Amplificacin por RT-PCR end point de fragmento del gen glutatin-

s-transferasa mu1 de Homo sapiens, a partir de RNA extrado de

clulas A549
Cajas, D1. Gavilanes, A1. Jarrn, A1. Lpez, N1.
1
Laboratorio de Biotecnologa Humana, Universidad de las Fuerzas Armadas-
ESPE

RESUMEN: El RNA es el encargado directo de la sntesis proteica, pero

muchas veces es utilizado para la obtencin de DNAc. En la RT-PCR de un
paso, tanto la transcripcin reversa como la PCR se realizan
simultneamente en un solo tubo, manteniendo las condiciones ptimas
para ambas reacciones. El presente trabajo tuvo como objetivo amplificar el
RNA (fragmento que codifica gen GST) mediante la tcnica de RT-PCR,
extrado de la lnea celular A549 de cncer de pulmn. Se emple tripsina
EDTA para obtener una dilucin celular A549 en PBS. El RNA extrado fue
verificado por electroforesis, para luego entrar a una RT-PCR end point donde
se obtuvo el DNAc de la muestra de RNA para posteriormente pasar a la
amplificacin el fragmento del gen GST. Se realiz una electroforesis para
verificar la amplificacin del gen. No tuvimos buenos resultados de la
electroforesis del RNA de clulas A549, por lo que para realizar la RT-PCR, se
utiliz muestras de RNA proporcionado por el laboratorio de nanomedicina y
nanobiologa (biotecnologa humana) obteniendo la amplificacin de un
fragmento de aproximadamente 130pb; estos resultados concuerdan con el
tamao del fragmento flanqueado en la secuencia del gen glutation S
transferasa mu1 en homo sapiens.

PALABRAS CLAVE: clulas A549, gen glutation S transferasa, RT-PCR end

point, DNAc

ABSTRACT:
RNA is the direct agent of protein synthesis, but is often used to obtain cDNA.
In one-step RT-PCR, both reverse transcription and PCR are performed
simultaneously in a single tube, maintaining optimum conditions for both
reactions. The present work aimed to amplify the RNA (fragment encoding
GST gene) by the RT-PCR technique, extracted from the A549 cell line of lung
cancer. EDTA trypsin was used to obtain a cell dilution A549 in PBS. The
extracted RNA was verified by electrophoresis, then entered a RT-PCR end
point where the cDNA was obtained from the RNA sample and then the GST
gene fragment was amplified. Electrophoresis was performed to verify the
amplification of the gene. We did not obtain favorable results from the RNA

1
electrophoresis of A549 cells, in order to perform the RT-PCR, RNA samples
were provided by the nanomedicine and nanobiology laboratory (human
biotechnology) and then used, obtaining the amplification of a fragment of
approximately 130bp; These results are consistent with the size of the
flanking fragment in the sequence of the glutathione S transferase mu1 gene
in homo sapiens.

KEY WORDS: A549 cells, gen glutation S transferasa, RT-PCR end point,
cDNA.
INTRODUCCIN complementario (cDNA) el cual es
estable y puede resistir la
El RNA es el cido nucleico ms metodologa PCR, a esta tcnica se
abundante dentro de la clula, es la conoce como RT-PCR, mediante
el encargado directo de la sntesis este mtodo se puede analizar de
proteica, est constituido por manera rpida y sensible la
regiones totalmente codificantes, expresin gnica (Dorn, 2007).
es decir no contiene intrones, por
lo que es la secuencia propia que Existen dos tipos de RT-PCR, las de
codifica el gen a ser expresado. un solo paso, o aquellas en las que
Existen diversas formas de se tiene dos pasos, para la RT-PCR
extraccin de mRNA, la ms de un paso, tanto la transcripcin
utilizada es mediante TRIzol, es un reversa como la PCR se realizan
reactivo listo para utilizarse en el simultneamente en un solo tubo,
aislamiento de RNA de clulas y manteniendo las condiciones
tejidos, es una solucin de fenol e ptimas para ambas reacciones.
isocianato de guanidina que Mientras que en la RT-PCR de dos
durante la lisis celular mantiene la pasos, cada fase posee condiciones
integridad del RNA, al mismo ptimas, la retrotranscripcin se
tiempo que altera la estabilidad de realiza primero para despus dar
las clulas y disuelve los lugar a la PCR.
componentes celulares, para hacer
ms fcil su extraccin (Dahm, La lnea celular utilizada para la
2005). extraccin del gen GST, fueron
clulas humanas del epitelio
Dado que el RNA es de una sola alveolar, son clulas encargadas de
hebra y es una molcula inestable, la difusin de los gases y otras
es necesario hacer una sustancias a travs del epitelio
transcripcin reversa mediante la alveolar de los pulmones, son
enzima (transcriptasa reversa) conocidas como lneas celulares
antes de iniciar la amplificacin por A549.
PCR. La transcripcin reversa
genera una copia de la hebra de El gen de la Glutatin S
RNA, pero esta copia es DNA transferasa, tambin conocido

2
como GST, es el encargado de Se coloc 250 L de cloroformo,
codificar una protena de
naturaleza enzimtica que cataliza se homogeneiz por inversin, se
reacciones como la conjugacin, incub tres minutos y se centrifug
fijacin y transformacin del 15 minutos a 12000 g a 4 C.
glutatin con otros sustratos Se puso 500 L de isopropanol y
electroflicos para dar un efecto se homogeneiz dos veces por
destoxificante, la produccin de inversin. Se dej 10 minutos y se
esta enzima combate el estrs centrifug 10 minutos a 12000 g a
oxidativo de la clula, 4 C.
permitindole funcionar en mejores Se removi el sobrenadante. El
condiciones (Watnabe,2008). precipitado de RNA total forma un
pellet gelatinoso blanquecino en el
El objetivo del presente trabajo es fondo del tubo.
la amplificacin de RNA (fragmento Para el lavado del RNA se re
que codifica gen GST) mediante la suspendi el pellet en etanol al
tcnica de RT-PCR, extrado de la 75%, se homogeniz en vortex y se
lnea celular A549 de cncer de centrifug 5 minutos a 7500 g y 4
pulmn. C.
Se descart el sobrenadante, se
sec y solubiliz el pellet en 20
METODOLOGA L de agua libre de RNAsas e

Dilucin de clulas A549 en incubamos a 55 C por 10 minutos.

PBS Las muestras se dejan a -80 C.
Se emple tripsina EDTA para Se alicuotaron tres tubos que
obtener una dilucin celular en PBS corresponden a la muestra, el
de 1,5 a 2 millones de clulas control negativo de RNA y el
A549, cultivadas en medio control negativo de DNA.
HAMSF12K.
Electroforesis
Extraccin de RNA Para verificar la extraccin se
Las muestras de RNA fueron realiz la corrida electrofortica en
extradas usando los solventes un gel de agarosa al 1%
orgnicos TRIzol LS Reagent y previamente preparado. Se corri a
cloroformo. 100 voltios por 1 hora.
Se coloc 250 L de clulas
RT-PCR end point
A549 disueltas en PBS, despus se Para realizar la RT-PCR end point se
puso 750 L de TRIzol, se utiliz el kit SuperScript III One-
homogeneiz por pipeteo y se Step RT-PCR System with
incub por 5 minutos. Platinum Taq DNA Polymerase y
se us los primers descritos en la

3
Tabla 1 para el gen glutatin-S- RT/Platinum
transferasa mu1 (transcrito Taq Mix
variante 2) en humanos (GSTM1). 10x Buffer 2 L
El tamao del amplicon se Agua grado 2.75 L
determin mediante el software ARN
Primer Blast de NCBI donde se
ingres la secuencia del gen Se prepararon dos muestras y
GSTM1 [Anexo 1] y los primers adems se hizo el control negativo
forward y reverse. de RNA y el control negativo de
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix
Tabla 1. Primers de GSTM1 donde se coloc 0,5 L de Taq DNA
empleados para la RT-PCR end point polimerasa Platinum para verificar
si exista contaminacin por ADN.
Tama Se realiz la amplificacin de la
o del muestras en un termociclador
Gen Primers
Amplic programado segn se detalla en la
on Tabla
Fw: GAT ACT
GGG GTA CTG
GST GGA CAT CC 130 pb
M1 Rev: CCA CTG Tabla 3. Programacin del
GCT TCT GTC termociclador para la RT-PCR end
ATA ATC AGG point.
t Cicl
Etapas T C
(min) os
Forward (Fw), Reverse (Rev).
Sntesis de
cDNA
55 30 1
Se realizaron los clculos para el Denaturacin
ensamblaje de la RT-PCR. Los inicial
95 2 1
valores obtenidos se encuentran en Denaturacin 95 0.5 -
la Tabla 2. Annealing 58 1 35
Extensin 68 0.5 -
Tabla 2. Clculos para el ensamblaje Extensin final 68 5 1
de la RT-PCR. Espera 4 10 1
Reactivo Volumen 1X
(12.5 L) RESULTADOS
Mix de 6.25 L
reaccin 2X Extraccin de ARN total de clulas
Primer 0.5 L A549
forward El resultado de la corrida
Primer 0.5 L electrofortica en gel de agarosa al
reverse 1% no fue el esperado. En la Figura
SuperScript 0.5 L 1, para las pruebas positivas, no se
III observa una banda clara tanto en
el pocillo 1 (C+1) como en el

4
pocillo 2 (C+2). En el pocillo 3 no
hay ninguna banda por ser la
prueba negativa (C-). El cuarto
pocillo presenta el marcador
molecular de 1 Kb que se utiliz.

RT-PCR end point de fragmento

de gen glutatin s transferasa
mu1
Para la posterior amplificacin por
RT-PCR end point, las muestras con
RNA fueron proporcionadas por el
laboratorio nanomedicina y
nanobiologa (biotecnologa
humana) de la Universidad de las
Fuerzas Armandas ESPE.

En la figura 2 se representa la
amplificacin de las muestras por
RT-PCR end point. En el pocillo 1
(C+1) y el pocillo 2 (C+2) se
presentan fragmentos de
aproximadamente 130 pb. El Figura 1. Extraccin de ARN total de clulas
pocillo 3 (C-ARN) es el control A549. Pocillo 1= (C+1). Pocillo 2=(C+2). Pocillo
3= (C-). Pocillo 4= marcador molecular de 1kb.
negativo de RNA donde no hay
amplificacin. El pocillo 4 (C-ADN)
es el control negativo de
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix
donde tampoco hay amplificacin.
El pocillo 5 es el marcador
molecular de 100pb.

5

Figura 2. RT-PCR end point de un fragmento
del gen GSTM1 variante 2 de humanos. Pocillo
1 (C+1) = Cadena de aproximadamente 130
pb. Pocillo 2 (C+2)= Cadena de
aproximadamente 130 pb. Pocillo 3 (C-ARN)=
Sin amplificacin por ser control negativo de
RNA. Pocillo 4 (C-ADN)= Sin amplificacin por
ser control negativo de SuperScript III
RT/Platinum Taq Mix. Pocillo 5= Marcador
molecular de 100pb.
DISCUSIN
Para llevar a cabo la extraccin de
RNA total de clulas A549 se
emple el reactivo TRIzol; este es
una solucin monofsica de fenol e
isotiocianato de guanidina, la cual
permite aislar el RNA total o RNA,
DNA y protenas simultneamente,
de clulas o tejidos de humanos,
animales, plantas, levaduras o
bacterias dentro de una hora
(Thermosfisher scientific, 2017).
Para la evaluacin de la integridad
utilizamos una electroforesis en gel
de agarosa al 1%, para determinar
la relacin de las bandas 28S:18S;
pero no se pudo obtener banda
6
alguna en ninguno de los dos
pocillos con controles positivos de
RNA (figura 1).
El motivo por el cual no se
observaron bandas, puede deberse
a la formacin de estructuras
secundarias intracatenarias de
RNA, resultado de no realizar una
electroforesis con gel
desnaturalizante; esto pudo haber
generado que la muestra no posea
bandas debido a una obstruccin
de los poros del gel (Gmez y
Royo; 2008). A pesar de la
evidencia mencionada
anteriormente, Fernndez y Surez
(2010) indican que el no usar geles
desnaturalizantes, provoca el
aparecimiento de una mancha
difusa en el pocillo en el que fue
cargada la muestra; por lo que esta
no parece ser la causa de nuestro
resultado.
La mala manipulacin de la
muestra puede traer consigo la
contaminacin de la misma con
RNAsas. Estas son enzimas que
catalizan la degradacin del RNA y
pueden ser introducidas
accidentalmente durante el
procedimiento de manipulacin de
la muestra, por lo cual debe
utilizarse durante todo el
procedimiento guantes de nitrilo y
todo el material debe estar estril,
ya que las mismas pueden
encontrarse en la piel o en el
ambiente (Gmez y Royo; 2008). El
no emplear inhibidores de RNAsas
en equipos empleados
(micropipetas o gradillas) (Nature,
2014), o la ya antes mencionada
mala manipulacin de la muestra,
pudo ser la causa del resultado
obtenido.
Mediante la herramienta Primer
Blast del NCBI, se determin que el
fragmento del gen GSTM1
(transcrito variante 2) de humanos
[anexo 1], flanqueado por los
primers es de 130pb. La
amplificacin por RT-PCR end point
del fragmento nos dio bandas de
aproximadamente 130pb en los
dos pocillos cargados con los
controles positivos, en el pocillo 3
(C-ARN) no se observ banda y en
el pocillo 4 (C-ADN) tampoco se
observa banda pero se puede
observar ligeramente algo de
smear por debajo de la banda de
100 pb del marcador (figura 2). El
smear encontrado en el pocillo 4 se
debe a la formacin de primer
dimers y no a la presencia de DNA
remanente despus de la
purificacin del RNA extrado, estas
estructuras son pequeos
amplicones de 30 a 80 pb que se
forman a partir de la hibridacin de
los primers forward y reverse,
gracias a la complementariedad
de algunas de sus bases (Roche,
2002). Este resultado indica que la
amplificacin del fragmento de 130
pb se logr exitosamente,
demostrando que las condiciones a
las que se llev a cabo la RT-PCR
end point y los primers empleados
fueron adecuados para obtener el
resultado esperado.
CONCLUSIONES
7
No se logr la extraccin de RNA de
clulas A549 debido a una mala
prctica en el procedimiento de
extraccin, se dio una degradacin del
RNA, posiblemente por la
contaminacin con RNAsas, debido a
esto no se logr observar bandas en la
corrida electrofortica
correspondientes a RNA.
En el gel de agarosa se pudo observar
manchas que representan el RNA
degradado, debido a la mala ejecucin
de la tcnica.
Se logr la amplificacin de un
fragmento de aproximadamente 130
pb que concuerda con el gen
correspondiente a la Glutatin S
Transferasa, mediante la tcnica de
RT-PCR y el RNA proporcionado por el
laboratorio de Biotecnologa Humana
de la Universidad de las Fuerzas
Armadas.
RECOMENDACIONES
La ejecucin de la tcnica para la
extraccin de RNA debe ser lo
mejor posible para as evitar la
contaminacin por RNAsas y la
degradacin del cido nucleico.
Se podra utilizar inhibidores de
RNAasas en la extraccin de RNA
para evitar su degradacin y
asegurar el xito de la prctica.
BIBLIOGRAFA
Dahm, R. (2005). Friedrich
Miescher and the discovery
of DNA. Developmental
Biology

Doran, G. (2007). RNAi Is
one suffix
sufficient?. Journal of RNAi
and Gene Silencing
Fernndez, M; Surez, S.
(2010). DGGE: electroforesis
en gel con gradiente
desnaturalizante. Instituto
Nacional de Ecologa y
Cambio Climtico. Mxico.
Gmez, E; Royo, J. (2008).
PRCTICAS DE GENTICA DEL
DESARROLLO. Universidad de
Alcal. Madrid, Espaa.
Nature. (2014). Protocols
Exchange: RNA exrtraction
troubleshooting. Recuperado
el 13 de enero del 2017 de:
http://www.nature.com/protoc
olexchange/system/uploads/4
603/original/Table_2._Troubles
hooting_-_1.pdf?1467723266
Roche. (2002). Optimization
of reactions to Reduce
Formation of Primer Dimers.
Technical Note No. LC 1.
Alemania. Recuperado el 13
de enero del 2017 de:
https://www.core-facility.uni-
freiburg.de/qpcrddpcr/lc480o
bj/primerdimer.
Thermo Fisher Scientific.
(2017). TRIzol Reagent.
Recuperado el 13 de enero
del 2017 de:
https://www.thermofisher.co
8
m/order/catalog/product/155
96026
Watanabe, T., Totoki, Y.,
Toyoda, A., et al (2008).
Endogenous siRNAs from
naturally formed dsRNAs
regulate transcripts in mouse
oocytes. Nature
ANEXOS
Anexo 1.
Secuencia del gen glutatin S-
transferasa mu 1 de la especie
Homo sapiens, variante del
transcrito 2, mRNA.
NCBI Reference Sequence: NM_146421.2
TGTCCCCTCTCCGGAGCTCTTATACTC
TGAGCCCTGCTCGGTTTAGGCCTGTC
TGCGGAATCCGCACCAACCAGCACCA
TGCCCATGATACTGGGGTACTGGGAC
ATCCGCGGGCTGGCCCACGCCATCC
GCCTGCTCCTGGAATACACAGACTCA
AGCTATGAGGAAAAGAAGTACACGAT
GGGGGACGCTCCTGATTATGACAGAA
GCCAGTGGCTGAATGAAAAATTCAAG
CTGGGCCTGGACTTTCCCAATCTGCC
CTACTTGATTGATGGGGCTCACAAGA
TCACCCAGAGCAACGCCATCTTGTGC
TACATTGCCCGCAAGCACAACCTGTG
TGGGGAGACAGAAGAGGAGAAGATT
CGTGTGGACATTTTGGAGAACCAGAC
CATGGACAACCATATGCAGCTGGGCA
TGATCTGCTACAATCCAGAATTTGAGA
AACTGAAGCCAAAGTACTTGGAGGA
ACTCCCTGAAAAGCTAAAGCTCTACT
CAGAGTTTCTGGGGAAGCGGCCATG
GTTTGCAGGAAACAAGGGCTTGGAG
AAGATCTCTGCCTACATGAAGTCCAG
CCGCTTCCTCCCAAGACCTGTGTTCT TTAGGCCTACCTGATGGAAGTAAAGC
CAAAGATGGCTGTCTGGGGCAACAA CTCAACCACAAAAAAAAAAAAAAAA
GTAGGGCCTTGAAGGCCAGGAGGTG AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
GGAGTGAGGAGCCCATACTCAGCCT AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
GCTGCCCAGGCTGTGCAGCGCAGCT AAAAAAAAAAAAAAAA
GGACTCTGCATCCCAGCACCTGCCTC
CTCGTTCCTTTCTCCTGTTTATTCCCAT
CTTTACTCCCAAGACTTCATTGTCCCT
CTTCACTCCCCCTAAACCCCTGTCCCA
TGCAGGCCCTTTGAAGCCTCAGCTAC
CCACTATCCTTCGTGAACATCCCCTCC
CATCATTACCCTTCCCTGCACTAAAGC
CAGCCTGACCTTCCTTCCTGTTAGTG
GTTGTGTCTGCTTTAAAGGGCCTGCC
TGGCCCCTCGCCTGTGGAGCTCAGC
CCCGAGCTGTCCCCGTGTTGCATGAA
GGAGCAGCATTGACTGGTTTACAGGC
CCTGCTCCTGCAGCATGGTCCCTGCC