TEKNIK TRANSFORMASI GENETIK BEBERAPA TANAMAN

MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens

ARIEF PAMBUDI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
 2

ABSTRAK

ARIEF PAMBUDI. Teknik Transformasi Genetik beberapa Tanaman Menggunakan

Agrobacterium tumefaciens. Dibimbing oleh MIFTAHUDIN dan TETTY CHAIDAMSARI.
Transformasi genetik adalah proses introduksi gen dari satu organisme ke organisme lain
yang memungkinkan untuk memunculkan sifat harapan tanpa mengubah sifat lain. Penggunaan
Agrobacterium tumefaciens sebagai vektor transformasi memiliki keunggulan karena tidak
membutuhkan peralatan khusus serta efisiensi transformasi dan salinan tunggal dari gen yang
ditransformasi relatif tinggi. Penelitian ini merupakan penelitian transformasi komparatif pada
beberapa tanaman yang memiliki karakter berbeda, yaitu manggis sebagai tanaman apomiksis,
tembakau sebagai tanaman model, anggrek sebagai perwakilan dari kelas monokotil, dan kopi
sebagai perwakilan dari kelas dikotil. Transformasi dilakukan dengan metode yang sama dan
dilanjutkan dengan regenerasi pada media seleksi yang mengandung antibiotik. Konfirmasi sisipan
gen hasil transformasi dilakukan dengan teknik Polimerase Chain Reaction (PCR). Hasil
konfirmasi dari sampel tanaman yang mampu tumbuh pada media seleksi menunjukkan hanya
tembakau yang positif tersisipi oleh gen yang ditransfomasi. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman
hasil transformasi yang mampu hidup di media seleksi belum merupakan jaminan tersisip oleh gen
yang diintroduksi sebelum dilakukan pengujian molekuler. Beberapa optimasi dalam sterilisasi,
teknik infeksi, peningkatan jumlah eksplan yang ditransformasi dan jumlah sampel yang diuji
perlu dilakukan untuk peningkatan efisiensi transformasi.

Kata kunci : Transformasi genetik, Agrobacterium tumefaciens, tanaman transgenik.

ABSTRACT

ARIEF PAMBUDI. Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation Techniques in Several

Plants. Supervised by MIFTAHUDIN and TETTY CHAIDAMSARI.
Genetic transformation is a process to introduce foreign gene from one organism to other
organisms. This process is a site directed mutagenesis that can improve a good character without
changing the existing characters. The use of Agrobacterium tumefaciens as a vector in genetic
transformation has several advantages compared to other transformation techniques. It is a simple
method, does not need special equipment, and produces high transformation efficiency in
transfering a single copy of insert gene. This research is a comparative genetic transformation
among several plants that have different characters. They are mangosteen as an apomixis plant,
tobacco as a model plant, orchid as a monocotyledon plant, and coffee as a dicotyledon plant. The
transformation were conducted in a same method and continued with regeneration step in
antibiotic selectable medium. Gene insert confirmation using Polimerase Chain Reaction (PCR)
technique showed that only tobacco the expected gene insert. The result suggested that the plant
ability to grow in selective medium was not guaranteed as a transgenic plant before being
confirmed using molecular assay approach. Some optimation in explants sterilization, infection
techniques, number of transformed explants and tested transformed samples are required to be
increases to achieve high transformation efficiency.

Keyword : Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, transgenic plant.

 3

TEKNIK TRANSFORMASI GENETIK BEBERAPA TANAMAN

MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens

ARIEF PAMBUDI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
 4

Judul : Teknik Transformasi Genetik beberapa Tanaman Menggunakan

Agrobacterium tumefaciens
Nama : Arief Pambudi
NIM : G34104067

Menyetujui:

Pembimbing I, Pembimbing II,

(Dr. Ir. Miftahudin, M.Si) (Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si)

NIP. 131 851 281 NIK. 110 400 241

Mengetahui:

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Dr. drh. Hasim, DEA

NIP. 131 578 806

Tanggal lulus :
 5

PRAKATA

Alhamdulillah, puji syukur atas limpahan rahmat, karunia, dan hidayah yang diberikan oleh
Allah SWT kepada penulis sehingga karya ilmiah yang berjudul Teknik Transformasi Genetik
beberapa Tanaman Menggunakan Agrobacterium tumefaciens dapat diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. Miftahudin, M.Si dan Dr. Tetty
Chaidamsari M.Si selaku pembimbing yang telah memberikan dukungan, bantuan, pengarahan,
dan bimbingan kepada penulis selama pelaksanaan penelitian. Juga kepada Dr. Anja Meryandini
M.Si selaku dosen penguji yang banyak memberikan masukan dalam penulisan dan perbaikan
karya ilmiah ini.
Terima kasih juga kepada Mbak Herti, Mbak Nina, Mas Topan, Mbak Riana, Mbak Retno,
dan Bu Dewi atas bantuan teknisnya, Winda, Kusnandar, Syamsul, Ruth, teman-teman di lab
BMRG dan Fistum, David, Yanti, Amie, Icha, Resti, Arlyn, Andik, Puspita, Uci, keluarga besar
Lab BMRG, Lab Fistum, kontrakan Delapan, teman-teman Biologi angkatan 41, para praktikan,
dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu. Tidak lupa ucapan terima kasih kepada
Papa, Mama, Annis, Ipul, Han, dan seluruh keluarga yang selalu memberi dukungan, kasih sayang,
doa, dan dorongan semangat yang tiada henti untuk menjadikan penulis lebih baik.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2009

Arief Pambudi
 6

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 14 April 1987 dari pasangan Bapak
Sumarmadji dan Ibu Susiana. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Tahun 1998
penulis lulus dari SDN Malabar 1 Bogor, tahun 2001 lulus dari SMPN 2 Lubuk Pakam, kemudian
melanjutkan ke SMAN 1 Medan. Tahun 2004 lulus dari SMAN 1 Medan dan di tahun yang sama
penulis diterima sebagai mahasiswa Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru
(SPMB).
Selama studi di IPB, penulis aktif di Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) sebagai Staf
Bioworld 2006/2007 dan ketua divisi Biosains tahun 2007/2008. Penulis pernah menjadi asisten
praktikum Biologi Dasar, Fisiologi Tumbuhan Dasar, Sistematika Tumbuhan Berpembuluh, dan
pengajar biologi bimbingan belajar dan tutorial mahasiswa Be Expert.
Penulis melakukan praktek lapang pada tahun 2007 di PT. Bridgestone Sumatra Rubber
Estate dengan judul Sistem Pengusahaan Tanaman Karet (Hevea brasiliensis). Penulis juga pernah
menjadi finalis Pekan Ilmiah Mahasiswa Tingkat Nasional XX di Lampung dengan tulisannya
yang berjudul Analisis kandungan senyawa golongan flavonoid Selaginella yang berpotensi
sebagai antioksidan.
 7

DAFTAR ISI
Halaman

DAFTAR TABEL ............................................................................................................................ viii

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN................................................................................................................... viii

PENDAHULUAN................................................................................................................................1
Latar Belakang.................................................................................................................................1
Tujuan ..............................................................................................................................................1

BAHAN DAN METODE ....................................................................................................................1

Waktu dan Tempat ..........................................................................................................................1
Bahan dan Alat ................................................................................................................................1
Metode .............................................................................................................................................2
Kultur bakteri A. tumefaciens.....................................................................................................2
Transformasi genetik dan regenerasi ........................................................................................2
Isolasi DNA Total .......................................................................................................................2
Uji kuantitatif dan kualitatif DNA..............................................................................................2
Uji Insersi dengan PCR..............................................................................................................2

HASIL ..................................................................................................................................................3
Transformasi dan regenerasi ...........................................................................................................3
Manggis ......................................................................................................................................3
Tembakau....................................................................................................................................4
Anggrek.......................................................................................................................................4
Kopi.............................................................................................................................................4
Isolasi DNA dan uji insersi dengan PCR........................................................................................4

PEMBAHASAN ..................................................................................................................................5
Transformasi dan regenerasi ...........................................................................................................5
Manggis ......................................................................................................................................5
Tembakau....................................................................................................................................6
Anggrek.......................................................................................................................................6
Kopi.............................................................................................................................................6
Isolasi DNA dan uji insersi dengan PCR........................................................................................7

SIMPULAN..........................................................................................................................................7

SARAN.................................................................................................................................................8

DAFTAR PUSTAKA ..........................................................................................................................8

LAMPIRAN .........................................................................................................................................9
 8

DAFTAR TABEL
Halaman
1. Primer spesifik yang digunakan dalam uji insersi..........................................................................2
2. Hasil transformasi tembakau setelah 8 minggu..............................................................................4
3. Hasil transformasi anggrek .............................................................................................................4
4. Absorbansi dan konsentrasi DNA total hasil isolasi ......................................................................4

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Sumber eksplan daun tanaman manggis yang diambil dari rumah kaca yang masih
berwarna merah (A), daun in-vitro (B), dan biji (C)....................................................................3
2 Pola pertunasan biji (A, B, C) dan pengkalusan daun manggis (D, E, F)
yang bukan berasal dari luka. .......................................................................................................3
3 Eksplan transformasi daun rumah kaca (A), kontrol transformasi rumah kaca (B), kontrol
negatif rumah kaca (C), transformasi daun in-vitro (D), kontrol transformasi in-vitro (E),
kontrol negatif in-vitro (F) ...........................................................................................................3
4 Persentase kalus manggis hasil transformasi daun asal rumah kaca............................................3
5 Persentase kalus manggis hasil transformasi daun in-vitro.........................................................3
6 Pola pertumbuhan tunas tembakau (tanda panah) berasal dari bekas luka..................................4
7 Planlet tembakau hasil transformasi dengan TcAG (A), kontrol (B), dan TcAP1 (C).................4
8 Planlet kultur in-vitro anggrek hasil transformasi TcAG (A), kontrol (B), dan TcAP1 (C) .......4
9 Planlet kopi hasil transformasi TcAG terlihat menguning (A), kontrol (B), kopi TcAP1 (C).....4
10 Elektroforesis 200 ng DNA hasil isolasi ......................................................................................5
11 Hasil PCR dengan primer TcAG ...................................................................................................5
12 Hasil PCR dengan primer TcAP1 .................................................................................................5
13 Konsep model ABC pada pembentukan organ bunga..................................................................6

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Pembuatan larutan MS (Murashige & Skoog) ............................................................................10
2 Pembuatan buffer SDS.................................................................................................................10
3 Komposisi media LB (Luria Bertani Broth)................................................................................10
4 Komposisi media ko-kultivasi .....................................................................................................10
5 Komposisi media eliminasi..........................................................................................................10
6 Komposisi media seleksi..............................................................................................................11
7 Komposisi MS vitamin ................................................................................................................11
8 Pembuatan larutan antibiotik .......................................................................................................11
9 Peta plasmid pBIN-AG dan pBIN-AP1.......................................................................................11
10 Bagan alur penelitian....................................................................................................................12

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pemuliaan tanaman telah dimulai sejak
dimulainya peradaban manusia. Secara
konvensional, pemuliaan dapat dilakukan
dengan berbagai cara seperti seleksi sifat
tertentu, persilangan, dan mutasi buatan.
Penemuan gen sebagai substansi penentu sifat,
diikuti dengan penemuan teknik isolasi gen,
transfer gen, dan pengekspresiannya pada sel
lain memberikan alternatif baru dalam
pemuliaan melalui bioteknologi (Suwanto
1998). Hal ini memungkinkan penyisipan gen-
gen penting saja, sedangkan sifat lain yang
telah ada diharapkan tidak berubah.
Transformasi genetik yang merupakan
proses introduksi gen dari satu organisme ke
organisme lain adalah salah satu bentuk dari
bioteknologi. Proses transformasi genetik
dapat dilakukan secara langsung (particle
bombardment, penggunaan polietilen-glikol
(PEG), elektroporasi) maupun tidak langsung
menggunakan bantuan Agrobacterium
tumefaciens.
Setiap teknik transformasi memiliki
keunggulan dan kekurangan masing-masing.
Transformasi secara langsung memiliki
keunggulan karena cakupannya yang luas
pada berbagai spesies tanaman, namun gen
yang tersisip cenderung dalam jumlah salinan
yang banyak sehingga peluang terjadinya
penyusunan kembali (re-arrangement) gen
lebih tinggi (Hansen & Chilton 1996).
Transformasi tidak langsung meng-
gunakan A. tumefaciens memiliki keunggulan
karena tidak membutuhkan peralatan khusus,
dapat dilakukan dengan peralatan
laboratorium yang sederhana dan sisipan gen
tunggal berpeluang lebih tinggi dibanding
transformasi langsung, sehingga stabilitas
ekspresi gen lebih tinggi (Hansen & Chilton
1996; Dai et al. 2001; Rahmawati 2006).
Namun transformasi tidak langsung memiliki
kekurangan yaitu sekuen yang ditransfer ke
genom target bersifat acak, ada kemungkinan
yang ditransfer bukan gen target (Wenck et al.
1997; Gelvin 2003).
Secara alami A. tumefaciens hanya dapat
menginfeksi tanaman dikotil, sehingga pada
awalnya transformasi menggunakan A.
tumefaciens hanya terbatas pada tanaman
dikotil. Perkembangan penelitian dasar
mengenai mekanisme infeksi A. tumefaciens
telah memberikan pemahaman baru sehingga
beberapa modifikasi metode transformasi
9
dapat dilakukan untuk tanaman monokotil
(Slamet-Loedin 1994).
Penelitian ini merupakan penelitian
transformasi gen terhadap beberapa spesies
tanaman dengan karakteristik yang berbeda
dengan menggunakan sistem dan metode yang
sama. Hasil penelitian ini diharapkan mampu
memberikan informasi baru mengenai teknik
transformasi yang efektif menggunakan
A. tumefaciens pada berbagai jenis tanaman.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mencari
sistem yang tepat dalam melakukan introduksi
gen menggunakan A. tumefaciens strain
AGL0 pada beberapa spesies tanaman yang
memiliki karakter berbeda yaitu manggis
(tanaman apomiksis), tembakau (tanaman
model), anggrek (kelas monokotil), dan kopi
(kelas dikotil).
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai bulan
Februari 2008 hingga November 2008 di
Laboratorium Biologi Molekuler dan
Rekayasa Genetika (BMRG) Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia dan
Laboratorium Fisiologi dan Biologi
Molekuler Tumbuhan Departemen Biologi,
FMIPA IPB.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan antara lain
tanaman manggis, kultur in-vitro tembakau,
kultur in-vitro anggrek, kopi, dan tembakau
hasil transformasi. Bakteri untuk transformasi
merupakan koleksi Laboratorium BMRG,
yaitu A. tumefaciens strain AGL0 pembawa
konstruksi gen Agamous asal kakao (TcAG)
dan gen Apetala1 asal kakao (TcAP1). Kultur
in-vitro menggunakan media Murashige &
Skoog (MS) (Lampiran 1) dengan pemberian
antibiotik kanamisin dan cefotaksim. Isolasi
DNA menggunakan buffer SDS (Lampiran 2).
Uji insersi menggunakan Polimerase Chain
Reaction (PCR) kit RBC (Real Biotech Corp.,
Taiwan) dengan primer spesifik gen target
(Tabel 1).
Alat yang digunakan adalah laminar air
flow, skalpel, pinset, alat gelas, shaker
incubator, sentrifuse berpendingin, vortex,
tabung mikro, speed vac, spektrofotometer,

deep freezer, mesin PCR, pipet mikro,
perangkat elektroforesis, dan gel doc.
Tabel 1. Primer spesifik yang digunakan dalam uji insersi
Primer Sekuen
TcAG-F396 5-CGCATTGCCTATGAAGGATC
TcAG-R 5-GGTGACCGTAGCACTTACTCCACCAGA
TcAP1-F2 5-ATGGGAAGAGGTAGGGTTCA
TcAP1-R2 5-CTTCTCCCATGTAGTGCCTG
Metode
Kultur bakteri A. tumefaciens
Sebanyak 1 lup suspensi A. tumefaciens
dari gliserol stok diremajakan pada media
Luria Bertani Agar (LA) (Lampiran 3) +
antibiotik kanamisin 25 mg/L dan rifampisin
25 mg/L. Kemudian diinkubasi selama 18 jam
pada suhu maksimum 28 oC. Pengkayaan
kultur dilakukan dalam media Luria Bertani
Broth (LB) (Lampiran 3) + kanamisin 25
mg/L dan rifampisin 25 mg/L dalam shaker
incubator dengan kecepatan 150 rpm, suhu
maksimum 28 oC (kondisi gelap). Hasil
pengkayaan diresuspensi dengan media ko-
kultivasi cair (Lampiran 4) dan diinkubasi
pada kondisi yang sama selama 2-3 jam.
Transformasi genetik dan regenerasi
Sumber eksplan manggis yang digunakan
dalam transformasi adalah daun manggis asal
rumah kaca, daun in-vitro dan biji. Daun asal
rumah kaca yang digunakan sebagai sumber
eksplan adalah tunas daun dengan lebar 3-3,5
cm yang masih berwarna kemerahan. Daun in-
vitro yang digunakan sebagai sumber eksplan
berasal dari kultur in-vitro yang sudah
memunculkan sepasang daun dengan ukuran
lebar 1-1,5 cm berwarna hijau kemerahan.
Eksplan biji manggis didapatkan dengan
membersihkan biji dari arilusnya yang
berwarna putih, kemudian direndam dalam
larutan Dithane M45 0,8% yang diberi 500
mg/L PVP (polivinilpirolidon). Selanjutnya,
biji yang telah disterilisasi dipotong melintang
menjadi 3-4 potongan sebelum ditanam pada
media atau ditransformasi.
Transformasi pada eksplan daun manggis
asal rumah kaca diawali dengan sterilisasi
permukaan menggunakan alkohol 70% dan
klorox 1%. Potongan eksplan diinokulasi
dalam suspensi bakteri A. tumefaciens
pembawa gen insert dalam larutan MS cair +
acetosiringone 200 mg/L selama 15 menit
dalam shaker incubator 75 rpm (kondisi
102
gelap). Lalu eksplan dikeringkan dengan tisu
steril dan ditanam pada media ko-kultivasi
padat (Lampiran 4) yang diberi kertas saring
selama 2 hari. Transformasi pada tembakau
menggunakan sumber eksplan daun in-vitro.
Prosedur transformasi pada eksplan tembakau,
kopi, dan anggrek sama dengan prosedur
transformasi pada daun manggis.
Eksplan hasil ko-kultivasi kemudian dicuci
dengan media eliminasi (Lampiran 5) hingga
jernih. Eksplan yang telah dikeringkan
kemudian dikultur pada media seleksi
(Lampiran 6) pada suhu 26 oC kondisi gelap.
Sub-kultur ke media baru dilakukan setiap 4-6
minggu sekali dan persentase planlet berkalus
diamati tiga minggu sekali selama masa
percobaan.
Isolasi DNA Total
Isolasi DNA total dilakukan dengan
menggunakan buffer SDS (Lampiran 2)
menggunakan 100 mg sampel jaringan daun.
Uji kuantitatif dan kualitatif DNA
DNA total hasil isolasi kemudian diuji
kuantitatif untuk mengetahui konsentrasinya
dengan mengukur perbandingan serapan pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Konsentrasi DNA yang tinggi digambarkan
dengan nilai serapan tinggi pada panjang
gelombang 260 nm. Kemurnian DNA
dibanding dengan makromolekul lain dapat
dilihat dari perbandingan serapan antara
260/280 yang berkisar antara 1,8-2,0
(Sambrook et al. 1989). Menghitung
konsentrasi DNA dilakukan dengan
persamaan :
Kons (ng/l) = A260nm x k x fp
A260nm : Serapan pada 260 nm
k : Konstanta konsentrasi (50 untuk DNA)
fp : Faktor pengenceran
Uji kualitatif DNA dilakukan dengan
teknik elektroforesis gel agarose 1% pada
tegangan 65V, 40 menit menggunakan 0.5x
buffer TBE.
Uji Insersi dengan PCR
Uji insersi dilakukan untuk mengetahui
integrasi gen insert pada genom tanaman
sampel. PCR dilakukan dengan total volum
sebesar 15 l yang terdiri atas 100 ng DNA
template, 1X buffer PCR (+ MgCl2), 0.1 M
dNTPs, 0.2 M masing-masing primer
forward dan reverse, 1.5 unit taq polimerase,
 3
11

dan ddH2O hingga mencapai volume 15 l.

Program termal yang digunakan sesuai dengan
Chaidamsari et al. (2006b) antara lain 95 oC
selama 5 menit (pra-denaturasi), 95 oC 30
detik (denaturasi), 50 oC 30 detik (penem- A B C
pelan), 70 oC 1.5 menit (pemanjangan), yang
diulang 35 siklus dan diakhiri dengan
pemanasan 70 oC 5 menit. Hasil PCR di-
elektroforesis dengan gel agarose 1% pada D E F
tegangan 75 V selama 40 menit menggunakan Gambar 2 Pola pertunasan biji (A, B, C) dan pengkalusan
0.5x buffer TBE kemudian divisualisasi daun manggis (D, E, F) yang bukan berasal
dengan pewarna etidium bromida diatas UV dari luka.
transluminator.

HASIL
A B C
Transformasi dan regenerasi

Manggis
Sumber eksplan tanaman manggis yang
digunakan dalam kultur in-vitro dan D E F
transformasi dapat dilihat pada Gambar 1. Gambar 3 Eksplan transformasi daun rumah kaca (A),
kontrol transformasi rumah kaca (B), kontrol
negatif rumah kaca (C), transformasi daun in-
vitro (D), kontrol transformasi in-vitro (E),
kontrol negatif in-vitro (F). Garis
menunjukkan ukuran sepanjang 5 mm.

A B C
Gambar 1 Sumber eksplan daun tanaman manggis yang
diambil dari rumah kaca yang masih
berwarna merah (A), daun in-vitro (B), biji
(C).

Kontaminasi kultur in-vitro baik dari

sumber eksplan daun maupun biji sangat
tinggi (74,19% untuk transformasi daun yang
diambil dari rumah kaca, 13,79% untuk
transformasi yang berasal dari daun in-vitro,
dan 72,62% untuk kultur biji). Hal ini salah Gambar 4 Persentase kalus manggis hasil transformasi
satunya disebabkan permukaan eksplan yang daun asal rumah kaca.
tidak halus, kandungan polifenolik serta
mucilage (karbohidrat kompleks) yang tinggi
pada manggis sehingga sterilisasi permukaan
kurang maksimal. Optimasi sterilisasi perlu
dilakukan untuk menurunkan tingkat
kontaminasi dengan cara pengocokan
menggunakan shaker lalu diikuti screening
eksplan asal rumah kaca sebelum dilakukan
transformasi.
Pola pertunasan dan pengkalusan pada
manggis tidak berasal dari bekas luka
(Gambar 2). Hasil transformasi daun manggis
asal rumah kaca dan in-vitro yang Gambar 5 Persentase kalus manggis hasil transformasi
ditransformasi menggunakan gen TcAP1 daun in-vitro.
dapat dilihat pada Gambar 3-5.
 4
12

Eksplan manggis yang diamati belum Tabel 3. Hasil transformasi anggrek

mengalami regenerasi membentuk tunas. ,,,
Pertumbuhannya masih sampai tahap kalus
sehingga eksplan belum bisa diambil untuk
pengujian molekuler.

Tembakau
Tingkat keberhasilan transformasi
tembakau dan kultur tembakau hasil
transformasi dengan gen TcAG dan TcAP1
berturut-turut dapat dilihat pada Tabel 2 dan
Gambar 6-7.
Gambar 8 Planlet kultur in-vitro anggrek hasil
Tabel 2. Hasil transformasi tembakau setelah 8 minggu transformasi TcAG (A), kontrol (B), dan
TcAP1 (C).

Kopi
Kultur kopi hasil transformasi dua jenis
gen pengatur pembungaan asal tanaman
kakao, TcAG dan TcAP1 dapat dilihat pada
Gambar 9.

Gambar 6 Pola pertumbuhan tunas tembakau (tanda

panah), berasal dari bekas luka. Garis
menunjukkan ukuran sepanjang 2 cm.
B
Gambar 9 Planlet kopi hasil transformasi TcAG terlihat
menguning (A), kontrol (B), kopi TcAP1
(C).

Isolasi DNA dan uji insersi dengan PCR

A B
Gambar 7 Planlet tembakau hasil transformasi dengan
TcAG (A), kontrol (B), dan TcAP1 (C). Garis
menunjukkan ukuran sepanjang 2 cm.
Anggrek
Tingkat keberhasilan transformasi anggrek
dan kultur anggrek hasil transformasi dengan
gen TcAG dan TcAP1 berturut-turut dapat
dilihat pada Tabel 3 dan Gambar 8.
C
Absorbansi dan konsentrasi DNA hasil
isolasi disajikan pada Tabel 4. Elektroforesis
200 ng DNA hasil isolasi berdasarkan hasil
spektrofotometri menunjukkan pita dengan
intensitas ketebalan yang berbeda (Gambar
10) oleh karena itu, dilakukan penyesuaian
perhitungan konsentrasi antara hasil spektro-
fotometri dengan hasil elektroforesis.

Tabel 4. Absorbansi dan konsentrasi DNA total hasil isolasi

No Sampel 260 nm 280 nm 260/280 [ng/ml]
1 Kontrol anggrek 0.032 0.018 1.778 640
2 Anggrek AG 0.026 0.013 2.000 260
3 Anggrek AP1 0.027 0.013 2.077 271
4 Kontrol kopi 0.014 0.022 1.564 208
5 Kopi AG 0.040 0.034 1.176 100
6 Kopi AP1 0.016 0.009 1.778 160
7 Kontrol tembakau 0.038 0.024 1.583 228
8 Tembakau AG 0.049 0.031 1.581 216
9 Tembakau AP1 0.239 0.130 1.838 1793

Gambar 10 Elektroforesis 200 ng DNA hasil isolasi.
(Lajur 1-10: anggrek kontrol, anggrek AG,
Anggrek AP1, kopi kontrol, kopi AG, kopi
AP1, tembakau kontrol, tembakau AG,
tembakau AP1, DNA ).
Hasil uji insersi dengan primer TcAG dan
TcAP1 menunjukkan hasil positif hanya pada
sampel tembakau (Gambar 11-12).
Gambar 11 Hasil PCR dengan primer TcAG. Lajur 1-
9: marker 100 bp, kontrol negatif, kontrol
positif, anggrek kontrol, anggrek
transformasi, kopi kontrol, kopi
transformasi, tembakau kontrol, tembakau
transformasi.
Gambar 12 Hasil PCR dengan primer TcAP1. Lajur 1-
9: marker 100 bp, kontrol negatif, kontrol
positif, anggrek kontrol, anggrek
transformasi, kopi kontrol, kopi
transformasi, tembakau kontrol, tembakau
transformasi.
PEMBAHASAN
Transformasi dan regenerasi
Manggis
Daun rumah kaca yang memenuhi
persyaratan sebagai sumber eksplan adalah
daun dengan umur yang tidak terlalu muda
dan tidak terlalu tua (berumur sekitar 2 bulan
sejak tunas muncul) dengan lebar kira-kira 3
cm. Daun yang lebih muda, akan memiliki
tingkat browning yang tinggi, sedang daun
yang lebih tua tingkat browning sudah
berkurang, karena produksi metabolit
sekunder/mucilage (karbohidrat kompleks)
juga menurun. Tingginya tingkat kontaminasi
manggis, salah satunya disebabkan karena
struktur permukaan eksplan yang tidak rata,
sehingga sterilisasi permukaan kurang efektif.
Untuk itu, perlu dilakukan pengocokan
5
13
menggunakan shaker selama proses sterilisasi
agar sterilisasi efektif. Selain itu, screening
bagi eksplan asal rumah kaca setelah
dilakukan sterilisasi permukaan juga perlu
dilakukan. Hasil screening yang tidak
terkontaminasi yang kemudian digunakan
untuk transformasi.
Kandungan metabolit sekunder diharapkan
dapat mempermudah infeksi oleh
A. tumefaciens. Hal ini biasanya terlihat dari
perubahan eksplan menjadi coklat (browning)
setelah dilukai. Namun, hal ini tidak terjadi
pada manggis karena kalus tidak terinduksi
dari bekas luka tersebut. Hal lain yang dapat
diamati setelah proses transformasi adalah
sulitnya mengeliminasi A. tumefaciens karena
A. tumefaciens mengkolonisasi di bagian yang
tidak dilukai yang mempunyai kandungan
mucilage dan polifenol yang tinggi.
Hasil penelitian menunjukkan pola
pembentukan kalus berbeda antara tanaman
manggis dan tembakau. Manggis merupakan
tanaman apomiksis yang memiliki banyak
embrio (poliembrio) dalam bijinya dan dapat
berkembang tanpa terjadinya fertilisasi
(Eckardt 2003). Hal ini menjadikan biji
manggis merupakan sumber eksplan yang
potensial digunakan dalam perbanyakan
massal tanaman manggis secara in-vitro.
Namun setelah diamati ternyata pola
pertunasan yang tidak keluar dari bekas luka
(Gambar 2) dan letak embrio yang belum
diketahui secara pasti di dalam biji
menyebabkan transformasi dengan
A. tumefaciens sulit untuk dilakukan pada biji
manggis. Penggunaan metode particle
bombardment dapat dilakukan sebagai
alternatif dalam proses transformasi gen
karena penembakan partikel DNA secara
langsung pada biji, memungkinkan peluang
terintegrasinya DNA insert pada banyak
embrio cukup tinggi.
Transformasi menggunakan eksplan daun
juga belum efektif dalam perakitan tanaman
transgenik. Pengkalusan eksplan daun
manggis memiliki pola yang sama dengan
pola pengkalusan pada biji. Kalus tumbuh dari
dalam, memecah tulang daun. Bukan berasal
dari bekas luka pada mesofil daun yang
mengalami kontak langsung dengan media
seleksi (Gambar 2). Hal ini akan menyulitkan
infeksi oleh A. tumefaciens yang masuk
melalui luka, sehingga transformasi
menggunakan sumber eksplan daun juga
belum efektif dalam perakitan tanaman
transgenik.

Eksplan daun manggis mengalami
regenerasi tidak langsung melalui
pembentukan kalus. Hasil penelitian
menunjukkan pembentukan kalus memiliki
laju peningkatan yang tinggi pada lima
minggu pertama (Gambar 5 dan 6). Hal ini
menjadikan kalus sebagai sumber eksplan
alternatif dalam transformasi pada tanaman
manggis. Sebagai upaya peningkatan efisiensi
infeksi oleh A. tumefaciens, perlu dilakukan
optimasi dalam proses infeksi. Beberapa cara
dan perlakuan fisik yang dapat dilakukan
untuk meningkatkan efektivitas transformasi
menggunakan A. tumefaciens antara lain
dengan perlakuan pre-kultur (Venkatachalam
et al. 2000), pelukaan, penggoresan, atau
pemberian suara ultrasonik (Shrestha et al.
2007). Sebagai konfirmasi insersi gen dari
hasil transformasi, perlu dilakukan analisis
DNA atau RNA. Namun, pertumbuhan kalus
manggis yang sangat lambat menjadi faktor
pembatas dalam penelitian ini.
Tembakau
Berbeda dengan manggis, transformasi
dan regenerasi pada tanaman tembakau lebih
banyak diketahui. Selain itu, tembakau juga
responsif terhadap introduksi gen asing,
mudah diamati perubahannya, dan cocok
tumbuh di daerah tropis. Berbeda dengan
Arabidopsis thaliana yang hanya dapat
tumbuh optimum di daerah subtropis.
Beberapa sifat dan kelebihan ini menyebabkan
tembakau banyak digunakan sebagai tanaman
model dalam transformasi genetik
(Chaidamsari et al. 2006a), khususnya di
daerah tropis. Pola pembentukan tunas pada
eksplan juga berbeda dengan pola
pengkalusan pada manggis. Tembakau
mengalami regenerasi langsung dan tunas
yang tumbuh berasal dari luka potongan saat
transformasi (Gambar 6).
Transformasi dua gen pengatur
pembungaan asal tanaman kakao, Agamous
(TcAG) dan Apetala1 (TcAP1) pada tembakau
sudah menunjukkan perkembangan pada
minggu kedua setelah transformasi. Memasuki
usia 8 minggu, terlihat perubahan per-
tumbuhan pada tanaman yang ditransformasi
dengan gen TcAG, TcAP1, dan kontrol.
Planlet AP1 mengalami pertumbuhan yang
lebih cepat dibandingkan dengan planlet
kontrol dan planlet AG (Gambar 7).
Kemampuan tanaman hasil transformasi untuk
tumbuh pada media seleksi memberi indikasi
bahwa planlet tembakau tersebut telah
6
14
mengalami introduksi gen melalui
transformasi genetik.
Anggrek
Transformasi anggrek dengan dua gen
pengatur pembungaan kelompok MADS-Box
asal kakao, TcAG dan TcAP1 menunjukkan
perbedaan pertumbuhan dengan planlet
kontrol. Anggrek yang ditransformasi dengan
gen TcAG memiliki perkembangan yang
terhambat, daun memutih, dan persentase
pertunasannya rendah (Tabel 3 dan Gambar
8A). Berbeda dengan tanaman anggrek yang
ditransformasi dengan TcAG, anggrek yang
ditransformasi dengan TcAP1 memiliki
pertumbuhan lebih cepat dan persentase
pertunasannya lebih tinggi (Tabel 3) namun
menampilkan morfologi abnormal pada saat
awal perkembangan dengan membentuk
struktur mirip sepal, bergantung pada
kekuatan tingkat ekspresinya (Gambar 8C).
Kemampuan planlet anggrek hasil
transformasi kedua gen insert untuk tumbuh
pada media seleksi dan perubahan morfologi
pada planlet anggrek menunjukkan bahwa
planlet tersebut sudah terinduksi oleh fragmen
plasmid ekspresi melalui transformasi.
Kopi
Transformasi dua gen pembungaan (TcAG
dan TcAP1) pada eksplan kopi menunjukkan
hasil yang hampir sama seperti pada eksplan
tembakau dan anggrek (Gambar 9). Berdasar
atas kemampuannya tumbuh di media seleksi,
planlet yang tumbuh diduga membawa
fragmen plasmid.
Regulasi gen-gen pembungaan dan
pembentukan organ bunga mengikuti konsep
model ABC (Gambar 13). Antara gen kelas A
(AP1) dan gen kelas C (AG) memiliki regulasi
antagonistik (Putterill et al. 2004). Over
ekspresi pada gen kelas A akan menekan
ekspresi gen kelas C, begitu juga sebaliknya.
Gambar 13 Konsep model ABC pada pembentukan
organ bunga (Putterill et al. 2004).

Informasi lain yang diketahui dari tanaman
model Arabidopsis adalah bahwa regulasi
pada kelompok MADS-Box memiliki jaringan
regulasi yang tidak searah. Over ekspresi
salah satu kelas gen dapat menginduksi
beberapa dan atau sekaligus menghambat
ekspresi gen kelas lainnya.
Selain menekan gen kelas C, transformasi
dan over ekspresi gen AP1 juga dapat
menginduksi gen induk pembungaan, LFY.
Terekspresinya gen LFY akan menginduksi
kembali gen dari semua kelas, termasuk kelas
C yang semula ditekan (Jack 2004). Ekspresi
fenotipe akan terlihat seperti bunga yang
normal namun berbeda pada tingkat
pertumbuhannya. Terekspresinya gen LFY
karena induksi oleh AP1 akan memacu
pertumbuhan tanaman lebih cepat dari
tanaman normal.
Isolasi DNA dan uji insersi dengan PCR
Isolasi DNA dan uji insersi dilakukan
sebagai konfirmasi hasil transformasi, apakah
planlet sudah terinsersi oleh gen target atau
tidak, walaupun sudah dapat tumbuh di media
seleksi. Hasil uji insersi dengan primer gen
insert menunjukkan bahwa tanaman putatif
transgenik anggrek dan kopi yang diuji tidak
terinsersi oleh gen AG dan AP1, sedangkan
tanaman tembakau terinsersi. Hal ini
ditunjukkan dengan munculnya amplikon
sebesar 315 bp (gen AG) dan 349 bp (gen
AP1) pada sampel tanaman tembakau tetapi
tidak munculnya amplikon pada sampel
anggrek dan kopi (Gambar 11-12). Kejadian
seperti ini wajar terjadi, karena efisiensi
transformasi memiliki persentase yang kecil.
Pengujian hanya dapat dilakukan pada satu
tanaman tiap perlakuan karena keterbatasan
sampel.
Kemampuan tanaman anggrek dan kopi
untuk hidup di media seleksi menunjukkan
tanaman ini sudah mengalami transformasi.
Namun tertransformasinya tanaman tersebut
tidak dapat dipastikan oleh T-DNA yang
membawa gen insert atau backbone (tulang
punggung) plasmid Ti, yaitu daerah plasmid
Ti diluar batas right border (RB) dan left
border (LB) T-DNA (daerah non T-DNA).
Kedua fragmen (T-DNA dan tulang
punggung) dalam konstruksi plasmid Ti yang
digunakan dalam transformasi sama-sama
mengandung marker antibiotik nptII, yaitu
gen penyandi resisten kanamisin. Bagian
fragmen dari plasmid Ti yang mana yang akan
terintegrasi pada kromosom tanaman tidak
dapat dipastikan karena merupakan
7
15
rekombinasi secara acak (Gelvin 2003) dan
memiliki peluang yang sama pada sistem
vektor biner (Wenck et al. 1997).
Informasi bahwa bagian backbone plasmid
Ti biner dapat ditransfer pada genom tanaman
pertama kali dilaporkan oleh Martineau et al.
(1994). Penelitian transformasi yang di-
lakukan oleh Ramanathan & Veluthambi
(1995) pada tanaman tembakau juga
menunjukkan insert yang terintegrasi pada
genom tembakau adalah gen penyandi resisten
kanamisin (nptII) yang terdapat pada daerah
backbone plasmid biner. Begitu pula
penelitian yang dilakukan oleh Kononov et al.
(1997) yang menunjukkan bahwa daerah
backbone terdapat pada genom tanaman yang
ditransformasi dan mencapai 75% dari total
tanaman yang ditransformasi. Mekanisme
tertransfernya daerah backbone merupakan
konsekuensi alami dari mekanisme kerja
protein VirD2 dalam mentransfer DNA
(Kononov et al. 1997), karena selain mengikat
kovalen pada ujung 5 T-DNA, VirD2 juga
dapat mengikat kovalen pada ujung 5 utas
non-T-DNA (Durrenberger et al. 1989).
Dengan demikian, kemampuan hidup
kultur hasil transformasi pada media seleksi
belum dapat dijadikan indikator suatu
tanaman merupakan tanaman transgenik
pembawa suatu gen insert sebelum dilakukan
pengujian molekuler.
SIMPULAN
Transformasi dengan A. tumefaciens pada
manggis menggunakan sumber eksplan biji
dan daun sulit dilakukan tanpa optimasi teknik
transformasi terlebih dahulu karena pola
pertumbuhan kalus tidak berasal dari luka.
Kalus atau embrio somatik berpotensi
digunakan sebagai sumber eksplan dalam
transformasi manggis melihat pertumbuhan-
nya yang cepat pada awal perkembangan.
Transformasi dengan A. tumefaciens pada
tembakau dapat dilakukan dengan baik dan
perubahannya mudah diamati. Pengujian
insersi pada anggrek dan kopi hasil
transformasi yang diduga membawa gen insert
memberikan hasil negatif karena keterbatasan
jumlah sampel yang diujikan, mengingat
efisiensi transformasi memiliki persentase
yang rendah.
Kemampuan tanaman hidup pada media
seleksi, belum merupakan jaminan tanaman
tersebut tersisipi oleh gen asing yang
diintroduksi sebelum dilakukan beberapa uji
molekuler.

SARAN
Penggunaan shaker selama proses
sterilisasi permukaan serta screening eksplan
asal rumah kaca perlu dilakukan untuk
menekan tingkat kontaminasi. Biji manggis
lebih memungkinkan ditransformasi dengan
particle bombardment karena sifatnya yang
poliembrio. Perlu penelitian lebih lanjut
mengenai struktur anatomi biji manggis dan
letak embrionya agar transformasi tepat
sasaran. Optimasi teknik dalam transformasi
manggis dapat dilakukan dengan perlakuan
fisik, optimasi waktu inokulasi dan ko-
kultivasi. Peningkatan efisiensi transformasi
dapat dilakukan dengan meningkatkan jumlah
eksplan yang ditransformasi. Pengujian
molekuler perlu dilakukan pada jumlah
sampel yang lebih banyak agar lebih mewakili
populasi yang diamati.
DAFTAR PUSTAKA
Chaidamsari T, Samanhudi, Budiani A,
Poerwanto R, Santoso D. 2006a. Ekspresi
fenotipe gen APETALA1 kakao (TcAP1)
pada eksplan tembakau. Menara
Perkebunan 74(1): 1-9.
Chaidamsari T, Samanhudi, Sugiarti H,
Santoso D, Angenent GC, Maagd RA de.
2006b. Isolation and characterization of an
AGAMOUS homologue from cocoa. Plant
Sci. 170: 368-975.
Dai S, Zheng P, Marmey P, Zhang S, Tian W,
Chen S, Beachy RN, Fauquet C. 2001.
Comperative analysis of transgenic rice
plants obtained by Agrobacterium-
mediated transformation and particle
bombardment. Mol. Breed. 7: 25-33.
Durrenberger F, Crameri A, Honh B,
Koukolikova-Nicola Z. 1989. Covalently
bound VirD2 protein of Agrobacterium
tumefaciens protects the T-DNA from
exonucleolytic degradation. Proc. Natl.
Acad. Sci .USA 86: 9154-9158.
Eckardt NA. 2003. Pattern of gene expression
in apomixis. Plant Cell 15: 1499-1501.
Gelvin SB. 2003. Agrobacterium-mediated
plant transformation: the biology behind
the gene-jockeying tool. Microbiol. Mol.
Biol. Rev. 67(1): 16-37.
Hansen G, Chilton MD. 1996. Agrolistic
transformation of plant cells : Integrated of
T-strands generated in planta. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93: 14978-14983.
8
16
Jack T. 2004. Molecular and genetic
mechanisms of floral control. Plant Cell
16: S1-S17.
Kononov ME, Bassuner B, Gelvin SB. 1997.
Integration of T-DNA binary vector
backbone sequences into the tobacco
genome: evidence for multiple complex
patterns of integration. Plant J 11(5): 945-
947.
Martineau B, Voelker TA, Sanders RA. 1994.
On defining T-DNA. Plant Cell 6: 1032-
1033.
Putterill J, Laurie R, Macknight R. 2004. Its
time to flower: the genetic control of
flowering time. BioEssays 26: 1-11.
Rahmawati S. 2006. Status perkembangan
perbaikan sifat genetik padi menggunakan
transformasi Agrobacterium. J.
Agrobiogen. 2(1): 36-44.
Ramanathan V, Veluthambi K. 1995. Transfer
of non-T-DNA portions of Agrobacterium
tumefaciens Ti plasmid pTiA6 from the
left terminus of TL-DNA. Plant. Mol. Biol
28: 1149-1154.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989,
Nolan C, editor. Molecular Cloning, A
Laboratory Manual. New York: Cold
Spring Harbor Laboratory.
Shrestha BR, Chin DP, Tokuhara K, Mii M.
2007. Efficient production of transgenic
plantls of Vanda through sonication-
assisted Agrobacterium-mediated trans-
formation of protocorm-like bodies. Plant
Biotech. 24 : 429-434.
Slamet-Loedin IH. 1994. Transformasi
genetik pada tanaman: Beberapa teknik
dan aspek penting. Hayati 1(2): 66-67.
Suwanto A. 1998. Bioteknologi molekuler:
Mengoptimalkan manfaat keanekaragaman
hayati melalui teknologi DNA rekom-
binan. Hayati 5: 25-28.
Venkatachalam P, Geetha N, Khandelwal A,
Shaila MS, Sita GL. 2000. Agrobacterium-
mediated genetic transformation and
regeneration of transgenic plants from
cotyledon explants of groundnut (Arachis
hypogaea L) via somatic embryogenesis.
Curr. Sci. 78(9): 1130-1136.
Wenck A, Czako M, Kanevski I, Marton L.
1997. Frequent collinear long transfer of
DNA inclusive of the whole binary
vector during Agrobacterium-mediated
transformation. Plant Mol. Biol. 34: 913-
922.
 17

LAMPIRAN
 10
18

Lampiran 1. Pembuatan larutan MS (Murashige & Skoog)

Kode Stok Vol pemakaian stok Konsentrasi akhir

Senyawa
Stok mg/L mg/250 ml per liter MS (ml) (mg/L)
A NH4OH 82500 20 1650
B KNO3 95000 20 1900
C CaCl2 . 2H2O 22000 5 440
H3BO3 310 6,2
KH2PO4 8500 170
D CoCl2 . 6H2O 1,3 5 0,025
Na2MoO4 . 2H2O 12,5 0,25
KI 41,5 0,83
MgSO4 . 7H2O 18500 370
MnSO4 . 4H2O 752,7 22,3
E 5
ZnSO4 . 7H2O 430 8,6
CuSO4 . 5H2O 1,3 0,025
Na2- EDTA 1,86 37,2
F 5
FeSO4 . 7H2O 1,39 27,8

Lampiran 2. Pembuatan buffer SDS

Komposisi Larutan stok Konsentrasi akhir

SDS (% b/v) 10 2
Glisin (M) 1 0,1
NaCl (M) 5 0,05
EDTA pH 8 (M) 0,5 0,01

Lampiran 3. Komposisi media LB (Luria Bertani Broth)

Komposisi Konsentrasi akhir (g/L)

Tripton 10
Yeast Extract 5
NaCl 5
Bacto Agar 15 (untuk LA)
pH diatur sampai 7,2 dengan larutan KOH 1N dan 0,1N.

Lampiran 4. Komposisi media ko-kultivasi

Komposisi Konsentrasi akhir

Larutan MS
Gula pasir (g/L) 30
Agar (g/L) 8 (hanya untuk media padat)
BAP (M) 2,2 (untuk daun) 22,2 (untuk biji)
TDZ (M) 2,27 (hanya untuk eksplan daun)
PVP (M) 1,39
Acetosiringone (mg/L) 200
pH diatur sampai 5,7-5,8 dengan larutan KOH 1N dan 0,1N.

Lampiran 5. Komposisi media eliminasi

Komposisi Konsentrasi akhir

Larutan MS
Gula pasir (g/L) 30
Agar (g/L) 8 (hanya untuk media padat)
BAP (M) 2,2 (untuk daun) 22,2 (untuk biji)
TDZ (M) 2,27 (hanya untuk eksplan daun)
PVP (M) 1,39
Cefotaksim (mg/L) 250
pH diatur sampai 5,7-5,8 dengan larutan KOH 1N dan 0,1N.
 11
19

Lampiran 6. Komposisi media seleksi

Komposisi Konsentrasi akhir

Larutan MS
Gula pasir (g/L) 30
Agar (g/L) 8 (hanya untuk media padat)
BAP (M) 2,2 (untuk daun) 22,2 (untuk biji)
TDZ (M) 2,27 (hanya untuk eksplan daun)
PVP (M) 1,39
Cefotaksim (mg/L) 250
Kanamisin (mg/L) 25
pH diatur sampai 5,7-5,8 dengan larutan KOH 1N dan 0,1N.

Lampiran 7. Komposisi MS vitamin

Senyawa mg/L g/100 ml

Myo-inositol 100 1
Thiamine 10 0,1
Nicotinic acid 1 0,01
Pyridoxine-HCl 1 0,01

Lampiran 8. Pembuatan larutan antibiotik

Senyawa Konsentrasi Stok (mg/L) Pelarut g/ml

Kanamisin 100000 Air 0,1
Cefotaksim 250000 Air 0,25
Rifampisin 25000 Air 0,025
Acetosiringone 250000 DMSO + Etanol absolut 0,25

Lampiran 9. Peta plasmid pBIN-AG dan pBIN-AP1

 12
20

Lampiran 10. Bagan alur penelitian

A. tumefaciens AGL0 dengan

konstruk
pBIN-AP1 dan pBIN-AG

Eksplan daun manggis dan

tembakau

Ko-kultivasi

Media eliminasi dan seleksi

Planlet putatif transgenik Planlet putatif transgenik

manggis dan tembakau anggrek dan kopi

Isolasi DNA

Uji insersi (PCR)

Tanaman Transgenik