Anda di halaman 1dari 12

ROLLING CIRCLE REPLICATION, DAN REVERSE TRANSCRIPTION

PADA RETROVIRUS

RESUME

Disusun Untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Genetika I


Yang dibina oleh Prof. Dr. H. Agr. M. Amin, M. Si

Oleh:
Kelompok 13
Off H / 2015
Ida Nurpitasari ( 150342604029 )
Siti Rayhanah (150342605454 )

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM


UNIVERSITAS NEGERI MALANG
JURUSAN BIOLOGI
Maret 2017
Percobaan Meselson dan Stahl
Pada tahun 1958 Matthew Meselson dan Franklin Stahl melakukan percobaan
untuk membuktikan bahwa replikasi DNA itu secara semikonservatif. Replikasi
semikonservatif berarti bahwa DNA double helix melakukan replikasi, setiap double
helix terdiri dari satu untaian helix asli dan yang satu untaian dari hasil dari sintesis
baru.

Untuk membuktikan teori tersebut Meselson dan Stahl menggunakan isotop


nitrogen yang berlainan untuk membedakan DNA lama dan DNA baru. Nitrogen
15
merupakan unsur pokok DNA. Isotop nitrogen yang digunakan adalah N yang
14
merupakan isotop berat nitrogen dan N yang merupakan isotop nitrogen yang
ringan. Kemudian mereka mengkulturkan bacteria E. Coli dalam medium yang
15
mengandung N selama beberapa generasi. Sehingga dihasilkan bakteri yang
mengandung DNA 15N yang akan menjadi lebih berat dari pada berat DNA biasa.
Perbedaan bobot ini dapat diketahui dengan sentrifugasi dengan gradien CsCl.
Dengan menumbuhkan E. Coli dalam isotop 15N sampai beberapa generasi, Meselson
15
dan Stahl memperoleh populasi sel yang berisi molekul-molekul berlabel N
seluruhnya.

Selanjutnya bacteria E. Coli dipindahkan ke medium normal yang


mengandung 14N. Langkah selanjutnya disentrifugasi secara terpisah di dalam gradien
kerapatan CsCl. CsCl ini berfungsi untuk memisahkan DNA yang memiliki
kepadatan yang berbeda.

Diketahui bahwa sesudah satu kali putaran replikasi, DNA pada sel anak tidak
mempunyai kepadatan baik 15N asli ataupun 14N murni, tetapi ditemukan suatu jenis
tunggal dengan kepadatan pertengahan bastar 15N-14N, tepat seperti yang diharapkan
dari replikasi yang diajukan oleh Watson dan Crick. Bila sel anak kemudian dibiarkan
untuk membelah diri lagi, dua jenis DNA timbul di dalam gradien kira-kira setengah
15
DNA menunjukkan kepadatan bastar N-14N, sedangkan sisanya menunjukkan
14 14
kepadatan N murni. Sementara sel terus membelah diri di dalam medium N,
14
perbandingan DNA menunjukkan makin meningkatnya kepadatan N dalam
populasi, tetapi untuk banyak generasi, gelang samar-samar terlihat pada posisi DNA
15
N-14N di dalam gradien.

Percobaan Meselson-Stahl sangat berharga karena tidak hanya menetapkan


cara replikasi DNA, tetapi juga menyingkirkan kemungkinan-kemungkinan cara lain.
Misalnya, mungkin dapat digagaskan bahwa replikasi itu konservatif yaitu dupleks
asli bertindak sebagai pencetak untuk dupleks baru, tetapi duplek itu tetap utuh,
sedemikian hingga pada akhir satu putaran replikasi terlihat heliks ganda yang lama
dan yang baru. Dalam hal ini, DNA 15N-14N bastar tidak terbentuk. Akan tetapi, hasil
percobaan lain membuktikan sebaliknya, replikasi DNA dengan cara terpencar
(dispersif) juga dikesampingkan oleh percobaan Meselson-Stahl. Dalam percobaan
dispersif ini tidak ada pola transmisi yang terjadi dan bahwa benang-benang DNA
induk putus dimana saja selama proses replikasi.

Dengan cara demikian dupleks-dupleks DNA didalam sel-sel anak


mengandung berbagai jumlah kedua DNA yang lama dan yang baru. Dalam hal ini
15
spektrum kepadatan DNA yang luas, bukannya jenis N-14N tunggal, yang
seharusnya terlihat sesudah satu putaran duplikasi. Dengan adanya percobaan
Meselson-Stahl membuktikan bahwa replikasi DNA terjadi secara semikonservatif
berarti bahwa DNA double helix melakukan replikasi, setiap double helix terdiri dari
satu untaian helix asli dan yang satu untaian dari hasil dari sintesis baru.
Gambar.
Percobaan Meselson dan Stahl

Rolling Circle Replication

Bakteriofage X174 adalah wakil dari sekelompok virus kecil (baik bacterial
maupun eukariotik) yang menyimpan informasi genetik dalam molekul DNA yang
bundar (circular) ber-strand tunggal. Di saat virus ini menginfeksi sel induk E. coli
pada X174, DNA viral berstrand tunggal (disebut strand positif) akan dirubah ke
dalam bentuk double helix (diistilahkan format replikasi/ RF) melalui sintesa strand
negatif tambahan (komplemen). RF parental ber-strand dobel ini kemudian akan
bereplikasi beberapa kali hingga menghasilkan sebuah populasi yang terdiri dari
molekul RF progeny (strand dobel) yang pada saatnya akan bereplikasi secara
asimetris untuk menghasilkan strand (+) viral progeny dalam jumlah besar. Strand
viral progeny lalu akan bergabung dengan mantel protein untuk menutup satu siklus
reproduksi yang komplit. Replikasi dari kromosom X174 lalu dipilah menjadi tiga
bagian : (1) parental strand + parental RF, (2) parental RF progeny RFs dan
CS / progeny RFs progeny strand (+) (gambar 5.52). Dalam dua tahapan terakhir,
akan terjadi sintesis DNA lewat mekanisme yang berbeda yang disebut lingkaran
berputar (selanjutnya diisilahkan dengan rolling circle).
Perangkat replikasi rolling circle kebanyakan sama dengan perangkat
replikasi seperti yang sudah dibicarakan sebelumnya yaitu struktur , eye, dan Y
umum dalam jumlah yang lebih banyak. Dalam hal ini, struktur replikatifnya adalah
molekul DNA bulat dengan ekor strand tunggal.
Replikasi rolling circle diawali dengan aktivitas endonuklease dengan
rangkaian khusus (sequence specific) pada fage X174 di mana gen protein
memecah strand positif milik parental RF pada asal (origin) replikasi. Aktivitas
endonuklease ini terjadi pada lokasi tertentu (site specific); memotong kromosom
X174 pada satu lokasi saja yaitu asal (origin) replikasinya. Proses ini menghasilkan
termini 3 OH dan 5 fosfat di lokasi pemotongan pada strand (+) nya; sedangkan
strand (-) tetap tak terputus. Ujung 5 strand (+) tak terluka dan terkelupas saat
strand (-) memutari sumbunya (oleh sebab itu disebut rolling cirle, mengakibatkan
strand ini memiliki ekor (gambar 5.32 dan 5.33). Seperti yang diutarakan sejak awal
oleh W.Gilbert dan D.Dressler, model rolling circle pada replikasi DNA
membutuhkan enzim khusus yang disebut transferase yang mengikat ujung tepian
strand (+) dengan lokasi khusus dalam membran selnya. Meskipun banyak jika tidak
semua, kromosom yang bereplikasi terikat ke membran, hanya sedikit info yang
diketahui mengenai sifat alami dari ikatan semacam ini. Banyak kasus yang
menganggap ikatan membran semacam ini bukanlah perangkat esensial dari replikasi
rolling circle, karena pada saat lingkaran berputar dan ujung tepi 5 berpindah,
polymerase DNA meng-katalisasi ekstensi kovalen pada ujung tepi (3-OH) yang
lainnya.
Saat proses replikasi parental RF menjadi progeny RF berlangsung, strand
positif lah yang dipakai sebagai template untuk sistesis berulang tanpa putus
(diskontinyu) dari strand negatif tambahannya. Pada beberapa kasus, sintesa dari
strand tambahan terjadi secara diskontinyu pada ekor strand tunggal sebelum sintesa
pada strand pertama komplit. Dalam kasus semacam ini, akan dihasilkan ekor ber-
strand dobel. Pergantian proses sintesis DNA RF dengan strand dobel menjadi
sintesis DNA viral (+) dengan strand tunggal terjadi saat ada protein tertentu di dalam
mantel protein sedang diproduksi didalam sel. Replikasi rolling circle terus
berlangsung, namun pada saat strand viral berganti tempat, mantel protein akan
mengikatnya dan mencegah terjadinya sintesis pada strand (-) tambahannya.
Fage X174 dari gen protein A adalah protein kunci dalam proses replikasi
X174. ia memiliki banyak perangkat aktivitas. (1) gen protein A mempunyai
aktivitas endonuklease pada lokasi khusus (site specific) yang bisa memecah strand
(+) pada daerah asalnya (origin). (2) gen protein A kemudian mampu
mempertahankan energi dari pecahan ikatan fosfodiester dalam bentuk ikatan kovalen
pada terminus 5 fosforil itu sendiri. (3) gen protein A terus mengikat ujung terminus
5 pada strand (+)-nya dan juga pada garpu replikasi yang melintasi perputaran
template dari strand (-). (4) ketika strand (+) mulai disintesiskan, gen protein A
memecah dan membentuk asal (origin) baru, ligasi termini 3 hidroxil dan 5 fosforil,
dan sekali lagi akan terikat secara kovalen kepada 5 terminus strand positif yang baru
dihasilkan. Daur aktivitas gen protein A ini akan terus berulang sampai sebuah
populasi progeny RFs (tahap II) atau progeny strand (+) (tahap III) akan diproduksi.

Bukti terjadinya replikasi rolling circle ditemukan pada (1) DNA virus ber-
strand tunggal seperti pada X174, (2) replikasi yang dikaitkan dengan transfer
kromosom selama proses perkawinan (konjugasi) dalam bakter, dan (3) replikasi
molekul DNA ekstrakromosomal berukuran kecil yang membawa kumpulan (cluster)
gen rRNA saat oogenesis pada amfibi.
Tahapan replikasi DNA berstrand tunggal milik bakteriofage X174.
(Gambar atas a-e). Tahap 1 adalah konversi dari kromosom ber-strand tunggal (a)
menjadi bentuk replikatif parental (RF) ber-strand dobel (e), (b) sintesis dari strand (-)
tambahan (komplemen) yang diawali dengan proses sintesis RNA primer yang
berukuran pendek. Reaksi ini dikatalisasi oleh primase dan memerlukan aktivitas
setidaknya dari 6 macam protein utama; kompleks protein semacam ini biasanya
disebut dengan primosome (c) selanjutnya, DNA polimerase III akan mengkatalis
tambahan kovalen dari deosiribonukleus pada ujung tepi 3 milik RNA primer.
Sintesis dari strand (-) tambahan kemudian akan terjadi tanpa putus sampai template
strand (+)-nya kehilangan energi. Primosome akan terbentuk dan berkeliling
memutari strand template, berhenti sebentar untuk memulai proses sintesis pada
setiap fragmen Okazaki yang baru terbentuk. (d) eksisi dari RNA primer dan
pengisian celah kosong akan dikatalisir oleh DNA polimerase I, polinukleotida (DNA
ligasi) lalu mengkatalisasi formasi ikatan kovalen antara 3-OH dan grup 3-PO4
untuk menghasilkan parental RF ber-strand dobel (e) pusat e-1.

Tahap II : replikasi rolling circle dari parental RF (e) memproduksi


populasi progeny RFs (1) (f) strand (+) dari parental RF terpotong di daerah asal
(origin) lewat aktivitas endonuklease di lokasi tertentu (site specific) / nikase pada
gen protein A milik X174. gen tersebut akan memotong parental RF hanya pada
daerah asal (origin); tidak akan memotong molekul DNA sama sekali. (f-h) sepanjang
proses pemotongan ini, gen protein A akan terikat secara kovalen dengan kelompok
5 fosforil pada strand (+). Akan terus terikat pada terminus 5 sampai progeny strand
(+) yang komplit berhasil disintesiskan. Ujung 5 dari strand (+) akan dilepaskan dari
strand (-) lalu ditambahkan deosiribonukleus pada ujung bebas 3 OH saat lingkaran
(dijaga lewat ikatan strand (-) memutari sumbunya (g-h). Gen protein A terus terikat
saat garpu replikasi berputar mengelilingi strand (-). Sekali saja strand (+) asal
(origin) berhasil disintesiskan, gen protein A akan memecah daerah asal (origin) dan
melakukan ligasi simultan pada termini 3 dan 5untuk menghasilkan strand (+)
melingkar tertutup yang kovalen. (i-i) sintesis dari strand negatif tambahan kemudian
berlangsung terus menerus seperti pada tahapan I memakai strand (+) sebagai
template. Fragmen Okazaki mulai terjadi, diawali oleh RNA primer pada tahapan
ini juga, namun RNA primer tak terlihat di dalam diagram (i-f-l) parental RF terus
bereplikasi lewat model rolling circle sampai terbentuk sebuah populasi berisi 60
progeny RFs (bawah, j-q)

Tahapan III : sintesis dari kromosom progeny ber-strand tunggal, (j-p)


replikasi rolling circle dari progeny RFs terjadi hanya untuk parental RFs dalam
tahapan II, hanya saja strand (-) tidak di-sintesiskan, sedangkan strand (+) akan
dimasukkan ke dalam progeny virion (n-p) Perpindahan dari sintesis RF (tahap II)
menjadi sintesis progeny strand (+) (tahap III) hasil dari pengikatan sintesa mantel
protein viral baru dengan strand (+), mencegah untuk dijadikan template untuk
sintesa strand (-). (q) proses pematangan (maturasi) dari progeny virion menjadi
penutup daur hidup komplit fage X174. kurang lebih ada 500 progeny virion yang
diproduksi untuk setiap sel yang terinfeksi.

Transkripsi Balik (Reverse Transcription) pada Retrovirus

Transkripsi merupakan proses pembentukan RNA dari template DNA.


Sedangkan reverse transcription atau transkripsi balik merupakan proses
pembentukan rantai ganda molekul DNA dengan template (cetakan) berupa rantai
tunggal RNA. Disebut transkripsi balik karena prosesnya berlawanan dengan proses
transkripsi pada. Transkripsi balik ini dapat dilakukan oleh retrovirus.

Retrovirus merupakan virus yang tergolong famili Retroviridae yang memiliki


materi genetik berupa RNA dan dapat mereplikasi DNA dan prosesnya disebut
transkripsi balik. Retrovirus dapat melakukan transkripsi balik dengan bantuan enzim
reverse transcriptase yang dimilikinya. Enzim ini pertamakali ditemukan oleh
Howard Temin dan David Baltimore pada tahun 1970. contoh retrovirus adalah
Human Immunodeficiency Virus (HIV) and Human T-Lymphotropic virus (HTLV).

Pada peristiwa transkripsi balik, bagian dari RNA virus akan bersilangan
dengan tRNA sel inang yang spesifik, bagian dari RNA virus tersebut disebut Primer
Binding Site (PBS), bagian ini terletak dekat ujung 5` RNA. Kemudian tRNA ini
akan menjadi ujung 3` dari untai DNA yang sesuai dengan kode pada RNA virus.
Kemudian ujung bagian luar PBS akan terlepas dari untai RNA virus dengan bantuan
enzim RNase H.

Tahap selanjutnya DNA meloncat dari ujung 5` ke segmen R pada ujung 3`


RNA virus. lalu dari ujung ini, DNA mengalami polimerisasi mengikuti kode pada
RNA virus. Di sisi lain sebagian dari RNA telah terlepas akibat RNase H. Dari sisa
untai RNA virus yang masih ada dibentuk untai DNA kedua yang sesuai dengan kode
pada DNA yang pertama. Terjadi lompatan kembali, segmen PBS pada untai DNA
pertama bertemu dengan PBS pada DNA untai DNA kedua. Kemudian dari masing-
masing untai DNA melakukan polimerisasi sehingga terbentuklah DNA untai ganda
(dobel helix).

Keterangan:
1. tRNA primer terikat pada Primer Binding Site (PBS) RNA.
2. Enzim reverse transcriptase memulai kerjanya dari PBS dengan mengkopi
RNA menjadi rantai tunggal DNA. Pada tahap ini, pengkopian RNA hanya
terjadi dari PBS ke LTR (Long Terminal Repeat).
3. Setelah terjadi pengkopian RNA, RNase H akan memindahkan fragmen RNA
(U5 dan R) yang telah dikopi sebelumnya.
4. Tahapan tersebut diikuti dengan loncatan pertama, yakni berpindahnya kopi
DNA ke ujung rantai 3.
5. Rantai DNA mulai dikopi kembali dengan diawali dari ujung rantai 3.
6. RNase H memindahkan RNA yang telah dikopi dan hanya menyisakan satu
fragmen RNA yang utuh, yang dinamakan bidang polypurine.

Keterangan:
7. Reverse transcriptase mulai menyusun rantai kedua DNA. Tahapan ini dimulai
dari bidang polypurine. Pembuatan rantai kedua DNA merupakan pembuatan
rantai sebagai pasangan kode rantai pertama.
8. Sekarang, RNase H memindahkan semua RNA, bidang polypurine dan tRNA
primer.
9. Loncatan kedua terjadi, PBS yang terletak pada rantai kedua terikat pada PBS
di rantai pertama.
10. Enzim Reverse Transcriptase telah menyelesaikan tugasnya dengan
menuntaskan pengkopian rantai kedua DNA sekaligus menyelesaikan
pembentukan LTR pada tiap-tiap ujung rantai. Setelah rantai ganda DNA
terbentuk, DNA ini siap bergabung dengan DNA sel inang dengan bantuan
enzim integrase.
Pertanyaan :
1 Kapan dimulainya rolling-circle replication?
Dimulainya rolling circle replication adalah saat enzim endonuclease
memotong untai parental positif pada sisi spesifik. Untai DNA ini kemudian
menjadi template untuk replikasi untai negative dibantu oleh untai RNA
primer. Untai negative akan menjadi untai anakan. Untai positif akan terlepas
dari untai negative dan akan melanjutkan proses rolling circle replication
kembali untuk membuat untai anakan.
2 Sebutkan tiga tahap utama proses rolling circle replication!
1 Tahap pembentukan molekul RF induk
2 Tahap pembentukan RF anakan
3 Tahap sintesis untaian DNA
3 Mengapa pada percobaan meselson dan stahl menggunakan gradient
kerapatan CsCl sebagai tempat DNA diisolasikan ?
Karena kerapatan CsCl mendekati kerapataann molekul DNA sebagai
perbandingan kerapatan DNA E.coli dengan basa nitrogen yang mengandung
isotop 14N dan 15N
4 Mengapa pada perobaan digunakan medium yang isotopnya 15N ?
Karena molekul DNA dengan basa nitrogen 15N memiliki tingkat
kerapatan (berat per satuan volume ) yang lebh tinggi dari pada molekul DNA
normal yaitu 14N. molekul-molekul dengan tingkat kerapatan yang berbeda
dapata dipisahkan pada saat disentrifuge.