3.

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de

estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual finalmente las separa
por tamaos moleculares y carga elctrica, dependiendo de la tcnica que se use.

La tcnica clsica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un
electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depsitos independientes que contienen
ambos al electrolito y estn unidos a los electrodos del generador de corriente. La
muestra se deposita en forma de un pequeo trazo transversal en la tira. La distancia de
migracin se mide en relacin un marcador interno. Las placas son reveladas con sales
de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular.

Fundamentos y Conceptos Bsicos

La electroforesis capilar (CE) es una tcnica de separacin que se ha desarrollado gracias

a los avances de la cromatografa lquida de alta eficacia junto con los procedimientos
ms tradicionales de electroforesis. Esta tcnica permite separar bastante bien
biomolculas, donde la cromatografa lquida se muestra menos eficaz, y compuestos de
pequea masa molecular, difciles de estudiar por los procedimientos clsicos de
electromigracin en soporte.
La electroforesis capilar constituye una adaptacin particular de la tcnica de
electroforesis. Esta tcnica separativa se basa en la migracin de las especies de la
muestra en disolucin, portadora de una carga elctrica global, bajo el efecto de un
campo elctrico y en contacto con un soporte (medio de desplazamiento) adecuado.

En electroforesis capilar la tira se reemplaza por un tubo capilar abierto en sus extremos,
fabricado con un dimetro pequeo (15 a 150m). El capilar oscila entre 20 y 80cm, y
est lleno de una solucin buffer. Un detector se encuentra ubicado en un extremo del
capilar, cerca del compartimiento catdico. La seal obtenida es la base de la obtencin
del electroferograma, que muestra el registro de la composicin de la muestra. Solo las
especies que se dirigen hacia el ctodo sern detectadas.

Mtodos de Deteccin

En la deteccin UV-Vis se mide la intensidad de la luz que pasa a travs del capilar en
una pequea zona en la que se ha eliminado el revestimiento opaco.
La deteccin por fluorescencia resulta ms sensible si se emplea una fuente lser muy
intensa, asociada a menudo a un procedimiento de preformacin de derivados de los
analitos portadores de un fluorforo.

Tcnicas Electroforticas

Electroforesis capilar en zona o en disolucin libre (CZE)

Es el procedimiento de electroforesis ms habitual, en el cual el capilar es recorrido por el
electrolito a travs de un medio buffer que puede ser cido (fosfato o citrato), bsico
(borato), o anftero (carcter cido y bsico). El flujo electroosmtico crece con el pH del
medio electrofortico.
Electroforesis capilar electrocintica micelar (MEKC)
En esta variante del procedimiento anterior se aade a la fase mvil un compuesto
catinico o aninico para formar micelas cargadas. Estas pequesimas gotitas
inmiscibles con la disolucin retienen a los compuestos neutros de un modo ms o menos
eficaz, por afinidad hidrfila- hidrfoba. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para
molculas que tienen tendencia a migrar sin separacin, como es el caso de algunos
enantiomeros.

Electroforesis capilar en gel (CGE)

Esta es la transposicin de la electroforesis en egel de poliacrilamida o de agarosa. El
capilar est relleno con un electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de
filtracin que ralentiza a las grandes molculas y que minimiza los fenmenos de
conveccin o de difusin. Los oligonucletidos, poco frgiles, se pueden separar de este
modo.

Isoelectroenfoque capilar (CIEF)

Esta tcnica, tambin conocida como electroforesis en soporte, consiste en crear un
gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada que contiene un anftero. Cada
compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que su punto isoelctrico (al pI
su carga neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de una presin hidrosttica y
manteniendo el campo elctrico, se desplazan las especies separadas hacia el detector.
Las altas eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten separar pptidos con pI
que apenas difieren entre s 0.02 unidades de pH.

Electrocromatografa Capilar

Este tipo de separacin asocia la electromigracin de los iones, propio de la

electroforesis, y los efectos de separacin entre fases presentes en la cromatografa. La
tcnica consiste en la utilizacin de un capilar relleno con una fase estacionaria, cuyo
papel es doble: acta como material selectivo que debe, por otro lado, participar en la
migracin del electrolito.
El factor de separacin es muy elevado, pero existen un cierto nmero de problemas que
limitan su aplicacin, como el efecto de los modificadores orgnicos sobre el flujo
electroosmtico y la dificultad de un control preciso del volumen de muestra introducido en
el capilar.

4. Fundamentos y Tipos de ELISAs.

El ELISA se basa e el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma
que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al
estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e
insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo
quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un
substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o
cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro.

ELISA Directo.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para
eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los
anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado.
Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
 Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA Indirecto.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos
objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o
no fijados.
Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn
especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan
con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se
encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

Pasos generales de un ELISA.

1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo.

2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos.
3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el
pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no unido
5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adicin del substrato
9. Unin del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color

ELISA Sndwich DAS (Double Antibody Sandwich).

Consta de las siguientes etapas:
 Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no
fijados.
Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.),
de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno),
reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no
fijados.
Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un
eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte)
conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos
con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado
para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA Sndwich HADAS.

Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no
fijados.
Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.),
de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno),
reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no
fijados.
Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un
eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los
cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que
se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos
que no hayan reaccionado.
Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos
empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA Competitivo.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no
fijados.
Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo
utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos
desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, aadir nicamente antgenos
 del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para
eliminar los antgenos que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y
comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el
antgeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para
tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el
antgeno objeto de estudio, est relacionado serolgicamente con el anticuerpo
empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad ptica, es
proporcional a la concentracin del antgeno problema en la muestra.

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos:
ELISAs para detectar antgenos: ELISAs sndwich.
ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos.

La fase slida debe ser de un tipo que permita un fcil manejo (especialmente en los
procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unin de antgenos o anticuerpos
sobre su superficie. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350L son
especialmente ventajosas para procesar un elevado nmero de muestras y un vez
tapizadas, el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que
se mantenga seco y a baja temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de
poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estriles y con o sin tapa.

Microplacas de poliestireno de 96 pocillos

Las tcnicas de ELISA se realizan mediante la adicin secuencial de todos los

reactivos necesarios separados por etapas de lavado. Cada una de las operaciones
puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la
automatizacin de todas y cada una de las etapas. Esta completa automatizacin se
justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nmero de muestras y
necesitar una elevada repetibilidad de resultados.
Adsorcin de antgenos y anticuerpos (tapizado).
Los mtodos empleados son dos fundamentalmente:
Dilucin del antgeno o anticuerpo en tampn carbonato (pH 9,6) e incubacin
posterior durante 3h a 37C o 16h a 4C.
Tratamiento a 40-50C en tampn fosfato (PBS) o en agua fisiolgica tamponada pH
7,2-7,4 hasta desecacin.
Solucin de lavado.
Solucin salina con Tween 20 como agente tensioactivo:
ClNa ................................................... 8,5gr
Tween 20 ........................................... 0,5mL
Agua destilada .................................... 1000mL
Conjugados.
La enzima escogida como marcador debe unirse fcilmente a antgenos y
anticuerpos, encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato
cromognico o fluorognico conveniente y de fcil preparacin. Las enzimas ms
utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa de rbano y -galactosidasa; a
continuacin se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una as
como los substratos que se emplean con cada una de ellas.

Referencia

Castellan, G. Fisicoqumica, 2 ed. Mxico, Pearson-Adisson Wesley. 2010 Pgs.

461-462
Rouessac, F. Anlisis Qumico: Mtodos y Tcnicas Instrumentales Modernas.
Espaa, McGraw Hill. 2003Pgs. 121-133
Nelson, D. Lehninger Principios de Bioqumica, 3 ed. Espaa, Omega. (2001) Pgs.
123- 125
Qumica Orgnica Aminocidos: Punto isoelctrico en
http://www.quimica organica.net/quimica-organica/aminoacidos/ph-
isoelectrico/aminoacidos-pH-isoelectrico.htm revisado el viernes 19 de septiembre de
2008.
Pontfica Universidad Javeriana Electroforesis en
http://www.javeriana.edu.co. 2008
/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electroforesis.html revisado el
sbado 20 de septiembre de 2008.