liu et / Bioteknologi Laporan 10 (2016) 56-65 57

Gambar. 1. Skema sdAb-qds disiapkan sebelumnya, melalui histidin ekor diperpanjang pada sdAb dan melalui metode saat ini
memanfaatkan qds terbiotinilasi dan sdAb-RZ. Sisi kiri menunjukkan QD DHLA-capped ke mana sdAb telah terkonjugasi
melalui histidin ekor diperpanjang. Sisi kanan menunjukkan QD ditutup dengan 80% DHLA-PEG550- OMe dan 20% DHLA-
PEG400-biotin ke mana sdAb-RZ terkonjugasi melalui interaksi RZ-biotin. Struktur sdAb adalah dari PDB: 4W70 [40] dan
struktur RZ dari PBD: 3EW2 [14]. Komponen tidak digambar dengan skala.

Imobilisasi disediakan oleh RZ di qds menghasilkan sdAb sangat aktif yang mengikat target yang efektif.

2. Bahan dan metode

2.1. Konstruksi SdAb-RZ fusi dengan Gly-Ser

LinkerD12f-L10-RZ dibangun dengan terlebih dahulu memasukkan RZ ke situs XhoI dari vektor ekspresi pET22b di mana
urutan D12f sdAb telah dikloning ke situs NcoI-NotI (D12f-pET22b ); vektor ini termasuk C-terminal 6xHis tag [32]. Fragmen
RZ diapit dengan situs XhoI di kedua ujung yang diperkuat dari vektor asli menggunakan PCR dan dimasukkan ke situs XhoI
dalam D12f- pET22b. D12f-RZ [33] kemudian menjabat sebagai template untuk memasukkan asam 10 amino Gly-Ser linker
(L10, GGGGSGGGGS) menggunakan Quikchange II mutagenesis kit dan modifikasi kecil untuk protokol pabrik (Agilent
Technologies; Santa Clara, CA). Mutagenesis dicapai dengan menggunakan primer forward, 50-
GCGGCCGCACTCGAGGGCGGTGGCGG- TAGCGGCGGTGGCGGTTCTTTTGATGCGTCCAATTTTAAA-30, dan urutan
pelengkap sebaliknya sebagai primer sebaliknya. Singkatnya, suhu rendah anil (47 C) dan 18 siklus amplifikasi yang bekerja dan
sisanya dari prosedur tidak berubah dari protokol pabrik, untuk mendapatkan plasmid bermutasi. Semua klon dikonfirmasi oleh
sekuensing (Euofins Genomics; Hunts- ville, AL). Protein mutan disebut D12f-L10-RZ. Semua enzim restriksi dan ligase T4
DNA yang dibeli dari New England Biolabs, Inc (Ipswich, MA).

2.2. Pembangunan disatukan RZ dengan tag hexa histidin C-terminal (RZh) di pET22b (+)

The rhizavidin fragmen itu dikeluarkan dari D12f-RZ menggunakan enzim restriksi XhoI. Pemurnian gel dari fragmen
dipotong dilakukan dengan QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Menggunakan

fragmen rhizavidin dan pET22b (+) Vector, 3: ligasi 1 pada 16 C dilakukan semalam. Urutan yang benar diidentifikasi oleh
sekuensing DNA (Euofins Genomics).

2.3. Ekspresi, produksi, dan pemurnian SdAb-RZ dan RZh protein

Protein ekspresi dan pemurnian dilakukan mirip dengan metode yang dijelaskan sebelumnya [7]. Secara singkat, koloni
tunggal Rosetta (DE3) sel menyembunyikan ekspresi plasmid digunakan untuk menyuntik budaya semalam 50 mL tumbuh pada
30 C di Luria broth (LB) di hadapan 100 mg / mL ampisilin dan 35 mg / mL kloramfenikol. Hari berikutnya, budaya 500 mL di
LB diinokulasi menggunakan budaya semalam dan tumbuh pada 30 C selama 3 jam. Suhu kemudian dikurangi menjadi 25 C dan
ekspresi protein diinduksi dengan penambahan 0,5 mM IPTG (isopropil

b-D

-1-thiogalactopyranoside). Setelah 3 jam, protein dipanen oleh kejutan osmotik. Secara singkat, pelet sel pertama dari 500 mL
kultur homogen di 14 mL dingin sukrosa-tris (750 mM sukrosa, 100 mM Tris pH 7,5). Berikutnya 28 mL 1 mM
ethylenediaminete- traaceticacid (EDTA; pH 8) ditambahkan setetes demi setetes ke masing-masing sampel dan sampel dikocok
selama 15 menit di atas es. Akhirnya 1 mL dari 500 mM

MgCl2
 ditambahkan, sampel diinkubasi lebih lanjut 10 menit dan sel-sel pellet. 5 mL 10 penyangga IMAC (0,2 M
Na2HPO4, 4 M NaCl, 0,2 M imidazol, pH 7,5) dan 0,5 mL Ni Separose (GE Healthcare) ditambahkan ke supernatan dan sampel
jatuh semalam di 4 C di rotisserie. Selanjutnya, resin dicuci dengan 1 IMAC penyangga dan dielusi dengan IMAC buffer yang
mengandung 500 mM imidazol. Sampel dimurnikan dengan immo- kromatografi bilized logam afinitas (IMAC) dan
kromatografi ukuran-eksklusi menggunakan biologis Duo-aliran sistem kromatografi (Bio-Rad, Hercules, CA) dan salah seorang
memperkaya SEC 70 10 300 mm kolom atau Superdex G75 10 300 mm kolom (GE Healthcare, Piscataway, NJ)
diseimbangkan di buffer fosfat saline (PBS) + 0,02% azida dan berjalan pada 0,5 mL / menit.

Hasil panen dari RZh dari produksi periplasmic bertekad untuk menjadi 13,5 2,5 mg / L dengan mengukur absorbansi pada
280 nm menggunakan spektrofotometer NanoDrop. Laporan sebelumnya rinci produksi rekombinan dari disatukan RZ dari
sitoplasma dengan hasil rata-rata dari 4 mg / L [13,14]. Dengan demikian, produksi periplasmic dari RZh dengan tag itu
meningkat secara signifikan dari produksi RZ dilaporkan sebelumnya [13,14], meskipun produksi ke dalam ruang periplasma
umumnya dianggap sebagai faktor pembatas [34,35]. Pada bagian ini mungkin karena peningkatan pemulihan dari IMAC versus
kolom 2-iminobiotin.

Untuk mengevaluasi keadaan kuaterner (monomer, dimer, atau tetramer) dari konstruk fusion, 0,5 sampel mL protein baik
dengan atau tanpa kelebihan biotin ( 20 mM) ditambahkan yang memutarkan pada memperkaya SEC 70 kolom (Gambar. S1).
Tanpa diduga, raphy eksklusi ukuran chromatog- dari RZh IMAC dimurnikan, dengan tidak adanya biotin dielusi sebagai
tetramer a. Namun, setelah tambahan pemisahan eksklusi ukuran pengenceran dari protein RZh, konsentrasi bergantung tetramer
untuk transisi dimer diamati. Di hadapan kelebihan biotin kami mengamati bahwa bentuk dimer independen konsentrasi
didominasi. Pada denaturasi gel, mengikuti protokol standar untuk denaturasi protein pertama, RZh berlari sebagai 29,1 kDa
dimer baik di hadapan dan tidak adanya biotin, membuktikan stabilitas tinggi interaksi dimer (Gambar. S2). Secara umum,
tampak bahwa biotin bentuk terikat dari RZh tidak hanya lebih termostabil, tetapi juga lebih mudah larut seperti yang diamati
secara konsisten terelusi dari kolom filtrasi gel dengan bandwidth setengah tinggi lebih sempit dari itu mengamati untuk RZh
gratis biotin (Gambar. S1B dan S1C). Mungkin biotin saku mengikat menunjukkan beberapa kecenderungan untuk berinteraksi
lemah dengan matriks kolom atau lemah tetramer untuk dimer transisi yang terjadi.

58 JL Liu et al. / Bioteknologi Laporan 10 (2016) 56-65

2,4. Biotin difungsikan qds

bercahaya CdSe-CdZnS-ZnS titik kuantum core-shell-shell dibuat seperti yang dijelaskan sebelumnya [36]. Ukuran CdSe-
CdZnS-ZnS qds core-shell-shell yang digunakan pada penelitian ini adalah 4,6 0,44 nm yang diukur dengan mikroskop
elektron transmisi (TEM); yang qds memiliki emisi yang berpusat pada 540 nm dan ditutup dengan kombinasi 80% DHLA-
PEG550-OMe dan 20% DHLA-PEG400-biotin. Ada sekitar 100-200 ligan per QD dan dengan demikian ada diperkirakan 20-40
biotin per QD [30].

The qds biotin-difungsikan (Bt-qds), serta DHLA-PEG capped qds dengan emisi pada 540 nm, diencerkan dalam PBS dan
diterapkan dalam rangkap tiga pada konsentrasi mulai dari 100 nM ke 0,8 nM (5 kali lipat pengenceran seri) untuk sumur dari
NeutrAvidin dilapisi 96-baik piring yang telah dicuci tiga kali dengan PBS yang mengandung 0,05% tween ( PBST). Setelah
inkubasi untuk $ 2 h fotoluminesen (PL) diukur dan kemudian solusi QD telah dihapus dan sumur dicuci 3 kali dengan PBS dan
spektrum PL akhir dikumpulkan. Pengukuran diambil sebelum mencuci sumur menegaskan bahwa spektrum pengenceran QD
seperti yang diharapkan; pengukuran setelah mencuci sumur menunjukkan bagaimana qds terikat ke piring. Semua spektrum
emisi fluoresensi diukur dari masing-masing juga menggunakan TECAN Tak Terbatas M1000. Eksitasi panjang gelombang 300
nm. Data dikumpulkan setiap 5 nm 450-600 nm. Setiap sampel QD diperiksa dalam rangkap tiga.

2.5. Konjugasi sdAb-RZ ke biotin difungsikan qds

Biotin difungsikan qds ($ 200 pmol; 10 mL larutan 19,8 mM) dan D12f-L10-RZ ($ 4.000 pM; 77 mL larutan 52 mM)
dicampur, dibuat sampai dengan 1 mL di PBS dan diinkubasi selama kurang lebih setengah jam di atas es. Hal ini memberikan
rasio molar 20: 1 sdAb-RZ ke qds, rasio dipilih untuk menjenuhkan permukaan QD. Campuran sdAb-RZ-QD diaplikasikan
pelampung-a-lyzer dengan 100 kDa dipotong (Spectra / Por) dan didialisis PBS dengan tiga perubahan buffer dengan dialisis
akhir semalam melawan penyangga segar. Hari berikutnya sdAb-RZ-qds dipindahkan dari cangkir dialisis dan cangkir dibilas
dengan 1 mL PBS untuk memberikan volume akhir 2 mL dengan konsentrasi $ 100 nM QD reagen, dengan asumsi tidak ada
kerugian dialisis.

2,6. Binding penentuan oleh plasmon resonansi permukaan (SPR)

Semua percobaan SPR dilakukan dengan menggunakan Bio-Rad Proteon XPR36 dan data dianalisis menggunakan menyertai
Proteon Manajer 3.1software menggunakan analisis global Langmuir fit. Data mentah ditampilkan untuk langkah-langkah
imobilisasi, untuk amplifikasi mengikat dan selanjutnya risin dengan qds. Data tersebut diperbaiki untuk sinyal interspot dan
konsentrasi nol, jika sesuai. Untuk evaluasi QD bioconjugates tiga antibodi anti-risin yang berbeda digunakan: D12f dan H1W
keduanya sdAb dikembangkan oleh kami [32], dan mAb 5F4, yang merupakan hadiah semacam Dr. Thomas O'Brien, Tetracore
(Rockville, MD). Ketiga antibodi semua mengikat epitop berbeda pada risin Sebuah rantai dan bergerak menggunakan
konsentrasi 20 mg / mL ke sebuah chip GLC, yang memiliki karboksil dimodifikasi kompak lapisan polimer dengan kapasitas
pengikatan sekitar satu monolayer protein, menggunakan 10 mM buffer asetat pH 5.0 dengan standar EDC amina kopling kimia
yang direkomendasikan oleh Bio-Rad. Antibodi amobil kemudian diizinkan untuk mengikat risin untuk 120 s, 100 mL / menit,
pada kisaran konsentrasi 100-0 nM, qds kemudian biotin capped (Bt-qds; 10 nM) yang telah jenuh dengan D12f-L10 fusion -RZ
(dibuat seperti dijelaskan di atas) yang mengalir di atas chip untuk 120 s, diikuti oleh 240 s buffer (PBS + 0,005% Tween-20).
Regenerasi berikut chip yang sama dengan asam fosfat 0,085% antibodi diizinkan untuk mengikat 100 nM risin pada semua jalur
untuk 120 s.

Kemudian untuk mengevaluasi respon dosis D12f-L10-RZ dilapisi Bt-qds, konsentrasi 10, 3.3, 1.1, 0.37, 0.124, dan 0 nM QD
konjugat masing-masing mengalir di atas satu jalur untuk 120 s diikuti oleh 240 s buffer.

The RZh diuji pada chip sensor Bio-Rad HTE, yang memiliki kepadatan tinggi tris-NTA kompleks untuk meningkatkan
menangkap protein histidin-tag menyediakan stabilitas mengikat baik dan kemampuan regenerasi dalam penangkapan protein
histidin-tag. The HTE Chip pertama kali terkena 10 mM Ni sulfat untuk 300 s pada 30 mL / menit (tidak ditampilkan). Lanes 1-5
kemudian dilapisi dengan RZh (hanya 1 jalur ditampilkan, namun hasil yang sama diperoleh di semua lima jalur) atau D12f-L10-
RZ (hanya satu jalur digunakan sebagai kontrol) melalui 6xHis-tag mereka dengan mengalir untuk 20 mg / mL masing-masing
lebih dari jalur masing-masing pada 30 mL / menit untuk 300 s. The RZh kemudian dibiarkan

JL Liu et al. / Bioteknologi Laporan 10 (2016) 56-65 59

Gambar. 2. Menunjukkan efektivitas rhizavidin (RZh) menggunakan HTE chip pada Proteon SPR. Panel A menunjukkan
rhizavidin (20 mg / mL) mengikat semua 6 tempat di salah satu jalur chip HTE melalui tag 6xHis. Panel B menunjukkan tempat
yang sama seperti pada panel A yang dilapisi dengan biotinylated anti-risin sdAb, D12f (Bt-D12f). Panel C menunjukkan enam
tempat dari jalur lain yang dilapisi dengan D12f-L10-RZ melalui tag-Nya. Setelah chip sensor diputar 90, kemampuan kedua
jalur sehingga siap (panel B dan C) untuk mengikat risin ditunjukkan seperti yang ditunjukkan pada panel D dan E, untuk Bt-
D12f pada RZh saja dan D12-L10- RZ masing-masing.

mengikat Bt-D12f (20 mg / mL) untuk 300 s. Setelah itu chip berubah 90 dan jalur ditantang dengan berbagai konsentrasi risin
(100-0 nM) selama 90 s pada 100 mL / menit, tingkat off diikuti untuk 600 s. Sedangkan chip HTE memiliki kurang pemisahan
protein Nya-tag dari chip kepadatan HTG Bio-Rad lebih rendah, seperti RZh adalah dimer dan dapat mengikat dengan dua ekor
Nya, yang untuk tarif lebih lanjut ditekan. Selain itu, kemampuan interspot koreksi dari Proteon memungkinkan untuk koreksi
drift latar belakang.

2.7. Experion otomatis sistem elektroforesis

Untuk lebih mengevaluasi struktur kuaterner dari protein dan sampel stabilitas baik asli atau terdenaturasi dianalisis pada
sistem Experion Bio-Rad mengikuti petunjuk yang disediakan, lihat

panduan buletin 10004490. sampel Protein Bio-Rad diperiksa di asli dan mengurangi kondisi, baik dengan dan tanpa
menambahkan biotin (20 mM). (Gambar. S2).
2.8. SdAb-QD digunakan bioconjugate difluoroimmunoassays

Fluoroimmunoassaysdilakukan sama dengan sebelumnya sdAb-QD tes [20]. Wells dari piring 96-baik (Nunc, maxisorb)
dilapisi semalam di 4 C dengan menangkap antibodi menggunakan 5F4 antibodi monoklonal pada konsentrasi 3 mg / mL di PBS.
Langkah-langkah inkubasi yang tersisa semua dilakukan pada suhu kamar. Keesokan paginya, cairan coating dibuang keluar dan
sumur diblokir selama satu jam dengan PBS yang mengandung 4% susu bubuk. Wells dicuci dua kali dengan PBST dan
kemudian pengenceran risin, yang dibuat di PBS yang mengandung 1 mg / mL BSA (PBS-B) yang diterapkan pada sumur (4 kali
lipat pengenceran mulai 10 mg / mL). Setelah $ 1,5 jam sumur dicuci dengan PBST. The sdAb-RZ-QD reagen diencerkan
menjadi $ 14 nM di PBS-B dan 75 mL ditambahkan per baik dan diinkubasi selama $ 1,5 jam. Solusi sdAb-RZ-QD telah dihapus
dan sumur dicuci dengan PBST. Piring ditampar di atas kertas handuk untuk menghapus sisa mencuci penyangga dari sumur dan
fluoresensi pada 545 nm diukur pada TECAN Tak Terbatas M1000 menggunakan eksitasi 300 nm. Pengukuran dilakukan dalam
rangkap tiga; kontrol di mana tidak ada lapisan antibodi, ada risin, atau tidak ada sdAb-RZ-qds juga dilakukan.

3. Hasil dan diskusi

3.1. Produksi fusion genetik sdAb-RZ

Baru-baru ini, kami menerbitkan laporan pertama dari fusi genetik antara sdAbs dan biotin mengikat protein RZ [10]. Dalam
pekerjaan yang kita menunjukkan bahwa konjugat sdAb-RZ ternyata memiliki kemampuan yang sama untuk menyediakan
berorientasi capture permukaan seperti yang kita telah menemukan dengan fusi sdAb ke inti streptavidin [11], dengan keuntungan
dari 20 kali lipat produksi protein yang lebih baik dari $ 14 mg / L dari fusi sdAb-RZ. Semua konstruksi ini termasuk urutan dari
engsel atas llama alami menghubungkan dua protein, dan menggunakan vektor ekspresi berbasis pECAN45.

Untuk produksi sdAbs, kami telah menemukan ekspresi protein yang terbaik ketika urutan sdAb dimasukkan ke dalam
pET22b

60 JL Liu et al. / Bioteknologi Laporan 10 (2016) 56-65

Gambar. 3. Binding dari qds ditutup dengan DHLA PEG dan 20% biotin reagen (Bt-QD), dan qds ditutup hanya dengan DHLA
PEG untuk sumur NeutrAvidin dilapisi. QD pengenceran (100 nM, 20 nM, 4 nM dan 0,8 nM) pertama kali diterapkan pada
sumur NeutrAvidin dilapisi dan memungkinkan untuk mengikat, sebelum sumur dicuci dan spektrum fluoresensi diukur. Spectra
kode warna; tombol pada sisi kanan plot yang menunjukkan warna dan simbol sesuai dengan jenis QD dan yang dilusi. Inset di
sisi kiri plot menunjukkan nilai-nilai emisi fluoresensi pada 540 nm untuk kedua Bt-qds (segitiga hijau) dan qds ditutup hanya
dengan DHLA PEG (segitiga merah) diplot terhadap konsentrasi QD. Eksitasi adalah pada 300 nm. Plot ini menunjukkan bahwa
Bt-qds secara khusus mengikat ke NeutrAvidin. Titik data mewakili fluoresensi rata-rata dari tiga sumur; error bar yang
standardeviasi.

vektor ekspresitanpa termasuk urutan dari engsel atas [37]. Dengan demikian, untuk reagen generasi kedua sdAb-RZ kita beralih
ke vektor ekspresi pET22b, dan dibangun versi sdAb-RZ yang menggantikan engsel linker atas dengan yang lebih generik yang
berisi urutan asam amino yang terdiri dari situs restriksi yang digunakan dalam kloning dan tambahan asam amino 10 Gly-Ser
linker (AAALEGGGGSGGGGS) antara dua domain. Selain itu, untuk pekerjaan ini kami dimanfaatkan D12f risin mengikat
sdAb yang menunjukkan afinitas yang sangat baik dengan suhu leleh tinggi (78 C) untuk menyediakan reagen dengan
peningkatan rugged- ness dibandingkan dengan fusi RZ asli dengan anti-risin C8 sdAb yang meleleh $ 60 C [32]. Ketika
dimurnikan protein fusi, D12f-L10- RZ, dielusi dari memperkaya SEC 70 sebagai $ 60 kDa dimer, dengan biotin tidak
berpengaruh pada volume elusi, menunjukkan fusi membangun selalu ada sebagai dimer (Gbr. S1A). Di Experion, D12f-L10-RZ
berlari $ 63 kDa dimer ketika di negara asli, tetapi sebagai $ 30,3 kDa monomer ketika terdenaturasi (Gambar. S2).

3.2. Demonstrasi utilitas RZh disatukan

Selain tujuan utama kami, kami juga siap dan mengevaluasi kegunaan protein RZh dengan melakukan tes serupa dengan yang
dijelaskan oleh Zhou et al. [38], lihat Gambar. 2. RZh dan D12f-L10-RZ keduanya ditangkap melalui 6xHis tag mereka ke
permukaan chip HTE. RZh menjadi dimer, kedua tag-Nya membentuk interaksi yang lebih stabil pada permukaan tris-NTA dari
protein monomer dengan tag-Nya tunggal. The RZh kemudian diizinkan untuk mengikat D12f biotinylated (Bt-D12f). Setelah
reagen capture yang bergerak, chip berubah 90 dan berbagai konsentrasi risin (100-0 nM) kemudian mengalir di atas chip.
Jumlah risin terikat oleh dua permukaan adalah sangat sebanding dan afinitas diamati adalah sama untuk kedua bentuk D12f (K

= 86 24 pM). RZh berorientasi dihitung untuk mengikat $ 1,3

Bt-D12f untuk setiap dimer RZh dan Bt-D12f mengikat $ 1 risin untuk setiap 2 Bt- D12f bergerak. Dengan demikian, tingkat
yang sangat baik dari aktivitas mengikat diperoleh. Percobaan ini menunjukkan bahwa RZh dapat digunakan di tempat lain Nya-
tag biotin mengikat protein untuk beragam aplikasi, dengan keuntungan tambahan yang RZh menghasilkan setidaknya 10 kali
lipat hasil yang lebih baik di E. coli dari strep-core biotin protein yang mengikat (tidak ditampilkan).

Gambar. 4. Efektivitas Biotin-qds dilapisi dengan D12f-L10-RZ berfungsi sebagai penguat dalam tes Sandwich SPR. Sebuah
chip GLC SPR dilapisi dengan bahan pengikat anti-risin [mAb-5F4 (atas), D12f (tengah), dan H1W (bawah)]. Chip itu berbalik
90, dan memungkinkan untuk mengikat risin untuk 120 s pada kisaran konsentrasi 100-0 nM seperti yang ditunjukkan, kolom
kiri. Sisi kiri dari angka menunjukkan pengikatan pengenceran risin ke tiga antibodi capture. Kemudian kompleks sdAb-RZ-QD
$ 10 nM yang mengalir di atas permukaan untuk 120 s diikuti dengan penyangga untuk memantau disosiasi seperti yang
ditunjukkan di sisi kanan gambar. Kompleks sdAb-RZ-QD terikat dengan cepat dalam dosis risin tergantung cara.

3.3. Pengujian biotin-difungsikan qds

Fungsi dari qds ditutup dengan 20% terbiotinilasi ligan (Bt-qds) pertama kali dinilai dengan memeriksa kemampuan mereka
untuk mengikat piring NeutrAvidin dilapisi. Seri pengenceran qds, dengan dan tanpa biotin difungsikan ligan, yang diterapkan
untuk sumur dari NeutrAvidin

Tabel 1 konstanta Binding ditentukan untuk tiga antibodi capture dan nilai-nilai yang jelas ditentukan untuk D12f-RZ-qds
menggunakan (1) mAb 5F4 dan (2 & 3) H1W sebagai capture molekul untuk risin.

MA1 SA1 k

1 SA1 K

mAb 5F4 6.2 105 4.1 104 6,7 1010 D12f 6,6 105 4.3 105 6,5 1011 H1W 3,6 105 2.4 104 7,5 1010
1D12f-L10-RZ -QD 2,0 107 3.1 1018 6,7 1025 2D12f-L10-RZ-QD 1.0 107 2.3 1017 6,7 1024 3C8-QD 6.4
A106 2.2 104 3,5 1011

JL Liu et al. / Bioteknologi Laporan 10 (2016) 56-65 61

piring dilapisi. The qds biotin-difungsikan menunjukkan mengikat NeutrAvidin, berbeda qds serupa yang hanya dilapisi dengan
DHLA-PEG-OMe menunjukkan hanya sedikit non-spesifik mengikat NeutrAvidin (Gambar. 3). Percobaan ini diverifikasi
ketersediaan biotin pada qds untuk mengikat NeutrAvidin dan menunjukkan bahwa Bt-qds khusus akan mengikat NeutrAvidin.
3.4. Evaluasi sdAb-RZ-qds oleh SPR

The Bt-qds yang konjugasi D12f-L10-RZ dan mereka mengikat risin dievaluasi oleh SPR untuk menentukan kinetika
mengikat reagen QD dan mengevaluasi mereka untuk mendeteksi risin. Sebelumnya kami telah mengamati bahwa sdAb
digabungkan ke qds DHLA dibatasi melalui diperpanjang Ekornya disediakan> amplifikasi 2 kali lipat lebih sdAbs tak
terkonjugasi untuk mendeteksi risin, sedangkan komersial streptavidin difungsikan qds tersedia kurang dari amplifikasi [20].
Dalam karya ini D12f-L10-RZ tersedia unsur pengakuan yang terkonjugasi ke qds. tinggi

Afinitasinteraksi RZ-biotin tersedia imobilisasi berorientasi D12f pada permukaan Bt-QD. Skema dari dua jenis konjugat sdAb-
QD ditunjukkan pada Gambar.

1.sdAb-RZ-qds diperiksa untuk menentukan kinetika mereka mengikat dan kemampuan mereka untuk memperkuat sinyal di
tes sandwich untuk risin. Risin terikat oleh tiga antibodi capture amobil yang berbeda: antibodi monoklonal (mAb 5F4), yang
D12f sdAb, dan sdAb H1W yang mengakui epitop berbeda pada risin dari D12f (Gambar 4 panel kiri.) [32]. The sdAb-RZ-qds
kemudian diterapkan pada risin antibodi-ditangkap (Gbr. 4 panel kanan). Mengikat kinetika untuk reagen capture, serta sdAb-RZ-
qds ditunjukkan pada Tabel 1. Interaksi dari D12f-L10-RZ-QD dengan risin adalah multivalent, dan tercermin dalam tingkat
lambat off yang berada di luar batas kemampuan kita untuk mengukur secara akurat. Ketika off tarif menjadi sangat rendah
kemampuan untuk membedakan menjadi lebih menantang karena nilai dapat dengan mudah dipengaruhi oleh drift. Seperti yang
diharapkan, tidak ada pengikatan D12f-L10-RZ-qds direkam ketika risin ditangkap oleh D12f bergerak. Hal ini karena risin
adalah

62 JL Liu et al. / Bioteknologi Laporan 10 (2016) 56-65

Gambar. 5. Evaluasi respon dosis konjugat QD. Sebuah chip GLC SPR dilapisi dengan bahan pengikat anti-risin [mAb-5F4
(atas), D12f (tengah), dan H1W (bawah)], sama seperti pada Gambar. 5. Setiap jalur terkena risin 100 nM selama 90 s (kolom
kiri). Seperti dapat dilihat di sisi kiri dari gambar, untuk masing-masing tiga antibodi capture, ini dihasilkan sekitar sinyal yang
sama di masing-masing dari enam jalur. Berikutnya jalur terkena konjugat SdAb-RZ-QD di berbagai pengenceran, mulai dari 10-
0 nM (seperti yang ditunjukkan dalam legenda). Data ditampilkan di sisi kanan gambar. Dosis tergantung pada tingkat diamati,
sama seperti orang akan melihat untuk setiap analit khas.

Racun heterodimeric sederhana tanpa mengulangi epitop. Dalam rangka membentuk mengikat Sandwich sukses, reagen harus
mengakui bagian yang berbeda dari toksin.

Evaluasi respon dosis D12f-L10-RZ-QD dilakukan, melihat sinyal yang dihasilkan oleh pengenceran dari sdAb-RZ- qds pada
permukaan risin ditangkap. Tiga antibodi anti-risin (mAb 5F4, H1W dan D12f) terkena 100 nM risin; panel kiri Gambar. 5
menunjukkan bahwa untuk masing-masing tiga reagen capture, sinyal yang dihasilkan dengan menerapkan risin adalah kira-kira
setara melintasi 6 jalur. Menerapkan serangkaian pengenceran dari sdAb-RZ-qds menunjukkan (Gbr. 5 sisi kanan) dosis-
tergantung pada tingkat seperti yang diharapkan untuk analit khas. Seperti sebelumnya tidak ada mengikat diamati dengan D12f
capture reagen.

Gambar. 6 menunjukkan perbandingan DHLA capped qds dilapisi dengan C8, sebuah sdAb sangat homolog untuk D12f,
melalui tag his diperpanjang dan konjugat sdAb-RZ-QD siap untuk pekerjaan ini. SPR mengikat studi yang memanfaatkan sdAb-
qds memungkinkan kita untuk membandingkan pada tingkat; karena ini adalah sistem multi-valent, pada tingkat yang relatif1).;

qds kami saat ini ditampilkan lebih cepat pada tingkat mengikat kinetika oleh $ 3,1 kali dari yang digunakan sebelumnya (Tabel
dengan demikian, konsentrasi setidaknya 3 kali lipat lebih rendah dari qds saat ini dapat digunakan. Ini adalah keuntungan
berguna ketika berhadapan dengan reagen mahal qds tersebut. Ara. 6 juga menunjukkan perbandingan amplifikasi diamati, yang
sebelumnya lebih besar dari 2 kali lipat diperoleh versus peningkatan kurang dari 1 kali lipat dilihat dengan qds kami saat ini.
Tidak jelas, mengapa bioconjugates QD ini memberikan sedikit amplifikasi, meskipun mereka muncul

Gambar. 7. fluoroimuno, memanfaatkan reagen sdAb-RZ-QD untuk mendeteksi risin. In these assays, a capture antibody was
adsorbed onto wells and exposed to dilutions of ricin. Excess toxin was washed and then the sdAb-RZ-QD reagent allowed to
bind to captured ricin. Finally wells were washed and fluorescence measured from each well at 545 nm (300 nm excitation). Dark
brown circles represent signal generated by a sandwich assay with capture monoclonal antibody 5F4. Light brown triangles are
the signal in the absence of capture antibody and represent a combination of non-specific binding by both the ricin antigen and
the fluorescent sdAb-RZ-QD tracer. Ricin concentrations are given in nM; for reference 100 nM ricin $6 mg/mL. Each ricin
concentration was assayed in triplicate, the average value is plotted; error bars represent the standard deviation.

JL Liu et al. / Biotechnology Reports 10 (2016) 5665 63

Fig. 6. Comparison of DHLA capped QDs prepared coated with the anti-ricin sdAb C8 via its His-tag (left panel) [20] with the
current Bt-QDs conjugated with D12f-L10-RZ (right panel). For both sets of data ricin at various concentration was captured via
mAb 5F4 immobilized on the surface of the SPR sensor chip (top panels). The DHLA-QDs gave an amplification >3-fold ricin
alone, however the Bt-QDs appear to have a superior on rate >2-fold.

just as active as the previously utilized QDs. Previously we had also observed less amplification when examining sdAb-QD
conjugates prepared utilizing commercial streptavidin coated QDs [20]; potentially the ligands used to make the QDs
biocompatible are a factor in amplification. While the greater thickness of Bt-PEG layer on the QDs, as well as the increased
thickness of the sdAb-RZ conjugate, increase the distance of the QDs from the surface, additional experimentation is required to
determine if this change

was responsible for the reduced amplification. The D12f-L10-RZ- QDs bound with high specificity, as no binding to ricin that
had been captured using covalently immobilized D12f-sdAb was observed. SPR testing of QD bioconjugates, however, was
envisioned more as a means to evaluate the nature of the QD bioconjugates rather than as a method for SPR amplification.
Alternatives such as gold nanoparticles are likely superior for that application [39].

3.5. Fluroimmunoassays utilizing sdAb-RZ-QDs

We had previously shown that sdAbs directionally conjugated to DHLA-capped CdSeZnS coreshell QDs could be
successfully utilized in fluoroimmunoassays for the detection of ricin [20]. Ara. 7 shows a fluoroimmunoassay utilizing the sdAb-
RZ-QD reagent for ricin detection. Examination of binding to wells that had no capture antibody show non-specific binding only
at the highest ricin concentration; this signal is likely due to non-specific binding of the ricin toxin, as there was no binding of the
sdAb-RZ- QD reagent to similar wells having lower amounts of ricin. Using the sdAb-RZ-QD reporter reagent, detection of ricin
was essentially identical to what we had observed previously using sdAbs conjugated to QDs through an extended His tail as the
reporter and the same monoclonal antibody as a capture [20]. In both cases we demonstrated detection of toxin down to $0.16 nM
($10 ng/mL). These sdAb-RZ reagents should enable oriented immobilization on any biotinylated surface, including commercial
preparations of biotinylated QDs.

4. Conclusions

This work detailed the production and characterization of sdAb- RZ fusions with a generic Gly-Ser linker in place of the hinge
region as well as RZh (RZ with a His tag). The proteins produced well (at least 10 mg/L), and were fully functional, with both the
RZ portion showing binding to biotin, and the sdAb portion of the fusions recognizing ricin. The focus however was
demonstrating the bioconjugation of sdAb-RZ to Bt QDs. The antigen recognition function was provided by a previously
described high-affinity ricin binding sdAb. The advantages of QD bioconjugation using a sdAb- RZ fusion include the ability to
prepare a wide range of sdAb-RZ fusions that can be conjugated to stable bio-compatible biotin coated QDs as desired. The
dimeric nature of RZ makes the attachment bivalent and thus makes for an extremely stable noncolavent interaction. Just as
important, the sdAb-RZ coats the BT-QDs in an oriented manner, providing a highly active surface. As the RZ monomer is of
similar size as an sdAb molecule, they pack efficiently onto the surface of the QD. This format provides a useful alternative to
preparation of streptavidin-QDs that are coated with biotin tagged ligands. The use of sdAb-RZ to bioconjuagate QDs or any
biotinylated nano or microparticle hold great promise as diagnostic and imaging reagents as well as for detection applications.

Acknowledgements
 Funding for this project was provided by the Defense Threat Reduction AgencyCBCALL12-DIAGB5-2-0037 and
CBCALL12-LS6- 2-0036. Other support for this work was provided by ONR/NRL 6.1 and 6.2 Base funds. KBT was an
American Society for Engineering Education postdoctoral fellow.

64 JL Liu et al. / Biotechnology Reports 10 (2016) 5665

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data associated with this article can be found, in the online version, at
http://dx.doi.org/10.1016/j.btre.2016.03.001.

References

[1] L. Eyer, K. Hruska, Single-domain antibody fragments derived from heavy-

chain antibodies: a review, Vet. Med. 57 (2012) 439513. [2] A. de Marco, Biotechnological applications of recombinant
single-domain

antibody fragments, Microb. Cell Fact. 10 (2011). [3] J. Wesolowski, V. Alzogaray, J. Reyelt, M. Unger, K. Juarez, M. Urrutia,
A.

Cauerhff, W. Danquah, B. Rissiek, F. Scheuplein, N. Schwarz, S. Adriouch, O. Boyer, M. Seman, A. Licea, DV Serreze, FA
Goldbaum, F. Haag, F. Koch-Nolte, Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and
immunity, Med. Microbiol. Immunol. 198 (2009) 157174. [4] S. Muyldermans, Nanobodies: natural single-domain antibodies,
Annu. Rev.

Biochem. 82 (2013) 775797. [5] SA Walper, SR Battle, PAB Lee, D. Zabetakis, KB Turner, PE Buckley, AM

Calm, HS Welsh, CR Warner, MA Zacharko, ER Goldman, GP Anderson, Thermostable single domain antibody-maltose binding
protein fusion for Bacillus anthracis spore protein BclA detection, Anal. Biochem. 447 (2014) 64 73. [6] LJ Sherwood, LE
Osborn, R. Carrion, JL Patterson, A. Hayhurst, Rapid

assembly of sensitive antigen-capture assays for Marburg virus using in vitro selection of llama single-domain antibodies, at
biosafety level 4, J. Infect. Dis. 196 (2007) S213S219. [7] ER Goldman, PA Brozozog-Lee, D. Zabetakis, KB Turner, SA
Walper, JL Liu, GP Anderson, Negative tail fusions can improve ruggedness of single domain antibodies, Protein Expr. Purif. 95
(2014) 226232. [8] G. Hussack, Y. Luo, L. Veldhuis, JC Hall, J. Tanha, R. MacKenzie, Multivalent

anchoring and oriented display of single-domain antibodies on cellulose, Sensors 9 (2009) 53515367. [9] LJ Sherwood, A.
Hayhurst, Hapten mediated display and pairing of

recombinant antibodies accelerates assay assembly for biothreat countermeasures, Sci. Rep. 2 (2012). [10] JL Liu, D. Zabetakis,
SA Walper, ER Goldman, GP Anderson, Bioconjugates of rhizavidin with single domain antibodies as bifunctional
immunoreagents, J. Immunol. Methods 411 (2014) 3742. [11] SA Walper, PA Brozozog Lee, ER Goldman, GP Anderson,
Comparison of single domain antibody immobilization strategies evaluated by surface plasmon resonance, J. Immunol. Methods
388 (2013) 6877. [12] M. Pleschberger, D. Saerens, S. Weigert, UB Sleytr, S. Muyldermans, M. Sara, E.

M. Egelseer, An S-layer heavy chain camel antibody fusion protein for generation of a nanopatterned sensing layer to detect the
prostate-specific antigen by surface plasmon resonance technology, Bioconjug. Chem. 15 (2004) 664671. [13] SH
Helppolainen, KP Nurminen, JAE Maatta, KK Halling, JP Slotte, T.
Huhtala, T. Liimatainen, S. Yla-Herttuala, KJ Airenne, A. Narvanen, J. Janis, P. Vainiotalo, J. Valjakka, MS Kulomaa, HR
Nordlund, Rhizavidin from Rhizohium etli: the first natural dimer in the avidin protein family, Biochem. J. 405 (2007) 397405.
[14] A. Meir, SH Helppolainen, E. Podoly, HR Nordlund, VP Hytonen, JA Maatta, M. Wilchek, EA Bayer, MS Kulomaa, O.
Livnah, Crystal structure of rhizavidin: insights into the enigmatic high-affinity interaction of an innate biotin- binding protein
dimer, J. Mol. Biol. 386 (2009) 379390. [15] E. Petryayeva, WR Algar, IL Medintz, Quantum dots in bioanalysis: a review

of applications across various platforms for fluorescence spectroscopy and imaging, Appl. Spectrosc. 67 (2013) 215252. [16]
WR Algar, H. Kim, IL Medintz, N. Hildebrandt, Emerging non-traditional Forster resonance energy transfer configurations with
semiconductor quantum dots: investigations and applications, Coord. Chem. Rev. 263 (2014) 6585. [17] KB Gemmill, JR
Deschamps, JB Delehanty, K. Susumu, MH Stewart, RH

Glaven, GP Anderson, ER Goldman, AL Huston, IL Medintz, Optimizing protein coordination to quantum dots with designer
peptidyl linkers, Bioconjug. Chem. 24 (2013) 269281. [18] A. Sukhanova, K. Even-Desrumeaux, A. Kisserli, T. Tabary, B.
Reveil, JM Millot, P. Chames, D. Baty, M. Artemyev, V. Oleinikov, M. Pluot, JHM Cohen, I. Nabiev, Oriented conjugates of
single-domain antibodies and quantum dots: toward a new generation of ultrasmall diagnostic nanoprobes, Nanomed.
Nanotechnol. Biol. Med. 8 (2012) 516525. [19] D. Fatehi, TN Baral, A. Abulrob, In vivo imaging of brain cancer using

epidermal growth factor single domain antibody bioconjugated to near- Infrared quantum dots, J. Nanosci. Nanotechnol. 14
(2014) 53555362. [20] GP Anderson, RH Glaven, WR Algar, K. Susumu, MH Stewart, IL Medintz, ER Goldman, Single
domain antibody-quantum dot conjugates for ricin detection by both fluoroimmunoassay and surface plasmon resonance, Anal.
Chim. Acta 786 (2013) 132138. [21] KD Wegner, S. Linden, ZW Jin, TL Jennings, R. el Khoulati, P. Henegouwen, N.

Hildebrandt, Nanobodies and nanocrystals: highly sensitive quantum dot- based homogeneous FRET immunoassay for serum-
based EGFR detection, Small 10 (2014) 734740.

[22] MB Zaman, TN Baral, J. Zhang, D. Whitfield, K. Yu, Single-domain antibody functionalized CdSe/ZnS quantum dots for
cellular imaging of cancer cells, J. Phys. Chem. C 113 (2009) 496499. [23] MB Zaman, TN Baral, ZJ Jakubek, J. Zhang, X. Wu,
E. Lai, D. Whitfield, K. Yu,

Single-domain antibody bioconjugated near-IR quantum dots for targeted cellular imaging of pancreatic cancer, J. Nanosci.
Nanotechnol. 11 (2011) 3757 3763. [24] JB Blanco-Canosa, M. Wu, K. Susumu, E. Petryayeva, TL Jennings, PE Dawson,

WR Algar, IL Medintz, Recent progress in the bioconjugation of quantum dots, Coord. Chem. Rev. 263 (2014) 101137. [25] BC
Mei, K. Susumu, IL Medintz, JB Delehanty, TJ Mountziaris, H. Mattoussi, Modular poly(ethylene glycol) ligands for
biocompatible semiconductor and gold nanocrystals with extended pH and ionic stability, J. Mater. Chem. 18 (2008) 49494958.
[26] V. Dona, M. Urrutia, M. Bayardo, V. Alzogaray, FA Goldbaum, FG Chirdo,

Single domain antibodies are specially suited for quantitative determination of gliadins under denaturing conditions, J. Agric.
Makanan Chem. 58 (2010) 918926. [27] MM Harmsen, CB van Solt, AMV van Bemmel, TA Niewold, FG van

Zijderveld, Selection and optimization of proteolytically stable llama single- domain antibody fragments for oral immunotherapy,
Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2006) 544551. [28] V. Alzogaray, W. Danquah, A. Aguirre, M. Urrutia, P. Berguer, EG
Vescovi, F.

Haag, F. Koch-Nolte, FA Goldbaum, Single-domain llama antibodies as specific intracellular inhibitors of SpvB, the actin ADP-
ribosylating toxin of Salmonella typhimurium, FASEB J. 25 (2011) 526534. [29] K. Susumu, HT Uyeda, IL Medintz, H.
Mattoussi, Design of biotin-

functionalized luminescent quantum dots, J. Biomed. Biotechnol. (2007), doi: http://dx.doi.org/10.1155/2007/90651. [30] K.
Susumu, HT Uyeda, IL Medintz, T. Pons, JB Delehanty, H. Mattoussi,
Enhancing the stability and biological functionalities of quantum dots via compact multifunctional ligands, J. Am. Chem. Soc.
129 (2007) 1398713996 Article ID 90651 7 pages.

JL Liu et al. / Biotechnology Reports 10 (2016) 5665 65

[31] YV Kozlov, OY Sudarkina, AG Kurmanova, Ribosome-inactivating lectins of

plants, Mol. Biol. 40 (2006) 711723. [32] KB Turner, JL Liu, D. Zabetakis, AB Lee, GP Anderson, ER Goldman,

Improving the biophysical properties of anti-ricin single-domain antibodies, Biotechnol. Rep. 6 (2015) 2735. [33] M. Raphael,
J. Christodoulides, J. Byers, G. Anderson, J. Liu, K. Turner, E.

Goldman, J. Delehanty, Optimizing nanoplasmonic biosensor sensitivity with orientated single domain antibodies, Plasmonics
(2015) 17. [34] P. Riggs, Expression and purification of recombinant proteins by fusion to

maltose-binding protein, Mol. Biotechnol. 15 (2000) 5163. [35] G. Georgiou, L. Segatori, Preparative expression of secreted
proteins in

bacteria: status report and future prospects, Curr. Opin. Biotechnol. 16 (2005) 538545. [36] K. Susumu, E. Oh, JB Delehanty, F.
Pinaud, KB Gemmill, S. Walper, J. Breger, MJ Schroeder, MH Stewart, V. Jain, CM Whitaker, AL Huston, IL Medintz, A new
family of pyridine-appended multidentate polymers as hydrophilic surface ligands for preparing stable biocompatible quantum
dots, Chem. Mater. 26 (2014) 53275344. [37] KB Turner, D. Zabetakis, PM Legler, ER Goldman, GP Anderson, Isolation

and epitope mapping of staphylococcal enterotoxin B single-domain antibodies, Sensors 14 (2014) 1084610863. [38] M. Zhu,
R. Luo, D. Shezifi, S. Nimri, A novel biotinylated ligand capture method

with surface regeneration capability for label-free biomolecular interaction analysis, Bioradiations (February(12)) (2013)
Protocols and tips. [39] S. Szunerits, J. Spadavecchia, R. Boukherroub, Surface plasmon resonance:

signal amplification using colloidal gold nanoparticles for enhanced sensitivity, Rev. Anal. Chem. 33 (2014) 153164. [40] J.
George, JR Compton, DH Leary, MA Olson, PM Legler, Structural and mutational analysis of a monomeric and dimeric form of
a single domain antibody with implications for protein misfolding, Proteins 82 (2014) 3101 3116.