Syarat utama dalam kegiatan kultur jaringan adalah kondisi yang aseptis atau steril untuk

semua komponen dalam kultur jaringan. Kegiatan kultur diawali dengan sterilisasi alat dan

bahan. Sterilisasi alat dan bahan adalah perlakuan untuk menjadikan suatu alat atau bahan yang

bebas dari mikroorganisme yang tidak diingikan seperti jamur dan bakteri. Alat- alat yang

digunakan yaitu botol kultur, cawan petri, erlenmeyer, batang pengaduk, gelas piala, pipet serta

peralatan glass ware lainnya harus bersih dan steril. Sterilisasi alat yang dilakukan pada

praktikum ini adalah menggunakan autoclave. Alat-alat yang di sterilisasi yaitu peralatan yang

berupa glass ware dan dissecting kit. glass ware dan dissecting kit ini di sterilisasi dengan

menggunakan autoclave pada suhu 120 C dengan tekanan 17,5 psi selama 30 menit karena pada

tekanan ini bakteri dan jamur yang terdapat dalam peralatan akan mati.

Tidak hanya glass ware dan dissecting kit saja yang digunakan pada praktikum kultur

jaringan. Berikut adalah peralatan yang akan digunakan pada praktikum kultur jaringan beserta

fungsinya.

1. Autoclave
Autoclave merupakan alat yang digunakan untuk sterilisasi alat dan media kultur

jaringan, peralatan yang biasa di sterilisasi menggunakan autoclave adalah glass ware dan

dissecting kit. Gabriel (1988) mengemukakan bahwa autoclave merupakan alat yang mampu

mensterilkan bermacam- macam alat dan bahan yang digunakan dalam lingkup mikrobiologi

yakni menggunakan uap air yang bertekanan panas. Jadi autoclave adalah alat yang digunakan

untuk mensterilkan alat atau bahan- bahan yang dalam hal ini dugunakan pada teknik kultur

jaringan. Autoclave bekerja berdasarkan prinsip tekanan panas uap air. Beberapa mikroba akan

mati apabila berada pada kondisi lingkungan panas tinggi, tetapi ada pula mikroba yang masih

bisa hidup pada kondisi lingkungan yang ekstrim seperti mampu hidup di lingkungan yang

suhunya tinggi. Autoclave digunakan pada tekanan 17,5 psi dan suhu 120C.
2. Laminar Air Flow (LAF)
Laminar Air Flow (LAF) merupakan lemari yang digunakan sebagai tempat ketika akan

melakukan penanaman eksplan dalam kultur jaringan. Menurut Sriyanti dan Ari Wijayani (2012)

prinsip kerja dari laminar air flow ini adalah dengan mengalirkan arus udara yang laminair ke

dalam almari penabur melalui saringan yang besar dengan ukuran mesh 0,22-0,24 mikron.

Bakteri dan jamur ditahan oleh saringan ini, sehingga udara yang masuk kedalam laminar air

flow sudah steril dan membuat ruangan menjadi steril pula.

Sama seperti peralatan yang lainnya, laminar air flow pun harus melalui tahap

sterilisasi. Laminar air flow terlebih dahulu disemprot dengan alkohol 70 % di bagian dalamnya.

Setelah sterilisasi dengan alkohol, pintu laminar air flow ditutup dan lampu ultraviolet (UV)

dinyalakan selama sampai 1 jam. Setelah sterilisasi dengan lampu ultraviolet (UV) pekerjaan

dapat segera dimulai.

3. Botol Kultur
Botol kultur digunakan sebagai tempat media yang digunkanan untuk menanam eksplan.

Botol kultur ini harus dicuci hingga bersih terlebih dahulu menggunakan detergen. Hal ini

dilakukan untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang menempel pada dinding botol guna

menghindari kontaminasi.

Gambar 3. Botol kultur Gambar 4. Gelas piala Gambar 5. Gelas ukur

4. Gelas Piala

Gelas piala merupakan wadah yang terbuat dari borosilikat. Gelas piala yang digunakan

untuk bahan kimia yang bersifat korosif terbuat dari PTPE. Fungsi gelas piala pada kultur

jaringan adalah untuk mengaduk, mencampur dan memanaskan larutan yang akan digunkan

untuk pembuatan media.

5. Gelas ukur
 Gelas ukur adalah gelas berbentuk tabung dengan skala pada dindingnya. Pada

praktikum ini gelas ukur digunakan untuk mengukur jumlah larutan yang akan digunakan dalam

jumlah cukup banyak seperti akuades. Gelas ukur termasuk dalam glass ware, ukuran volume

gelas ukur bermacam-macam misalnya : 100 ml, 300 ml sampai 1000 ml. Gelas ukur biasanya

jarang disterilkan karena penggunaannya hanya untuk pembuatan medium saja.

6. Botol Erlenmeyer
Botol erlemeyer adalah botol berdasar lebar, botol ini terbuat dari kaca bening yang

tahan panas. Erlemeyer pada kultur jaringan dipergunakan untuk tempat dan sarana menuangkan

air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan. Ukuran erlemeyer bermacam-

macam dari volume 50 ml, 100 ml, 200 ml, 250 ml, sampai 2 liter.
7. Cawan Petri

Cawan petri atau petridish adalah jenis gelas piala yang dibutuhkan dalam kultur

jaringan untuk memotong eksplan yang akan ditanam pada media. Cawan petri biasanya

disterilisasi bersama dengan kertas saring di dalamnya tetapi sebelumnya cawan petri ini harus

dicuci bersih kemudian dikeringkan dan setelah kering dibungkus dengan kertas payung coklat

untuk disterilisasi dengan autoclave.

8. Bunsen
Lampu spirtus atau bunsen digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (scalpel dan pinset)

di dalam laminar air flow pada saat penanaman atau sub-culture. Sterilisasi dengan

menggunakan bunsen ini dengan cara mencelupkan dissecting kit kedalam alkohol kemudian

dibakar diatas api bunsen.

9. Pipet Tetes
Pipet tetes (drop pipette) berfungsi membantu memindahkan cairan dari wadah yang

satu ke wadah yang lain dalam jumlah yang sangat kecil tetes demi tetes. Pipet tetes ini memiliki

ketelitian yang kurang dalam memindahkan larutan karena hanya dapat digunakan dengan

perkiraan.
10. Pinset
 Dalam kultur jaringan pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan

eksplan atau untuk menanam eksplan. Teknik penanaman eksplan harus diusahakan agar ujung

pinset tidak mengenai media supaya tidak terkontaminasi.

11. Scalpel
Scalpel atau pisau dalam kultur jaringan digunakan untuk mengiris atau memotong

eksplan. Scalpel ini termasuk dalam peralatan yang masuk kategori dissecting kit. Sebelum

digunkan scalpel harus disterilisasi di dalam autoclave dan dengan di flamir yaitu scalpel

dicelupkan dalam alkohol kemudian dibakar di atas api bunsen.

12. Alumunium Foil dan Seal
Alumunium foil digunakan sebagai penutup botol kultur. Aluminium foil dipotong

persegi dan ukuran potongan aluminium foil dibuat sedemikian rupa sehingga aluminium foil

tersebut menutupi bagian terbuka dari botol kultur sampai 2 inchi ke bawah pada tepi botol

kultur atau wadah lainnya. Dan untuk lebih merapatkan penutupan dapat dipakai seal.

Aluminium foil ini tahan panas sehingga saat dipanaskan dalam autoclave pun tidak masalah.

Gambar 12. Alumunium foil Gambar 13. Seal

13. Magnetik Stirrer dan Hot Plate
Magnetic stirrer digunakan untuk menghomogenkan larutan media yang akan dibuat

nantinya. Magnet pengaduk ini nantinya akan berputar pada dasar botol dimana magnet akan

menempel karena adanya gaya tarik menarik magnet. Kecepatan putaran dapat diatur sesuai

keinginan. Ada beberapa jenis magnetic stirrer yang dilengkapi dengan hot plate yang bisa

digunakan untuk memanaskan.

14. Hand Sprayer
Hand sprayer digunakan untuk menyemprotkan alkohol untuk sterilitasi laminar air

flow dan tangan serta alat-alat yang akan dimasukkan ke dalam laminar air flow.

Gambar 16. Hand sprayer Gambar 17. pH meter elektrik

15. pH Meter Elektrik
pH meter digunakan untuk mengetahui nilai atau tingkat kemasaman suatu jenis bahan.

pH meter sangat diperlukan karena dalam pembuatan media, ada parameter tingkat kemasaman
 yang harus dipenuhi yaitu diantara 5,7- 5,8. Cara menggunakan pH meter yaitu, sensor pada pH

meter dicelupkan kedalam larutan yang akan dibuat menjadi media, nantinya akan muncul angka

pada layar yang menunjukkan nilai kemasaman larutan tersebut.

16. Kertas Payung

Kertas payung berguna untuk membungkus peralatan seperti dissecting kit saat di

sterilisasi di dalam autoclave.

Gambar 18. Spatula Gambar 19. Corong Gambar 20. Tisu

Selain peralatan-peralatan tersebut ada pula peralatan-peralatan lain yang digunakan

dalam kegiatan kultur jaringan, seperti spatula untuk mengaduk larutan secara manual saat

pembuatan media, corong untuk memasukkan larutan agar tidak meluber, rak kultur untuk

menempatkan botol kultur baik setelah sterilisasi maupun yang sudah berisi media dan eksplan,

tisu untuk membersihkan atau mengelap botol yang basah, serta sarung tangan untuk

membungkus tangan dan masker yang digunakan untuk menutupi mulut agar tidak terjadi

kontaminasi pada media maupun eksplan yang ditanam.

Di dalam memulai melakukan kegiatan kultur jaringan diperlukan ruang dan peralatan. Ukuran
ruang yang diperlukan dapat disesuaikan dengan volume aktivitas kultur jaringan yang akan
dilakukan. Ruang yang diperlukan untuk kegiatan kultur jaringan yaitu laboratorium yang ideal
yang memiliki: 1.) Ruang persiapan yang di dalamnya terdapat timbangan analitik, lemari
pendingin, hotplate, mikrowave, oven, pH meter, alat-alat gelas standar (labu takar, pipet
volume, erlenmeyer, gelas piala, batang pengaduk dari gelas, dan wadah kultur), alat untuk
mencuci (washtaple), lemari untuk alat dan bahan kimia, sentrifuse, fumehood, destilator, dan
kereta dorong; 2.) Ruang transfer yang di dalamnya terdapat laminar air flow, dissecting,
mikroskop, alat diseksi, lemari tempat penyimpanan alat-alat steril, dan timbangan kecil. 3.)
Ruang kultur yang dilengkapi dengan rak kultur dan lampu fluorescent, timer untuk mengatur
lama penyinaran, AC untuk mengontrol temperatur, mikroskop binokuler, dan shaker. (Barahima,
2011).
Peralatan yang mutlak dimiliki untuk memulai melakukan kegiatan kultur jaringan yaitu:
timbangan analitik, destilator, pH meter, autoclaf, laminar air flow, dan gelas-gelas standar.
Peralatan ini kemungkinan dapat menimbulkan resiko pada pemakainya atau menimbulkan
kerusakan apabila salah prosedur dalam mengoperasikannya. (Barahima, 2011).
Kultur jaringan tanaman terdiri dari sejumlah teknik untuk menumbuhkan organ,
jaringan dan sel tumbuhan. Jaringan dapat dikulturkan pada agar padat atau dalam medium hara
cair. Jika ditanam dalam agar, jaringan akan membentuk kalus, yaitu massa atau sel-sel yang tak
tertata. Kultur agar juga mempergunakan teknik untuk meristem (Suryo, 1992).
Keberhasilan dalam teknologi serta penggunaan metode in vitro terutama disebabkan
pengetahuan yang lebih baik tentang kebutuhan hara sel dan jaringan yang dikulturkan. Hara
terdiri dari komponen yang utama dan komponen tambahan. Komponen utama meliputi garam
mineral, sumber karbon (gula), vitamin dan pengatur tumbuh. Komponen lain seperti senyawa
nitrogen organic, berbagi asam organic, metabolit dan ekstak tambahan tidak multak, tetapi dapat
menguntungkan ketahan sel dan perbanyakannya (Anonim, 2011)
Medium yang digunakan untuk kultur jaringan tanaman dapat berupa medium padat atau
cair. Medium padat digunakan untuk menghasilkan kalus yang selanjutkan diinduksi membentuk
tanaman yang lengkap, sedangkan medium cair biasanya dugunakan untuk kultur sel. Medium
yang diggunakan mengandung lima komponen utama, yaitu senyawa anorganik, sumber karbon,
vitamin, zat pengatur tumbuh dan suuplemen organik (Anonim, 2011).
Adapun gambaran secara sederhana proses kultur jaringan tanaman sampai akhirnya
menjadi tanaman yang lengkap dan dapat dipindahkan ke medium tanah atau medium bukan
artifisial lainnya. Secara garis besar meode perbanyakan tanaman secara kultur jaringan terdiri
atas empat tahapan, yaitu seleksi dan penyiapan kultur aseptic, multiplikasi kultur, regenerasi
plantlet, aklimatisasi, dan pemindahan ke tanah. Dalam tahapan seleksi dan penyiapan kultur
aseptic dilakukan pengambilan bahan awal dan penanamannya pada medium in vitro yang
sesuai. Setelah diperoleh tunas pada tahapan pertama, dilakukan multiplikasi kultur untuk
mendapatkan tunas-tuans baru dalam jumlah lebih banyak. Tunas-tunas baru hasil perbanyakan
kemudian dipindahkan ke medium yang khusus dibuat untk menginduksi pembentukan akar
sehingga akhirnya terbentuk plantlet yang lengkap. Planlet yang terbentuk selaniutnya diadaptasi
dengan lingkungan alami sebagi persiapan untuk dipindahkan dan ditanam di tanah atau
lapangan (Yuwono, 2008).
Secara sederhana, tahapan yang dilalui dalam proses kultivasi tanaman secara kultur
jaringan dapat disejikan sebagai berikut : (1) pengambilan eksplan, misalnya daun yang masih
muda. Daun yang muda dipotong sesuai dengan ukuran yang digunakan, selajutnya dilakukan
sterilisasi, (2) eksplan yang diporoleh kemudian ditanam pada medium (padat) yang sesuai dan
sudah disterilisasi. Medium yang digunakan dimsukkan dalam wadah yang akan digunakan
untuk kultivasi, misalnya tabung Erlenmeyer, sampai terbentuk struktur kalus, (3) sebagian kalus
terbentuk diambil untuk disub-kultur pada medium segar pada tabung lain, (4) sebagian kalus
terbentuk dari subkultur kemudian dipindahkan pada medium lain yang khusus digunakan untuk
induksi pembentukan organ, misalnya tunas, (5) jika induksi organogenesis berhasil maka pada
langkah ke-4 di atas akan terbentuk tunas adventif, (6) sebagian tunas yang terbentuk kemudian
dipotong dan dipindahkan ke medium lain yang digunakan untuk menginduksi pembentukan
akar, (7) jika induksi penbentukan akar berhasil maka sudah di dapatkan planlet yang siap
dipindahkan ke medium bukan artificial, misalnya medium tanah, (8) yang sudah terbentuk
selanjutnya dipindahkan ke medium tanha utuk proses aklimatisasi (Yuwono, 2008).
Perlengkapan dan sarana yang digunakan pada percobaan kultur jaringan tanaman
meliputi (1) Sterilisasi, alat yang digunakan adalah lemari aliran udara laminari atau ruang kecil
(catatan: lemari ini tersedia dalam berbagai ukuran, dan dapat diletakkan di tempat yang
diperlukan tanpa diperlukan tanpa perlu ruang khusus untuk itu. Kipas angin pada lemari ini
seringkali dijalankan terus menerus dan pra filter diganti atau dibersihkan sebulan sekali),
Otoklaf, Oven untuk sterilisasi kering (sebaiknya ada tetapi tidak muklat), Perlengkapan untuk
sterilisasi dengan penyaringan, Radas penyulingan air dan atau pembebas mineral air murni, (2)
Kultur alat yang diperlukan adalah Ruang kultur dan atau kotak berpengatur suhu (Catatan: baik
terang ataupun gelap terus-terusan sama baiknya untuk pertumbuhan sel. Umumnya cahaya
yangdipancarkan dari lampu neon yang dingin dan putih pada 25 W.m 2 sudah mencukupi. Lampu
ini dapat ditambah dengan bola lampu pijar. Atau, dapat dipaki lampu Gro-Lux yang berspektur
luas sebagi ganti lampu neon dan lampu pijar), Rak (Rak dari kawat kasa yang kaku
memungkinkan aliran udara sebanyak-banyaknya dan naungan sekecil-kecilnya), Pengocok
(Yang lebih baik adalah model putar. Bentuk ini tersedia dari ukuran kecil untuk diletakkan di
atas meja (ukuran meja) sampai ukuran besar untuk ditempatkan di lantai), (3) Alat yang lainnya
adalah Pisau klinis, tang dan pembakaran Bunsen. Botol, cawan petri untuk kultur agar. Lebih
cocok digunakan botol gelas dan cawan petri plastic sekali pakai yang disterilkan lebih dahulu.
Labu kultur, botol Delong mempunyai beberapa keunggulan dibandingkan botol lainnya seperti
labu Erlenmeyer, yang mempunyai leher sehingga cenderung mengumpulkan debu. Sumbat,
dapat digunnakan sumbat busa. Sumbat kapas yang dibungkus dengan kain kasa tipis
tidaklahmahal, tidak berubah bentuk dalam pemanasan dengan autoclave dan dapat digunakan
berulang-ulang. Pipet, tersedia pipet steril sekali-pakai, tetapi lebih baik digunakan pepet gelas
sengan ujung yang dapat dilepaskan. Lemari pendingin dan pembeku (Yuwono, 2008).

BAB III
METODOLOGI