1.

Perkenalan
Prosedur ini menjelaskan sakarifikasi enzimatik selulosa dari asli atau
dengan perlakuan biomassa lignoselulosa menjadi glukosa untuk menentukan
maksimum tingkat kecernaan mungkin (tingkat menjenuhkan dari tersedia secara
komersial atau dalam Rumah diproduksi persiapan selulase dan hidrolisis kali sampai
satu minggu digunakan).

2. Cakupan

2.1 Prosedur ini cocok untuk biomassa lignoselulosa. Jika biomassa dicuriga
memiliki beberapa kadar pati, berat kering persen selulosa dihitung dari
total glucan (LAP-002) harus dikoreksi untuk mengurangi kontribusi pati
total berat kering glukosa persen.
2.2 Semua analisis harus dilakukan sesuai dengan pedoman yang ditetapkan di
Etanol Rencana proyek Quality Assurance (QAP).

3. Terminology

3.1 Pretreatment biomassa - Biomassa yang telah mengalami penggilingan,

perlakuan kimia dengan air atau uap, kuat atau encer asam atau basa, atau
kimia fisik atau lainnya metode untuk membuat kadar selulosa dari bahan
lebih mudah diakses enzimatik tindakan
3.2 enzim selulase - persiapan enzim yang menunjukkan semua tiga selulolitik
sinergis Kegiatan: endo-1,4-b-D-glukanase, exo-1,4-b-glukosidase, atau b-
D-glucosidase kegiatan, yang hadir untuk luasan yang berbeda dalam
persiapan selulase yang berbeda.

4. Signifikansi dan Penggunaan

4.1 Batas maksimum daya cerna digunakan bersama dengan tes lain untuk
menentukan pemuatan enzim yang tepat untuk sakarifikasi biomassa.

5. Gangguan
5.1 spesimen uji tidak cocok untuk analisis dengan prosedur ini mencakup
asam dan alkalinepretreated sampel biomassa yang belum dicuci. Dicuci
biomassa pretreatment sampel yang mengandung asam bebas atau alkali
dapat berubah pH solusi untuk nilai-nilai luar berbagai aktivitas enzimatik.

6. Peralatan
6.1 Model VWR 1540 inkubator ditetapkan pada 50o 1oC.
.
6.2 Cole-Parmer Model 7637-20 "Roto-Torque" Tetap Kecepatan Rotator
6.3 A 24-slot besar-bersembunyi rak tabung reaksi yang dapat melekat pada
"Roto-Torque" Rotator
6.4 Model Eppendorf 5414 microcentrifuge.
6.5 pH meter
 6.6 Neraca Analiti , ketelitian 0,00001 g
6.7 Yellow Springs Instrument, Inc., Model 27 Glucose Analyzer or Model
2700 Select Biochemistry Analyzer
6.8 Pengeringan oven disesuaikan dengan 105oC 2oC.
6.9 A 200 mL dan 1000 mL Eppendorf Pipetman pipet dengan tips.

7. Reagen dan bahan

7.1 Tetrasiklin (10 mg / mL dalam etanol 70%).
7.2 Cycloheximide (10 mg / mL dalam air suling).
7.3 Sodium sitrat penyangga (0,1 M, pH 4,80).
7.4 enzim selulase aktivitas diketahui, FPU / mL.
7.5 enzim -glucosidase aktivitas diketahui, pNPGU / mL.
7.6 Solka Floc 200 NF, FCC (mikrokristalin selulosa) dari Brown Perusahaan
dengan abu, kelembaban, dan isi xilan ditentukan (lihat Proyek Etanol
Laboratorium Prosedur Analitis, LAP-001, -002, dan -005).
7.7 Eppendorf Aman-Lock 1.5-mL tabung microcentrifuge
7.8 mL botol kaca kilau dilengkapi dengan topi plastik berlapis

8. ES & H Pertimbangan dan Bahaya

8.1 Cycloheximide dan tetrasiklin yang berbahaya dan harus ditangani dengan
tepat peduli
8.2 Ikuti semua NREL Laboratorium Pedoman khusus Rencana Hygiene
berlaku.

9. Prosedur
9.1 Jumlah padatan harus ditentukan untuk semua selulosa yang mengandung
sampel yang akan dicerna (LAP-001).
Catatan: semua bahan lignoselulosa yang telah mengalami beberapa berair
pretreatment tidak harus menjalani setiap pengeringan apapun sebelum
enzim cerna, karena ireversibel runtuhnya pori dapat terjadi dalam struktur
mikro dari biomassa yang menyebabkan penurunan rilis enzimatik glukosa
dari selulosa. Selain itu, semua bahan lignoselulosa beku yang menjadi
dikenakan tes cerna tidak bisa telah dibekukan selama lebih dari satu bulan
sebelum analisis, karena, tergantung pada lingkungan, sublimasi bisa saja
terjadi, yang mengarah ke kemungkinan runtuhnya ireversibel micropores
di biomassa.
9.2 Timbang sampel biomassa sama dengan setara dengan 0,1 g selulosa pada
105oC sebuah dasar berat kering (kadar selulosa sampel awalnya ditetapkan
sebagai glukosa oleh LAP- 002, minus kontribusi dari setiap hadir pati,
LAP-016) dan menambah 20 mL kaca kilau botol. Juga, menimbang 0,1 g
Solka Floc MVS dan menambah botol lain.
9.3 Untuk setiap vial, tambahkan 5.0 mL 0,1 M, pH 4,8 sodium sitrat
penyangga.
 9.4 Untuk setiap vial, tambahkan 40 ml (400 Fg) tetrasiklin dan 30 mL (300
mg) cycloheximide ke mencegah pertumbuhan organisme selama
pencernaan.
9.5 Hitung jumlah air suling yang dibutuhkan untuk membawa volume total di
setiap vial untuk 10,00 mL setelah penambahan enzim ditentukan pada
langkah berikut. Tambahkan Volume dihitung sesuai air untuk setiap botol.
Semua solusi dan biomassa adalah diasumsikan memiliki berat jenis 1,000
g / mL. Jadi, jika 0.200 g biomassa ditambahkan untuk vial, diasumsikan
untuk menempati 0.200 mL dan 9,733 mL cairan yang akan ditambahkan.
9.6 Bawa isi dari setiap vial untuk 50oC dengan pemanasan di inkubator
ditetapkan pada 50o 1oC. Untuk masing-masing vial ditambahkan
volume yang sesuai dari persiapan enzim selulase untuk sama sekitar 60
FPU / g selulosa dan volume yang sesuai b-glukosidase enzim untuk sama
64 pNPGU / g selulosa.
Catatan: Jika laju pelepasan enzimatik glukosa harus diukur, semua isi botol
sebelum penambahan enzim harus berada di 50oC. Itu enzim selalu
ditambahkan terakhir sejak reaksi dimulai dengan penambahan tersebut
enzim
9.7 Siapkan kosong reaksi untuk substrat. Substrat kosong berisi penyangga,
air, dan jumlah yang sama dari substrat di 10.00 Volume mL
9.8 Siapkan kosong enzim untuk selulase dan b-glukosidase dengan penyangga,
air, dan Jumlah yang sama dari enzim.
9.9 Tutup botol erat dan menempatkan mereka di "Roto-Torque" kecepatan
tetap rotator ditetapkan pada sudut perkiraan 45oC yang telah ditempatkan
di inkubator VWR ditetapkan pada 50oC. Inkubasi dengan rotasi lembut
(68 RPM) untuk jangka waktu 72 sampai 168 jam atau sampai pelepasan
gula larut dari sampel (s) menjadi diabaikan bila diukur dengan YSI, seperti
yang dijelaskan pada langkah berikutnya
9.10 kemajuan reaksi harus diukur, sebuah 0,3-0,5 mL aliquot dihapus di setiap
yang telah ditentukan interval waktu setelah isi botol telah baik dicampur
dengan gemetar. Hal ini dicapai dengan menggunakan pipet 1,0 ml
Eppendorf Pipetman dengan ujung plastik tip 1.0-mL sedikit terpotong
(untuk memungkinkan padatan, serta cair, untuk menjadi ditarik ke orifice).
Sampel dikeluarkan ke dalam tabung microcentrifuge 1,5 mL dan
disentrifugasi selama 1,5 menit. supernatan dikenakan glukosa analisis
menggunakan yang YSI glukosa analyzer.

10. Perhitungan
10.1 Untuk menghitung cerna persen dari selulosa
ditambahkan ke botol kilau, menentukan konsentrasi
glukosa dalam supernatan disentrifugasi oleh YSI. Kurangi
 konsentrasi glukosa, jika ada, dari substrat dan kosong
enzim.
10.2 benar untuk hidrasi (kalikan pembacaan glukosa
0,9 untuk mengoreksi air molekul menambahkan pada
hidrolisis polimer selulosa) dan kalikan dengan 10 mL Total
volume assay.
Contoh: Jika analyzer glukosa membaca (dikoreksi dengan
kosong) adalah 9,9 mg / mL, maka jumlah selulosa dicerna
adalah: 0,0099 g / mL x 10 mL x 0,9 = 0,0891 g 10,3
Hitung persen pencernaan

%pencernaan = gr selulosa dicerna/gr selulosa ditambahkan

x 100 %

11. Laporan
11.1 Laporan selulosa persen dicerna dalam sampel, dua
tempat desimal, pada 105 C dasar berat kering. Mengutip
dasar yang digunakan dalam laporan.
11.2 Untuk mereplikasi analisis dari sampel yang sama,
melaporkan rata-rata, standar deviasi, dan persen
perbedaan relatif (RPD).

12. Presisi dan Bias

12.1 Ketepatan protokol ini belum ditetapkan karena
tergantung pada Sumber selulase dan komposisi substrat.
Tidak hanya akan persiapan yang berbeda dari selulase
menghidrolisis substrat identik dengan luasan yang
berbeda, tapi persiapan yang berbeda biomassa dengan
perlakuan menunjukkan jumlah yang berbeda homogenitas.

13. Quality Control

13.1 Dilaporkan angka penting: Biasanya hasilnya
dilaporkan sebagai persentase, dihitun untuk dua tempat
desimal, bersama dengan standar deviasi dan RPD. Uji
kondisi, khususnya pencernaan waktu, harus didefinisikan
ketika melaporkan hasil.

% Pencernaan = Gr selulosa dicerna/ gr selulosa

ditambahkan x 100%.
13.2 ulangan: Disarankan sampel dijalankan dalam
rangkap dua untuk memverifikasi reproduktifitas
13.3 Kosong: Enzim dan substrat kosong dijalankan
untuk mengoreksi kontribusi glukosa lainnya daripada yang
dihasilkan oleh hidrolisis selulosa
13.4 kriteria Perbedaan persen Relatif: Tidak ditentukan;
tergantung pada substrat yang diuji. persiapan yang
berbeda dari biomassa pretreated akan menunjukkan
jumlah yang berbeda dari homogenitas, yang akan
mempengaruhi sejauh mana mereka dihidrolisis.
13.5 Metode verifikasi standar: Solka Floc 200 NF
dicerna bersama sampel. Hidrolisis diharapkan berada di
kisaran 94,00-96,00%.
13.6 Kalibrasi standar verifikasi: Tidak berlaku.
13.7 Ukuran sampel: Tergantung pada komposisi
selulosa persen berat kering. Khas antara 0,10 dan 1,00
gram sampel akan diperlukan. Penyimpanan 14,8
13.8 Contoh: pra-perawatan sampel harus disimpan
lembab, atau beku tidak lebih dari satu bulan.
13.9 penyimpanan Standard: Tidak berlaku.
13.10 persiapan Standard: Tidak berlaku.
13.11 Definisi batch: Batch didefinisikan sebagai ulangan
sampel dan metode standar verifikasi dihidrolisis dengan
persiapan selulase identik dan diinkubasi selama waktu
yang sama.
13.12 Pengendalian grafik: Persen hidrolisis Solka Floc
200 NF akan memetakan, penggunaan persiapan yang
berbeda dari enzim selulase dan total waktu hidrolisis akan
dicatat.