Anda di halaman 1dari 8

Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Jumat /26 Mei 2016

Biokimia Waktu: 13.00- 17.00 WIB


PJP : Ukhradiya M. Safira P, Msi
Asisten : Bayu Cakra Buana
Rizki Rinda Sari

ISOLASI DNA
Kelompok 4, P-1
Dwiky Ramadhan J3P115009
Ratu Nurendah J3P115015
Andri J3P115025
Anggita Dwi Candra J3P115027
Febby Rhoma Safitry J3P115029

PROGRAM KEAHLIAN PARAMEDIK VETERINER


DIREKTORAT PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2016
PENDAHULUAN

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah molekul utama yang dapat mengkode semua
informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Corkill, G.,
Rapley, R. 2008). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa
nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. Molekul DNA ini terikat
membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang
menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double
helix), dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam
pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan
nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel
makhluk hidup dan disebut sebagai cetak biru kehidupan karena molekul ini berperan
penting sebagai pembawa informasi hereditas yang dapat menentukan struktur protein dan
proses metabolisme lain (Corkill, G., Rapley, R. 2008).

Gambar 1 struktur DNA

Kromosom adalah struktur seperti benang yang terletak di dalam inti sel hewan dan
tumbuhan. Setiap kromosom terbuat dari protein dan molekul tunggal dari DNA. DNA dapat
mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi (Zubaidah. 2004).
Isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel,
pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat
dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat
memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida
dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Semakin tinggi kadar air
maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang
terpretisipasi juga akan sedikit.
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan, DNA juga berfungsi dalam
membawa informasi genetic, membentuk RNA, dan mengontrol aktivitas sel baik secara
langsung maupun tidak langsung. DNA juga berperan penting dalam proses sintesis protein.
DNA terdapat di nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Ada perbedaan di antara ketiga lokasi
DNA ini, yaitu: DNA nukleus berbentuk linear dan berhubungan sangat erat dengan protein
histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berhubungan
dengan protein histon. DNA memiliki struktur helix utas ganda, yang mengandung
komponen-komponen gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Satu sel
memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan akan diturunkan pada keturunannya.
Isolasi DNA merupakan tahap awal dalam proses identifikasi DNA. Proses isolasi DNA
diawali dengan ekstraksi DNA, hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel
lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati agar tidak
menyebabkan kerusakan pada dinding sel, membran plasma, dan membran inti baik dengan
cara mekanik atau secara kmiawi. Cara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau
penggerusan menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan
dengan pemberian bahan atau zat yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah
satunya adalah detergen. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus
dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 260 nm
dan panjang gelombang 280 nm. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnin terhadap
kontaminasi protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang
gelombang tersebut. Praktikum ini bertujuan menunjukkan sifat dan struktur DNA
kromosom melalui proses isolasinya.

BAHAN dan METODE

Alat dan Bahan

Alat alat yang digunakan pada praktikum ini antara lain, neraca analitik, mortar,
sudip, corong, pipet mohr, pipet mikro, penangas air, pipet tetes, gelas beaker, tabung reaksi,
gegep, tabung appendorf, spektrofotometer, sentrifuge, pisau.
Bahan bahan yang digunakan pada praktikum ini antara lain, bawang merah, aquades,
tris HCl, sodium dadesil sulfat (SDS), ETDA, larutan lisis, buffer ET, NaCl, etanol dingin,
Kristal protease, es batu.

Metode Kerja

Umbi bawang merah dipotong sebanyak 50 gram dan dimasukkan kedalam mortar,
kemudian ditambahkan 80 ml larutan lisis dan 3 gram NaCl, kemudian digerus sampai halus
diatas es. Setelah umbi bawang halus, ditambahkan dengan 10 ml larutan SDS 10% dan
kemudian dituang kedalam tabung reaksi. Tabung reaksi yang berisi bahan kemudian
diinkubasi pada penangas air bersuhu 60oC selama 20 menit. Hasil inkubasi disaring kedalam
tabung reaksi lainnya dengan menggunakan kertas saring dan corong, penyaringan dilakukan
diatas es agar larutan segera menjadi dingin. Setelah larutan dingin, kemudian ditambahkan
dengan 1 gram Kristal protease, kemudian larutan diaduk hingga merata dan didiamkan
selama 15 menit. Larutan dibiarkan selama 5 menit, lapisan paling atas larutan diambil
dengan menggunakan pipet mikro , kemudian dipindahkan didalam 2 buah pipet baru.
Ditambahkan 20 ml etanol dingin melalui dinding tabung, tabung diletakkan secara perlahan
diatas es dan didiamkan selama 2-5 menit. Setelah DNA tampak mengendap, kemudian
diambil secara hati hati dengan sesedikit mungkin etanol yang terikut, DNA kemudian
dipindahkan didalam tabung appendorf 1,5 ml. tabung appendorf yang berisi DNA kemudian
disentrifuge selama 1 menit (padakecepatan 13000 rpm). Etanol yang berada pada lapisan
atas, dibuang dengan hati hati. Setelah itu DNA yang berada ditabung appendorf
dikeringkan dengan cara dibuka tutup tabungnya selama 5 menit. Setelah kering. DNA
ditambahkan dengan 1 ml buffer TE untuk melarutkan DNA. Absorbansi larutan DNA diukur
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tablel hasil percobaan

Sample A260 A280 A260 A280 A260/A280


terkoreksi terkoreksi terkoreksi
Blanko -0,6607 -0,6661

Sample -0,6753 -0,6482 -1,022 -0,973 -1,0503

a b c
Keterangan: (a) kromosom DNA yang terbentuk, (b) endapan yang terbentuk setelah
proses sentrifuge, (c) hasil perhitungan spektrofotometer.

Pada praktikum percobaan isolasi DNA bawang merah, dilakukan 2 kali perhitungan
absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer yaitu dengan blanko dan sampel yang
telah dibuat. Pada perhitungan absorbansi pada blanko dengan panjang gelombang 260 nm
dan 280 nm didapatkan angka yaitu -0,6607 dan -0,6661. Sedangkan untuk sampel yang
dibuat pada saat perhitungan nilai absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer
didapatkan angka yaitu -0,6753 dan -0,6482. Hasil percobaan yang telah dilakukan tidak
sesuai dengan literature yang ada, hal ini dikarenakan spectrometer merupakan alat yang
digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel secara kuantitatif berdasarkan interaksi materi
dengan cahaya. Cahaya akan diserap oleh materi akan terukur sebagai transmitans ataupun
absorbans, sehingga perhitungan terkecil atau paling kecil dari alat spektrofotometer adalah
angka0. Hasil percobaan yang menunjukkan hasil negative tidak sesuai dengan literature,
kesalahan yang terjadi pada percobaan ini sehingga menyebabkan hasil yang diperoleh
negative adalah karena larutan atau sampel yang dimasukkan kedalam kuvet
spektrofotometer terlalu dingin (karena direndam didalam air es) yang menyebabkan
permukaan kaca kuvet menjadi berembun sehingga pembacaan pada spektrofotometer
menjadi tidak jelas.
Selain pengukuran absorbansi larutan, penghitungan dengan alat spektrofotometer ini
juga dapat digunakan untuk mengetahui tingkat kemurnian sampel DNA yang telah dibuat.
Untuk membuktikan tingkat kemurnian sampel dapat diketahui dari hasil pengukuran
absorbansi dengan 260 nm dan 280 nm. Panjang gelombang 260 nm sebenarnya ditujukan
untuk mengukur kandungan DNA dan RNA didalam sampel sedangkan untuk panjang
gelombang 280 nm, ditujukan untuk mengukur kadar protein didalam sampel. DNA murni
atau yang mendekati murni memiliki rentang nilai 1,8 2,0 sehingga untuk mengetahui
kemurnian sampel yang telah dibuat, dapat dilakukan dengan cara melihat hasil dari
pengukuran absorbansi, jika nilai pengukuran dibawah nilai rentang tersebut, maka DNA
terkontaminasi oleh protein. Namun jika nilai pengukuran menunjukkan hasil diatas nilai
rentang, maka DNA terkontaminasi oleh RNA. Sampel hasil dari percobaan yang telah
dilakukan menunjukkan bahwa DNA terkontaminasi oleh protein. Hal ini dapat diketahui
karena nilai yang dihasilkan dari pengukuran absorbansi menunjukkan nilai dibawah nilai
rentang DNA murni yaitu 1,8 2,0.
Pada percobaan isolasi DNA ini, untuk menghasilkan hasil yang sesuai dibutuhkan
berbagai larutan atau reagen yang membantu dalam pembuatan sampel untuk uji ini. Ada
berbagai reagen yang diperlukan dalam percobaan isolasi DNA dan masing masing
memiliki fungsi tertentu. Reagen reagen tersebut adalah larutan lisis yang mengandung 50
mM tris HCl ph 8,0 dan 50 mM EDTA yang berfungsi untuk melisiskan dinding sel. (SDS)
berfungsi mengurangi aktivitas enzim nuclease yang merupakan enzim pendegradasi DNA.
EDTA berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ penting untuk mempertahankan keseluruhan
struktur sel serta menghambat enzim enzim seluler yang dapat merusak DNA ( ion Mg 2+
merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang biasa memakan DNA). Garam NaCl
berfungsi untuk menghilangkan protein dan karbohidrat (polisakarida) karena garam dapat
menyebabkan keduanya terpresipitasi.selain itu garam juga berfungsi untuk melarutkan DNA
karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membuat ikata) dengan
kutub negative fosfat DNA yaitu kutub yang bias menyebabkan molekul molekul saling tolak
menolak satu sama lain sehingga ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negative fosfat
DNA, DNA akan terkumpul dan juga membantu dalam proses pemekatan DNA. Alcohol
dingin berfungsi untuk pengikatan strand DNA yang telah terkumpul karena pemekatan oleh
garam karena kerapatan alcohol lebih kecil dibandingkan dengan kerapatan air,maka alcohol
akan berada diatas larutan pada tabung reaksi. Strand- strand DNA yang terikat oleh alcohol
akan tampak sebagai benang benang berwarna putih yang terapung diatas filtrate. Dengan
kata lain fenol atau alcohol berfungsi untuk mendenaturasi protein yang menyebabkan
ektraksi mengalami presopitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui
sentifugasi. Buffer TE yang terdiri dari 10 Mm tris HCl ph 8,0 dan 0,1 Mm EDTA ph 8,0
berfungsi untuk memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah
disbanding DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA.
Selain penggunaan reagen reagen untuk membantu dalam pembuatan sampel, pada
percobaan isolasi DNA ini juga dilakukan dengan bantuan alat spektrofotometer yang
berfungsi untuk mengukur absorbansi sampel yang telah dibuat. Pada spektrofotometer ini
panjang gelombang yang digunakan adalah 260 nm dan 280 nm yang merupakan
spektrofotometri UV. Dalam penggunaannya, biasanya panjang gelombang akan terbaca
sebagai A260 atau A280. Pengertian dari A260 itu sendiri adalah absorbansi atau banyaknya
atau jumlah cahaya atau energi yang diserap oleh partikel partikel dalam larutan dengan
panjang gelombang 260 nm. Sedangkan pengertian dari A280 adalah absorbansi atau
banyaknya cahaya atau energi yang diserap oleh partikel partikel dalam larutan dengan
panjang gelombang 280 nm.
Ada berbagai macam fungsi isolasi DNA didalam bidang veteriner atau ilmu
kesehatan hewan, fungsi tersebut antara lain: isolasi DNA dapat digunakan untuk diagnosa
suatu penyakit yang terjadi pada hewan, untuk mengidentifikasi jenis atau spesies dari seekor
hewan, dapat digunakan untuk rekayasa genetika pada hewan, dapat dimanfaatkan untuk
proses cloning pada hewan.

SIMPULAN

Isolasi DNA merupakan tahap awal dalam proses identifikasi DNA . Isolasi DNA
pada dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding dan membrane sel dan juga
membrane inti. Perusakan ini dapat dilakukan dengan pemblenderan, penggerusan atau yang
lainnya. Namun dalam praktikum kali ini digunakan dengan cara penggerusan. Bahan yang
digunakan untuk menentukkan isolasi DNA adalah umbai bawang merah. DNA ditentukan
dengan menggunakan dua panjang gelombang, yaitu panjang gelombang 260 dan panjang
gelombang 280. Panjang gelombang 260 nm sebenarnya ditujukan untuk mengukur
kandungan DNA dan RNA didalam sampel sedangkan untuk panjang gelombang 280 nm,
ditujukan untuk mengukur kadar protein didalam sampel. DNA murni atau yang mendekati
murni memiliki rentang nilai 1,8 2,0 sehingga untuk mengetahui kemurnian sampel
dilakukan dengan cara melihat hasil dari pengukuran absorbansi. Jika nilai pengukuran
dibawah nilai rentang tersebut, maka DNA terkontaminasi oleh protein. Isolasi DNA juga
dapat berfungsi banyak di dalam bdang veteriner atau ilmu kesehatan hewan, seperti diagnosa
suatu penyakit yang terjadi pada hewan, untuk mengidentifikasi jenis atau spesies dari seekor
hewan, dapat digunakan untuk rekayasa genetika pada hewan, dapat dimanfaatkan untuk
proses cloning pada hewan.

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2002. Molecular Biology
of the Cell. 4 th ed. Garland Science. New York.
Ardiana, D. W. 2009. Teknik isolas DNA genom tanaman pepaya dan jeruk menggunakan
modifikasi buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian. 14 (1): 12-16.
Arhan. 2009. Laporan Pratikum isolasi DNA. Farabee, M.J Cells . 2007. II: Cellular
Organization. Wikibook.
Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and
Techniques. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M.,
Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.Khosravinia, H. 2007. Optimazing Factors
Guyton and Hall. 2007. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Jakarta (ID): EGC.
Harisha, S. 2007. Biotechnology procedures and experiments handbook (An introduction to
biotechnology).Infinity Science Press LLC. Canada : Hingham, MA.
Infuencing DNA Extraction From Fresh Whole
Avian Blood. African Journal of Biotechnology. 6 (4): 481-486.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak
Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Malang (ID):
Universitas Negeri Malang.
Murray, Robert K. 2009. Biokimia Harper. Jakarta (ID): EGC Sahasrabudhe, A. 2010.
Pharmawati. M. 2009. Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada grevillea
spp. (Proteaceae). Junal Biologi. 13 (1): 12-16.
Standardization of DNA extraction and optimization of RAPD-PCR
Conditions in Gracinia Indica. International Journal of Botany. 6 (3) : 293-298.
ISSN : 1811 -97001.
Sadikin, Mohamad. 2002. Biokimia Enzim. Jakarta (ID) : Widya Medika.
Soewoto, Hafiz, dkk. 2000. Biokimia Eksperimen Laboratorium.Jakarta (ID): Widya
Medika.
Solomon, E.P, Berg, L.R, Martin, D.W. 2002. Biology. 6th Ed. Brooks/Cole Thompson
Learning. USA Stryer, L. 1988. Biochemistry. 3rd ed. W.H. Freeman and Company.
New York White.
Suharono dan Widyastut, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen.
Bogor (ID): IPB Press.
Yusminah, Oslan Jumadi. 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta (ID): BambatangHala.
Zainudin Agus, Miftuchah. 2006. Jatropha curcas; DNA isolation; umm. Jurnal Gamma. 2
(1).
Zubaidah, Siti. 2004. Identifikasi, Variasi Genetik, Distribusi. Malang (ID): Program Pasca
Sarjana Universitas Brawijaya.