Anda di halaman 1dari 13

BAB 4

MATERI DAN METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Desain penelitian yang digunakan adalah cross-sectional dengan jenis analitik

korelatif. Sesuai dengan tujuan penelitian ini yaitu mengidentifikasi korelasi

genotipe HPV dengan LSIL dan HSIL pada jaringan serviks yang diawetkan

menggunakan formalin dan dibenamkan dalam parafin formalin-fixed paraffin-

embedded.

4.2 Populasi, Besar Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel

4.2.1 Populasi

Populasi penelitian adalah blok parafin (FFPE) jaringan serviks dengan

LSIL dan HSIL dari pasien wanita aktif seksual di Rumah Sakit dr. Soetomo

Surabaya. Pemilihan sampel blok parafin menggunakan prinsip nonprobability

sampling dengan tehnik purposive sampling, yang dibantu oleh ahli Patologi

Anatomi. Ahli Patologi Anatomi melakukan pemilahan dan penyesuaian antara

slide representatif jaringan serviks dengan LSIL dan HSIL (pemeriksaan ulang

menggunakan mikroskop) dengan blok parafin, dimana sampel jaringan baik pada

slide maupun blok parafin berasal dari subjek pasien dengan LSIL dan HSIL.

Proses pemilihan ini dilakukan terhadap seluruh sampel penelitian dari subjek

lainnya.

Kriteria Inklusi :
a. Blok parafin jaringan serviks dengan LSIL dan HSIL dari pasien wanita aktif

seksual.

b. Jaringan serviks diperoleh dari hasil operasi histerektomi.

4.2.2 Besar sampel

Penelitian ini menggunakan rumus besar sampel dari Stuart dan Ord, dari

perhitungan besar sampel. Sampel penelitian (n) yang diperoleh dari perhitungan

rumus (Stuart dan Ord, 1994).


2
Z1-/2+Z1- +

n= 1n (1+r)/(1-r) 3

Nilai r = 0,5

Nilai = 0,05 sehingga Z1-/2n = 1,96

Nilai = 0,2 sehingga Z1- = 0,84

Pengamilan sampel penelitian dilakukan dengan tehnik purposive

sampling sebanyak 30 sampel.

4.2.3 Teknik pengambilan sampel

Pengambilan data subjek penelitian, data hasil operasi histerektomi, dan

pemeriksaan imaging (foto rontgen, USG, dan hasil lainnya) dari rekam medik,

serta pengambilan sampel blok parafin (FFPE) dari hasil operasi histerektomi

dilakukan di Rumah Sakit dr. Soetomo Surabaya. Pemeriksaan genotipe HPV

dengan metode Single Step PCR dan Reverse Line Blot dilakukan di

Laboratorium Biologi Molekuler FK UNAIR. Penelitian dilakukan dari bulan Mei

hingga Juni 2016.


4.3 Variabel Penelitian

Klasifikasi variabel pada penelitian ini adalah sebagai berikut :

4.3.1 Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah jaringan serviks dengan LSIL

dan HSIL.

4.3.2 Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah genotipe HPV pada LSIL

dan HSIL jaringan serviks.


.

4.4 Definisi operasional variabel pada penelitian ini adalah sebagai berikut:

Variabel Definisi Cara Ukur Alat Ukur Skala Ukur


Low Grade Pertumbuhan Shock freeze Mikroskop Kategori
Squamos sedikit abnormal Blok Parafin (Ordinal)
Intraephitelial dan lesi pada (FFPE) hasil
Lesion (LSIL) intrepithelial operasi
skuamos histerektomi
serviks kurang dalam larutan
dari 1/3 hingga nitrogen,
2/3 bagian analisis lesi
sel squamos
High Grade Pertumbuhan Shock freeze Mikroskop Kategori
Squamos sangat abnormal Blok Parafin (Ordinal)
Intraephitelial dan lesi pada (FFPE) hasil
Lesion (HSIL) intrepithelial operasi
skuamos histerektomi
serviks lebih dalam larutan
dari 2/3 bagian nitrogen,
analisis lesi
sel squamos
Genotipe HPV Satu set alel Analisis Ampliquality Numerik
yang genotipe HPV HPV Type
menentukan dengan Express
ekspresi mengevaluasi (Single Step
karakteristik PCR dan
setiap strip
human Reverse Line
papillomavirus
menggunakan Blot)
film
transparan
untuk
interpretasi
(termasuk
dalam kit
Ampliquality
HPV Type
Express
4.5 Kerangka Operasional

Penelitian dilakukan setelah mendapat persetujuan Majelis Komite Etik


Penelitian (Ethical Clearance)
Penentuan sampel penelitian secara purposive sampling (n = 30)

Pengumpulan data melalui pencatatan data subjek penelitian, hasil


pemeriksaan penunjang, serta data lainnya yang diperlukan dari rekam medik
Pengumpulan sediaan blok parafin

Pemotongan blok parafin

Pemerikasaan genotipe HPV dengan Reserve Line Blot menggunakan kit


Amplyquality HPV-type Express.

Analisis genotipe HPV dengan mengevaluasi setiap strip menggunakan film


transparan untuk interpretasi (termasuk dalam kit Ampliquality HPV Type
Express

Pelaporan
4.6 Bahan Penelitian

4.6.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikrotom, vortex, mesin

microcentrifuge (12.000 14.000 rpm), pipet otomatis, pipet micro (0,5 10 L,

2 20 L, 20-100 L, 100 1000 L), waterbath, kuvet RNA, spektrofotometri,

wadah tabung dengan alas icepack, spindown, PCR thermal cycler, orbital

agilator, lemari pendingin suhu -200 C atau -800 C, dan ampliquality HPV type

express, thermoshaker atau thermal bath (dubnoff) (Svizzera, 2008).

4.6.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah blok parafin (FFPE)

jaringan kanker squamos serviks hasil operasi histerektomi, tabung

microcentrifuga 1,5 mL, xylene, tips filter, ethanol 96-100%, buffer RF,

Proteinase K, buffer RB, spin column CR3, collection tubes (1,5 mL), DNAse I,

buffer RDD, buffer RW1, buffer RW, RNAse-free ddH2O, dH2O, 5 x reaction

buffer, nuclease-free water, mixed enzyme, alumunium foil, PCR tube, SYBR

Green master mix, , qPCR tube, masker, sarung tangan, dan tissue (Svizzera,

2008).

4.6.3 Prosedur kerja

Menyiapkan sampel: siapkan small sections (hingga 25 mg) dari fixed

bloks, embedded tissue. Pegang sections dengan pinset atau tusuk gigi dan

tempatkan sampel ke tabung microcentrifuge. Tambahkan 1 mL n-octane atau

xylene ke tiap tabung. Vortex dengan cepat dan inkubasi pada suhu kamar selama

sekitar 30 menit. Vortex sesekali. Centrifuge di 11.000 x g selama 3 menit. Pipet


off supernatan. Tambahkan 1 mL etanol (96-100%) ke tiap tabung. Tutup dan

campurkan dengan membalik beberapa kali. Centrifuge di 11.000 x g selama 3

menit. Pipet off supernatan. Ulangi ethanol washing step. Pipet off sebanyak

mungkin etanol. Inkubasi tabung terbuka pada suhu 37 C sampai etanol

menguap (+ 15 menit).
Pre-lyse sample: tambahkan 180 L Buffer T1 dan 25 l Proteinase K

solution. Vortex untuk campuran. Pastikan bahwa sampel benar-benar tertutup

dengan lysis solution. Inkubasi pada suhu 56C sampai didapat lisis komplit

(setidaknya 1-3 jam). Vortex sesekali selama inkubasi atau menggunakan shaking

incubator. Lyse sample: vortex sampel. Tambahkan 200 L Buffer B3, vortex

dengan keras dan inkubasi pada suhu 70 C selama 10 menit. Vortex sebentar.
Adjust DNA binding conditions: tambahkan 210 L etanol (96-100%) ke

sampel dan vortex dengan keras. Bind DNA: untuk setiap sampel, tempatkan satu

NucleoSpin Tissue Column ke dalam Collection Tube. Aplikasikan sampel ke

kolom. Centrifuge selama 1 menit pada 11.000 x g. Buang Collection Tube

dengan flow-through dan tempatkan kolom dalam Collection Tube baru.


Genotyping by reverse line blot, Preliminary steps: keluarkan reagen dari

dalam kulkas, kemudian biarkan beberapa menit dalam suhu ruangan.

Menyiapkan thermal bath / thermoshaker. Panaskan thermal bath / thermoshaker

ke 42C dan pastikan bahwa suhu tidak menyimpang lebih dari 0,5C selama

seluruh proses. Menghangatkan HUB-1 dan solusi CON-D1 di thermal bath /

thermoshaker. Jumlah setiap strip dengan pensil di atas black positioning line.

Sesaat spin down tabung dengan produk PCR.

Denaturation and hybridization: reaksi: 10 ml produk PCR, 20 ml

denaturation solution (DEN). Inkubasi selama 5 menit pada suhu ruangan.

Menyiapkan strip hibridasi: ambil strip dengan penjepit (selalu gunakan gloves
saat kerja pada strip). Letakan tray pada thermoshaker. Masukan strip dalam kanal

tray. Tambahkan 2 ml prewarmed HYB-1 solution pada tiap canal dengan strip

(pastikan strip terendam). Tambahkan reaksi 1 (30ml) pada canal. Inkubasi selama

60 menit pada suhu 420C ( 0,5oC), shaking tray gently ( 250 rpm).

Colorimetric visualization: menyiapkan solution, streptavidine-alkaline

phosphatase conjugate (CON): 5 sampel = 5 X 0,5 l CON solution, 5 X 2 ml

CON-D1 Solution (prewarmed). Menyedot semua cairan hibridasi yaitu 2ml

solution CON. Letakan tray pada thermoshaker 42oC ( 0,5oC) selama 15 menit,

shaking the tray gently. Menyedot semua cairan, cuci dengan 2 ml RIN solution,

shaking tray pada suhu kamar selama 2 menit. Aspirasi cairan pencuci. 2 ml RIN

solution, shaking tray dalam 2 menit pada suhu ruangan. Kosongkan tray. Stop

staining dengan mencuci menggunakan 2 ml stop solution selama 2 menit.

Aspirasi stop solution dan cuci selama 2 menit dengan distilled water. Ambil strip

dari tray dan keringkan atau dibiarkan kering. Cocokan strip dengan marker

(Svizzera, 2008).

4.1 Analisa data


Analisis data terkait dengan hasil penelitian laboratorium akan diolah

dengan prosedur sebagai berikut.


1. Data yang terkumpul akan diedit, coding, dan dilakuan entry ke dalam file

computer. Setelah itu dilakukan cleaning data.


2. Kemudian dilakukan analisis statistic dengan menggunakan software

SPSS 17 sebagai berikut :


- Pertama dilakukan analisis deskriptif dengan menghitung ukuran

kecenderungan sentral (mean, median) serta sebaran data (SD)

variable.
- Dilakukan uji normalitas data dengan uji Kolmogorov Smirnov untuk

mengetahui gambaran distribusi data.

Dilakukan uji independent t test untuk mengetahui hubungan antara infeksi

tunggal dan infeksi gabungan terhadap kejadian LSIL dan HSIL.


DAFTAR PUSTAKA

Bruni, Laia. 2010. Cervical Human Papillomavirus Prevalence in 5 Continents:


Meta-Analysis of 1 Million Women with Normal Cytological Findings.
The Journal of infectious diseases vol 202, no.12, hal: 17891799.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21067372.

Burd, E. 2003. Human Papillomavirus and Cervical Cancer. Clin Microbiol Rev
16, no.1, hal: 117. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/
S0140673607614160.

Castellsagu, Xavier. 2008. Natural History and Epidemiology of HPV Infection


and Cervical Cancer. Gynecologic Oncology vol 110 (3 SUPPL.2), hal:
47.

Conway, M J, and C Meyers. 2009. Replication and Assembly of Human


Papillomaviruses. Journal of dental research vol 88, no.4, hal: 307317.

Crowe, E., Pandeya, N., Julia M.L, Dobson, A.J., Kisely, S., Lambert, S.B.,
Whiteman, D.C. 2014. Effectiveness of Quadrivalent Human
Papillomavirus Vaccine for the Prevention of Cervical Abnormalities:
Case-control Study Nested within a Population Based Screening
Programme in Australia. BMJ research. http://www.BMJ 2014;348:g1458
doi: 10.1136/bmj.g1458

Doorbar,J; Ely, S; Mclean, C; Crawford, L. 1991. Spesific Interaction Betwen


HPV-16 E1-E4 and Cytokeratins Results in Collapse of Epithelial Cell
Intermediate Filament Network. Letters To Nature 352.

Dwipoyono, Bambang. 2007. Kanker Servik Dan Vaksin HPV. Indonesian


Journal of Cancer vol 3, hal: 8791.

Gomez D.T., Santos J.S. 2007. HUMAN PAPILLOMAVIRUS INFECTION


AND CERVICAL CANCER: PATHOGENESIS AND
EPIDEMIOLOGY. Communicating Current Research and Educational
Topics and Trends in Applied Microbiology hal: 680-687.

Kanodia, Shreya, Laura M Fahey, and W Martin Kast. 2007. Mechanisms Used
by Human Papillomaviruses to Escape the Host Immune Response.
Current cancer drug targets vol 7, no.1, hal: 7989.

Klaes, Ruediger. 1999. Detection of High-Risk Cervical Intraepithelial Neoplasia


and Cervical Cancer by Amplification of Transcripts Derived from
Integrated Papillomavirus Oncogenes. Cancer Research vol 59, no.24,
hal: 61326136.
Krivak TC, McBroom JW Elkas JC. Cervical and vaginal cancer. In: Berek JS,
Adashi EY, Hillard PA, (editor). 2002. Novaks ginecology. Edisi 13.
Baltimore: Lippincot Williams & Wilkin. Hal: 1199-1244.

Kumar, Himanshu, Taro Kawai, and Shizuo Akira. 2011. Pathogen Recognition
by the Innate Immune System. International reviews of immunology vol
30, no.1, hal: 1634.

Kurman, R J. 1994. Interim Guidelines for Management of Abnormal Cervical


Cytology. The 1992 National Cancer Institute Workshop. JAMA: the
journal of the American Medical Association vol 271, no.23, hal: 1866
1869

Madkan, V K. 2007. The Oncogenic Potential of Human Papillomaviruses: A


Review on the Role of Host Genetics and Environmental Cofactors. The
British journal of dermatology vol 157, no.2, hal: 228241.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17553059.

Meyers, C, T J Mayer, and M a Ozbun. 1997. Synthesis of Infectious Human


Papillomavirus Type 18 in Differentiating Epithelium Transfected with
Viral DNA. Journal of virology vol 71, no.10, hal: 73817386.

Michal Lehoux, Claudia M. DAbramo, and Jacques Archambault. 2009.


Molecular Mechanisms of Human Papillomavirus-Induced
Carcinogenesis. Am J Hum Biol vol 21, no.3, hal: 365370.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4654617/.

Moody, Cary a, and Laimonis a Laimins. 2010. Human Papillomavirus


Oncoproteins: Pathways to Transformation. Nature reviews. Cancer vol
10, no.8, hal: 550560. http://dx.doi.org/10.1038/nrc2886.

Naus, Monica. 2008. HPV Vaccine Revolutionizes Prevention of Cervical


Cancer. BC Medical Journal vol 50, no.5, hal: 263-264.

Nees, Matthias. 2001. Papillomavirus Type 16 Oncogenes Downregulate


Expression of Interferon-Responsive Genes and Upregulate Proliferation-
Associated and NF-kappaB-Responsive Genes in Cervical Keratinocytes.
J Virol vol 75, no.9, hal: 42834296. http://www.ncbi.nlm.nih.g
ov/pubmed/11287578.

Noviana, Hera. 2012. Human Papillomavirus Dan Kanker Serviks. Kalbe


Genomics Laboratory vol 39, no.1, hal: 6566.

Piras, Franca. 2011. Prevalence of Human Papillomavirus Infection in Women in


Benin, West Africa. Virology journal vol 8, hal: 514.

Pista, A., A. Oliveira, N. Verdasca, and F. Ribeiro. 2011. Single and Multiple
Human Papillomavirus Infections in Cervical Abnormalities in Portuguese
Women. Clinical Microbiology and Infection vol 17, no.6, hal: 941946.
http://dx.doi.org/10.1111/j.1469-0691.2010.03387.x.

Resende, Leandro Santos. 2014. A Portrait of Single and Multiple HPV Type
Infections in Brazilian Women of Different Age Strata with Squamous or
Glandular Cervical Lesions. BMC infectious diseases vol 14, no.1, hal:
214. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24751127.

Sahiratmadja, Edhyana. 2014. Multiple Human Papilloma Virus Infections


Predominant in Squamous Cell Cervical Carcinoma in Bandung. Vol 33,
no.1, hal: 33-43.

Schellekens, Maaike C. 2004. Prevalence of Single and Multiple HPV Types in


Cervical Carcinomas in Jakarta, Indonesia. Gynecologic Oncology vol
93, no.1, hal: 4953.

Senba, Masachika, and Naoki Mori. 2012. Mechanisms of Virus Immune


Evasion Lead to Development from Chronic Inflammation to Cancer
Formation Associated with Human Papillomavirus Infection. Oncology
Reviews vol 6, no.2, hal: 135144.

Sherris J., Wittet S., Kleine A., Sellors J., Luciani S., Sankaranarayanan R.,
Barone M.A. 2009. Evidence-Based,Alternative Cervical Cancer
Screening Approaches in Low-Resource Settings. International Journal
of Gynecology & Obstetrics vol 35, no.3, hal: 147-151.

Sistem Informasi Rumah Sakit (2014), Dirjen P3L Kementerian Kesehatan RI

Smith, Jennifer S. 2007. Human Papillomavirus Type Distribution in Invasive


Cervical Cancer and High-Grade Cervical Lesions: A Meta-Analysis
Update. International Journal of Cancer vol 121, no.3, hal: 621632.

Stanley, Margaret, Ligia A. Pinto, and Connie Trimble. 2012. Human


Papillomavirus Vaccines - Immune Responses. Vaccine vol 30
(SUPPL.5), hal: 8387. http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2012.04.106.

Steenbergen, Renske D M, Peter J F Snijders, Danille a M Heideman, and Chris


J L M Meijer. 2014. Clinical Implications of (Epi)genetic Changes in
HPV-Induced Cervical Precancerous Lesions. Nature reviews. Cancer vol
14, no.6, hal: 395405.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24854082.

Stipan Jonjic1, Marina Babic1, Bojan Polic1, and Astrid Krmpotic1. 2009.
Immune Evasion of Natural Killer Cells by Viruses. Cancer
Immunology and Immunotherapy vol 58, no.6, hal: 867876.

Stoecklinger, Angelika. 2011. Langerin+ Dermal Dendritic Cells Are Critical for
CD8+ T Cell Activation and IgH -1 Class Switching in Response to Gene
Gun Vaccines. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950) vol 186,
no.3, hal: 13771383.

Stubenrauch, F, H B Lim, and L A Laimins. 1998. Differential Requirements for


Conserved E2 Binding Sites in the Life Cycle of Oncogenic Human
Papillomavirus Type 31. Journal of virology vol 72, no.2, hal: 1071
1077. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?
artid=124579&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.

Svizerra, Via. 2008. User Manual Ampliquality HPV-Type Express v.3.0. Italy:
AB Analitica

Tindle, R, W. 2003. Cervical Cancer. Clin. Evid. 2(January), hal: 17.

Tobing, Maringan Diapari Lumban. 2014. Human Papillomavirus Genotypes


Profile in Cervical Cancer Patients at Dr. Hasan Sadikin General Hospital,
Bandung, Indonesia. Asian Pacific journal of cancer prevention: APJCP
vol 15, no.14, hal: 57815785.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25081701.

WHO. 2014. Comprehensive Cervical Cancer Control. Geneva, hal: 5864 dan
366378.

Wiebe, E., Denny, L., Thomas, G. 2012. Cancer of Cervix Uteri. International
Journal of Gynecology and Obstetrics.
http://www.elsevier.com/locate/ijgo.

Woodman, C. S.; Collins, C.; Young, and L.S. Young. 2007. The Natural History
of Cervical HPV Infection: Unresolved Issues - ProQuest. Nature
Reviews Cancer 7(January), hal: 1122.
http://www.ulib.niu.edu:2205/docview/275099916/fulltextPDF/F29ABC7
210B746CEPQ/18?accountid=12846.