Anda di halaman 1dari 15

Nama : Rika Anisa A.

NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

BAB VIII
KROMATOGRAFI KOLOM
PRELAB

A. Pre-lab
1.Apa yang dimaksud kromatografi?

Kromatografi diartikan sebagai suatu metode yang digunakan untuk memisahkan


campuran komponen atau fraksi sejenis menjadi unit-unit yang terpisah satu dengan
yang lain yang didasarkan pada perbedaan sifat masing-masing. Komponen-komponen
yang telah dipisahkan akan didistribusikan diantara dua fase, salah satu fase tersebut
ialah fase stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang
mengalir disepanjang landasan stasioner (Wixom, 2010).

2.Jelaskan pengertian fase stasioner dan fase mobil!

Fase stasioner merupakan fase diam atau fase tetap tidak berpindah. Sehingga dapat
dikatakan bahwa partikel padat yang halus hanya melapisi partikel tersebut. Contoh:
lapisan silica pada kromatografi lapis tipis (thin layer chromatography) (Hostettmann
2009).

Fase mobile merupakan fase bergerak atau berpindah pada arah tertentu. Fase ini bisa
suatu cairan (LC and Capillary Electro-chromatography (CEC)), suatu gas (GC), atau
cairan super-kritis (super-critical-fluid chromatography, SFC). Fase mobil terdiri dari
sampel yg dipisahkan dan solven yang menggerakkan sampel sepanjang kolom. Pada
kasus HPLC fase mobil terdiri dari suatu solven (non-polar semisal hexan dalam fase
normal atau solven polar dalam reverse phase chromatography), dan sampel yg
dipisahkan. Fase mobil bergerak sepanjang kolom (fase stationer) dimana sampel
berinteraksi dengan fase stationer dan dipisahkan (Hostettman, 2009).

3.Apa fungsi alumina pada penentuan beta karoten?

Fungsi alumina pada penentuan beta karoten adalah sebagai adsorben polar (fase diam)
yang dapat mengadsorpsi larutan yang bersifat polar. Selain itu juga digunakan untuk
memisahkan senyawa yang bersifat basa karena alumina ini bersifat basa yaitu senyawa
karotenoid selain beta karoten yang akan diikat oleh alumina pada fase diam, dan
betakaroten (non polar) akan larut bersama fase gerak (Noviyanti, 2010).

4. Jelaskan prinsip kromatografi adsorpsi?

Prinsip kromatografi adsorpsi yaitu memisahkan komponen secara selektif berdasarkan


sifat fisik adsorbsi dengan fase stationer berupa adsorben alumina yang mengisi kolom
dan fase mobile PE-aseton dengan perbandingan 10:1. Kecepatan pergerakan suatu
komponen tergantung pada kemampuannya untuk tertahan atau terhambat oleh
penyerap di dalam kolom (Noviyanti, 2010).

5.Apa yang dipisahkan pada proses kromatografi adsorbsi pada penentuan kadar
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

beta karoten?
Pada proses kromatografi adsorbsi pada penentuan kadar beta karoten, senyawa yang
dipisahkan ialah komponen polar dan non polar pada sampel yang mengandung beta
karoten, diantaranya komponen-komponen karetonoid yaitu beta karoten, alfa karoten,
gamma karoten, zeta karoten dan likopen. Beta karoten bersifat non-polar sehingga
digunakan untuk memisahkan dari senyawa menggunakan pelarut heksana, karena
heksana adalah pelarut non polar dan beta karoten pun akan terlarut didalamnya
(Wixom, 2010).
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

C. Tinjauan Pustaka

a. Kromatografi kolom (prinsip disertai gambar)


Prinsip kromatografi ialah pemisahan berdasarkan pada pemisahan daya
adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun
hasil isolasinya serta menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan
komponen-komponen dalam cairan. Pada kromatografi kolom, campuran yang akan
dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap yang berada
dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastik. Pelarut (fasa gerak)
dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau
didorong oleh tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang
berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom
(Campbell, 2012).

(Campbell, 2012).
b. Betakaroten (sumber, fungsi, sifat kepolaran)
-karoten merupakan salah satu pigmen atau zat kimia alami yang berwarna
merah, kuning, hingga jingga yang mengandung antioksidan yang dapat mencegah
penyakit. Beta karoten merupakan senyawa organik, secara kimiawi diklasifikasikan
sebagai hidrokarbon dan secara spesifik diklasifikasikan sebagai terpenoid. Beta
karoten merupakan karotenoid, precursor vitamin A dan sebagai antioksidan. Beta
karoten tidak larut dalam air tetapi larut dalam pelarut non polarSecara alamiah -
karoten banyak terdapat pada buah-buahan seperti wortel, labu merah, buah merah,
semangka, mangga, tomat, melon dan terdapat juga pada cabe. Manfaat beta
karoten ini antara lain menjamin kesehatan mata, memlihara kesehatan kulit,
mempertahankan membran sel, berperan dalam sistem kekebalan tubuh dan
kesehatan tulang, serta membantu pembentukan sel darah merah (Serlahwaty,
2009).
c. Petrolium Eter (sifat kepolaran, fungsi petrolium eter)
Petroleum eter adalah pelarut non polar yang merupakan campuran
hidrokarbon cair yang bersifat mudah menguap. Petroleum eter disini akan
melarutkan senyawa-senyawa yang bersifat kurang polar pada selubung sel dan
dinding sel seperti lemak-lemak, terpenoid, klorofil dan steroid. Petroleum eter
memiliki titik didih 60-80oC dan massa jenis cairan 0,8 gr/cm3. Petroleum eter
berbentuk jernih, berbau khas seperti gasoline, bersifat volatil, dan flammable liquid.
Uapnya dapat membentuk ledakan apabila bercampur dengan udara. Cairan ini
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

menyebabkan iritasi pada mata, kulit, pusing sehingga dalam pemakaiannya harus
hati-hati sehingga tidak terhirup atau tertelan (Yuswantina, 2009).
d. Aseton (sifat kepolaran, fungsi petrolium eter)
Aseton merupakan keton yang paling sederhana, digunakan sebagai pelarut
polar dalam kebanyakan reaksi organik. Aseton dikenal juga sebagai dimetil keton, 2-
propanon, atau propan-2-on. Aseton adalah senyawa berbentuk cairan yang tidak
berwarna dan mudah terbakar, digunakan untuk membuat plastik, serat, obat-obatan,
dan senyawa-senyawa kimia lainnya. Selain dimanufaktur secara industri, aseton
juga dapat ditemukan secara alami, termasuk pada tubuh manusia dalam kandungan
kecil (Day, 2010).
e. Alumina (sifat kepolaran, fungsi petrolium eter)
Aluminium oksida (alumina) adalah senyawa kimia dari aluminium dan oksigen,
dengan rumus kimia Al2O3. Secara alami, alumina terdiri dari mineral korondum, dan
memiiki bentuk kristal. Senyawa ini termasuk dalam kelompok material aplikasi
karena memiliki sifatsifat yang sangat mendukung pemanfaatannya dalam beragam
peruntukan. Senyawa ini diketahui merupakan insulator listrik yang baik, sehingga
digunakan secara luas sebagai bahan isolator suhu tinggi, karena memiliki kapasitas
panas yang besar. Alumina juga dikenal sebagai senyawa berpori sehingga
dimanfaatkan sebagai adsorben. Sifat lain dari alumina yang sangat mendukung
aplikasinya adalah daya tahan terhadap 9 korosi (Mirjalili, et. al., 2011) dan titik lebur
yang tinggi, yakni mencapai 2053- 2072 C (Day, 2010).
f. Total betakaroten pada ubi orange dan wortel
Wortel (Daucus carota L.) adalah tumbuhan jenis sayuran umbi yang
biasanya berwarna kuning kemerahan atau jingga kekuningan dengan tekstur serupa
kayu (Malasari 2005). Wortel merupakan sayuran penting dan paling banyak ditanam
di berbagai tempat. Kegunaan awalnya hanyalah sebagai obat, tetapi sekarang
wortel telah menjadi sayuran utama dan umumnya dikenal karena kandungan - dan
-karotennya. Kedua jenis karoten ini penting dalam gizi manusia sebagai provitamin
A. Selain kandungan provitamin A yang tinggi, wortel juga mengandung vitamin C
dan vitamin B serta mengandung mineral terutama kalsium dan fosfor. Sebuah wortel
ukuran sedang mengandung sekitar 12000 SI betakaroten. Wortel Chantenay 100 g
memiliki kandungan kadar -karoten berkisar 1358,5 mg dan kadar air awal 90,20. -
karoten adalah bentuk provitamin A paling aktif yang terdiri atas 2 molekul retinol
yang saling berkaitan (Cahyono, 2012).
Ubi jalar (Ipomoea batatas L.) terutama yang berdaging umbi warna oranye
atau kuning memiliki potensi unggulan pada kandungan beta karoten (provitamin A)
yang tinggi dan memiliki banyak manfaat bagi tubuh, karena selain mampu
memenuhi kebutuhan vitamin A juga berfungsi sebagai antioksidan untuk melawan
radikal bebas dalam tubuh. Hasil penelitian analisis kandungan -karoten dan vitamin
C yang menggunakan metode spektrofotometer ini yaitu varietas ubi jalar yang
umbinya berwarna oranye memiliki kandungan -karoten paling besar yaitu 0,8001
mg/100 gram. Kandungan -karoten dan vitamin C akan berkurang bahkan sampai
tidak ada sama sekali seiring dengan lamanya waktu penyimpanan yaitu 1 minggu
dan 1 bulan pada suhu 30C. Hal ini dikarenakan sifat -karoten dan vitamin C yang
mudah teroksidasi apabila terkena udara (Wahyuni, 2015).
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

Daftar Pustaka

Cahyono, B. 2012. Wortel Teknik Budidaya dan Analisa Usaha Tani. Yogyakarta: Kanisius.
Campbell, M. 2012. Biochemistry. Stanford: Cengage Learning
Day, R.A. 2010. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga
Hostettmann, K., Marston., A. 2009. Cara Kromatografi Preparatif. Bandung: ITB
Menggunakan Aquapec HV-505. Jakarta: Kongress Ilmiah XV ISFI
Noviyanti, L. 2010. Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom untuk Pemisahan Trigliserida dari
Ekstrak Buah Merah. Surakarta: FMIPA UNS
Serlahwaty, D. 2009. Penetapan Kadar -Karoten Dalam Buah Paprika Merah, Kuning dan
Hijau (Capsicum Annuum Var. Annuum L.) Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
Seminar Nasional Patpi. Jakarta.
Wahyuni, D. 2015. Pengaruh Jenis Pelarut dan Lama Ekstraksi Terhadap Ekstrak Karotenoid
Labu Kuning dengan Metode Gelombang Ultrasonik. Jurnal Pangan dan
Agroindustr. Vol 2 (3): 390-401
Wixom, R. 2010. Chromatography: A Science of Discovery. New Jersey: John Wiley & Sons
Yuswantina, R. 2009. Uji Aktivitas Penangkap Radikal Dari Ekstrak Petroleum Eter, Etil
Asetat Dan Etanol Rhizoma Binahong (Anredera Cordifolia (Tenore) Steen) Dengan
Metode Dpph (2,2-Difenil-1-Pikrihidrazil). Skripsi. Fakultas Farmasi. Universitas
Muhammadiyah Surakarta. Surakarta

Daftar Pustaka Tambahan

Ardianingsih. 2009. Stabilitas Warna Ekstrak Buah Merah (Pandanus conoideus) Terhadap
Pemanasan Sebagai Sumber Potensial Pigmen Alami. Fakultas Teknologi Pertanian,
Universitas Brawijaya. Malang
Mustafa, A., Leire M., dan Charlotta T. 2012. Pressurized Hot Ethanol Extraction of
Carotenoids from Carrot By-Products. Journal Molecule. Vol. 17
Noviyanti, L. 2010. Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom untuk Pemisahan Trigliserida dari
Ekstrak Buah Merah. Surakarta: FMIPA UNS
Nielsen, S. 2010. Food Analysis Laboratory Manual Second Edition. New York: Springer
Putra, E.D.L. 2008. Kromatrografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Artikel Ilmiah.
Medan: USU
Rodriguez, D. B. 2007. A Guide To Carotenoid Analysis In Foods. Washington D.C: ILSI
Press
Sathya, M., Sumanthi, dan John J. 2014. A Simple and Rapid Screening Technique for Grain
Beta Carotene content in Pearl Millet Through Spectrophotometric Method. African
Journal of Agricultural Research. Vol. 9 No. 5
Selby, A. 2007. Makanan Berkhasiat: 25 Makanan Bergizi Super Untuk Kesehatan Prima.
Jakarta: Erlangga
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

Persamaan regresi kurva standar : Tabel Poin + Kurva


Tabel
No. Konsentrasi Absorbansi
1. 0,0004 0.004
2. 0,0008 0,052
3. 0,0012 0,100
4. 0,0016 0,140
5. 0,0020 0,207

Y Y= 123,5x 0,0476
R2 0,9933

Kurva

Kurva standart - katoten


0.25
0.2
f(x) = 123.5x - 0.05
0.15 Absorbansi
R = 0.99
Absorbansi 0.1 Linear (Absorbansi)
0.05
0
00000000000
Konsentrasi

Perhitungan kadar beta karoten dari sampel yang dianalisis :

Y = 123,5x 0,0476
0,279 = 123,5x 0,0476
123,5x = 0,279 0,0476
x = 2,64 x 103

Berat Sampel Absorbansi


3,0006 gram 0,279

Volume dalam labu


Faktor pengenceran=
Volume keluar kolom
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

25
Faktor pengenceran= =20,83
1,2

konsentrasi x FP x volume filtrat x 2


Kadar karoten=
berat sampel

2,64 x 103 x 20,83 x 100 x 2


Kadar karoten=
3,0006

Kadar karoten=1,835 mg/ g

LKP

1 Apa yang menjadi fase stasioner dan fase mobil pada analisis beta karoten dengan
kromatografi kolom?
Senyawa yang menjadi fase stasoner pada analisis beta karoten dengan kromatografi
kolom ialah alumina dan Na2SO4. Pada fase stasioner ini senyawa alumina dan Na 2SO4.
memiliki karakteistik absorbsi yang berbeda dengan senyawa yang akan dipisahkan.
Karakteristik dari senyawa alumina dan Na2SO4 bersifat polar, sedangkan senyawa yang
ingin dipisahkan yaitu beta karoten memiliki sifat non polar sehingga mampu menahan
senyawa campuran dan senyawa yang tidak terlarut dalam fase gerak atau mobile.
Karakteristik dari senyawa alumina dan Na2SO4 bersifat polar, sedangkan senyawa yang
ingin dipisahkan yaitu beta karoten memiliki sifat non polar. Sedangkan yang menjadi
fase mobile ialah petroleum eter-aseton yaitu memilliki absorbsi yang sama dengan
senyawa yang akan dipisahkan yaitu sama-sama bersifat non polar sehingga sehingga
mampu melarutkan senyawa yang akan dipisahkan tersbut. Pada praktikum kal ini
senyawa yang akan dipisahkan ialah beta karoten dan beta karoten memiliki sifat non
polar.

2 Komponen apa yang terelusi pada analisis beta karoten dengan kromatografi
kolom?
Komponen yang terelusi pada analisis beta karoten dengan kromatografi kolom ialah
beta karoten. Hal ini karena beta karoten merupakan senyawa yang akan dipisahkan dan
beta karoten bersifat non polar sehingga beta karoten tersebut akan terelusi atau terikat
dengan senyawa PE-aseton sebagai fase gerak. PE-aseton pun juga memiliki sifat non
polar sehingga dapat mengelusikan senyawa betakaroten. Selain itu, komponen-
komponen lainnya yang bersifat non polar pun juga dapat terelusikan bersama beta
karoten namun jumlahnya tidak banyak.

3 Komponen apa yang teradsorbsi kuat pada adsorben?


Komponen yang teradsorpsi kuat pada absorben adalah komponen yang bersifat polar
karena memiliki sifat kepolaran yang sama dengan absorben. Komponen yang bersifat
polar akan mampu memisahkan senyawa atau komponen yang tidak larut dalam fase
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

gerak dan juga akan memisahkan komponen dari bahan yang akan dipisahkan yaitu beta
karoten yang memiliki sifat non polar.

4 Apakah analsis tersebut dapat memisahkan beta karoten dengan karotenoid lain
seperti alfa dan gama karoten?
Tidak, analisis kromatograf kolom tidak dapat memisahkan beta karoten dengan
karotenoid lainnya seperti alfa dan gamma karoten. Hal ini disebabkan karena prinsip
dari kromatografi kolom itu sendiri ialah memisahkan komponen secara selektif
berdasarkan sifat absorbansi dan kepolaran senyawa tersebut bukan memisahkan beta
karatenoid berdasarkan jenis karatenoid secara spesifik atau berat molekulnya.
Sehingga beta karoten akan terpisah atau terelusi bersama dengan komponen-
komponen lain yang memilikii kepolaran yang sama dengan beta karoten. Sebaiknya
untuk memisahkan beta karoten dengan karotenoid lain seperti alfa dan gama karoten
digunakan metode HPLC dengan detector sseperti Uv-vis yang mampu memisahkan
beta karoten secara spesfik (Nielsen, 2010).

5 Apa fungsi pengukuran kadar beta karoten dalam eluen dengan spektrofotometer?
Fungsi pengukuran kadar beta karoten dalam eluen dengan spektrofotometer ialah
untuk mengetahui nilai absorbansi dari kadar beta karoten. Dengan mengetahui
konsentrasi dari beta karoten tersebut sehingga dapat diketahui kadar dari beta karoten
tersebut dengan rumus perhitungan %beta karoten. Beta karoten akan diukur dengan
spektroforometri berdasarkan intensitas warnanya dengan panjang gelombang 450 nm
sesuai dengan spektrum cahaya yang tampak dari larutan beta karoten yang didapatkan
setelah proses kromatografi kolom.

6 Apa fungsi ekstraksi dengan petroleum eter-aseton?


Fungsi ekstraksi dengan petroleum eter-aseton ialah untuk mengekstrak beta karoten
dalam sampel. Hal ini dikarenakan beta karoten diasumsikan akan berikatan dengan
senyawa lain dengan kemungkinan sifat kepolaran yang tidak terlalu polar namun semi
polar. Sehingga digunakan aseton yang bersifat semi polar dan aseton pun akan
mengekstrak senyawa yang bersifat sama dengan aseton yaitu semi polar.

7 Fraksi apa saja yang terekstrak pada proses ekstraksi tersebut?


Fraksi yang terekstrak pada proses ekstraksi ialah komponen yang bersifat non polar dan
semipolar. Komponen atau fraksi yang bersifat non polar akan akan diekstrak oleh PE,
kemudian fraksi semi polar akan diekstrak oleh aseton.

8 Apa fungsi penambahan akuades pada ekstrak petroleum eter-aseton?


Fungsi penambahan akuades pada ekstrak petroleum eter-aseton ialah untuk mengikat
komponen-komponen yang bersifat polar. Akuades akan memisahkan senyawa yang
memiliki fase polar dan fase non polar. Pada proses ini akuades aakan mengikat
senyawa polar yang kemudian akan dikeluarkan dari kolom agar yang tersisa hanya
senyawa non polar dan senyawa yang akan diukur kadarnya yaitu beta karoten memiliki
senyawa yang bersifat non polar. Sehngga senyawa polar dikeluarkan agar tidak
mengganggu proses ekstraksi beta karoten.
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

9 Fraksi apa yang larut pada aseton-air dan petroleum eter?


Fraksi yang larut dalam aseton-air adalah fraksi yang bersifat polar. Sedangkan fraksi
yang larut dalam petroleum eter ialah fraksi yang bersifat non polar, dalam hal ini ialah
beta karoten

10 Sebutkan beberapa sumber-sumber bahan pangan yang yang tinggi beta karoten?
Beta karoten adalah bentuk provitamin A yang paling aktif. -karoten memiliki sifat kimia
yang mirip dengan vitamin A, yaitu sensitif terhadap oksigen, cahaya, dan lingkungan
asam. Buah dan sayuran yang memiliki warna merah, kuning, dan orange biasanya
memiliki kandungan beta karoten yang tinggi. Beberapa makanan yang mengandung beta
karoten tinggi tersebut ialah blewah, wortel, daun singkong, paprika, nanas, dan pisang
(Selby, 2007).

Prinsip disertai literature dan Rumus

Prinsip dari kromatografi kolom ialah pemisahan komponen secara selektif


berdasarkan sifat adsorbsi senyawa terhadap fase mobile atau fase stasioner yang
digunakan. Fase stasioner merupakan fase diam yang memiliki karakteristik adsorpsi yang
berbeda dengan senyawa yang akan dipisahkan dan berada pada kolom. Pada fase
stasioner, komponen sampel Fase stasioner mampu menahan senyawa campuran yang
tidak diinginkan agar tetap menempel atau tertahan berdasarkan prinsip adsorpsi atau partisi
(Ardianingsih, 2009). Sedangkan fase mobile atau fase gerak merupakan larutan yang
membawa sampel yang akan dilewatkan pada kolom kromatrografi dan normalnya
kepolarannya sama dengan senyawa yang yang akan dipisahkan (Putra, 2008). Rumus-
rumus yang digunakan saat kroatografi kolom ialah
konsentrasi x FP x volume filtrat x 2
Kadar karoten=
berat sampel

Rumus diatas merupakan rumus untuk menentukan kadar dari bera karoten. Sedangkan
rumus yang dibawah merupakan rumus untuk mencari faktor pengencer.
Volume dalam labu
Faktor pengenceran=
Volume keluar kolom

Analisa Prosedur

1. Proses Ekstraksi Betakaroten Dari Sampel


Dalam melakukan ekstraksi betakaroten dari sampel, hal pertama yang perlu
dilakukan ialah persiapan alat-alat dan bahan. Alat-alat yang digunakan ialah mortar dan alu,
gelas ukur, labu ukur 100 ml, timbangan analitik, gelas arloji, spatula, erlenemeyer, shaker,
corong pemisah, kertas saring, penggaris, kolom kromatografi, alumunium foil, dan kapas.
Sedangkan bahan-bahan yang diperlukan ialah sampel yaitu wortel, petroleum eter-aseton
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

(1:1), aquades, alumina, dan Na2SO4. Setelah disiapkan alat-alat dan bahan, maka
selanjutnya dilakukan penghalusan sampel. Sampel wortel dipotong dan kemudian
dihaluskan dengan menggunakan mortar dan alu. Mortar dan alu ialah alat yang digunakan
untuk menumbuk atau menghaluskan bahan kimia yang berbentuk padatan. Mortar
merupakan wadah penumbuk, sedangkan alu merupakan penumbuknya. Wortel tersebut
ditumbuk agar memperluas permukaan sehingga dapat mempercepat suatu reaksi. Setelah
dihaluskan, wortel tersebut ditimbang sebanyak 3 gram menggunakan timbangan analitik di
atas kaca arloji. Kaca arloji terlebih dahulu diletakkan pada timbangan analitik kemudian
dinolkan hal ini bertujuan agar kaca arloji tidak ikut terhitung beratnya. Kemudian barulah
ditimbang sampel sebanyak 3 gram. Setelah itu, sampel dimasukkan ke dalam erlenmeyer
250 ml dan ditambahkan 30 ml petroleum eter-aseton (1:1). Petroleum eter-aseton (1:1)
yang berfungsi untuk memaksimalkan proses ekstraksi beta karoten. Hal ini dikarenakan
beta karoten diasumsikan akan berikatan dengan senyawa lain dengan kemungkinan sifat
kepolaran yang tidak terlalu polar namun semi polar. Sehingga digunakan aseton yang
bersifat semi polar dan aseton pun akan mengekstrak senyawa yang bersifat sama dengan
aseton yaitu semi polar. Setelah ditambahkan PE aseton, larutan segera ditutup dengan
alumunium foil agar reagen tidak menguap. Setelah itu Erlenmeyer berisi sampel diletakkan
pada shaker selama 10 menit dengan kecepatan skala 3 agar sampel dan reagen menjadi
homogen. Shaker untuk menghomogenkan atau mencampur rata reagen dengan sampel.
Setelah dishaker selama 10 menit, didapatkan larutan sampel yang berwarna
kuning.Kemudian dilakukan proses penyaringan menggunakan kertas saring dengan residu
tetap di dalam Erlenmeyer. Apabila filtrate didalam erlenmeyer sudah habis maka
ditambahkan lagi petroleum eter-aseton (1:1) sebanyak 30 ml dan dihomogenkan dengan
shaker selama 10 menit dan kemudian dilakukan proses penyaringan kembali menggunakan
kertas saring. Proses ekstraksi ini dilakukan selama tiga kali dengan cara yang sama yang
bertujuan untuk memaksimalkan proses pelarutan komponen non polar pada sampel.
Kemudian filtrat yang dihasilkan dari proses penyaringan yang terakhir dimasukkan ke dalam
labu ukur 100 ml kemudian ditambahkan petroleum eter-aseton (1:1) hingga tanda batas dan
dihomogenkan. Setelah itu, diambil filtrat sebanyak 50 ml dengan menggunakan gelas ukur
dan dimasukkan ke dalam corong pemisah. Selanjutnya ditambahkan 50 ml aquades ke
dalam corong pemisah lalu ditutup kran dan penutup corong pemisahnya. Sebelumnya pada
penutup corong pemisah dilapisi vaselin untuk memudahkan membuka tutup. Setelah itu
dilakukan penggojokan yang bertujuan untuk menghomogenkan sampel dan melarutkan
komponen-komponen yang bersifat polar agar larut dalam aquades sehingga terpisah
dengan larutan sampel yang berwarna kuning yang mengandung komponen-komponen non
polar. Selama proses penggojokan, dilakukan beberapa kali dengan menutup dan membuka
kran untuk mengeluarkan gas yang ada pada corong pemisah. Pada proses ini pun penutup
sorong pemisah harus ditekan dengan kuat agar tutup tidak lepas. Proses ini dihentikan
apabila gas yang didalam corong pemisah sudah habis, hal ini ditandai dengan tidak
timbulnya suara. Selanjutnya, larutan dibiarkan hingga terjadi pemisahan sehingga ada 3
lapisan, yaitu lapisan yang berwarna kuning, lapisan yang berwarna bening, dan lapisan
yang berwarna keruh. Setelah itu, lapisan yang berwarna keruh dan bening dibuang dengan
cara kran pada corong pemisah dibuka. Lapisan yang berwarna keruh adalah aseton,
sedangkan yang berwarna jernih adalah aquades. Maka, hanya akan dihasilkan lapisan
berwarna kuning yang disebut dengan fase eter. Pada fase eter, ditambahkan kembali
aquades sebanyak 50 ml dan dilakukan penggojokan dengan cara yang sama. Proses ini
dilakukan sebanyak 3 kali pencucian untuk mendapatkan hasil yang maksimal. Setelah itu
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

fase eter hasil pencucian terakhir dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam gelas ukur untuk
diukur volumenya. Setelah itu, dimasukkan ke dalam gelas beaker dan yang kemudian
ditutup aluminium foil.
Hal lain yang dipersiapkan selanjutnya ialah kolom kromatografi. Kolom kromatografi
berbentuk seperti buret yang diisi dengan beberapa bahan yaitu filter, kapas putih dengan
ketebalan 1,5 cm hingga padat yang bertujuan untuk menyaring kotoran yang terbawa pada
sampel, alumina dengan tebal 10 cm yang berfungsi untuk mengikat senyawa polar pada
sampel, Na2SO4 dengan tebal 2,5 cm yang berfungsi untuk mengikat sisa aquades, dan
kapas putih 1,5 cm sampai memadat.

2. Proses Pemisahan Fraksi Senyawa Menggunakan Kromatografi Kolom

Pada proses pemisahan fraksi senyawa menggunakan kromatografi kolom, hal pertama
yang dilakukan ialah persiapan alat-alat dan bahan yang akan digunakan. Alat-alat yang
diperlukan yaitu labu ukur 25 ml dan 10 ml untuk pengenceran, spektrofotometer, pompa
listrik, kolom kromatografi yang telah terisi dengan fase diam, gelas ukur, plastic, karet,
timbangan analitik, beaker glass, dan Erlenmeyer. Sedangkan bahan-bahan yang diperlukan
ialah fase eter hasil preparasi, petroleum eter-aseton (10:1) dan Na2SO4. Setelah persiapan,
dilakukan penambahan fase eter dengan Na2SO4 sebanyak 1 gram setiap 20 ml fase eter
yang didapatkan. Na2SO4 berfungsi untuk mengikat senyawa-senyawa polar yang masih ada
pada fase eter. Setelah itu, diaduk dengan pengaduk agar tercampur merata. Kemudian
dimasukkan fase eter tersebut kedalam kolom kromatograf dan disiapkan petroleum eter-
aseton (10:1) untuk pengelusian yang terlebih dahulu dilakukan agar sampel mudah terelusi
nantinya. Selanjutnya, mulut kolom kromatografi ditutup menggunakan plastik yang telah
dilubangi tengahnya kemudian diikat dengan kuat menggunakan karet gelang dan
dimasukkan pompa agar proses elusi lebih cepat. Pada saat proses elusi berlangsung, pada
kolom kromatografi apabila PE-aseton (10:1) sudah hampir habis maka segera ditambahkan
lagi. Proses elusi dilakukan hingga cairan yang keluar dari kolom kromatografi berwarna
kuning, yang artinya proses kromatogradi sudah selesai dan seluruh larutan non polar dari
sampel sudah terelusi. Proses elusi ini dihentikan jika cairan yang keluar dari kolom
kromatografi sudah berwarna kuning, yang artinya proses kromatogradi sudah selesai dan
seluruh larutan non polar dari sampel sudah terelusi. Setelah itu, hasil larutan tersebut
dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml dan ditambahkan petroleum eter-aseton (10:1)
sampai tanda batas kemudian dihomogenkan. Selanjutnya diukur absorbansinya
menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 450 nm sehingga didapatkan
nilai absorbansi beta karoten dan dimasukkan dalam persamaan regresi linear kurva standar
beta karoten yang telah dibuat dan didapatkan konsentrasinya yang dimasukkan dalam
rumus kadar beta karoten.

3. Pembuatan Larutan Standar Berakaroten


Pada kromatografi kolom, juga diperlukan pembuatan larutan standar betakaroten. Hal
pertama yang perlu dipersiapkan ialah alat-alat dan bahan. Alat-alat yang diperlukan ialah
gelas ukur, labu ukur 25 ml dan 10 ml, timbangan analitik, spatula untuk mengambil
sampel, gelas beaker, shaker untuk menghomogenkan reagen dengan sampel,
spektrofotometer, dan pipet ukur untuk mengambil reagen dengan volume tertentu.
Sedangkan bahan yang digunakan yaitu petroleum eter-aseton (10:1) dan beta karoten.
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

Setelah persiapan alat dan bahan, dilakukan penimbangan beta karoten sebanyak 10
gram menggunakan tmbangan analitik. Setelah itu, beta karoten yang telah ditimbang
dimasukkan ke dalam gelas beaker dan ditambahkan dengan petroleum eter-aseton
(10:1) sebanyak 25 ml dan dishaker hingga larut. Tujuannya shaker ialah untuk
melarutkan beta karoten dalam reagen. Setelah larut, diambil 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25 ml
dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. Setelah itu diencerkan dengan petroleum eter-
aseton (10:1) sampai tanda batas lalu dihomogenkan pada labu ukur. Setelah itu, diambil
1 ml menggunakan pipet ukur dari masing-masing volume dan dimasukkan dalam labu
takar 10 ml untuk diencerkan dengan petroleum eter-aseton (10:1) hingga tanda batas.
Fungsi penambahan PE;Aseton (10:1) adalah untuk memisahkan secara maksimal antara
senyawa yang ingin dipisahkan. Selanjutkan dihomogenisasi dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi dan diberi label agar tidak tertukar. Kemudian dilakukan pengukuran
absorbansi menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 450 nm sehingga
didapatkan kurva standar. Kemudian dicari persamaan linear dan regresinya sehingga
bisa dihitung kadar beta karotennya.

Analisa DHP dibandingkan dengan literatur


Dari praktikum kromatografi kolom dapat diketahui bahwa prinsip dari kromatografi
kolom ialah pemisahan komponen secara selektif berdasarkan sifat adsorbsi senyawa
terhadap fase mobile atau fase stasioner yang digunakan. Pada praktikum ini bertujuan
untuk mengetahui kandungan betakaroten menggunakan kromatografi kolom dan dari data
hasil praktikum ini dapat diketahui jumlah kadar beta karoten pada wortel ialah sebesar
1,835 mg/g. Pada awal praktikum dapat diketahui berat wortel yaitu sebesar 3,0006 gram
yang kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektofotometer pada panjang
gelombang 450nm dihasilkan absorbansi sebesar 0,279. Kemudian dimasukkan pada
persamaan y= 123,5x 0,0496 yang selanjutnya didapatkan konsentrasi beta karoten pada
sampel, kemudian diditung kadar beta karoten menggunnakan rumus konsentrasi dikali
faktor pengencer dikali volume filtrate dikali 100 dibagi volume filtrate yang selanjutnya
semuanya dibagi berat sampel (gram) sehingga didapatkan kadar beta karoten sebesar
1,835 mg/gram. Wortel segar mengandung air, protein, karbohidrat, lemak, vitamin (beta
karoten, B1, dan C). Beta Karotennya mempunyai manfaat sebagai anti oksidan yang
menjaga kesehatan dan menghambat proses penuaan. Selain itu Beta Karoten dapat
mencegah dan menekan pertumbuhan sel kanker serta melindungi asam lemak tidak jenuh
ganda dari proses oksidasi (Sun, 2010). Menurut literature, kadar beta karoten pada wortel
alah sebesar 8.1 -19.3 mg/100 g atau sekitar 0,081 mg/g (Mustafa, 2012).
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

(Mustafa, 2012).
Hal ini cukup berbeda jauh dengan hasil praktikum, sehingga tidak sesuai dengan literature
karena kadar beta karoten hasil praktikum yang diperoleh lebih tinggi dibandingkan literatur.
Sehingga kesalahan yang dihasilkan ialah kesalahan positif. Kesalahan ini dapat
dikarenakan kesalahan pada saat praktikum seperti kesalahan identifikasi, ekstraksi yang
belum cukup, proses kromatografi yang belum sempurna, kesalahan perhitungan, dan
perpindahan jenis carotene dari satu pelarut ke pelarut lain yang belum maksimal ketika
proses pemisahan (Rodriguez, 2007). Selain itu, perbedaan juga dapat terjadi karena
penggunaan jenis wortel yang berbeda antara yang digunakan pada literature dan praktikum
sehingga hasil kadar beta karoten pun berbeda. Menurut (Noviyanti, 2010), terdapat faktor-
faktor yang mempengaruhi penetapan kadar beta karoten dengan metode kromatografi
kolom yaitu jenis sampel, jenis pelarut yang digunakan, jenis absorben, dan waktu. Jenis
adsorben yang digunakan harus memiliki sifat yang berlawanan dengan senyawa yang ingin
dipisahkan agar tidak terikat dengan fase diam. Semakin lama waktu yang digunakan untuk
ekstraksi maka semakin banyak zat yang diperoleh.

Analisa Kurva Larutan Betakaroten Standar dibandingkan dengan literature

Pada kurva larutan standart beta karoten dapat diketahui persamaan linearnya yaitu
y= 123,5x 0,0476 dengan nilai regresi 0,9933. Berdasarkan literature, apabila nilai r2 atau
regresi menunjukkan angka >0 dan <1, maka dapat dikatakan terjadi hubungan linear yang
sempurna (mendekati benar) dengan garis pada kurva semakin lurus serta nilai mendekati
akurat (Sathya, 2014). Makin besar nilai x maka makin besar pula nilai variabel y-nya dan
semakin mendekati 1 dan semakin mendekati 1 maka hasil yang didapatkan semakin baik.
Namun, jika garis pada kurva tidak signifikan maka data yang dihasilkan belum akurat. Pada
praktikum ini didapatkan garis yang hampir lurus dengan regresi 0,9933 yang artinya
mendekati 1. Sehingga dapat disimpulkan bahwa kurva larutan standart beta karoten sesuai
dengan literature dan mendekati benar. Menurut (Sathya, 2014) kurva standar untuk
betakaroten linear, dimana semakin besar konsentrasi maka nilai absorbansinya semakin
tinggi.
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

Kesimpulan

Prinsip dari kromatografi kolom adalah memisahkan komponen secara selektif secara
selektif berdasarkan sifat adsorbsi senyawa terhadap fase mobile atau fase stasioner yang
digunakan. Tujuan dari percobaan ini adalah mengidentifikasi peralatan yang diperlukan
untuk analisis dengan kromatografi kolom, mengoperasikan peralatan yang digunakan untuk
analisis kromatografi kolom adsorbsi dengan benar, dan prinsip dasar analisis kromatografi
kolom adsorbsi. Pada data hasil praktikum dapat diketahui bahwa pada uji sampel wortel
berat 3,0006 gram. Setelah dianalisis menggunakan spektrofotometer didapatkan nilai
absorbansi sebesar 0,279 kemudian dimasukkan ke dalam persamaa y=123,5x 0,0476
sehingga didapatkan nilai konsentrasi sebesar 2,64 x 10-3. Sehingga diperoleh kadar beta
karoten sebesar 1,835 mg/gram.
Nama : Rika Anisa A.
NIM : 145100107111011
Kelas :D
Kelompok: D7

Daftar Pustaka

Lampiran DHP