SEPARASI DENGAN METODA CHROMATOGRAFI

Adalah pemisahan suatu solute dari campuran solute lainnya dalam solven tertentu (fasa
mobile) yang didasarkan pada mudah-sulitnya suatu solute melewati unggun (bed) padatan
(fasa stationer) yang berfungsi sebagai media separator sehingga masing-masing solute akan
mempunyai kecepatan melewati bed yang berbeda-beda dan keluar bed dengan waktu yang
berbeda-beda pula. Hal ini yang mendasari pemisahan secara chromatography. Larutan feed
yang mengandung berbagai macam solute diumpankan ke kolom chromatograf yang berisi
unggun bead kemudian dituangkan cairan eluant . Unggun bead separator akan secara
selektif memperlambat laju masing-masing solute sehingga semakin panjang unggun bead
akan semakin tinggi tingkat separasinya dan saat keluar dari bawah kolom solute akan
terpisah-pisah dengan selang waktu tertentu.

Walaupun metoda separasi-purifikasi ini baru mulai berkembang diakhir perang dunia II, saat
ini semakin banyak industri khususnya bioproses yang menggunakannya. Hal ini didukung
oleh kemajuan pembuatan resin bead yang lebih selektif dan sistem kontrol otomatis yang
memungkinkan pemisahan bisa dilakukan secara akurat.(penggunaan on line measurement &
automation system)

Berdasarkan pada sifat retentif fasa stasioner terhadap solute, ada 4

metoda pemisahan secara chromatograf ini :
 Adsorption chromatografi
Ion exchange chromatografi
Gel filtration atau Gel permeation chromatografi
Affinity chromatografi

I. Adsorption Chromatograf : berdasarkan pada mekanisme physicals

surface force yang akan menahan solute yang bersifat nonpolar dan non volatile. Sebagai
adsorbennya banyak digunakan silika, alumina, karbon aktif dan makroporous nonionik
polimer dan sebagai eluant-nya banyak digunakan solven organik ber-BM rendah.

Senyawa yang teradsorsi akan membentuk ikatan monolayer dipermukaan adsorben,

sehingga luasan area permukaan adsorben merupakan faktor utama dari karakteristik suatu
adsorben. Dengan demikian ada kecenderungan molekul-molekul dengan BM kurang dari
2000 saja yang dapat dengan baik diadsorpsi mengingat ukuran pori suatu adsorben yang
relative lebih kecil.

Bentuk penurunan kemampuan adsorben ini diikuti dengan kenaikan konsentrasi solute yang
tidak terserap di effluent.

Influent

selected solute tertahan sebagai adsorbat

effluent
Tahapan operasi adsorpsi :

Tahap Adsorpsi : solute terpilih akan tertahan sebagai adsorbat

Tahap Pencucian dengan solven tertentu : membersihkan dari impuritas solute lain
Tahap Pelepasan kembali (:proses Elusi ) dengan solven tertentu (:eluant ) :
solute terpilih akan terbawa solven eluant keluar dari pori-pori adsorben.

Skema system kolom adsorben : dengan tujuan kesempurnaan adsorbsi bisa dipilih berbagai
macam skema, masing-masing dg kelebihan dan kekurangannya.

Bahan yang sering digunakan sebagai eluant adalah : 2 butanone; 2 propanone; acetone; 1
butanol; 1 propanol; methanol, ethanol; dan air.

Beberapa jenis adsorben yang terkenal dan banyak digunakan saat ini dalam pemurnian
produk-produk bioteknologi adalah :

Karbon active
Oksida Silicon dan Aluminum contoh : zeolit
Senyawa-senyawa polimer crosslink organic

Pemilihan adsorben tergantung pada ukuran dan sifat solute yang diinginkan serta harga
produk dan biaya operasional system adsorbsi.
II. Ion Exchanger Chromatograf terjadi ikatan kimiawi heteropolar diantara
ion-ion dalam fasa stationer dan fasa mobile. Bead ion exchanger baik yang hidrophobik
maupun yang hidrophilik diberi gugus fungsional untuk memungkinkan mekanisme
pengikatan solute tertentu secara ionik. Sebagai cairan eluant untuk produk-produk bioproses
biasanya air ataupun larutan buffer.
Operasi separasi dan purifikasi dengan menggunakan resin ion exchange didasari oleh
pertukaran ion secara reversible (bolak-balik) antara resin padat yang mempunyai gugus
fungsional dengan solute yang terionisasi didalam larutan.

Reaksinya reversible : R-H+ + Na+ Cl- R-Na + + H+ Cl-

untuk kation exchange.
R-OH- + H+ Cl- R-Cl - + H+ - OH- untuk
anion exchange.

Secara kimiawi tidak terjadi perubahan struktur yang utama, sehingga prosesnya dapat
dilakukan secara bolak-balik dan berulang-ulang. Untuk itulah resin ion exchange dapat di-
regenerasi / dielusi sebelum digunakan kembali.

Aplikasi metoda ini dalam bioproses industri adalah untuk proses-proses recovery dan
purifikasi a.l : antibiotik, vitamin, asam amino, protein, enzym, plasma dll.

Sistem kolom ion exchange :

III. Gel Filtration Chromatograf = Gel Permeation
Chromatograf : Phasa stationer difungsikan sebagai filter solute berdasarkan pada
ukuran molekulnya. Metoda ini didasarkan pada gel yang akan mengembang didalam air
sehingga bersifat seperti filter untuk molekul-molekul solute. Dow Chemical menggunakan
gel yang dibuat dari polystyrene gel yang mengembang dalam solven organik untuk
memfilter senyawa polimer synthetis berdasarkan ukurannya.

IV. Affinity Chromatograf didasarkan pada sifat produk bioproses yang

mempunyai kecenderungan berinteraksi secara selektif dan bersifat reversible dengan
molekul-molekul tertentu. Sifat inilah yang digunakan dalam metoda affinity chromatografi.

Berdasarkan pada type solute yang bisa dipisahkan, pemisahan chromatografi dapat
diklasifikasikan menjadi 3 type :

Affinity differences
Ion exclusion
Size exclusion

a. Affinity Differences Chromatograf baru dikembangkan pada tahun

1968 untuk pemurnian protein (enzym), dimana metoda separasi ini didasarkan pada
biospecific recoqnition (pengenalan gugus spesifik suatu senyawa) diantara suatu solute
tertentu oleh gugus senyawa spesifik (=ligand) yang diimobilisasi kesuatu material
supportnya (menjadi fasa stationer-nya).

Karena selektivitas separasinya lebih tinggi dari metoda yang lain, maka pemurnian dengan
metoda affinitas ini dapat mempersingkat proses sekaligus menurunkan biaya pemurnian. Hal
inilah yang membuat metoda ini sangat cepat berkembang dan digunakan dalam industri
bioproses secara luas.

Peranan resin sangat dominan dalam affinity separasi ini, sehingga banyak dikembangkan
berbagai resin untuk keperluan purifikasi solute tertentu pula. Secara skematik dapat
digambarkan sebagai berikut.
Perbedaan affinitas solute pada fasa stasioner dan fasa mobile didasarkan pada koeffisien
distribusi solute Kd yaitu perbandingan konsentrasi solute dalam resin dan dalam larutan
atau

Kd = Cr / Cl

Sedangkan faktor separasi adalah perbandingan antara koeff distribusi solute satu dengan
solute yang lain atau

= Kd1 /Kd2

harga ini dapat dipakai untuk mengetahui urutan separasi yang terjadi dalam kolom
chromatograf untuk suatu jenis resin tertentu yang digunakan sebagai fasa stasionernya.
Contoh rasio koeffisien distribusi individu formaldehyde : aceton sering disebut faktor
separasibilitas dalam resin Dowex 50WX8(H+) adalah 2,03 dan dalam resin Dowex 1X8 (Cl-)
adalah 1,02 . Maka berdasarkan definisi tersebut diatas akan lebih baik digunakan resin
Dowex 50WX8(H+) karena lebih besar affinitasnya terhadap solute. Sedangkan yang akan
keluar duluan dari kolom adalah aseton, sesuai rule of thumb : yang keluar duluan adalah
yang berfungsi sebagai penyebut bila nilai rasionya lebih besar dari 1, atau akan terjadi
sebaliknya bila kurang dari 1.

Type pemisahan seperti ini sudah digunakan secara luas di industri untuk pemisahan fructose
dari glucose untuk membuat fructose syrup dari 55 hingga 90 %. Penggunaan lain affinity
separation ini antara lain untuk pemurnian enzyme, protein, antibody,asam-asam nukleat.

b. Ion Exclusion Chromatograf merupakan pemisahan suatu senyawa

berbentuk ion dari senyawa-senyawa lain non ionik. Senyawa ionik akan tertahan diluar bead
resin oleh adanya gaya repulsi ionik resin, sedangkan senyawa non ionik akan larut dalam
solven yang terserap masuk dalam bead. Karena senyawa ionik bergerak diluar bead maka
akan dapat keluar terlebih dulu dari resin bed dibanding solute yang tertahan dalam resin
bead. Aplikasi type ini dalam industri contohnya pemisahan sukrose yang non ionik dari
komponen komponen ionik dalam molasses.

Penggunaan lain ion exclusion dalam industri adalah pemisahan MSG dari asam-asam amino
lainnya yang juga telah ternetralkan oleh penambahan NaOH. Larutan asam amino mula-
mula dinetralkan dengan NaOH hingga pH 7.2 maka akan membentuk garam sodium dari
asam amino, kemudian dilewatkan resin tipe kation asam kuat dari asam sulfonat. MSG akan
terelusi pertama kali, baru kemudian garam sodium dari asam-asam amino lainnya.

c. Size Exclusion Chromatograf disini bead resin berfungsi sebagai

flter molekuler (moleculer sieves ) dimana molekul yang kecil bisa masuk ke dalam
bead resin sedangkan yang besar lolos dan tetap mengalir diluar resin bead, sehingga lebih
cepat keluar dari kolom. Contoh pemakaian tipe ini adalah pemisahan dextrose dari senyawa
disacharida dan poly sacharida