Colletotricum Trabajo

CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS
AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITECNICO
NACIONAL
UNIDAD IRAPUATO
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA GENETICA
Anlisis de ideomorfos MAT en
Colletotrichum lindemuthianum
Tesis que presenta
QFB MNICA DEL CARMEN GARCA SERRANO
Para Obtener el Grado de
DOCTORA EN CIENCIAS
En la Especialidad de
Biotecnologa de Plantas
Directora de Tesis: Dra. June K. Simpson Williamson
Irapuato, Gto. Abril del 2008

ndice General
ndice de Tablas y Figuras ................................................................................................. iii

DEDICATORIA ......................................................................................................................... v
A G R A D E C I M I E N T O S .........................................................................................vi
Resumen ................................................................................................................................... 2
Abstract .................................................................................................................................. 4
1. Introduccin ........................................................................................................................ 5
1.1 Genmica y protemica aplicadas al estudio de hongos modelo ...................... 5
1.2 Saccharomyces cerevisiae ................................................................................ 5
1.3 Candida albicans ............................................................................................... 8
1.4 Neurospora crassa .......................................................................................... 11
1.5 Aspergillus spp. ............................................................................................... 14
1.6 Magnaporthe grisea ......................................................................................... 16
1.7 Fusarium spp ................................................................................................... 17
1.8 Ustilago maydis ............................................................................................... 17
1.9 Estudios genmicos comparativos entre diferentes hongos ............................ 19
1.10 Hongos fitopatgenos como modelo de estudio ............................................ 22
1.11 Colletotrichum lindemuthianum como modelo de estudio .............................. 23
2. Antecedentes ............................................................................................................... 25
2.1 Reproduccin asexual en hongos .................................................................... 25
2.2 Reproduccin sexual en Ascomicetos ............................................................ 26
2.3 Reproduccin sexual en Basidiomicetos ........................................................ 40
2. 4 Reproduccin sexual en especies del gnero Colletotrichum........................ 41
2.4.1 Biologa del gnero Colletotrichum .................................................................... 41
2.4.2 Regulacin gentica del desarrollo sexual en el gnero Glomerella ........... 43
2.4.3. Reproduccin sexual en Colletotrichum lindemuthianum ............................. 50
3. Objetivos ............................................................................................................................ 58
3.1 Objetivo General .............................................................................................. 58
3.2 Objetivos Especficos....................................................................................... 58
3.2.1 Clonar el ideomorfo MAT1-2 de de las cepas heterotlicas MU03 y DGO02
de C. lindemuthianum .................................................................................................... 58
3.2.1 Analizar las secuencias del ideomorfo MAT1-2 clonadas. ........................... 58
3.2.2 Determinar el patrn de segregacin del ideomorfo MAT1-2 en la progenie
obtenida en la cruza de las cepas heterotlicas. ....................................................... 58
3.3.3 Analizar la expresin del ideomorfo MAT1-2 bajo diferentes condiciones
de crecimiento. ................................................................................................................ 58
4. Materiales y Mtodos ............................................................................................... 59
4.1 Cepas y medios de cultivo. ........................................................................... 59
4.2 Extraccin de DNA. (modificado de Gonzlez-Chavira y col., 1998). ............ 59
4.4 Amplificacin de la caja HMG de otros aislados. ....................................... 61
4.5 TAIL-PCR. ....................................................................................................... 61
4.6 Clonacin del fragmento de 2 Kb. ................................................................ 63
4.7 Hibridacin Southern. ................................................................................... 64
4.8 Anlisis de segregantes. ............................................................................... 65
4.9 Extraccin de RNA......................................................................................... 65
4.10 Hibridacin Northern. .................................................................................. 67
4.11 RT-PCR y anlisis de intrones. ................................................................... 67
5. Resultados ..................................................................................................................... 68
5.1 Amplificacin de la caja HMG en las cepas parentales. ............................. 68
5.2 Amplificacin por PCR de la caja HMG de otros aislados. ........................ 69
5.3 TAIL-PCR. ....................................................................................................... 69
5.3.1 Anlisis de la caja HMG. ............................................................................. 73
5.6 Anlisis de expresin del gen MAT1-2-1. .................................................... 77
5.7 RT-PCR. .......................................................................................................... 79
6. Discusin ........................................................................................................................ 82
6.1 Amplificacin de la caja HMG. ...................................................................... 82
6.2 TAIL-PCR. ....................................................................................................... 84
6.5 Expresin del gen MAT1-2-1. ........................................................................ 88
6.6 Presencia de Intrones.................................................................................... 89
7. Conclusiones ............................................................................................................... 90
8. Perspectivas ................................................................................................................. 91
9. Apndice ............................................................................................................................. 93
9.1 Obtencin de ncleos de C. lindemuthianum ............................................. 95
9.2 Obtencin de protoplastos de C. lindemuthianum ..................................... 95
9.2.1 Protocolo A para la obtencin de protoplastos ......................................... 96
9.2.2 Protocolo B para la obtencin de protoplastos ......................................... 98
9.3 Obtencin de DNA de alto peso molecular ............................................... 101
9.4 Preparacin de los vectores de clonacin y transformacin .................. 106
9.5 Bioensayos en hipocotilos ......................................................................... 108
9.6 Produccin de apresorios........................................................................... 109
9.7 Conclusiones ............................................................................................... 111
10. Referencias ............................................................................................................... 112
11. ANEXOS.......................................................................................................................... 120
ANEXO 1 ............................................................................................................. 120
Artculo Publicado en Mycologia .......................................................................... 120
ANEXO 2 ............................................................................................................. 121
Artculo Publicado en Mycoscience ..................................................................... 121
ndice de Tablas y Figuras
Figura 1. Reproduccin asexual de S.cerevisiae 25

Figura 2. Reproduccin sexual en ascomicetos filamentosos 27
Figura 3. Formacin de ascosporas 27
Figura 4. Ciclo de vida de S. cerevisiae 29
Figura 5. Locus MAT en S. cerevisiae 30
Figura 6. Activacin-inactivacin de los genes del desarrollo sexual
en S. cerevisiae 31
Figura 7. Accin de las feromonas en S. cerevisiae 32
Figura 8. Reproduccin sexual en N. crassa 34
Figura 9. El locus MAT en las cepas de N. crassa 34
Figura 10. Locus MAT de cepas heterotlicas de P. anserina 36
Figura 11. Locus MAT de cepas heterotlicas deG. Fujikoroi 37
Figura 12. Organizacin de los genes de del locus MAT en
especies homotlicas de S. macrospora 38
Figura 13. Organizacin del locus MAT en una especie
homotlica de C. heterostrophus 39
Figura 14. Ciclo de vida de U. maydis 40
Figura 15. Representacin de la organizacin de los loci
MAT en Ustilago maydis 41
Figura 16. Diferentes frutos con antracnosis 42
Figura 17. Modelo de Wheeler 46
Figura 18. Diferentes partes de la planta de frijol
infectadas con C. lindemuthianum 51
Figura 19. Peritecios, ascas y ascosporas de C. lindemuthianum 56
Figura 20. Estrategia utilizada para amplificar la caja HMG 61
Tabla 1. Inciadores utilizados para amplificar la caja HMG 61
Figura 21. Localizacin de los iniciadores utilizados
para la primera reaccin TAIL-PCR 62
Tabla 2. Iniciadores utilizados en TAIL-PCR 62
Tabla 3. Iniciadores universales para TAIL-PCR 62
para realizar la segunda reaccin TAIL-PCR 63
para amplificar el fragmento de 2 Kb 64
Tabla 4. Iniciadores utilizados para amplificar el ideomorfo 64
Figura 24. Geles que muestran los productos de PCR
utilizando iniciadores degenerados y especficos 68
Figura 25. Amplificacin de caja HMG de diferentes aislados 69
Figura 26. Esquema de la posicin de los marcos de lectura

abiertos e intrones en las cepas parentales 71
Figura 27. Alineamiento de secuencias de aminocidos
iii
del ideomorfo MAT1-2 en las cepas parentales 72
Figura 28. Comparacin de aminocidos de los
ideomorfos MAT1-2 de C. lindemuthanum y C. gloeosporioides 73
Figura 29. Alineamiento de las cajas HMG de diferentes
hongos pertenecientes al gnero Colletotrichum 74
Figura 30. Dendrograma obtenido al analizar las secuencias HMG
de diferentes ascomicetos 75
Figura 31. Hibridacin tipo Southern en cepas parentales 76
Figura 32. Hibridacin tipo Southern en segregantes 76
Tabla 5. Anlisis de Chi cuadrada 77
Figura 33. Crecimiento de cepas parentales 78
Figura 34. Expresin del gen MAT1-2-1 79
Figura 35. Comprobacin de la presencia del intrn 1 80
Figura 36. Comprobacin de la presencia de los intrones 2 y 3 81
iv
DEDICATORIA
A la memoria de Mititu
A mi familia
A los tres amores de mi vida
v
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al CONACYT el apoyo brindado para la realizacin de este trabajo y

durante el transcurso del Doctorado.
Agradezco a CONCYTEG el apoyo otorgado al final del doctorado.
Agradezco infinitamente a la Dra. June Simpson su apoyo y paciencia, a todos los

doctores integrantes del comit de sinodales, especialmente al Dr. Plinio Guzmn
Villate.
Agradezco a todo el personal del CINVESTAV por que sin su apoyo, los estudiantes
no podramos trabajar: intendencia, mantenimiento, centro de informacin,
departamento de cmputo, almacn, cafetera, enfermera, invernaderos,
transferencia, preparacin de medios de cultivo, secuenciacin.
Agradezco el apoyo laboral y moral brindado por mis compaeros de laboratorio,

todos los buenos momentos de chistes, albures, reuniones, pachangas, seminarios,
en fin, todos esos bellos momentos que quedarn en mi mente y en mi corazn. De
forma muy especial, agradezco a Katy, Emy, Cori y Jazmn por la ayuda en la ltima
fase.
Tambin quiero agradecer el apoyo tcnico brindado por Pedro Martnez, Jimena
Carrillo, Diana Mendoza, Fernando Hernndez y Rosy; pero mucho ms agradezco
que me permitan ser su amiga.
Agradezco la amistad que encontr en todos mis compaeros de generacin,

seremos amigos por siempre.
Agradezco a mi familia, incluyendo adems de pap y hermana a suegros, cuados y

cuadas.
Agradezco de especial forma el apoyo y la amistad brindados por las autoridades y

amigos de la Universidad Latina de Mxico: Ing. Ramn Lemus, Lic. Carlos Lemus,
Dr. Rafael Lemus, Dr. Salvador Oliveros, Dr. Juan Manuel Lpez Escalante y Dr.
Gerardo J. Melesio Macas.
Necesitara muchas pginas para poder plasmar el agradecimiento que le debo a mi

ms grande amor, Pilo, mil gracias por todo el amor, la paciencia, los buenos,
mejores y excelentes momentos, gracias por toda la vida.
vi
Resumen
Colletotrichum lindemuthianum es un hongo patgeno del frijol comn, Phaseolus
vulgaris, que puede llegar a terminar con la cosecha si encuentra las condiciones
adecuadas para su desarrollo. Se ha registrado que los aislados del hongo obtenidos
de diversas localidades geogrficas de Mxico, presentan una alta variabilidad
gentica, a pesar de que no se ha reportado que C. lindemuthianum tenga
reproduccin sexual de forma natural. En el presente trabajo se estudiaron a nivel
molecular los genes que controlan la reproduccin sexual de los hongos
filamentosos, denominados ideomorfos MAT en dos aislados del hongo que llevaron
a cabo la reproduccin sexual. Solamente se encontr la presencia del ideomorfo
MAT1-2 en ambas cepas parentales. Al estudiar el DNA de las cepas parentales por
tcnicas basadas en PCR, se obtuvo una secuencia de 2 Kb que contena el dominio
HMG, caracterstico en todos los ideomorfos MAT1-2 de los ascomicetos
filamentosos. Se localizaron varios marcos de lectura abiertos, uno de los cuales
present alta homologa con el gen MAT1-2-1 de varias especies pertenecientes al
gnero Glomerella (teleomorfo de Colletotrichum) y con el de otros ascomicetos
filamentosos. En la secuencia obtenida se encontraron tres posibles intrones.
Mediante RT-PCR se determin si estos posibles intrones eran procesados como
tales, lo cual se confirm adems mediante tcnicas de secuenciacin. Debido a que
la secuencia del dominio HMG es utilizada como herramienta filogentica, se utiliz
la secuencia obtenida para las cepas parentales y las secuencias de este dominio
reportadas para otros hongos pertenecientes al mismo gnero y a la misma clase; se
obtuvo un dendrograma en el que se confirm la relacin filogentica de C.
lindemuthianum dentro del gnero Glomerella y de este gnero con los dems
ascomicetos filamentosos. Luego de realizar hibridaciones tipo Southern tanto en las
cepas parentales como en las segregantes, se concluy que el gen MAT1-2-1 se
encuentra en ambas cepas parentales, que es de copia nica en ambas y se
confirm mediante un marcador RFLP la segregacin 1:1 del gen, esperada para la
progenie de individuos haploides que llevaron a cabo una cruza sexual. Finalmente
se realizaron ensayos preliminares para probar algunas condiciones que podran
2
modificar la expresin del citado gen. Se observ que la expresin del gen se ve
afectada por los componentes del medio de cultivo y por la presencia de la cepa
complementaria.
3
Abstract
Colletotrichum lindemuthianum is a fungal pathogen of common bean, Phaseolus

vulgaris which is capable of destroying a complete harvest under adequate
developmental conditions. Reports indicate that isolates of this fungus obtained from
different geographical regions within Mexico show high levels of genetic variability,
even though sexual reproduction under natural conditions has never been observed
for C. lindemuthianum. In the present work, the MAT idiomorph which controls sexual
reproduction in filamentous ascomycetes was studied at the molecular level. Only the
idiomorph MAT 1-2 was found in both parental isolates. Analysis of the genome of
both parental isolates using PCR based methods identified a 2Kb DNA sequence
containing the HMG domain characteristic of the MAT1-2 idiomorph of filamentous
ascomycetes. Several open reading frames were identified, one of which encoded a
protein with strong homology to the MAT1-2-1 gene of fungi from the genus
Glomerella (teleomorph of Colletotrichum) and to that of other filamentous
ascomycetes. Three putative introns were determined within the sequence and these
were confirmed by RT-PCR and sequencing analysis. Since the HMG domain has
been used as a phylogenetic tool, this sequence was used to construct a dendrogram
comparing the HMG sequences of members of the same genus and class. This
analysis confirmed the phylogenetic relationship of C. lindemuthianum within
Glomerella and of this genus within the filamentous ascomycetes. Analysis of the
genomes of the parental isolates showed the presence of MAT1-2-1 in a single copy
in both parents with a 1:1 segregation in the progeny based on RFLP analysis,
confirming the expected Mendelian ratio for haploid individuals obtained from a
sexual cross. Finally preliminary experiments were carried out to test certain
conditions which could modify the expression of MAT1-2-1. It was found that different
growth media and the presence of the complementary strain both affected
expression.
4
1. Introduccin
1.1 Genmica y protemica aplicadas al estudio de hongos modelo

El Phylum Ascomycota representa el ms grande y diverso del reino Fungi, sus
miembros ocupan diferentes nichos alrededor del globo terrqueo. Muchos
ascomicetos tienen importancia econmica, agrcola o mdica y por ello han servido
como modelos en las investigaciones cientficas. Por otra parte, algunos
basidiomicetos tambin se han tilizado por aos como modelos para la investigacin
en biologa celular, desarrollo, dimorfismo y patognesis. Gracias al desarrollo de la
genmica y protemica en hongos modelo, ahora se conoce ms sobre las funciones
de los genes y sus productos y se pueden realizar estudios comparativos entre estos
genomas. A continuacin se resumirn los resultados de algunas publicaciones
recientes realizadas en hongos utilizados como modelo de estudio, para apreciar los
avances provocados por el desarrollo de la genmica y la protemica.
1.2 Saccharomyces cerevisiae
Uno de los hongos que ms se ha estudiado desde hace muchos aos es el

hemiascomiceto Saccharomyces cerevisiae. La simbiosis entre este hongo y el
hombre ha resultado muy valiosa, primero por su importancia a nivel de la industria
de las bebidas y los alimentos, despus por la facilidad de cultivarlo en el laboratorio,
utilizando medios sencillos y obteniendo el crecimiento y la reproduccin de las
colonias en poco tiempo y tambin por la produccin de protenas y algunas
pequeas molculas usadas como drogas. As durante aos se han obtenido
mutantes, se describieron vas metablicas, se mapearon genes, y se hicieron
estudios de microscopa antes que en ningn otro microorganismo. Inicialmente se
realizaron un gran nmero de estudios bioqumicos y bioenergticos, pero a medida
que stos se desarrollaban, quedaban expuestas las bondades que este modelo
ofreca para realizar anlisis de biologa celular, divisin celular, gentica y biologa
molecular. Una muestra del impacto que esta levadura ha causado dentro de la
biologa es la secuenciacin completa de su genoma en 1996, siendo el primer
eucariote con el genoma secuenciado (Goffeau y col., 1996)
5
S. cerevisiae posee un genoma pequeo, solamente una cuantas veces mayor que
el de Escherichia coli y 200 veces menor que el de clulas de mamfero. Como
resultado del anlisis de la secuencia del genoma de S. cerevisiae, se localizaron un
total de 6,183 marcos de lectura abiertos y se predijo que de stos, 5,800
correspondan a genes que codifican para protenas. A diferencia de los genomas de
organismos multicelulares, el genoma de la levadura es muy compacto, dado que el
72% de la secuencia corresponde a secuencias codificantes. Aproximadamente el
30% de los genes se han caracterizado experimentalmente, mientras que del 70%
restante, cuya funcin no se conoce, aproximadamente la mitad contiene al menos
un motivo de algn tipo de protenas ya caracterizadas, o corresponden a genes que
codifican para protenas estructuralmente relacionadas con productos gnicos ya
caracterizados en levadura o en otros organismos (Kolkman y col., 2005). La
secuenciacin del genoma de este hemiascomiceto ha constituido un recurso de
gran valor para el anlisis de la funcin y arquitectura genmica. As mismo, esta
experiencia facilit y propici el desarrollo de proyectos involucrados en la
secuenciacin de genomas de una gran variedad de organismos eucariotes,
incluyendo el proyecto del genoma humano.
Actualmente existe un alelo mutado para cada gen que se ha caracterizado en S.

cerevisiae y se han descrito cientos de bancos de datos y anlisis computacionales.
Sin embargo, existen un poco ms de 1000 genes que aun no se han caracterizado
en este hemiascomiceto (Pea-Castillo y Hughes; 2007). Hay una gran variedad de
factores que contribuyen a que exista un nmero grande de genes de levadura no
caracterizados, entre ellos la redundancia gentica, la carencia de un fenotipo
notable y la posibilidad de que no todos ellos sean reales. Muchos de estos genes
aun no caracterizados pueden estar involucrados en la respuesta a las condiciones
ambientales, a respuestas metablicas, o a estilos de crecimiento que no son las que
se utilizan de forma rutinaria en el laboratorio. La facilidad con la que se puede
estudiar el genoma de la levadura, la cantidad de manipulaciones genticas y la
metodologa disponible en este sistema han llevado al desarrollo de mtodos para
analizar DNA y protenas no slo de la levadura sino de otros organismos. En los
6
ltimos aos se han desarrollado diferentes estrategias para analizar el proteoma, el
transcriptoma y otros grupos de protenas de Saccharomyces cerevisiae. Dos de las
metodologas ms usadas por los cientficos en el anlisis protico global son la
electroforesis en gel de dos dimensiones y la cromatografa de lquidos acoplada a
espectrometra de masas (Kolkman y col., 2005). Tambin se han elaborado mapas
subprotemicos, como los mapas de mitocondrias de levaduras los cuales son
herramientas poderosas para los investigadores que trabajan con estos organismos,
pues pueden comparar los geles de sus estudios con los que se han reportado. La
expresin cuantitativa de protenas es una parte crucial de la protemica y requiere
mtodos que brinden agudeza y reproducibilidad en la expresin diferencial de las
protenas de dos o ms muestras biolgicas. Posiblemente la utilidad ms preciada
de haber desarrollado todas estas tecnologas para estudiar el genoma de S.
cerevisiae es el poder analizar estudios comparativos, en virtud de su uso como
modelo de estudio. El anlisis de los genes de S. cerevisiae, sus productos y las
funciones de stos pueden ser un buen elemento de prediccin sobre la funcin de
los genes de otros eucariotes, pues por ejemplo, cerca del 50% de los genes
humanos tienen homlogos en esta levadura (Bassett, 1996). Posteriormente se
presentarn los resultados de algunos de estos estudios comparativos en los que el
genoma de este hemiascomiceto ha jugado un importante papel.
Como ya se mencion, el desarrollo de la genmica en los hongos comenz con la

secuenciacin del genoma completo de S. cerevisiae en 1996. Sin embargo, este
genoma brindaba solamente informacin limitada con respecto a los miembros del
reino Fungi. La subsiguiente secuenciacin del genoma de S. pombe dej en
evidencia las limitaciones de las levaduras para realizar una aproximacin a otros
hongos. En el ao 2000 diversos consorcios privados y pblicos consolidaron la
Iniciativa del Genoma de los Hongos, cuya meta principal fue la secuenciacin de
diferentes miembros del reino. Desde entonces los genomas de 23 hongos diferentes
se han publicado a travs de este consorcio. Adems, otras instituciones han
trabajado en la secuenciacin del genoma de otros hongos, de tal manera que hasta
7
el 2006 haba 42 genomas de hongos secuenciados con acceso pblico (Galagan y
col., 2005; Arvas y col., 2007).
Usando la metodologa basada en arreglos genticos, Tucker y Fields (2004),

investigaron la sensibilidad de 4,800 cepas de levaduras haploides, cada una
conteniendo una delecin en un gen diferente, usando el ibuprofeno y otras tres
drogas como parte del medio en el que crecan las levaduras y encontraron que una
concentracin de 50 M de ibuprofeno inhibe el crecimiento de las cepas silvestres.
Observaron que la mutacin en uno de los 7 genes involucrados en la biosntesis de
triptofano confiere alta sensibilidad al ibuprofeno. Por otra parte, utilizando el mtodo
de arreglos genticos Baetz y col. (2004) analizaron 5,000 mutantes de levadura
heterocigotas para probar su sensibilidad a un compuesto utilizado como inhibidor de
metstasis (dihidromotuporamina C) e identificaron 21 mutantes que presentan gran
sensibilidad a la droga. Establecieron que estas mutantes son heterocigotas para dos
pasos en el metabolismo de esfingolpidos directamente.
1.3 Candida albicans
Candida albicans es el principal hongo patgeno en humanos, existe como comensal

en muchos individuos sin producir patologa alguna, pero puede causar infecciones
en pacientes inmunocomprometidos. La invasin de este hongo a los tejidos
humanos se correlaciona con cambios en la inmunidad del hospedero y con cambios
en las caractersticas fsicas de su nicho habitual (cirugas, por ejemplo). La clave
para entender la patogenicidad de este hongo est en estudiar los procesos
regulatorios que definen la transicin de ser un comensal para ser un patgeno.
El genoma de C. albicans tiene 8 cromosomas, el tamao de su genoma haploide es

de 14, 851 kilobases, contiene 6,419 marcos de lectura abiertos, 20% de los cuales
no tienen homlogos en las secuencias reportadas para otros organismos (Odds y
col., 2004). Presenta un gran repertorio de genes homlogos a los que se ha
predicho que intervienen en los estados esenciales de la meiosis en S. cerevisiae
(Tzung y col., 2001). El genoma de C. albicans tiene una gran similitud con el de S.
8
cerevisiae en el nmero de familias de genes y en el nmero de genes, pero C.
albicans tiene ms genes relacionados con su capacidad metablica y tiene una
cantidad significante de DNA repetido. Existen cepas que presentan cambios en su
cariotipo y tambin en su fenotipo colonial (nmero de cromosomas, prdida de
heterocigocidad). La mayora de los genes requeridos para llevar a cabo la meiosis
por S. cerevisiae estn presentes en C. albicans, (Magee y Magee 2005). Alrededor
de la mitad de los genes predichos contienen diferencias allicas y dos terceras
partes de estas diferencias terminan alterando la secuencia de la proteina. El
genoma de C. albicans tiene secuencias de trinucletidos repetidas en tandem
localizadas dentro de las regiones codificantes. Ms de 1000 genes que no tienen
una funcin tampoco tienen homlogos en S. cerevisiae o en S. pombe y esto puede
ser por que estn involucrados en el proceso de infeccin, por lo que es muy posible
que el genoma de C. albicans contenga la informacin que le ha permitido
permanecer como patgeno en el humano y lidiar con la respuesta inmunolgica y
con otra microflora (Odds y col., 2004).
Hablando de la infeccin localizada causada por C. albicans, se han publicado

numerosos estudios en los que se analiza la expresin de los genes o las protenas
durante el proceso de infeccin, algunos de estos genes estn asociados a cambios
importantes a nivel celular como la morfognesis. Estos estudios se han enfocado en
predecir factores de virulencia y han utilizado para ello todas las tcnicas basadas en
la PCR y en Inmunohistoqumica y han permitido concluir que los genes que
codifican los factores de virulencia son especficos en diferentes estadios y tipos de
infeccin. Hube y col. (Tewes S y col., 2007) con la finalidad de definir genes que
estuvieran especficamente asociados con la invasin del tejido del hospedero,
compararon el genoma de una cepa no invasiva con el de una cepa invasiva de C.
albicans y examinaron cambios temporales en el transcriptoma durante el proceso de
invasin. Varios estudios han examinado el transcriptoma en C. albicans durante la
fagocitosis por neutrfilos, por macrfagos, la exposicin a sangre humana y a
diferentes fracciones de sta, la invasin del epitelio humano, la infeccin del rin y
del peritoneo en ratones. En todos estos estudios se ha mostrado que la clulas de
9
C. albicans alteran su metabolismo para poder asimilar nutrientes y protegerse de las
defensas del hospedero. Dichos resultados se han confirmado con un reciente
estudio de microarreglos (Zakikhany y col., 2007). Otros trabajos de microarreglos
sugieren que el hongo tiene cambios significantes en el metabolismo del carbono
luego de la exposicin al hospedero, lo cual se ha confirmado al estudiar diferentes
mutantes (Fradin C y col., 2005; Tewes S y col., 2007). Por otra parte, los genes
involucrados en la asimilacin de hierro y fosfato se encuentran sobre-expresados
durante el desarrollo de la infeccin (Tewes S y col., 2007). El anlisis de la
expresin del genoma completo tambin ha reforzado la observacin de que la
adaptacin al estrs es esencial para la virulencia de C. albicans. Todos los anlisis
genmicos realizados, concluyen que adems de tener bien regulados los genes que
intervienen en la virulencia, C. albicans tiene un control fino sobre los genes
involucrados en el metabolismo y en la regulacin de la respuesta al estrs en nichos
biolgicos de hospederos especficos (Brown y col.,2007).
Por otra parte, la genmica funcional brinda una ayuda poderosa para definir el modo
de accin de las drogas, pues ofrece un panorama del impacto de una droga sobre la
clula del hongo. Algunos investigadores han desarrollado las tcnicas de
reemplazamiento de genes y expresin condicional en C. albicans y estas mismas
tecnologas se han trasladado a otras especies de Candida con el mismo xito.
Tambin se ha llevado a cabo el anlisis del efecto global de una droga en la
expresin gnica tanto a nivel del transcriptoma como del proteoma. Analizando el
transcriptoma se ha observado que el ketoconazol afecta la expresin de genes
involucrados en el metabolismo de lpidos, cidos grasos y esteroles as como un
inhibidor de la 1-3 glucanosintasa que influye en la expresin de los genes
involucrados en la sntesis de la pared celular. De esta forma se puede evaluar el
mecanismo de accin de nuevos compuestos antifngicos y qu genes son
regulados en respuesta a la droga (Liu y col., 2005; Bruneau y col., 2003).
Existe un trabajo reciente sobre la tipificacin de secuencias multilocus en el que C.

albicans es una de las cepas ms importantes. Este trabajo se basa en el anlisis de
siete fragmentos de genes Housekeeping (Brougnoux y col., 2003); ha confirmado
10
que las cepas de este hongo sufren una microevolucin mientras se desarrollan en el
paciente (Odds y col., 2006).
En el aspecto del diagnstico clnico, Pitarch y col., (2006) han combinado las
tcnicas protemicas y bioinformticas para analizar el inmunoma de C. albicans
(proteinas de la pared celular que pueden interactuar con el suero de pacientes con
candidiasis sistmica) y han reportado una cantidad significantemente elevada de
anticuerpos contra la 1-3 glucosidasa en estos pacientes. La deteccin de estos
anticuerpos representa una forma eficiente de diagnstico en pacientes con
candidiasis sistmica (Pitarch y col., 2006).
A pesar de que se han comenzado a desarrollar todas estas nuevas tecnologas en

el estudio de Candida albicans, aun no se han creado drogas antifngicas para uso
clnico a travs de la genmica, sin embargo esta ciencia brinda una base slida
tanto para estudiar los mecanismos de adaptacin del hongo a los compuestos
atifngicos como para la creacin de nuevas drogas y para tener nuevas
herramientas para el diagnstico y el pronstico en las infecciones sistmicas
causadas por especies de Candida.
1.4 Neurospora crassa
Cuando se empezaron a obtener los primeros resultados de los estudios de

genmica y protemica de levaduras, se comprendi que existan genes, proteinas y
procesos que presentan los ascomicetos filamentosos que no estaban presentes en
las levaduras. Por otra parte, desde hace mucho tiempo se ha tenido como modelo
de estudio al ascomiceto filamentoso Neurospora crassa, debido a la facilidad de
estudiar los productos de la meiosis mediante el anlisis de ttradas, por lo que
realizar los estudios de genmica en este hongo presentaba una gran oportunidad
para el estudio del resto de los ascomicetos filamentosos. El genoma de N. crassa
fue el primero en ser secuenciado entre los ascomicetos filamentosos. Tiene una
longitud total de 39.9 Mb, presenta 10,082 genes que codifican para protenas, con
11
un promedio de 3.7 Kb por gen y un promedio de 1.7 intrones por gen y 134 pb por
intrn en promedio. 1,421 genes coinciden con protenas vegetales o animales
(Galagan y col., 2003). Presenta el 46% de protenas hipotticas conservadas, el
41% de protenas no presentan similitud y el 13% tienen semejanza con secuencias
conocidas (Borkovich y col., 2004). 584 de las protenas predichas no tienen
homlogos en S. cerevisiae o S. pombe, se cree que estas protenas deben estar
relacionadas con el crecimiento de la hifa y con la formacin de estructuras del
desarrollo multicelular, pues estas caractersticas no se encuentran en las levaduras,
lo que sugiere que puede ser un mejor modelo para el estudio de eucariotes
superiores en muchos aspectos de biologa celular. Se han identificado genes de
diez distintos receptores transmembranales acoplados a proteinas G (Borkovich y
col., 2004). Los genes que codifican para los elementos que constituyen el sistema
de dos componentes de Histidin-cinasas son ms abundantes que en S. cerevisiae.
Se han encontrado dos sensores de luz roja cuya funcin aun se desconoce.
Muchos genes de N. crassa slo tienen homlogos en procariotes, posiblemente por
que el hongo ha ocupado el mismo nicho ecolgico y requiere estos genes para la
degradacin del sustrato y el metabolismo secundario. Esta tambin puede ser la
razn principal para el relativamente grande nmero de genes involucrados en
catabolismo, desintoxicacin qumica y mecanismos de defensa ante el estrs. Al
comparar el genoma de este hongo con el de A. nidulans se observa que el primero
carece de genes importantes involucrados en el control de la produccin de esporas
asexuales, sin embargo posee el homlogo del gen que controla todo el proceso
(velvet veA). A pesar de que N. crassa crece solamente en material vegetal
decadente, posee protenas que se han reportado en organismos fitopatgenos
como la del citocromo P450. Otros dominios importantes son los que tienen
semejanza con dedos de zinc, el dominio de hidrogenasa-reductasa, entre otros. El
nmero de dominios involucrados en sealizacin aparece menos en comparacin
con otros hongos y con algunas plantas, junto con algunas helicasas y regiones de
unin a RNA (Galagan y col., 2003).
12
En S. cerevisiae se han identificado siete componentes que intervienen en el punto
de revisin o check point mittico, los cuales estn conservados en Neurospora.
Todas las histonas excepto H4 estn codificadas por genes nicos que tienen
intrones, lo que es similar a otros ascomicetos filamentosos pero diferente en las
plantas, que tienen muchos genes que codifican las histonas y en los de las
levaduras que no tienen intrones. Al analizar las secuencias de los factores de
transcripcin, se encontr que el genoma de N. crassa contiene elementos de
regulacin similares tanto a organismos simples (eucariote unicelular) como
elementos presentes en eucriotes ms complejos (metazoarios), lo que indica que
existen mecanismos de regulacin que ya se han descrito pero tambin nuevos
mecanismos de regulacin. Se han identificado muchos genes involucrados en la
meiosis y en el desarrollo del asca. De tres factores de transcripcin conocidos que
son especficos y estn involucrados en la transcripcin de genes meiticos en S.
cerevisiae, slo uno est conservado en N. crassa; sin embargo se han encontrado
genes que regulan la meiosis los cuales presentan homologa con genes de
eucriotes superiores como ratn y C. elegans (proteinas necesarias para el control
del paquiteno en la meiosis, proteinas involucradas en la adhesin, proteinas
involucradas en la segregacin y apareamiento de los cromosomas), por lo que se
concluye que N. crassa es intermedio entre estos ecucariotes superiores y las
levaduras en cuanto al control de la meiosis se refiere. Menos de la mitad de los
productos gnicos relacionados con la esporulacin que se encuentran en S.
cerevisiae estn presentes en N. crasa, por lo que parece que los componentes de la
sealizacin requerida para la esporulacin estn ms conservados que las
proteinas estructurales. Se han encontrado en el genoma de N. crassa genes que
codifican para tres proteinas semejantes a las que produce C. neformans para formar
su cpsula, producir patogenicidad y evadir la respuesta inmunolgica mediada por
macrfagos; sin embargo, no es capaz de producir cpsula debido a que carece de
otras dos protenas necesarias para la formacin de la cpsula presentes en C.
neoformans (Hynes, 2003).
13
1.5 Aspergillus spp.
El genoma de nueve especies de Aspergillus ha sido parcial o totalmente

secuenciado. A. nidulans ha sido utilizado como modelo de estudio por muchos aos.
Su genoma es de 30 Mb, con 9,541 genes que codifican, con un promedio de 3, 151
pb por gen y de 3.6 exones por gen (Galagan y col., 2005). En el 2005 se public la
secuencia del genoma completo de A. fumigatus (Nierman y col.,2005). El genoma
de este importante patgeno humano consta de 8 cromosomas que van de 1.8 a 4.9
Mb. Cuenta con 9,926 genes que se predice codifican para protenas, con una
longitud promedio de 1,431 pb. Alrededor de 3,000 de los genes predichos tienen
similitud con secuencias conocidas. Existen alrededor de 12 copias de genoma
mitocondrial por cada genoma nuclear. Al comparar este genoma con el de A.
nidulans y A. oryzae, A. fumigatus tiene alrededor de 500 genes nicos. Se han
encontrado los genes involucrados en el desarrollo sexual heterotlico, los
involucrados en el proceso de ensamble de la pared celular y al menos 28 grupos de
genes que codifican para protenas involucradas en el metabolismo secundario y en
la produccin de micotoxinas y alrededor de 128 grupos de genes involucrados en la
expulsin de drogas, toxinas y macromolculas. A. fumigatus codifica una gran
cantidad de informacin para proteger su integridad: enzimas que responden al dao
en el DNA (similares a la fotoliasa), para reparar el rompimiento de la doble hebra
(tambin presente en S. cerevisiae y E. Coli) y contiene la mayora de los genes
involucrados en la reparacin del DNA daado que se presentan en humanos. La
localizacin de grupos de genes involucrados en la sntesis de metabolitos
secundarios en A. fumigatus est en los telmeros, en contraste con A. nidulans que
se encuentra en las regiones subtelomticas (500 kb al final del cromosoma;
Galagan y col., 2005). La mayora de las regiones del genoma que agrupan genes
regulatorios estn asociados con la resistencia al metabolito, sin embargo, A. oryzae
presenta un potencial de metabolitos secundarios mucho mayor. El anlisis del
genoma de A. fumigatus ha localizado grupos de genes relacionados a la sntesis de
gliotoxina y a la sntesis del alcaloide ergot. Un acontecimiento sorpresivo al analizar
el genoma de A. fumigatus es que parece contener todos los genes que se sabe son
14
requeridos para la reproduccin sexual, sin embargo la presencia de ciclo sexual en
el hongo nunca ha sido reportada. El hongo no patognico A. nidulans es
homotlico, mientras que A. fumigatus es conocido por reproducirse solamente a
travs de esporas mitticas asexuales. Sin embargo, al analizar 61 genes implicados
en el proceso de apareamiento o de respuesta a feromonas, se encontr que cada
gen puede ser identificado en A. nidulans y en A. fumigatus. Se han reportado genes
similares a precursores de feromonas y a su receptor. Curiosamente una cepa de A.
fumigatus que se ha secuenciado contiene el ideomorfo MAT-2 y otra cepa que se
secuenci por otro grupo de investigacin contiene el ideomorfo MAT-1, lo que
sugiere que pueden ser un par de cepas heterotlicas. Los estudios realizados
indican que parece haber iguales cantidades de cepas con un ideomorfo y con otro,
lo que deja en el aire la pregunta por qu A. fumigatus no lleva a cabo la
reproduccin sexual y bajo qu condiciones es posible que la realice. El genoma de
A.fumigatus contiene 13 posibles genes de histidin-cinasas, comparado con 15 de A.
nidulans y A. oryzae. Comparado con S. cerevisiae, S. pombe y N. crassa, posee un
nmero mucho mayor de estos genes, lo que sugiere una gran importancia y
diversidad en este sistema regulatorio en la transduccin de seales en el gnero.
Los genomas de A. fumigatus, A. nidulans y A. oryzae contien cuatro genes que
codifican para MAP cinasas. Una aplicacin de anlisis protemicos muestra que el
crecimiento de A. fumigatus en diferentes fuentes de carbono cambia el proteoma
(Kniemeyer y col., 2006). La diferencia entre las secuencias de dos cepas de A.
fumigatus se encuentran localizadas en las regiones subtelomricas, en las que se
han encontrado grupos de genes involucrados en la poduccin de metabolitos
secundarios, los cuales son de gran inters en diferentes especies de hongos
(Ronning y col., 2005). Por otra parte, el genoma de A. oryzae consta de ocho
cromosomas con un tamao de genoma de 37.6 MB, mientras que el genoma
mitocondrial es de 28.9 Kb. Este genoma est muy relacionado con el de A. niger y
A. flavus y es 20-30% ms grande que el de A. nidulans y A. fumigatus. El nmero
total de genes codificadores para protenas mayores a 100 aminocidos es de
12,074. Tiene un promedio de 2.8 Kb por gen (Machida y col., 2005). Tiene una
gran cantidad de genes involucrados en metbolismo y en metabolismo secundario y
15
un nmero significante de genes con funcin desconocida (8,533). El nmero de
genes relacionados con el metabolismo es mayor que en N. crassa y que S.
cerevisiae y este aumento est marcado en varias rutas metablicas particulares: la
que contiene ms genes es la de degradacin de fenilalanina-triptofano, la de
degradacin de tolueno y la sntesis y degradacin de aminocidos hidrofbicos. El
genoma de A. oryzae posee una estructura de mosaico con loci comunes a las tres
especies de Aspergillus. Presenta una gran cantidad de genes relacionados al
metabolismo secundario en bacterias y se sabe que la mayora de estos genes no se
expresan en condiciones normales de crecimiento (Kobayashi y col., 2007).
1.6 Magnaporthe grisea
Este hongo filamentosos se ha utilizado como modelo de estudio para estudiar

diversos aspectos de la patognesis, pues es patgeno del arroz. La secuencia
completa de este hongo ha sido generada recientemente, contiene 38.8 Mb, 12,841
genes (Dean y col, 2005). Este genoma codifica para un numeroso y diverso grupo
de protenas secretadas. Contiene un gran repertorio de posibles receptores
acoplados a protena G, incluyendo 61 que no se haban descrito antes. Un grupo de
estos receptores posee un dominio membranal que se expande al espacio
extracelular, lo que es inusual en hongos. Dos de estos genes son diferencialmente
expresados durante el desarrollo del hongo en el proceso de infeccin, lo que
coincide con el papel en la percepcin antes del inicio de la infeccin. El genoma de
M. grisea codifica para un grupo extenso de enzimas involucradas en el metabolismo
secundario, lo que es consistente con la capacidad que tiene este hongo para
producir metabolitos secundarios. La funcin precisa de estos metabolitos en la
patognesis no se ha establecido, pero interesantemente uno de los genes que
codifica para una polictido-sintasa (PKS) se ha identificado como un gen de
avirulencia. Se ha observado que los metabolitos secundarios producidos por el
hongo juegan un papel importante en el establecimiento de la enfermedad (Caracuel-
Rios y Talbot, 2007). Al analizar el transcriptoma de este hongo en dos estadios de
desarrollo, el crecimiento vegetativo y la formacin del apresorio, Gowda y col.
16
(2006) encontraron una gran cantidad de genes que se expresan diferencialmente en
ambas condiciones. El mayor nmero de genes diferenciales lo encontraron durante
la formacin del apresorio; corresponden a genes involucrados en la modificacin
postranscripcional y las chaperonas. En cambio, los genes relacionados con la
traduccin, la estructura ribosomal y la biognesis se expresan en mayor cantidad
mientras el hongo se desarrolla como micelio.
1.7 Fusarium spp
La principal meta en la investigacin de la biologa molecular de los hongos de

diferentes especies de Fusarium es reducir la presencia de micotoxinas en los
granos de los cereales, es por eso que los esfuerzos se han enfocado a identificar
aspectos de la biosntesis de las micotoxinas y la regulacin de esta biosntesis. Con
la secuenciacin completa de los genomas de Fusarium graminearum, F.
verticilloides y varios bancos de secuencias de expresin gnica de diferentes
especies de Fusarium, los investigadores de todo el mundo estn trabajando para
identificar genes involucrados en la biosntesis de micotoxinas y sus genes
regulatorios. As, se han identificado siete grupos de genes involucrados en la
sntesis de micotoxinas. Cuatro de estos siete grupos corresponden a polictido
sintasas, lo que refleja la actividad de estos hongos en la sntesis de micotoxinas
(Desjardins y Proctor, 2007). Existen otrosmuchos reportes en los que se analiza la
expresin diferencial de diferentes especies de Fusarium que son fitopatgenas con
un gran inters agrcola.
1.8 Ustilago maydis
El uso de S. cerevisiae como modelo de estudio tiene sus limitaciones, debido a que
existen ciertos procesos bsicos que slo realizan las clulas animales, vegetales o
fngicas, como son el transporte a larga distancia a travs del citoesqueleto, la
remocin de la membrana nuclear durante la mitosis, la fotosntesis, etc. El
basidiomiceto Ustilago maydis, un conocido patgeno de maz, tiene una larga
17
historia como un organismo modelo en Biologa Celular para la comprensin de
conceptos bsicos como los mecanismos moleculares de la recombinacin.
Recientemente la importancia de este hongo como sistema modelo ha incrementado,
se ha estudiado y se sigue estudiando el sistema de microtbulos del citoesqueleto
durante el crecimiento polar y la mitosis, y se ha revelado que este proceso es
conservado entre este hongo y los mamferos, lo que no sucede en S. cerevisiae.
Debido a su estado de vida patognico, a los numerosos avances tecnolgicos y la
reciente publicacin de la secuencia de su genoma (Kamper y col., 2006) y de la
anotacin de su proteoma, este hongo se ha establecido como un poderoso sistema
modelo en la fitopatologa molecular; se han descrito, clonado y secuenciado genes
que codifican para enzimas involucradas en rutas de sealizacin relacionadas con
la patognesis, con el desarrollo sexual, el dimorfismo, etc. El genoma de U. maydis
tiene 6,867 genes que codifican para protenas, con 2.86 Kb/gen en promedio, con
exones de 1,208 pb en promedio y 1.45 exones/gen. Un importante proceso biolgico
en el que se est utilizando U. maydis en los ltimos aos como modelo es la
remocin de la membrana nuclear, que tambin sucede en los mamferos y no en S.
cerevisiae (Lippincott-Schwartz, 2002; Straube y col., 2005). Se ha observado una
gran conservacin en las protenas que componen el poro nuclear tanto en U. maydis
como en el humano (Munsterkter y Steinberg, 2007). Otro importante proceso
biolgico en el que U. maydis se utiliza como modelo de estudio es la accin de los
microtbuoos durante la mitosis (Steinberg, 2007). Analizando el proteoma de U.
maydis, de S. cerevisiae y la informacin accesible de Homo sapiens, se ha
encontrado que el proteoma de U. maydis est ms relacionado al humano que al del
hongo S. cerevisiae. Muchas proteinas conservadas en H. Sapiens y en U. maydis
pueden asignarse a ciertos procesos celulares; sin embargo, muchas de estas
protenas tienen funcin desconocida, lo que indica que aun faltan procesos por
descubrir que son comunes en ambos organismos (Munsterkter y Steinberg, 2007).
18
1.9 Estudios genmicos comparativos entre diferentes hongos
Fitzpatrick y col. (2006), utilizaron dos tecnologas computacionales para inferir la

relacin existente entre 42 especies de hongos cuyo genoma se ha secuenciado y
publicado. Usaron un banco de datos de 345,829 extrados de las secuencias
genmicas publicadas. Dentro del Phylum Ascomycota, los Subphylum
Pezizomycota y Saccharomicota fueron resueltos. Con ambas metodologas se
infieri que los Leotiomycetes son los ms cercanos a los Sordariomicetes.
Por otra parte, Arvas y col. (2007), realizaron la comparacin computacional del
genoma completo de los genes que codifican protenas en los Subphylum
Saccharomycotina y Pezizomycotina y encontraron que en ste ltimo fila existen
proteinas hay un subgrupo de familias proticas relacionadas conla degradacin de
biomasa vegetal y relacionados con elmetabolismo secundario que muestran
haberse expandido recientemente. Adems este Subphylum tiene un gran nmero
de genes que estn poco cracterizados con una variedad de funciones que se
predicen. Estos genes estn bien conservados en el Subphylum pero no muestran
signos de expansin reciente. Los genes encontrados en todos los hongos excepto
en el Subphylum Saccharomycotina estn ligeramente mejor caracterizados y
predichas las principales enzimas para las cuales codifican. Existe ms cantidad de
genes involucrados en la transcripcin y en las funciones mitocondriales. En este
anlisis se puede predecir que todos los miembros del Subphylum Pezizomycota a
diferencia de los del Saccharomycota pueden potencialmente producir una gran
variedad de metabolitos secundarios. Un gran nmero de todas las enzimas que se
predicen se encuentran en todos los hongos, excepto en Saccharomycotina.
Hablando de diferencias entre organismos ms cercanos genticamente, Gash

(2007) public un estudio de tres hongos modelo, Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe y Candida albicans en el que analiz las diferencias de
expresin genmica de estos hongos en condiciones de estrs ambiental. Estos
organismos responden con un alto grado de precisin en trminos de los genes
19
afectados en cada condicin y la magnitud y la cintica de la expresin cambian
dependiendo de la condicin a la que se someten. La respuesta al estrs ambiental
se describi inicialmente en S. cerevisiae en la que alrededor de 300 genes inducan
su expresin mientras que alrededor de 600 genes la repriman en respuesta a
diferentes tipos de estrs (calor, estrs oxidativo o reductivo, estrs osmtico, falta
de nutrientes, dao al DNA, etc, Causton y col., 2001). Luego de haber identificado
las respuestas de S. cerevisiae, Chen y col., (2003) demostraron que en S. pombe
tambin se induce y reprime la expresin de genes en respuesta a diferentes tipos de
estrs y que muchos de ellos de forma general eran los genes ortlogos a los que se
presentaban en S. cerevisiae. Otras caractersticas tambin se conservaban como el
tiempo de inicio de la respuesta. Muchos de estos genes incluyen aquellos
involucrados en el metabolismo de carbohidratos, en la defensa contra las especies
reactivas de oxgeno, en el metabolismo de protenas, en la sealizacin intracelular
y en la reparacin del DNA daado. Un nmero pequeo de genes se inducen en S.
cerevisiae pero se reprimen en S. pombe en respuesta al estrs, como los
involucrados en el metabolismo de los cidos grasos. Al analizar lo que suceda en el
patgeno humano, Candida albicans, Enjalbert y col., (2003) publicaron que este
hongo no inicia una respuesta comn al estrs bajo condiciones de laboratorio; sin
embargo en un estudio posterior identificaron un pequeo grupo de genes que se
ven afectados durante un severo estrs, los cuales coinciden con los de S. cerevisiae
(Smith y col., 2004) Aparentemente esta carencia de respuesta inicial tiene relacin
con el nicho especfico de esta especie. En otro anlisis combinatorio realizadopor
Tuch y col., (2008) se estudi la proteina Mcm1, un regulador transcripcional que en
combinacin con cinco cofactores se une al 4% de los genes de S. cerevisiae y
regula procesos que van del ciclo celular al apareamiento. Encontraron que en
Kluyveromyces lactis y Candida albicans el circuito regulatorio es muy diferente, pues
este factor de transcripcin se une al 12% de los genes en K. lactis y C. albicans.
Este anlisis muestra que los genes regulados por Mcm1 han cambiado
drsticamente a travs de la evolucin. Debido a las secuencias de DNA a las que
se une preferencialmente, se encuentra en mayor proporcin cerca de los genes que
estn relacionados con ella. El gen que codifica para esta proteina se encuentra
20
entre los genes que han variado considerablemente a travs de las especies y se
encuentra en mayor cantidad durante ciertas etapas del ciclo celular y durante el
apareamiento. Sin embargo existen varias diferencias especficas de especie. Al
realizar la comparacin del genoma de C. albicans con el de C. dubliniensis, Morn y
col. (2004), encontraron que alrededor del 4% del segundo hibrida con el primero y
que los genes involucrados en la virulencia de C. albicans divergen mucho de los
encontrados en C. dubliniensis, lo que explicara la baja patogencidad de este ltimo.
De Backer y col. (2001) bservaron que ms de 150 genes aumentan su expresin
cuando C. albicans crece en medio con itraconazol y 100 genes la disminuyen. El
cambio en el pH y la falta de hierro ocasionan un cambio drstico en la expresin
gentica en este hongo. Fraddin y col. (2003), tambin mostraron que la expresin
gentica tambin sufre un cambio cuando la cepa se incuba en sangre o plasma.
En cuanto a los hongos filamentosos, a pesar de que Neurospora no se asocia

ntimamente con plantas vivas, la secuencia de su genoma ha revelado la presencia
de genes cuyos posibles productos son muy similares a las proteinas presentes en
organismos que son fitopatgenos como Botrytis, Colletotrichum, Magnaporthe,
Nectria y otros. Estos genes presentes en N. crassa tienen aparentes homlogos en
M. grisea y F. graminearum, incluso se han encontrado estas proteinas en A.
fumigatus. Muchas protenas que se encuentran en otros hongos y que estn
relacionadas tanto con funciones de patogenicidad como de no patogenicidad
tambin se han encontrado en N. crassa, como aquellas involucradas en la salida de
compuestos txicos, la transduccin de seales en el estrs y en la biosntesis.
Parece ser que Neurospora y Magnaporthe comparten solo el 60% de sus genes.
Alrededor de 200 protenas que se predicen para N. crassa tienen similitud
significante con productos gnicos humanos cuya alteracin causa enfermedad.
Muchas de ellas se encuentran presentes en el genoma de S. cerevisiae o de S.
pombe, pero otras tantas no. Existen por lo menos dos protenas similares a
transportadores de cobre asociados con la enfermedad de Wilson en humanos.
Adems posee un amplio repertorio de enzimas modificadoras de histonas (Galagan
y col, 2003).
21
1.10 Hongos fitopatgenos como modelo de estudio
El estudio de la biologa de los hongos fitopatgenos tiene una gran importancia a

nivel mundial y nacional. Mientras ms conocimiento se tiene de los diferentes
procesos que realizan estos organismos tales como su desarrollo, la forma de
reproduccin, las fuentes de variabilidad, las herramientas moleculares utilizadas
para causar enfermedad, entre otros; mejor pueden ser controladas las
enfermedades causadas por ellos en los cultivos de importancia comercial, se reduce
la utilizacin de productos qumicos para erradicarlos y se beneficia a un gran
nmero de pases en vas de desarrollo. Como ya se revis, existen algunos hongos
filamentosos que se han utilizado por muchos aos como modelo de estudio. A
medida que las tcnicas moleculares son accesibles a ms investigadores, el nmero
de investigaciones utilizando hongos fitopatgenos como modelo aumenta y se
diversifica, pues existen procesos biolgicos que no son comunes aun entre los
mismos hongos fitopatgenos.
Dentro de los hongos fitopatgenos, diferentes especies pertenecientes al gnero

Colletotrichum ocupan un lugar importante a nivel mundial, pues son causantes de
enfermedades en varios cultivos de importancia comercial, tales como el mango, el
pltano, el aguacate, el maz y el frijol, entre otros. Algunas de estas especies de
Colletotrichum se han utilizado como modelo de estudio para conocer los
mecanismos que utiliza el hongo en el proceso de infeccin, as como para conocer
los mecanismos de defensa y reacciones que desarrolla la planta. Otras especies de
este gnero se han utilizado como modelo de estudio en el anlisis de los eventos de
reproduccin, mientras que otras se han utilizado para realizar estudios filogenticos.
Estas especies son entre otras C. gloesporioides, C. graminicola, C. magna, C.
acutatum y C. fragarie, las cuales se utilizan en todo el mundo como modelos.
Debido a que Mxico es un productor y consumidor importante de frijol, resulta de
especial inters el estudio de C. lindemuthianum, patgeno de este cultivo que puede
llegar a causar prdidas de hasta el 90% en la cosecha (Bayley, 1992; Melotto y col.,
22
2000) y que adems rene las caractersticas necesarias para ser utilizado como un
excelente modelo de estudio. Debido a que no se ha encontrado el estado sexual de
C. lindemuthianum en la naturaleza, ha sido difcil estudiar los procesos de
variabilidad y patogenicidad que se pueden realizar fcilmente en hongos que llevan
a cabo reproduccin sexual.
1.11 Colletotrichum lindemuthianum como modelo de estudio
En el laboratorio de Gentica Molecular del CINVESTAV-unidad Guanajuato, donde

se realiz el presente trabajo, se ha tenido especial inters en estudiar al hongo
Colletotrichum lindemuthianum, por la importancia nacional desde el punto de vista
agrcola y econmico, pero tambin por representar un candidato estupendo para
estudiar los procesos de patognesis, virulencia, avirulencia y, en el caso de este
trabajo, de la reproduccin sexual en ascomicetos fitopatgenos. Nuestro grupo de
trabajo ha recolectado aislados de este hongo provenientes de diferentes estados del
pas, se han clasificado, se ha estudiado su variabilidad gentica, su patogenia y la
interaccin que tiene con la planta.
La realizacin del presente trabajo fue posible gracias al hallazgo reportado por
nuestro grupo de dos cepas de C. lindemuthianum capaces de llevar a cabo un
desarrollo sexual en condiciones de laboratorio (Rodrguez-Guerra y col., 2005).
Este fenmeno ha sido reportado en contadas ocasiones y no se han realizado
estudios ms exhaustivos al respecto en esta especie. Una vez caracterizadas
patognicamente estas dos cepas y su progenie (Rodrguez-Guerra y col., 2005;
Luna-Martnez y col, 2007), se plante la posibilidad de analizar a nivel molecular los
fenmenos que determinan el desarrollo sexual en ellas. Se pens que la forma
idnea para abordar este problema sera la que se ha utilizado en diferentes
ascomicetos que llevan a cabo reproduccin sexual. Como se analizar en detalle
posteriormente, varias especies de ascomicetos filamentosos llevan a cabo
reproduccin sexual, la cual est controlada de forma general por un locus MAT con
dos ideomorfos (secuencias distintas en el mismo locus). Se ha reportado que las
23
cepas sexualmente compatibles poseen cada una, uno de estos ideomorfos, los
cuales pueden contener uno o ms genes. En uno de estos ideomorfos
invariablemente se encuentra un gen que tiene un dominio conservado denominado
caja HMG (MAT2), mientras que el otro presenta por lo menos un gen con un
dominio conservado denominado dominio alfa (MAT1). Diversos grupos han
diseado iniciadores especficos para amplificar por PCR estos dominios que son
conservados aun entre gneros. Con base en este antecedente, se pens utilizar los
iniciadores reportados para otros ascomicetos filamentosos, para amplificar por PCR
los dominios conservados de cada uno de los ideomorfos en las cepas de C.
lindemuthianum que presentan reproduccin sexual. Una vez obtenida la secuencia
de estos dominios, se utiliz la tcnica de TAIL-PCR (Liu y col., 1995) para conocer
las secuencias aledaas a ellas y de esta forma clonar y analizar el o los genes
involucrados en el desarrollo sexual de este hongo. En el presente trabajo se
muestran y discuten los resultados obtenidos luego del anlisis de estas secuencias.
Adems se realizaron anlisis preliminares de la expresin de estos genes y de la
segregacin de ellos en la progenie obtenida de la cruza mencionada. Con las
secuencias obtenidas al amplificar la regin conservada HMG se realiz un anlisis
filogentico, herramienta que se ha utilizado en diversos ascomicetos del gnero
Colletotrichum como instrumento de clasificacin (Vaillancourt y col., 2000).
24
2. Antecedentes
2.1 Reproduccin asexual en hongos
Los hongos son organismos que pueden reproducirse utilizando diferentes

mecanismos. Uno de estos mecanismos es la reproduccin vegetativa, en la que no
se requiere del apareamiento de dos clulas sexualmente compatibles. Durante la
reproduccin vegetativa en los hemiascomicetos, el material gentico se duplica, se
lleva a cabo la mitosis y la clula hija emerge de la clula madre por gemacin
(Snustad y Simmons, 2006; Figura 1).
Figura 1. Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae.

Slo se muestra el desarrollo vegetativo del hogo:
la clula madre produce una clula hija por gemacin.
(Lodish y col, 2006).
En el caso de los ascomicetos filamentosos una hifa crece, replica su material

gentico y forma clulas nuevas mediante la mitosis. Bajo ciertas circunstancias, la
hifa forma estructuras especializadas, denominadas conidiforos o acrvulos,
produce conidias que al ser liberadas al medio darn lugar a nuevas hifas (Nauta y
Hoekstra, 1992).
25
En los basidiomicetos se lleva a cabo la reproduccin asexual por mitosis, lo que
produce el aumento del nmero de clulas del micelio (Casselton y Olesnicky, 1998).
En los casos citados, la recombinacin de material gentico est ausente y las
clulas hijas tienen material gentico idntico al de la clula madre.
2.2 Reproduccin sexual en Ascomicetos
Otro mecanismo de reproduccin de los hongos es la reproduccin sexual, que tiene

como requisito el encuentro entre dos clulas sexualmente compatibles y puede ser
de dos tipos: la reproduccin sexual heterotlica, en la que las cepas son
autoestriles y slo pueden aparearse con clulas sexualmente compatibles
provenientes de otra cepa y la reproduccin sexual homotlica, en la que las cepas
son autofrtiles, es decir, pueden completar el ciclo sexual aparendose con ellas
mismas (Nauta y Hoekstra, 1992). Como ejemplos de hongos con reproduccin
sexual heterotlica se encuentran algunas cepas de N. crassa, C. heterostrophus, C.
albicans, P. anserina y G. Fujikoroi; mientras que algunas cepas de G. zae, S.
macrospora, N. crassa y C. heterostrophus llevan a cabo la reproduccin sexual
homotlica. En la reproduccin sexual deben formarse dos estructuras
especializadas: el ascogonio o estructura femenina y la microconidia o estructura
masculina. Estas dos estructuras se acercan entre s, fusionan sus membranas
celulares y desarrollan los protoperitecios, dentro de los cuales se forman las ascas.
En las ascas se lleva a cabo la fusin nuclear y la posterior meiosis para formar
cuatro ascosporas, las cuales se dividen por mitosis para formar finalmente 8
ascosporas. Este proceso da lugar a la maduracin del peritecio, el cual en ciertas
condiciones, libera las ascosporas para iniciar el ciclo nuevamente (Kronstad, 1997;
Figuras 2 y 3).
26
Figura 2. Reproduccin sexual en ascomicetos filamentosos.
Dos clulas con tipo de apareamiento complementario se unen
(plasmogamia), forman la hifa ascgena, luego el asca inicial.
Posteriormente ocurre la fusin entre los ncleos de estas clualas
(cariogamia) para formar las ascas y postreriormente dar lugar
al peritecio . Modificado de http://www.fgsc.net/Neurospora/.
1 2 3 4 5
Figura 3. Formacin de ascosporas. Las clulas con Mating-type complementario se fusionan para
formar un zigoto diploide (1). Despus de la duplicacin de cromosomas el ncleo diploide entra en la
primera divisin meitica (2). Cada ncleo hijo se divide por meiosis produciendo dos ncleos
haploides (3). Cada ncleo haploide se divide mitticamente para producir dos ncleos gemelos (4).
Los ocho ncleos resultantes se distribuyen en clulas separadas, desarrollando ocho ascosporas
maduras (5). Esquema modificado de Snustad y Simmons (2006).
Para que se lleve a cabo el acercamiento y fusin de clulas sexualmente

compatibles es necesario que una clula reconozca que est delante de otra clula
con la que es sexualmente compatible. Este reconocimiento se logra gracias a que
cada clula sexualmente compatible secreta un polipptido denominado feromona.
La sntesis y secrecin de este polipptido se encuentra regulada por el locus del
Tipo de Apareamiento. Las clulas con un tipo de apareamiento determinado,
secretan una feromona especfica, la cual se acopla a un receptor de membrana
27
especfico para ella presente en la cepa del tipo de apareamiento complementario.
Esta unin de la feromona con el receptor desencadena el desarrollo del ascogonio y
la microconidia y todos los pasos ya comentados (Watson y col., 2005).
Los ascomicetos poseen en general un locus nico que controla el desarrollo del
ciclo sexual. Esta regin se conoce como locus del tipo de apareamiento (MAT), el
cual como ya se dijo est involucrado en el reconocimiento celular. En cada una de
las cepas que se aparean existe un alelo de este locus. Sin embargo, cuando se
analiz la secuencia del alelo de cada cepa, se encontr que diferan en su
secuencia, por lo que se les denomin ideomorfos (Arie y col., 1997). Dentro de
cada ideomorfo existen de uno a varios genes, dependiendo del gnero y del tipo de
apareamiento del que se trate. De forma general estos genes codifican factores de
transcripcin involucrados en la activacin o desactivacin del desarrollo sexual.
Este sistema de apareamiento se denomina sistema bipolar: un locus nico que
gobierna el desarrollo sexual, con dos formas alternativas o ideomorfos. Se han
estudiado los ideomorfos MAT de algunos ascomicetos modelo. Como se describe a
continuacin, existen similitudes y diferencias entre stos.
a) Hemiascomicetos. Las clulas sexualmente compatibles se reconocen, unen sus

membranas, luego unen sus ncleos y llevan a cabo la meiosis; lo que da lugar a
dos clulas hijas con el mismo nmero de cromosomas que las clulas madre. En
el caso de Saccharomyces cerevisiae, una de las cepas que se aparean presenta
Tipo de apareamiento a y la otra, Tipo de apareamiento ; estas cepas al
aparearse forman una clula diploide a/. Una caracterstica importante en este
sistema es que tiene la capacidad de encender o cambiar de Tipo de
apareamiento, lo que lo hace un organismo homotlico (Herskowitz, 1988; Figura
4).
28
Figura 4. Esquema del ciclo de vida de Saccharomyces
cerevisiae. Se muestran tanto la reproduccin asexual
como la reproduccin sexual (Lodish y col, 2006).
.
El locus MAT se encuentra en el cromosoma III, que adems de tener el locus

MATa o MAT, contiene otras dos copias del casete del Tipo de apareamiento,
situadas en cada una de las regiones telomricas, denominadas HML y HMR.
Estos alelos estn transcripcionalmente reprimidos por silenciamiento. Cuando se
encuentran creciendo dos cepas cercanas y ambas presentan el mismo tipo de
apareamiento, cualquiera de ellas es capaz de cambiar su tipo de apareamiento
activando la copia del tipo de apareamiento que inicialmente se encontraba
silenciada. Esto se lleva a cabo gracias a un fenmeo de recombinacin que
produce la activacin de una secuencia presente en la regin HML o HMR que
contiene el tipo de apareamiento contrario A este cambio en el tipo de
apareamiento se denomina switch. (Cosma, 2004, Figura 5).
29
Figura 5. Locus MAT en S. cerevisiae, situado en el centro. En los extremos se muestran los
casetes necesarios para realizar el switch. Tomado de Watson y col.,(2005).
Dentro del locus MATa existen dos genes que son divergentes; a1, un regulador
negativo de genes haploides, miembro de la familia de genes de homeodominios
y a2, que no codifica para una protena funcional (Haber, 1998). En el locus
MAT hay dos genes; 1 que es un factor de transcripcin, regulador positivo de
los genes especficos y 2 que es un represor, acta evitando la activacin de
los genes a especficos y tambin pertenece a la familia de genes de
homeodominios (Haber, 1998; Figura 6). Las clulas a y codifican cada una,
reguladores especficos del tipo celular. Las clulas tipo a elaboran la protena
reguladora a1, mientras que las clulas producen las protenas reguladoras 1
y 2. Una cuarta protena llamada Mcm1 (no codificada por estos genes) tambin
participa en la regulacin de los genes especficos del Tipo de apareamiento
(entre muchos otros) y est en ambos tipos de clulas. En las clulas a los genes
especficos se encuentran inactivos debido a que no tienen unido ningn
activador. Los genes especficos del tipo a se encuentran activos debido a que la
protena Mcm1 y la protena a estn unidas a ellos. En las clulas los genes
especficos estn activados por que Mcm1 est unida ro arriba y los activa
siempre y cuando se una a ella la protena 1. En estas clulas los genes
especficos a se mantienen inactivos por la accin de la protena 2, que forma
un dmero y se une a estos genes junto con la protena Mcm1. Cuando ocurre la
30
fusin de los dos tipos de clulas, se forman las clulas diploides, en las que
tanto los genes especficos de a como los de estn desactivados (Haber, 1998;
Figura 6).
Figura 6. Activacin-desactivacin de los genes involucrados en el desarrollo sexual en S.

cerevisiae.Tomado de Watson y col., (2005).
Cada tipo celular haploide secreta un factor de apareamiento diferente, una

pequea feromona polipeptdica. Tambin expresa un receptor de superficie
celular asociado con la protena G que reconoce la feromona secretada por las
clulas del otro Tipo de apareamiento. La unin de los factores de apareamiento
a sus receptores induce la expresin de un grupo de genes que codifican
protenas que dirigen el arresto del ciclo celular en G1 y promueve la
adhesin/fusin de las clulas haploides para formar clulas diploides. En
presencia de nutrientes suficientes las clulas diploides continan creciendo. La
falta de nutrientes induce a las clulas diploides a entrar en meiosis, cada una
producir cuatro esporas haploides (Figura 7).
31
Figura 7. Accin de las feromonas en S. cerevisiae.
Tomado de Lodish y col., (2005).
Siguiendo con el anlisis de la reproduccin sexual en los hemiascomicetos,

Candida albicans, un importante hongo diploide patgeno en humanos, posee
varias caractersticas distintivas que no se observan en otros hongos. Una de
estas caractersticas es la habilidad de hacer un switch o cambio entre dos
diferentes tipos celulares: clulas que forman colonias blancas, en forma de domo
sobre el agar y que al microscopio se observan casi esfricas, cambian
repentinamente para formar colonias opacas, pegadas al agar y que al
32
microscopio se observan ms alargadas (Soll, 1997). A esta habilidad se
denomina cambio o switch blanco-opaco. El fenmeno antes descrito aunado al
hecho de que hace algunos aos Magee y Magee (2000) encontraron
condiciones especficas para que cepas de C. albicans con Tipo de apareamiento
complementario llevaran a cabo la reproduccin sexual en el laboratorio, llevaron
a Miller y Johnson a publicar la relacin existente entre el switch descrito por Soll
y el locus del Tipo de apareamiento (Miller y Johnson, 2002). Como antecedente
a este trabajo se saba que en el genoma de C. albicans existe un locus
denominado MTL (Mating-type Like) que contiene secuencias que codifican para
protenas con ms del 50% de similitud con las protenas codificadas por los
genes 1, 2 y a1 de Saccharomyces cerevisiae. Estas secuencias se
encuentran en los loci denominados MTL y MTLa. Miller y Johnson (2002),
demostraron que el switch que realiza una pequea proporcin de clulas de
aislados clnicos de C. albicans es controlado por protenas que regulan la
transcripcin, codificadas en el locus MTL, especficamente por los genes MTLa1
y MTL2, cuyos productos gnicos contienen homeodominios y forman un dmero
que acta como represor del switch. Adems, las clulas que cambiaban de
fenotipo (de blancas a opacas) eran capaces de reproducirse sexualmente con
una frecuencia extraordinariamente mayor (106 veces ms) que las clulas
blancas. Estos resultados se obtuvieron eliminando uno de los alelos de cada
cepa (diploide) para tener slo un alelo funcional. Posteriormente Lockhart y
colaboradores (2002) demostraron que las clulas deben ser homocigotas para el
respectivo alelo para que este switch pueda llevarse a cabo.
b) Ascomicetos filamentosos heterotlicos. Un importante modelo de hongo

filamentoso en el que se ha estudiado la reproduccin sexual es Neurospora
crassa, que es un hongo bsicamente heterotlico (Figura 8).
33
Figura 8. Reproduccin sexual en N. crassa. La microconidia de la cepa de un Tipo de
apareamineto se une al ascogonio de la cepa con Mating-type complementario y se lleva a
cabo la formacin de peritecios maduros y la liberacin de ascosporas.
http://www.fgsc.net/Neurospora/
Se sabe que las cepas de N. crassa, tienen dos ideomorfos denominados MatA y
Mata. Dentro del ideomorfo MatA se han encontrado tres genes: MatA-1, cuyo
producto gnico tiene similitud con el producto del gen 1 de S. cerevisiae, con
un dominio ; MatA-2 cuyo producto gnico no tiene homologa con lo reportado
para otros genes de apareamiento y MatA-3 que contiene un dominio HMG. El
ideomorfo Mata contiene dos genes: Mata-1 que tiene un dominio HMG y Mata-2
cuyo producto gnico no presenta similitud con lo reportado en los bancos de
datos (Figura 9).
Mat a Mat A
Mat a-1 Mat a-2 Mat A-3 Mat A-2 Mat A-1
Figura 9. El locus MAT en las cepas de N. crassa est constituido por dos genes en el caso de
Mata y por tres en el caso de MatA. Los genes Mata-1 y MatA-3 contienen un dominio HMG; el
gen MatA-1 contiene un dominio y el gen MatA-2 contiene un dominio caracterstico.
34
Los anlisis de mutantes en los ideomorfos MAT de N. crassa han proporcionado
informacin acerca de su funcin. Cuando se realiz la transformacin ectpica
con cualquiera de los ideomorfos, las transformantes fueron capaces de
aparearse, pero no de producir ascosporas, lo que indica que las regiones
aledaas a cada ideomorfo tienen un papel regulatorio en los pasos siguientes al
apareamiento (Staben y Yanofsky, 1990; Chang y Staben, 1994; Randall y
Metzenberg, 1995; Ferreira y col., 1996). Se ha comprobado que el gen mta-1
tiene un papel esencial en el apareamiento y en la incompatibilidad vegetativa
(formacin del dicarin, Philley y Staben, 1994), mientras que mtA-2 y mtA-3 por
su parte son esenciales en los pasos posteriores a la ascosporognesis, pero no
se sabe si ambos genes son esenciales o slo uno de ellos (Chang y Staben,
1994).
Los ideomorfos MAT en Podospora anserina, un ascomiceto filamentoso, son

similares a los encontrados en N. crassa: uno de ellos denominado mat +
contiene un solo gen, FPR1, que es homlogo a mata-1 y codifica para una
protena con un dominio HMG. El otro ideomorfo, denominado mat -, contiene
tres genes: FMR1, que codifica una protena con un dominio -1 y controla la
fertilizacin; SMR1, que codifica una protena con caractersticas de activador
transcripcional y SMR2 cuyo producto gnico contiene un dominio HMG. Al
analizar mutantes en cada uno de estos genes, se estableci que FMR1 es
necesario para la fertilizacin, mientras que los genes SMR1 y SMR2 junto con
FPR1 son requeridos para los procesos que siguen a la fertilizacin, como el
desarrollo del cuerpo fructfero (Debuchy y Coppin, 1992; Debuchy y col., 1993;
Zickler y col., 1995; Arnaise y col., 2001; Figura 10).
35
Mat+ Mat-
FPR1 SMR2 SMR1 FMR-1

Figura 10. Locus MAT de cepas heterotlicas de Podospora anserina. Las cepas Mat + contienen
un solo gen en este locus, que tiene un dominio HMG; mientras que las cepas Mat contienen
tres genes: SMR2 con un dominio HMG, FMR1 con un dominio y SMR1 con un dominio HPG
(Debuchy y Turgeon, 2006).
Para probar la funcin de los productos de los ideomorfos, se transform una

cepa N. crassa con los ideomorfos de P. anserina y viceversa, obteniendo en
ambos casos el desarrollo sexual; sin embargo, la introduccin de los genes de P.
anserina no brindaron la incompatibilidad vegetativa (falta de capacidad de una
cepa individual de un hongo de producir anastomosis con otra hifa y permanecer
con sus ncleos sin unirse, dentro de un mismo citoplasma), y los eventos post
fertilizacin en N. crassa, funciones que se crea realizaban en P. anserina
(Arnaise y col., 1993), lo que sugera que que estos eventos estaban controlados
adems por otros genes en P. anserina. Posteriormente se obtuvieron mutantes
de los genes de cada tipo de apareamiento y se concluy que los genes SMR1,
SMR2 y FMR1 (del tipo de apareamiento Mat -) activaban las funciones
especficas de los genes mat, involucradas en el reconocimiento internuclear y
repriman funciones especficas de los genes Mat+ involucradas en la fertilizacin
y el reconocimiento internuclear; mientras que el gen FPR1 (del tipo de
apareamiento Mat+) funciona como represor de las funciones especficas de los
genes mat y activa las funciones especficas mat+ involucradas en la fertilizacin
y el reconocimiento internuclear (Arnaise y col, 2001).
Si bien se ha presentado un anlisis del desarrollo sexual de importantes

ascomicetos modelos de estudio, no se ha hablado de hongos fitopatgenos.
Como un modelo importante de stos tenemos a Cochliobolus heterostrophus, un
patgeno del maz que lleva a cabo reproduccin sexual y que tambin presenta
dos ideomorfos alternativos denominados MAT1-1 y MAT1-2, cada uno de ellos
solo tiene un gen. El producto gnico de MAT1-1 tiene similitud con las protenas
36
MATA y Mat1 de N. crassa y S. cerevisiae respectivamente, contiene un dominio
HMG; mientras que el producto de MAT1-2 tiene similitud con MATa, de N.
crassa, con un dominio . Al analizar la expresin de los ideomorfos de cada tipo
de apareamiento de C. heterostrophus, Leubner-Metzger y col. (1997) detectaron
los transcritos correspondientes cuando los hongos fueron crecidos en medio
mnimo, pero no detectaron transcritos cuando los hongos crecieron en medio
completo, lo que sugiere que la transcripcin de los ideomorfos est altamente
regulada: ambos genes cuentan con intrones para realizar procesamiento
alternativo, lo que se traduce en la obtencin de tres transcritos diferentes y al
menos dos sitios posibles para el inicio de la transcripcin. La estructura de los
posibles transcritos sugiere que la expresin de los genes MAT puede estar
regulada a nivel traduccional durante el desarrollo sexual (Metzger y col., 1997).
Giberrella fujikuroi, otro fitopatgeno de importancia comercial, tiene cepas que

llevan a cabo reproduccin sexual con dos ideomorfos alternativos, MAT1-1 que
contiene tres genes: MAT1-1-1, codifica para una protena con un dominio ;
MAT1-1-2, codifica para una protena que tiene una regin similar a MatA-2 de N.
crassa y MAT1-1-3 similar a MatA-3 de N. crassa, con un dominio HMG. El
segundo ideomorfo, MAT1-2 contiene un solo gen que codifica para una protena
con un dominio HMG (Yun et al, 2000, Figura11).
Mat 1-1 Mat 1-2
Mat1-1-3 Mat1-1-2 Mat1-1-1 Mat1-2-1
Figura 11. Organizacin del locus MAT en cepas heterotlicas de Giberella fujikoroi. Las cepas
Mat 1-1 tienen tres genes en este locus: uno con un dominio HMG, otro con un dominio tipo MatA-
2 de N. crassa y otro con un dominio . Las cepas Mat 1-2 tienen un solo gen con un dominio
HMG. (Debuchy y Turgeon, 2006).
c) Ascomicetos Filamentosos Homotlicos. Hasta el momento se han presentado

datos obtenidos en ascomicetos heterotlicos, sin embargo, tambin se han
realizado estudios sobre el desarrollo sexual de ascomicetos homotlicos. De
37
forma general se observa que las especies homotlicas o bien tienen slo uno de
los ideomorfos o bien presentan ambos ligados o muy cercanos (Pgeler, 2001).
Un ejemplo de estas especies son algunas cepas de N. crassa, dentro de las
cuales existen dos grupos de especies homotlicas, un grupo contiene
secuencias similares al ideomorfo MatA (tipo A) y el segundo grupo tiene
secuencias similares a ambos ideomorfos (tipo A/a) (Glass y col., 1990; Beatty y
col., 1994). Otras especies que presentan cepas homotlicas y que son
importantes fitopatgenos son G. zae y C. heterostrophus, en ellas se han
encontrado ligados o muy cercanos los genes homlogos a ambos ideomorfos
reportados para sus respectivas cepas heterotlicas.
Otro ejemplo es Sordaria macrospora que tiene algunas cepas homotlicas tipo
A/a. El locus del tipo de apareamiento contiene secuencias homlogas a ambos
ideomorfos (semejantes a los de N. crassa). Presenta cuatro marcos de lectura
abiertos, tres de los cuales tienen una gran similitud con los genes
correspondientes de N. crassa (Figura 12).
Smata SmatA matA- matA-

-1 -3 2 1
Figura 12. Organizacin de los genes del locus MAT en especies homotlicas de Sordaria
macrospora. Se ilustra una cepa con los genes Smata que tiene un dominio HMG, SmatA
que no presenta homologa conocida, matA- codifica para una protena similar a MatA-2 de
N. crassa y matA-, con un dominio . (Debuchy y Turgeon, 2006).
Dentro de la especie G. zae (fitopatgeno), se han reportado cepas homotlicas

que tienen en su genoma los cuatro genes encontrados en ambos ideomorfos de
la correspondiente especie heterotlica G. fujikoroi (Yun y col., 2000).
En el gnero Cochliobolus existen tambin cepas homotlicas, en todas ellas se

han encontrado genes homlogos a ambos ideomorfos del tipo de apareamiento,
38
sin embargo la organizacin estructural de cada locus es nica para cada una de
ellas (Figura 13).
MAT1
Figura 13. /2 MAT en una especie homotlica de C.
Organizacin del locus
heterostrophus. Contiene ligados dos genes: uno con un dominio HMG y otro con un
dominio (Debuchy y Turgeon, 2006).
d) Ascomicetos filamentosos asexuales. A pesar de que la reproduccin sexual

no est presente en un gran nmero de ascomicetos filamentosos, se han
aislado secuencias del tipo de apareamiento de varias especies asexuales.
As por ejemplo, en Bipolaris sacchari, patgeno de la caa de azcar del cual
no se conoce su ciclo sexual, se ha encontrado una secuencia homloga al
gen MAT1-2-1 de la especie heterotlica relacionada C. heterostrophus. Este
gen de B. sacchari codifica para una protena con un dominio HMG y es 98%
idntica a la codificada por el gen MAT1-2-1 de C. heterostrophus. Cuando
una cepa MAT1 de C. heterostrophus fue transformada con el gen de B.
sacchari, fue capaz de producir peritecios. Sin embargo, cuando una cepa B.
sacchari fue transformada con los genes MAT de C. heterostrophus, el hongo
no realiz reproduccin sexual con l mismo ni con otras cepas. Una
caracterstica importante en B. sacchari es que no ha sido posible detectar el
transcrito del gen MAT en las cepas silvestres, pero si ha sido posible
detectarlo en las cepas transformantes de C. heterostrophus (Sharon y col.,
1996; Pgeler, 2001).
Otros ejemplos de ascomicetos asexuales son Alternaria alternata y Fusarium

oxysporum. El genoma de estos hongos presenta loci de mating-type MAT1-1-
1 y MAT1-2-1, cuya expresin heterloga (F. oxysporum) en C. heterostrophus
es funcional, por lo que la falta de ciclo sexual se atribuye a otros genes (Yun
y col., 2000).
39
2.3 Reproduccin sexual en Basidiomicetos
Mencin aparte merecen los Basidiomicetos, pues algunos de ellos se reproducen

sexualmente por medio del sistema bipolar que ya se ha explicado, mientras que
otros utilizan un sistema tetrapolar: la informacin gentica que regula el desarrollo
sexual se encuentra en dos loci no ligados, los cuales deben ser diferentes en las
cepas que se aparean. Cada uno de estos loci puede tener un gran nmero de
alelos, esto es, presentan dos loci con mltiples formas alternativas o alelos. Uno de
los basidiomicetos en los cuales se ha estudiado exhaustivamente el control de la
reproduccin sexual es Ustilago maydis (Figura 14).
Figura 14. Ciclo de vida de U. maydis. Las esporas haploides forman un tubo de conjugacin y
fusionan sus membranas celulares. El micelio dicaritico crece, se diferencia para infectar a su
hospedero (planta de maz) y dentro de ella sucede la cariogamia con la formacin del cuerpo
fructfero o tumores y la produccin de esporas sexuales.
Este hongo patgeno de maz presenta dos loci que tienen funciones diferentes en la
reproduccin sexual: el locus a que existe en forma de dos alelos a1 y a2, controla la
fusin de las clulas haploides y es necesario tanto para la fusin celular como para
mantener el crecimiento filamentoso. El locus a1 consta de 4.5 kb y contiene dos
genes; mfa1, que codifica para la feromona a1 y pra1 que codifica para el receptor.
El locus a2 abarca 8 kb; contiene los genes mfa2 que codifica para la feromona a2 y
pra2 que codifica para el receptor. Contiene otros dos genes con funciones no
40
conocidas (Casselton y Olesniky, 1998; Figura 15). Por otra parte existen dos genes
en cada locus locus b, designados como bE y bW los cuales se transcriben de forma
divergente. Los genes bW codifican para la proteina HD1 y los bE para la HD2,
ambas pertenecen a la familia de homeodominios. Estas proteinas intervienen en el
reconocimiento intracelular durante la compatibilidad sexual. Las mutantes en
cualquiera de estos genes del locus b no son capaces de llevar a cabo el desarrollo
sexual (Casselton y Olesniky, 1998; Figura 15).
A b1
. bW1 bE1
HD1 HD2
b2
bW2 bE2
HD1 HD2
B a1
. mfa 1 pra 1
a2
pra 2 lga 2 rga 2 mfa

2
Figura 15. Representacin de la organizacin de los loci MAT en Ustilago maydis. A: locus b con dos
diferentes alelos. B: locus a con dos diferentes alelos. El producto de los genes se especifica en el
texto. Modificado de Casselton y Olesnikcy, (1998).
2. 4 Reproduccin sexual en especies del gnero Colletotrichum
2.4.1 Biologa del gnero Colletotrichum
Los hongos filamentosos pertenecientes al gnero Colletotrichum y a su

teleomorfo Glomerella estn considerados como los principales fitopatgenos
alrededor del mundo. Causan importantes prdidas en cultivos de plantas que
crecen en regiones templadas, tropicales y subtropicales: leguminosas,
41
cereales, vegetales y rboles frutales. El mayor dao econmico se presenta
cuando el hongo ataca a los frutos, provocando la prdida de hasta el 50% o
ms en la cosecha (Vaillancourt y col., 2000). La enfermedad causada por los
hongos pertenecientes a este gnero se denomina antracnosis (Figura 16).
A B C
D E F
G H I
K
J
E
L
Figura 16. Diferentes frutos con antracnosis: A, tomates infectados con C. coccodes; B, hojas
de maz infectadas con C. graminicola; C, tallos de avena infectados con C. avenaceae; D,
calabazas infectadas con C. coccodes; E, F, G, H, frutos infectados con C. gloeosporioides; I, J
frutos infectados con C. acutatum; K y L, vaina y planta de frijol infectados con C.
lindemuthianum.
42
La habilidad de producir enfermedades latentes sita a estos hongos como los
ms importantes en la poscosecha, adems una sola especie de Colletotrichum
puede infectar mltiples hospederos (Freeman y Stanley, 2000), por ejemplo: C.
gloeosporioides infecta a frutos de manzana, aguacate, ctricos, papaya, nuez,
mango y fresa; C. acutatum infecta a almendras, aguacate, moras azules,
mango, durazno, ctricos, uva y fresa; C. coccodes ataca a pimiento, papa,
tomate y calabaza. Otras especies con mltiples hospederos incluyen: C.
lindemuthianum, C. capsici, C. dematium, C. graminicola y C. truncatum.
Adems de tener un impacto econmico considerable, diferentes especies de

Colletotrichum son usadas como sistema modelo para estudiar el proceso de
infeccin, la patogenicidad, la respuesta vegetal a la infeccin, la reproduccin y
la compatibilidad sexual. Como se describir posteriormente, Colletotrichum
gloeosporioides (Glomerella cingulata) ha sido utilizado como modelo de estudio
dado que fue el primer hongo de este gnero en el que se describi el desarrollo
sexual. Esta misma especie, junto con Glomerella graminicola, ha sido modelo
de estudio para conocer el proceso de infeccin del hongo en la planta y en el
fruto y se han obtenido importantes datos al respecto.
2.4.2 Regulacin gentica del desarrollo sexual en el gnero Glomerella
Como ya se ha descrito, los hongos filamentosos que se reproducen

sexualmente pueden ser clasificados como homotlicos o como heterotlicos.
Los homotlicos producen progenie homotlica, mientras que todos los
heterotlicos que se han estudiado (con algunas excepciones) presentan dos
tipos de apareamiento compatibles y producen progenie heterotlica.
Las especies pertenecientes al gnero Glomerella han sido objeto de estudio en

cuanto a su reproduccin sexual desde finales del siglo XIX, y se ha encontrado
que presentan una sexualidad ambigua. A pesar de exhaustivos estudios
43
durante las dcadas de los 40s y 50s, muchas preguntas siguen sin respuesta
(Bryson y col, en Bailey y Jeger, 1992).
El estado perfecto del gnero Colletotrichum fue identificado por Atkinson en

1892 en una cepa de Colletotrichum gloeosporioides y confirmado por
Stoneman en 1898, quien lo nombr Glomerella cingulata. En 1914, Edgerton
(Edgerton, W.C., 1914) public lo que fue el primer reporte de la diferenciacin
celular en ascomicetos. l comunic la existencia de dos cepas de Glomerella
cingulata a las que nombr Ms y Menos. Cuando cada una de estas cepas
creca sola en la caja de Petri, producan peritecios inmaduros. Sin embargo,
cuando se inoculaban ambas cepas en la misma caja de Petri, se formaba una
lnea oscura en el lugar en el que las cepas hacan contacto. Esta lnea estaba
formada por peritecios maduros, llenos de ascas y ascosporas bien
desarrolladas, lo que implicaba que la reproduccin sexual observada era del
tipo heterotlico. Sin embargo, al analizar el comportamiento sexual de la
progenie producto de esta cruza, observ que si tomaba una cepa hija con
fenotipo Mas y la ponan en contacto con otra hija con fenotipo Mas, la mayora
de las veces obtena descendencia con fenotipo Ms, pero otras veces obtena
progenie con fenotipo Menos. Tomando como base que G. cingulata es un
hongo haploide, la nica explicacin posible que encontr Edgerton para este
resultado fue que el fenotipo Mas o el fenotipo Menos estaba determinado por
un gen con dos alelos, esto es, el gen homlogo en la cepa con fenotipo Menos
haba sufrido una mutacin. Esta mutacin ocurra con alta frecuencia.
Edgerton observ que el mecanismo natural para que ocurriera dicha mutacin
dependa de varios factores. Uno de estos factores era la edad del cultivo: los
cultivos viejos mutaban ms rpidamente. Otro factor que influa en la
produccin de mutaciones era el tipo de medio, pues las mutaciones ocurran
ms frecuentemente cuando la cepa era cultivada en medio sinttico que
cuando se cultivaba en medio natural. Otro factor importante era el fondo
gentico, las cepas con fenotipo Mas mutaban con mayor frecuencia que las
cepas con fenotipo Menos.
44
Andes en 1941 (Lucas y col, 1944) observ el mismo fenmeno: aisl
ascosporas de los peritecios formados por la cepa Ms, observ que cuatro de
ellas producen cepas con fenotipo Ms y las otras cuatro producen cepas con
fenotipo menos o bien que las ocho ascosporas producan cepas con fenotipo
Menos. Un reporte posterior de experimentos realizados por Edgerton y col
(1945), seal que cuando se colocaron en la misma caja de petri la cepa Mas y
la Menos, en realidad existan variantes con diferentes fenotipos involucrados.
Estos investigadores realizaron cruzas entre los diferentes aislados que
identificaron, reportaron que la cepa Ms produce ascosporas individuales con
fenotipo de dos aislados diferentes, pero no encontraron una explicacin para
este fenmeno (Edgerton y col., 1945).
En 1945, Chilton y col. realizaron anlisis de cruzas de diferentes aislados con

diferentes fenotipos y propusieron que las cepas con diferentes fenotipos
difieren entre ellas en dos factores (dos genes Aa y Bb). Sin embargo, en todas
sus cruzas persista la obtencin de progenie con fenotipo no esperado.
En un estudio posterior, Wheeler (1950) report la existencia de una cepa con

fenotipo A+ (fenotipo Mas) que produce variantes B- (fenotipo Menos) en mucho
menor cantidad que la cepa descrita anteriormente. Estas variantes se
observaban con mayor frecuencia cuando el cultivo estaba viejo o se haba
resembrado varias veces, por lo que propuso que la diferencia entre la cepa A y
la B estribaba en una mutacin. Wheeler le llam a esta diferencia mutador o
factor M, el cual controlaba la produccin de mutantes Menos. Observ que la
cepa A+ contiene este factor, por lo que se favoreca la produccin de peritecios
muy grandes, cuyas ascosporas tenan fenotipo Menos.
Tiempo despus, el mismo Wheeler (1954) sintetiz los trabajos anteriores

diciendo que los tipos de apareamiento que se haban encontrado hasta el
momento para este gnero no podran ser clasificados como bipolares, como se
45
haba reportado para otros ascomicetos. Propuso que el desarrollo sexual poda
dividirse en varios pasos (hipotticos) y que cada paso estaba controlado por un
gen especfico. Los genes necesarios estaran situados en diferentes loci
(sistema de reproduccin tetrapolar, Figura17).
2 1 Wt B+, B1 dw+
A ,B
A+, B+ G1 B2 dw1
1
A1 F1 st arg1
bi1
th1
Proceso sexual en Glomerella cingulata
Figura 17. Modelo de Wheeler que esquematiza los genes que estn involucrados en el
desarrollo sexual. Las flechas horizontales representan los pasos en los que se lleva a cabo la
reproduccin sexual. Un tono diferente indica un proceso diferente: inicio peritecio;
plasmogamia; cariogamia y meiosis. Las flechas verticales representan bloques de varios
pasos de un proceso determinado (inicio de peritecio, plasmogamia, etc.). Las flechas amarillas
indican bloques parciales o interrumpidos y las anaranjadas bloques completos. Las cepas que
tienen solamente flechas naranjas, son completamente heterotlicas. Las flechas con la punta
hacia arriba representan genes que reparan las fallas en los bloques de ese proceso (flechas
amarillas), de tal forma que las cepas que contienen todas las flechas hacia arriba son
totalmente homotlicas, mientras que las que contienen flechas hacia abajo son heterotlicas.
As por ejemplo, si una cepa tiene mutado uno de estos genes involucrados en
el desarrollo sexual, sta ser totalmente autoestril. Si la misma cepa se
pusiera en contacto con otra que tuviera este gen silvestre y al mismo tiempo
tuviera mutado otro gen involucrado en el desarrollo sexual (autoestril
tambin), ambas cepas se complementaran reparando sus mutaciones y
dando como resultado el desarrollo sexual. Posteriormente se llam a esta
forma de reproduccin sexual heterotalismo no balanceado.
46
Despus de estos trabajos, existen muy pocos reportes sobre el desarrollo
sexual de algn hongo perteneciente al gnero Colletotrichum. Rodrguez y
Owen, 1992; Kimati y Galli, 1970; Batista y Chaves, 1982 y Bryson, 1990
reportaron la existencia de reproduccin sexual en Colletotrichum
lindemuthianum, de lo cual se hablar posteriormente. En 1999 Cisar y TeBeest
(1999) realizaron un arduo trabajo con 5 cepas de Glomerella cingulata. Para
este tiempo ya se haba descrito el desarrollo sexual de diferentes ascomicetos
filamentosos y en todos se haba reportado que el apareamiento en las especies
heterotlicas estaba controlado por un locus nico que poda tener dos alelos
alternativos cuyas secuencias no estaban relacionadas, estos alelos se
denominaron ideomorfos, esto es, presentaban un sistema de reproduccin
bipolar. Si fueran dos loci y no uno los que controlan el apareamiento (como en
los basidiomicetos) se esperara que ningn miembro de la progenie fuera
autofrtil (homotlico): se producira 50% de la progenie sexualmente
compatible con uno u otro parental (25% con cada uno) y 50% inhbil de
aparearse con cada parental debido a la presencia de alelos idnticos en uno o
ambos loci. En sus estudios Cisar y TeBeest (1999) utilizaron 5 cepas de
Glomerella cingulata las cuales cruzaron con ellas mismas y entre ellas.
Tambin realizaron retrocruzas entre las cepas de la progenie obtenida y las
cepas parentales. Al analizar los resultados concluyeron que dos de las cepas
pertenecan a un grupo de apareamiento y otras dos a otro grupo (dos grupos
de apareamiento) y que las cepas de cada grupo son sexualmente compatibles
con las del otro grupo. Al realizar retrocruzas entre la progenie y las cepas
parentales, encontraron que la mitad de la progenie fue sexualmente compatible
con una de las cepas parentales y la otra mitad con la otra cepa parental, lo que
se explicaba con la presencia de un sistema de reproduccin bipolar (un solo
locus con dos alelos alternativos). Sin embargo para la quinta cepa que
analizaron los resultados fueron diferentes, pues la progenie se apare con las
otras cuatro cepas parentales, tambin con su parental y con ella misma. Este
resultado concordaba con un sistema de apareamiento compuesto de un solo
locus con mltiples alelos alternativos, en el cual slo las cepas que tienen
47
diferentes tipos de apareamiento son sexualmente compatibles. Una
explicacin alternativa que propusieron los investigadores fue que esta cepa en
especial fuera diploide o heterocarin, pero al hacer anlisis de RFLPs
encontraron que todas las cepas eran haploides, adems de que todas se
obtuvieron de conidias nicas mononucleadas. En caso de existir una cepa
diploide, la segregacin de los marcadores RFLPs se obtendra en una
proporcin diferente a 1:1, que no fue el caso en este trabajo. La hiptesis
establecida en 1954 por Wheeler del efecto de complementacin entre cepas
mutantes no concuerda con los resultados obtenidos por estos investigadores,
pues la quianta cepa si bien podra no establecer desarrollo sexual con los dos
grupos de apareamiento, tampoco podra llevar a cabo el desarrollo sexual con
ella misma (pues tendra mutado el mismo gen y no se complementara).
Basndose en sus resultados, Cisar y TeBeest concluyeron que el sistema de
apareamiento de Glomerella cingulata est formado por un solo locus con
mltiples alelos alternativos (similar a lo reportado para G. fujikuroi).
En 1992 Rodriguez y Owen reportaron el hallazgo de cepas de Colletotrichum

musae, una especie del gnero Glomerella que lleva a cabo la reproduccin
sexual. Realizaron anlisis de la segregacin de la progenie utilizando
marcadores genticos y los resultados concordaron con un sistema heterotlico,
pero encontraron en la progenie al menos cuatro tipos de apareamiento
diferente que segrega en la proporcin 4:5:4:1, no pudieron hacer retrocruzas
para completar el anlisis debido a que sus cepas perdieron la capacidad de
aparearse y llevar a cabo el desarrollo sexual.
Otro hongo perteneciente al gnero Glomerella que ha sido estudiado en varios

aspectos incluyendo la reproduccin sexual, es Glomerella graminicola. Este es
un hongo patgeno de maz que originalmente fue descrito como homotlico.
Estudios posteriores mostraron aislados tanto homotlicos como heterotlicos.
G. graminicola parece ser aun ms verstil que G. cingulata ya que utiliza un
48
mayor nmero de estrategias para controlar el apareamiento: homotalismo,
heterotalismo no balanceado y heterotalismo verdadero.
En el 2000, Vaillancourt y col. analizaron la herencia y la fertilidad en la progenie

obtenida de la cruza de dos cepas autoestriles de G. graminicola con el
objetivo de determinar si el heterotalismo no balanceado se presentaba tambin
en esta especie del gnero Glomerella. Despus de realizar la cruza entre dos
cepas autoestriles (heterotlicas), realizaron retrocruzas para determinar la
forma en que se hereda el tipo de apareamiento. Hicieron anlisis tanto de
ttradas como de ascosporas elegidas al azar. Como resultado para ambos
estudios encontraron que ninguna cepa de la progenie fue capaz de cruzar con
ella misma ni con ambos parentales. En el anlisis de ttradas la mitad de la
progenie cruz slo con uno de los parentales mientras que una cuarta parte
cruz con el otro parental. La otra cuarta parte no se apare con ninguna cepa
parental. En el anlisis de las ascosporas, 11 de ellas cruzaron con uno de los
parentales, 5 con el otro y 8 con ninguno. Los datos obtenidos sugirieron que
las cepas parentales difieren en dos loci no ligados (Cfr1 y Cfr2) y que al menos
el segundo tiene diferentes alelos. Luego de realizar este anlisis, los
investigadores trataron de amplificar por PCR las secuencias de los genes MAT
conservadas, reportadas para otros ascomicetos filamentosos heterotlicos en
los que como ya se mencion, existe un solo locus con dos alelos alternativos
denominados ideomorfos. No pudieron amplificar la regin conservada de la
caja alfa del MAT1, sin embargo en ambas cepas parentales pudieron amplificar
la regin conservada de la caja HMG del MAT2. Al secuenciar este producto de
amplificacin de ambas cepas parentales, encontraron que son idnticos entre
ellos y que tienen una gran homologa con las secuencias de las cajas HMG del
ideomorfo MAT2 reportadas para otros ascomicetos filamentosos heterotlicos.
Sin embargo, al realizar RFLPs encontraron diferencias entre las dos cepas
parentales en este locus. Cuando realizaron el anlisis de RFLPs en los
miembros de la progenie, encontraron que el marcador segrega en una
proporcin 1:1. Los investigadores plantearon diferentes opciones para explicar
49
estos resultados. Una primera explicacin fue que el locus Cfr2 sea un locus
del tipo de apareamiento igual al descrito para otros ascomicetos filamentosos
heterotlicos, pero con la diferencia de que en este sistema la secuencia no sea
totalmente diferente, sino que haya diferencias puntuales entre ambos alelos (y
no ideomorfos). Una segunda opcin fue la existencia de un locus MAT1
diferente a lo hasta entonces reportado, es decir, que no contuviera una caja
alfa con secuencias conservadas (como en otros ascomicetos). Otra posible
explicacin fue que G. graminicola slo contuviera el ideomorfo MAT2. Hasta
entonces se haba reportado que algunas especies de Sordaraciaea slo
contenan el ideomorfo MAT1, pero no se haba reportado lo mismo para el
MAT2. Una ltima explicacin que proponen es que el locus Cfr2 conste de dos
o ms genes ligados.
Armstrong y Banniza (2006) encontraron condiciones de laboratorio adecuadas

para el desarrollo sexual de Colletotrichum truncatum, obtuvieron progenie frtil
la cual es bsicamente heterotlica, aunque, muchas cepas mostraron
interfertilidad, lo que sugiere al igual que el resto de las especies del gnero,
que siguen un sistema de reproduccin bipolar, ste es ms complejo
comparado con otros ascomicetos.
2.4.3. Reproduccin sexual en Colletotrichum lindemuthianum
C. lindemuthianum es un hongo el cual no se ha reportado que lleve a cabo la

reproduccin sexual en la naturaleza. Es un fitopatgeno (hemibiotrofo) que
causa la antracnosis en el cultivo de frijol y otras leguminosas (Figura 18). Se
han reportado prdidas de hasta el 95% de la cosecha en cultivares
susceptibles de frijol cuando el hongo encuentra las condiciones ambientales
favorables para desarrollarse: alta humedad relativa, precipitacin frecuente y
temperatura entre 18 y 22C (Melotto y col, 2000). Las semillas de estos
cultivares que estn infectadas, sirven de inculo primario. Este hongo tiene la
50
habilidad de sobrevivir por ms de 22 meses en desechos vegetales (Dillard y
Cobb, 1993).
A B
C D
E
Figura 18. Diferentes partes de la planta de frijol infectadas con
Colletotrichum lindemuthianum: A, planta completa; B, Hojas; C, Vainas y tallos;
D, Vainas y E, semillas.
Su alta variabilidad gentica conduce a que se supere la resistencia de los

cultivares comerciales y los hace susceptibles a la enfermedad nuevamente.
Debido a las caractersticas ya mencionadas y a su fcil manejo en el
laboratorio, C. lindemuthianum es un excelente modelo biolgico para el estudio
de los mecanismos de infeccin (hemibiotrofo), la produccin de compuestos
para evadir la respuesta de defensa de la planta, los genes de avirulencia, etc.
(Perfect y col., 1999). Desafortunadamente los eventos de reproduccin sexual
del hongo han sido pocos y con pocos individuos segregantes, lo que no ha
permitido el fcil y rpido aislamiento de genes involucrados en los procesos
51
mencionados como se ha hecho en otros hongos fitopatgenos como
Magnaporthe griseae.
Despus de analizar 115 razas de C. lindemuthianum colectadas en 13 pases

de Latinoamrica, se encontr que existe una alta variabilidad dentro de Mxico,
ms que la variabilidad existente entre todos los pases (Melotto y col., 2000).
Haciendo anlisis de variabilidad gentica mediante RFLPs, RAPDs, AFLPs e
ITSs se encontr un alto nivel de variabilidad gentica intra-especie, ms que
inter-especie.
Como se ha explicado, la fase teleomrfica de este hongo (Glomerella

lindemuthiana) no se ha encontrado en la naturaleza y slo se ha observado
raras veces en cultivo bajo condiciones de laboratorio. Kimati y Galli (1970)
reportaron el hallazgo de la fase ascgena de C. lindemuthianum y
establecieron condiciones de cultivo suficientes para la reproduccin sexual, la
cual lograron se llevara a cabo in vitro y analizaron la progenie obtenida de las
cruzas. Ellos encontraron una reproduccin del tipo heterotlica, pero que no
mantiene la fertilidad. Posteriormente Batista y Chaves (1982) estudiaron la
patogenicidad de cultivos monoascospricos obtenidos de cruzas entre razas de
este hongo, reportando la reproduccin sexual heterotlica, aunque algunas
cepas se aparearon con cepas del mismo Tipo de apareamiento y otras fueron
estriles.
En 1990 Bryson realiz un exhaustivo trabajo con el objetivo de analizar

diferentes aspectos de la biologa de Colletotrichum lindemuthianum, aspectos
tales como el apareamiento sexual y la gentica de la especificidad patognica.
Como primer paso de su trabajo, busc las condiciones de cultivo ms
adecuadas para optimizar la reproduccin sexual in vitro, utilizando las cepas
usadas por Batista y Chaves y otros aislados. Encontr que la reproduccin
sexual se optimiz utilizando iguales volmenes de concentraciones iguales de
conidias de ambas cepas parentales. En esta primera etapa observ que las
52
cepas tenan un comportamiento heterotlico y que podan clasificarse como
MAT1 o MAT2. Al intentar realizar esta clasificacin con la progenie, encontr
cepas que aparentaban tener 3 Tipos de apareamiento, esto es, algunas cepas
cruzaban con ambos Tipos de apareamiento (MAT1 y MAT2). Tambin
encontr cepas que no se cruzan con cepas MAT1 ni con cepas MAT2. Bryson
propuso como explicacin a este fenmeno la existencia de mltiples Tipos de
apareamiento o bien que se produca el proceso de encendido o switch descrito
para otros ascomicetos. En ste ltimo caso, las cepas deberan ser
autofrtiles, fenmeno que no se observ. Despus de tres generaciones,
observ que la mayor parte de la progenie frtil no mantiene esta fertilidad y no
pudo concluir si la baja fertilidad era causada por las condiciones de cultivo o
por poca compatibilidad entre las cepas. Dentro de las conclusiones de su
trabajo, Bryson expone la necesidad de utilizar tcnicas moleculares para
elucidar este enigma.
Nuestro grupo de trabajo se ha dedicado a estudiar la relacin planta-patgeno

en el sistema Colletotrichum lindemuthianum Phaseolus vulgaris desde
diferentes puntos de vista. Como primer paso se ha tratado de analizar la
variabilidad patognica del hongo en aislados de la Repblica Mexicana. As,
en 1998 Hernndez y col. presentaron un reporte en el que mostraron la
variabilidad patognica de este hongo.
Se han realizado colectas en todo el pas con la finalidad de conocer la

patogenicidad, la variabilidad gentica y la posible coevolucin del sistema
planta-patgeno. De esta forma, Gonzlez y col., (1998) publicaron por primera
vez la caracterizacin sistemtica de aislados mexicanos del hongo, utilizando
los 12 cultivares diferenciales de frijol establecidos por el CIAT para clasificar las
razas del hongo y utilizaron adems marcadores moleculares (RAPDs y AFLPs)
para realizar un anlisis de la diversidad gentica del patgeno. En esta
publicacin encontraron 10 patotipos, lo que daba idea de la gran variabilidad
del patgeno en trminos de patogenicidad. Sin embargo pudieron observar una
53
mayor diversidad a nivel de genotipo, pues todos los aislados mostraron
haplotipos nicos. Los investigadores propusieron que puesto que no se conoce
el estado sexual de C. lindemuthianum en condiciones naturales, sera de
esperarse que las poblaciones naturales del patgeno fueran linajes clonales
producidos mediante la reproduccin asexual y propusieron que los aislados
pueden agruparse en cuatro diferentes linajes representados por aislados con
una estrecha relacin gentica en cada linaje. En el anlisis por AFLPs
encontraron una muy clara asociacin entre la distribucin geogrfica y los
grupos obtenidos por el anlisis de distancias genticas. Fue posible establecer
dos grupos principales, uno que contiene a los aislados obtenidos de
Chihuahua-Zacatecas-Durango y el otro, claramente separado que cubri los
aislados de Michoacn-Jalisco. En el estado de Michoacn se encontr una
mayor variabilidad patognica, pues de un total de seis aislados analizados, se
encontraron cinco patotipos diferentes; mientras que en Chihuahua se identific
slo un patotipo. Estos resultados presentaron una estrecha relacin con el tipo
de variedad de frijol que se cultivaba en cada estado, pues en Chihuahua se
cultivaba preferentemente una sola variedad de frijol mientras que en
Michoacn se cultivaban diferentes variedades e incluso se encontraron criollos
de esta leguminosa. Tambin se ha estudiado la relacin del hongo con P.
vulgaris confirmando la interaccin gen por gen e identificando marcadores
ligados al gen de resistencia Co-1 (Mendoza, 2002). En el 2004, Rodrguez-
Guerra y col. analizaron la variacin entre el genotipo, el patotipo y la
compatibilidad vegetativa de aislados del hongo. Obtuvieron 38 aislados del
hongo provenientes de una sola planta en un campo de cultivo de frijol en
Chihuahua. Al realizar anlisis de estos aislados mediante AFLPs encontraron
cinco distintos genotipos. Cuando hicieron pruebas de anastomosis, observaron
que todos los aislados pertenecan al mismo grupo de anastomosis. Para
analizar el patotipo eligieron a un representante de cada genotipo y encontraron
que todos pertenecan al mismo patotipo. Estos anlisis fueron realizados de la
misma manera con 38 aislados recuperados de una sola planta de un campo de
cultivo de Michoacn. En estos aislados se encontraron nueve genotipos
54
diferentes y cinco grupos de anastomosis. Tomaron un aislado perteneciente a
cada grupo de anastomosis y se prob su patotipo, encontrando que los
representantes de los cinco grupos de anastomosis pertenecen a un solo
patotipo. Con los resultados expuestos, los autores encontraron que la
diversidad gentica fue menor en Chihuahua y mayor en Michoacn.
Propusieron que la diversidad en trminos de diferentes fenotipos es alta en los
aislados provenientes de Michoacn, sin embargo en trminos de nivel de
polimorfismo es mayor en Chihuahua. Discutieron que en la reproduccin
sexual es posible que todos los individuos de las muestras encontradas muy
cercanas puede haber genotipos nicos, pero no encontraron esto en los
aislados de Michoacn y Chihuahua, lo que sugiere que este mecanismo de
generacin de diversidad no es comn en condiciones de campo. Esto confirma
otros reportes que sostienen que la diversidad de C. lindemuthianum
probablemente es debida a una combinacin de fenmenos de mutacin y/o
interacciones parasexuales en poblaciones que se reproducen asexualmente.
La mutacin se sugiere por la presencia de regiones hipervariables y por cierto
nivel de aneuploida en el genoma de este hongo. Se demostr que en las
poblaciones naturales pueden identificarse diversos grupos de anastomosis, lo
que sugiere que este proceso es un mecanismo importante para la formacin de
linajes clonales. La presencia de genotipos estrechamente relacionados y de
distintos grupos de anastomosis en una localidad sugiri que bajo estas
condiciones la poblacin de C. lindemuthianum es asexual y clonal. La
variacin pudiera explicarse por mutaciones o por interacciones parasexuales
entre aislados del mismo grupo de anastomosis. En Chihuahua se encontraron
aislados de una sola planta con altos niveles de polimorfismo pero pocos
genotipos distintos, mientras que en Michoacn los aislados de una sola planta
muestran un bajo grado de polimorfismo pero un mayor nmero de genotipos
distintos. No se encontr una relacin entre grupos de anastomosis, genotipo y
patotipo.
55
En un trabajo posterior, Gonzlez Chavira y col. (2004) realizaron la colecta de
aislados de C. lindemuthianum de estados del centro del pas (Mxico, Puebla,
Tlaxcala e Hidalgo) y de 17 aislados, encontraron 8 patotipos; observaron que el
nivel de variabilidad patognica en estos aislados es mayor que lo reportado
previemente en otros estados del pas, lo que puede ser ocasionado por la
diversidad del germoplasma de P. vulgaris utilizado en esta regin. Al analizar
el genotipo de estos aislados mediante marcadores AFLPs y compararlo con los
resultados de los aislados de otros estados reportados antes, encontraron que
los aislados de los estados centrales forman un grupo discreto, separado de los
dems, lo que confirmaba la hiptesis de que las poblaciones de C.
lindemuthianum estn formadas por linajes clonales provenientes de la
reproduccin asexual. En 2005, Rodrguez-Guerra y col. tomaron 19 cepas de
las que se haban recolectado en trabajos anteriores y probaron diferentes
condiciones nutricionales y ambientales para intentar obtener la cruza sexual
entre alguna(s) de estas cepas. De 190 cruzas probadas, slo una combinacin
produjo peritecios maduros, con ascas y ascosporas (Figura 19).
A B
C D
Figura 19. Peritecios, ascas y ascosporas. Microfotografa en la que

se muestran: A, protoperitecio; B, peritecio maduro; C, ascas y
D, ascosporas de Colletotrichum lindemuthianum como producto de la
reproduccin sexual.
56
Los autores obtuvieron 168 cultivos monoascospricos de la progenie y las
analizaron utilizando marcadores AFLPs, con lo que corroboraron que las cepas
de la progenie segregaban como un producto de la reproduccin sexual.
Recientemente Luna-Martnez y col. (2007) publicaron el trabajo realizado con
las cepas pertenecientes a la progenie obtenida por Rodrguez-Guerra y col.
(2005) en el que utilizaron la tcnica de AFLPs para elaborar un mapa gentico
de C. lindemuthianum, en el cual obtuvieron 56 grupos de ligamiento.
Calcularon que el tamao aproximado del genoma de este hongo es de 3,500
cM. Tambin establecieron el patotipo de los miembros de la progenie y
encontraron patotipos diferentes al patotipo de los parentales, que son producto
de la cruza sexual entre las cepas parentales.
La evidencia presentada aqu sobre la reproduccin sexual en las diferentes

especies del gnero Colletotrichum sugiere que la determinacin del Tipo de
apareamiento es diferente a lo que se ha observado en otros ascomicetos
filamentosos. Surgen preguntas sobre los mecanismos genticos que controlan
las interacciones heterotlicas y homotlicas, los altos ndices de infertilidad, la
posibilidad de la existencia de un switch, la forma en que intervienen las
condiciones ambientales para el desarrollo sexual y sobre la evolucin del
proceso de apareamiento dentro de los ascomicetos.
La identificacin de cepas de C. lindemuthianum capaces de reproducirse de

forma heterotlica, brinda la oportunidad de estudiar la reproduccin sexual en
esta especie. Dado que en estudios preliminares las cepas parentales de C.
lindemuthianum capaces de aparearse in vitro presentan ambas slo el
ideomorfo MAT1-2, es importante la caracterizacin de este gen y las
secuencias aledaas en ambos parentales para estudiar el proceso de
apareamiento y sus pasos posteriores. Esta propuesta basada en los
antecedentes presentados es el enfoque del presente trabajo.
57
3. Objetivos
3.1 Objetivo General
Caracterizar el ideomorfo MAT1-2 en cepas de Colletotrichum lindemuthianum y

compararlo con el MAT 1-2 de otros hongos pertenecientes al mismo gnero.
3.2 Objetivos Especficos
3.2.1 Clonar el ideomorfo MAT1-2 de de las cepas heterotlicas MU03 y

DGO02 de C. lindemuthianum
3.2.1 Analizar las secuencias del ideomorfo MAT1-2 clonadas.
3.2.2 Determinar el patrn de segregacin del ideomorfo MAT1-2 en la

progenie obtenida en la cruza de las cepas heterotlicas.
3.3.3 Analizar la expresin del ideomorfo MAT1-2 bajo diferentes condiciones

de crecimiento.
58
4. Materiales y Mtodos
4.1 Cepas y medios de cultivo.

Las cepas utilizadas en este estudio fueron las parentales de Colletotrichum
lindemuthianum DGO02 y MU03 y 150 individuos de la progenie obtenidos de
esta cruza por cultivos monoascospricos nombrados con la letra S (por
segregante) seguidos de un nmero para identificacin. (Rodrguez-Guerra y
col., 2005). Las cepas se mantuvieron en PDA acidificado (200uL de cido
lctico al 85% por cada litro de PDA) y se incubaron a 22 C por 10-15 das.
4.2 Extraccin de DNA. (modificado de Gonzlez-Chavira y col., 1998).

Se tom un fragmento de 0.5 cm 2 de micelio de cada cepa en estudio, crecido
en PDA, se coloc en un tubo FALCON de 50 mL estril que contena 20 mL
de PDB y se incub a 22 C con agitacin constante por 10-12 das. El
contenido del tubo FALCON se verti sobre un embudo estril tapado por su
extremo inferior con dos cuadros de tela Miracloth estril, el micelio (agrupado
en forma de esfera) se exprimi con ayuda de pinzas y se guard en paquetes
de papel aluminio dentro de un recipiente con nitrgeno lquido. Se almacen a
- 80 C hasta su posterior tratamiento. Para la extraccin de DNA, se tom el
micelio congelado y se pas a un mortero estril, enfriado con nitrgeno lquido.
Se moli el micelio hasta obtener un polvo fino sin permitir que se descongelara,
se pas a un tubo de polipropileno de 1.5 ml en alcuotas hasta 1/3 la capacidad
del tubo (500 L). Se aadieron 500 L de solucin de lisis (200 mM Tris-HCl
pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8.0, 1% SDS) y se mezcl el tubo por
inversin tratando de homogenizar. Posteriormente se aadieron 500 L de la
mezcla Fenol:Cloroformo:Isoamlico (25:24:1) y se agit en vrtex por 2 min. El
tubo se centrifug a 12000 rpm por 25 min. Se separ la fase acuosa y se pas
a un tubo limpio. Al resto que qued en el tubo inicial se aadieron 500 L de
solucin de lisis y se sigui el mismo tratamiento. Se unieron las dos fases
acuosas y se realiz una segunda extraccin con Fenol:Cloroformo:Isoamlico,
se centrifug de igual manera y se recuper la fase acuosa a la cual se
59
aadieron 1/10 V de acetato de sodio 3M pH 4.8 y V de isopropanol. Se
incub el tubo a -20 C por 30 min luego de los cuales se centrifug a 12000
rpm por 10 min. Se decant el isopropanol y se aadi 1 mL de etanol al 70%
tratando de resuspender la pastilla. Se centrifug de la misma forma, se
decant el sobrenadante y se evapor el resto de etanol a temperatura
ambiente. Una vez seca la pastilla, se resuspendi en 50-100 L de agua
desionizada estril. Se verific la integridad y limpieza del DNA sometiendo a
electroforesis un gel de agarosa al 1% teido con bromuro de etidio, colocando
en el pozo 1 L de la muestra de DNA.
4.3 Amplificacin de la caja HMG de las cepas parentales.

Una vez extrado el DNA de las cepas parentales, ste se utiliz como templado
para realizar PCR utilizando como iniciadores degenerados los reportados por
Arie y col. (1997) descritos en la tabla 1 como HMGDF y HMGDR (Tabla 1,
Figura 20), bajo las siguientes condiciones de termociclado: 2 min 95 C, 30
ciclos de 94 C 1 min, 55 C 30 s, 72 C 1 min y un paso final de extensin de
72 C por 10 min. Los productos de amplificacin se observaron en un gel de
agarosa al 2% teido con bromuro de etidio, bajo luz ultravioleta. En la PCR se
utiliz tambin DNA de N. crassa (cepas A y a) como control. El producto de
amplificacin obtenido para cada cepa parental se clon en el vector TOPO 2.1
de Invitrogen y se secuenci. Con base en la secuencia obtenida se
disearon iniciadores especficos para amplificar la caja HMG de C.
lindemuthianum (HMGCLF y HMGCLR, Tabla 1). El DNA de las cepas
parentales se us como templado para realizar PCR usando estos iniciadores y
tambin se us el DNA de las dos cepas de mating-type complementario de N.
crassa como control. Los parmetros para realizar la amplificacin fueron los
mismos que se utilizaron en la amplificacin con los iniciadores degenerados.
Los productos de PCR de las cepas parentales se clonaron en el vector TOPO
2.1 y se secuenciaron. Se compararon las secuencias obtenidas con una base
de datos (BLAST) y se realiz el respectivo alineamiento (CLUSTAL-W; Chenna
y col., 2003).
60
HMG
5
3
HMG
HMGDF HMGDR
HMGCLF HMGCLR
Figura 20. Estrategia utilizada para amplificar por PCR la caja HMG de las cepas parentales
de C. lindemuthianum.
HMGDF CCYCGYCCYCCYAAYGCNTAYAT
HMGDR CGNGGRTTRTARCGRTARTNRGG
HMGCLF CATGCCGCAGTAAAGCAAAT
HMGCLR ATCATCAGACGTTCTTTGTG
Tabla 1. Nombre y secuencia de: los iniciadores degenerados utilizados para amplificar la
caja HMG de las cepas parentales de Colletotrichum lindemuthianum y de los iniciadores
especficos usados para amplificar la caja HMG del hongo.
4.4 Amplificacin de la caja HMG de otros aislados.

Se extrajo DNA de cada aislado y se someti a PCR utilizando tanto los
iniciadores degenerados como los iniciadores especficamente diseados para
C. lindemuthianum. Lo mismo se hizo con aislados de otras especies del
gnero colectadas por Rodrguez-Guerra y col. (no reportados). En ambas
amplificaciones se utilizaron las condiciones de termociclado descritas para
amplificar la caja HMG de las cepas parentales.
4.5 TAIL-PCR.
Se disearon tres iniciadores homlogos a un extremo de la secuencia
conocida, separados por 80-100 bases entre ellos y tres homlogos al otro
extremo, tal como se describe en el protocolo de la tcnica. Como par de cada
61
uno de estos tres iniciadores se utilizaron iniciadores diseados al azar (tambin
llamados universales, Liu y Whittier, 1995), que se denominaron AD1, AD2 y
AD3 (Tabla 2). Se realizaron dos reacciones de TAIL-PCR hacia cada extremo
de la caja HMG: en la primera reaccin se utilizaron los iniciadores anidados
marcados como F1, F2, F3, R1, R2 y R3 con los tres iniciadores diseados al
azar por Liu y Whittier (1995, Tabla 3, Figura 21).
F1
AD3
F2
F3
HMG
5 3
R1
AD3 R2
R3
Figura 21. Localizacin de los iniciadores utilizados para la primera reaccin TAIL-PCR.
F1 CATGCCGCAGTAAAGCAAATGG
AC
F2 AAACTTGGCAAAGCATGGAACG
CA
F3 CCTACTACCGCTACAACCC
F4 TGGCAAAGGTTACTCCCATCGC
CT
F5 TATTTTACATGCTGGTCAC
F6 TAGCGAGCAAATACCCCAA
R1 TTGTAGCGGTAGTAGGGATG
R2 AAAGCTGTCAAACTTGGCA
R3 TTTGCTTTACTGCGGCATG
R4 CGCCTACCCCCAGTTAGTATCAT AD1 NTCGASTWTSGWGTT

A
R5 CCGATGAAAACGTAGTCCC AD2 NGTCGASWGANAWGAA
R6 CAGTCTCGCAGCATCCAGA AD3 NGTGNAGNANCANAGA
Tabla 2. Iniciadores utilizados en TAIL-PCR. Tabla 3. Iniciadores degenerados universales

utilizados en TAIL-PCR.
62
Luego de verificar los productos de amplificacin mediante la electroforesis de
un gel de agarosa al 2% teido con bromuro de etidio, stos se clonaron en el
vector TOPO 4 (Invitrogen) y se secuenciaron. Con base en esta informacin
se dise otro juego de iniciadores anidados F4, F5, F6, R4, R5 y R6 que
fueron utilizados con los iniciadores AD1, AD2 y AD3 en una segunda reaccin
TAIL-PCR (Figura 22; Tablas 2 y 3). Las condiciones de la reaccin y de
termociclado fueron las reportadas por Liu y Whittier (1995).
F4
F5 AD3
F6
HM
5
G 3
R4
AD3 R5
R6
Figura 22. Localizacin de los iniciadores utilizados para realizar la segunda reaccin TAIL-
PCR.
4.6 Clonacin del fragmento de 2 Kb.

Una vez clonados los fragmentos de cada TAIL-PCR, se utilizaron los iniciadores
P5 y C3 (Figura 23; Tabla 4) para amplificar la secuencia completa. Al iniciador
P5 se le insert un sitio de restriccin Xba I. Las condiciones de amplificacin
fueron las mismas que las utilizadas para la amplificacin de la caja HMG,
excepto que para obtener la secuencia completa de la cepa MU 03 se baj la
temperatura de alineamiento a 45 grados centgrados. Una vez obtenidos los
productos de PCR para ambas cepas, se clonaron en el vector TOPO 4
(Invitrogen) y se secuenciaron. Las secuencias de DNA obtenidas se
compararon en el banco de datos (BLAST) y se alinearon entre ellas y con las
secuencias de genes MAT1-2 de hongos pertenecientes al gnero Glomerella
(CLUSTAL-W; Chenna y col., 2003). Estas secuencias tambin se compararon y
alinearon como secuencias de aminocidos utilizando los programas
CLUSTALW, Jalview (Clamp y col., 2004) y MEGA 4.0 (Tamura y col., 2007)
63
700 pb
P5 P3 3
HMG
5
C5 1300 pb C3
P5
C3
2 Kpb
Figura 23. Localizacin de los iniciadores utilizados para amplificar el fragmento de 2 Kb.
P3 CCAGACATCCTAGAATGATCTGT
P5 GGGGTAGTCGAAAGAAACTG
C3 TTGGGGTATTTGCTCGCTAAACT
C5 GATGCTGCGAGACTGTGCCAAG
Tabla 4. Iniciadores utilizados para amplificar por PCR
fragmentos del ideomorfo MAT.
4.7 Hibridacin Southern.

Se aisl DNA de las cepas parentales como se detall antes. Se utiliz 500 ng de
cada DNA para cortar con diferentes enzimas de restriccin. Las restricciones se
cargaron en un gel de agarosa que se someti a electroforesis, se trat por 30
min con solucin desnaturalizante (0.5 N NaOH y 1.5M NaCl)) y 15 min con
solucin neutralizante (0.5 M, pH 8.0 de Tris-HCl y 1.5 M NaCl). Se transfiri a
una membrana de nylon Hybond N+ (Amersham), utilizando como solucin de
transferencia SSC 6X (Sambrook y col., 1989). El DNA se fij a la membrana con
luz ultravioleta utilizando las condiciones estndar del equipo Stratalinker de
Stratagene. La membrana se prehibrid por un mnimo de 6 horas a 65 C con
solucin de hibridacin (1% W/V albmina, 0.5 M solucin amortiguadora de
fosfatos de sodio pH 7.4, EDTA 1mM pH 8.0 y 7% SDS) y luego se aadi la
sonda, que se obtuvo amplificando por PCR el DNA de la cepa DGO02, utilizando
los iniciadores P5 y P3 (Figura 26, Tabla 4). La sonda se marc previamente
usando dCTP (32P) y el kit Random Primer de (Amersham) siguiendo las
recomendaciones del proveedor. La hibridacin se llev a cabo en un horno de
64
hibridacin a 65C durante por lo menos 16 h. Posteriormente la membrana se
someti a lavados con las soluciones I (Na2HPO4 100 mM, SDS 0.5% y EDTA 1
mM) y II (Na2HPO4 40 mM, SDS 0.5% y EDTA 1 mM ) en caso necesario. Se
coloc en un cassette de exposicin, se le aadi una pelcula marca Kodak la
cual despus de tiempos variables se revel.
4.8 Anlisis de segregantes.

En base a los resultados obtenidos luego de la hibridacin Southern, se
seleccion la enzima Hind III para hacer el anlisis de la segregacin de la
progenie. Se aisl DNA de la forma en que se detall antes, de 150 de las 168
segregantes obtenidas en la cruza de las parentales y se analizaron por
hibridacin Southern como se describi.
4.9 Extraccin de RNA

a) Cepas crecidas en medio slido. Las cepas parentales se inocularon en cuatro
condiciones diferentes: 1. Cada cepa parental sola en una caja con medio PDA;
2. Cada cepa parental sola en caja con medio KG (Rodrguez-Guerra y col.,
2005); 3. Ambas cepas parentales en la misma caja con PDA y 4. Ambas cepas
parentales en caja con KG. Se coloc sobre el medio un crculo de Nylon Hybond
N+ (Amersham) previamente esterilizado y sobre el crculo de nylon fragmentos
de agar conteniendo colonias de las cepas, se incubaron a 22 C por 10 das, en
oscuridad, luego de los cuales se cosech el micelio utilizando una hoja de bistur
para separarlo del nylon. El micelio se coloc en sobres de papel aluminio y se
congel con nitrgeno lquido. Se guard a - 80 C hasta su utilizacin. El
micelio as obtenido se moli en un mortero enfriado con nitrgeno lquido,
evitando que se descongelara, hasta obtener un polvo fino. El micelio molido se
pas a un tubo de polipropileno de 1.5 mL, se aadieron 500 L de solucin
NTES (NaCl 100 mM; Tris-HCl 10 mM, pH 7.5; EDTA 1 mM, pH 8; SDS 1%) y
500 L de fenol:cloroformo:isoamlico (25:24:1). El tubo se mezcl en vrtex por
10 min y se centrifug a 8000 rpm por 10 min. La fase acuosa se pas a un tubo
nuevo y se aadieron 500 L de fenol:cloroformo:isoamlico. El tubo se mezcl y
65
centrifug de la forma descrita. La fase acuosa se pas a un tubo nuevo y se
agregaron 1/10 V de acetato de sodio 3M pH 5.3 y 2 V de etanol absoluto fro. El
tubo se incub a - 20 C por 20 min, luego de los cuales se centrifug a 8000 rpm
por 10 min. Se elimin el sobrenadante, se aadieron 300 L de agua DEPC y se
resuspendi la pastilla (mantenindola siempre en hielo). Se centrifug el tubo a
5000 rpm por 5 min, el sobrenadante se pas a un tubo nuevo y se aadieron 250
L de acetato de litio 4M. Se incub toda la noche a 4C. El tubo se centrifug a
8000 rpm por 10 min, se elimin el sobrenadante y la pastilla se resuspendi en
300 L de agua DEPC. Se agregaron 30 L de acetato de sodio y 600 L de
etanol absoluto fro. Se incub por 2 h a - 20 C. El tubo se someti a
centrifugacin como se ha descrito y se elimin el sobrenadante. Se aadieron
300 L de etanol al 70% fro y se centrifug como se ha descrito. La pastilla se
resuspendi en 20-40 L de agua DEPC (manteniendo siempre en hielo). Todos
los pasos de centrifugacin se realizaron a 4C. Una vez obtenido el RNA, se
verific su calidad en un gel desnaturalizante (para 100 ml: 15 mL de
formaldehdo, 10 mL de MOPS 10X, 1.5 g de agarosa y 75 mL de agua DEPC)
tratando las muestras para desnaturalizarlas [ a 3 L de RNA se aadieron 20 L
de formamida, 6.4 L de formaldehdo y 4 L de MOPS 10X. Se calentaron por 5
min a 55 C, se pasaron 5 min a hielo y se aadieron a cada muestra 2 L de
buffer de carga y 0.5 L de EtBr (10mg/mL)] y se determin su concentracin
mediante la lectura de la absorbancia a 260 nm en un espectrofotmetro de luz
UV (Applied Biosystems).
b) Cepas crecidas en medio lquido. Las cepas parentales fueron crecidas en

PDB tal como se hizo para la extraccin de DNA, primero cada una por separado
y posteriormente las dos en el mismo tubo. El micelio de ambas cepas se rescat
y limpi como se hizo para la extraccin de DNA. Se procedi a la extraccin de
RNA utilizando el sistema Purelink de Invitrogen siguiendo las instrucciones del
proveedor. La integridad y concentracin del RNA obtenido se determinaron igual
que en el inciso anterior.
66
4.10 Hibridacin Northern.
Con el RNA obtenido del micelio crecido en medio slido, se calcul el volumen
necesario para tener 20 g en cada muestra. Las muestras se
desnaturalizaron, se carg el volumen en un gel desnaturalizante (descrito
arriba), se someti a electroforesis, se transfiri a una membrana de nylon
Hybond N+ (Amersham) usando como solucin de transferencia SSC 6X, se
fij con luz ultravioleta como en la hibridacin Southern, se prehibrid e hibrid
utilizando como sonda el producto de PCR obtenido al amplificar DNA de la
cepa DGO02 con los iniciadores C5 y C3(Figura 26, Tabla 4), marcndola como
se hizo para la hibridacin Southern. Una vez hecha la hibridacin y los
lavados, la membrana se coloc en un casete de exposicin y se sobrepuso en
ella una pelcula fotogrfica Kodak. El casete se guard a - 80 C el tiempo
necesario para lograr ver las bandas de hibridacin de forma ntida. La
membrana se regener calentndola por 30-60 min a 65 C con SDS al 0.5%.
Esta operacin se repiti una vez a temperatura ambiente. Se dej secar la
membrana y se fijaron nuevamente los cidos nuclicos con luz ultravioleta
como se ha descrito. Esta membrana se prehibrid e hibrid usando como
sonda el gen 28S de humano, para tener control de carga del gel, en las
condiciones usadas en la primera hibridacin Northern.
4.11 RT-PCR y anlisis de intrones.

Partiendo del RNA obtenido de las cepas parentales creciendo individualmente
y juntas en un tubo con medio lquido (PDB), se obtuvo cDNA utilizando el
sistema de sntesis de primera cadena de Amersham Biosciences seguida.
Para realizar la reaccin de PCR primero se estandariz la temperatura de
alineamiento para cada par de iniciadores. Se utilizaron los iniciadores RTE1F
y RTE1R para confirmar la presencia del primer intrn. Los iniciadores RTE23F
y RTE23R se utilizaron para confirmar la presencia del segundo y tercer
intrones (Tabla 5). Los fragmentos amplificados se observaron en un gel de
agarosa al 1% teido con bromuro de etidio, se purificaron con el gel de
extraccin Qiaquick, se clonaron y secuenciaron como se ha explicado. Las
67
secuencias obtenidas se analizaron utilizando el programa BLAST y el
programa Genescan (Burge y Karlin, 1997).
RTE1F CCCTGGAGACTCGATAGCAA
RTE1R GTATCGGTGGCCATTTGAAG
RTE23F GCTTTCAGTCCGTCATAGCTG
RTE23R GTTCCATGCTTTGCCAAGTTT
Tabla 5. Iniciadores utilizados en RT-PCR para confirmar
la presencia de intrones dentro del ideomorfo MAT1-2.
5. Resultados
5.1 Amplificacin de la caja HMG en las cepas parentales.

Utilizando los iniciadores degenerados descritos en Materiales y Mtodos (Tabla
1), se obtuvo un producto de amplificacin en ambos parentales del tamao
esperado (300 pb). Tambin se obtuvo una banda para la cepa a de N. crassa
del mismo tamao, no as para la cepa A. Basado en las secuencias de los
productos de amplificacin obtenidos, se disearon oligonucletidos especficos
para C. lindemuthianum. Utilizando estos oligonucletidos se obtuvo un producto
de amplificacin en ambas cepas parentales del tamao esperado
(aproximadamente 240 pares de bases) y no se obtuvo producto en las cepas de
N. crassa (Figura 24). Estos resultados fueron publicados en el artculo de
Rodrguez-Guerra y col. (2005).
1 2 3 4
1 2 3 4
5
5
300pb
300pb
A B
68
Figura 24. Geles que muestran los productos de PCR utilizando en A iniciadores degenerados y en B
iniciadores especficos para C. lindemuthianum. Carril 1, cepa DGO02; carril2, cepa MU03; carril 3,
cepa a de N. crassa; carril 4, cepa A de N. crassa. Carril 5, control positivo.
5.2 Amplificacin por PCR de la caja HMG de otros aislados.
Se extrajo DNA de diferentes aislados de especies pertenecientes al gnero
Colletotrichum que infectan a frutos como jcama, aguacate, chile, chcharo,
cacahuate, papaya, tejocote y de plantas de frijol de diferentes localidades.
Como se muestra en la figura 26 (Figura 25), cuando se utilizaron los
oligonucletidos degenerados para amplificar la caja HMG, estos aislados
mostraron de uno a varios productos de amplificacin, pues posiblemente se
amplificaron regiones con secuencias semejantes, sin embargo, invariablemente
se obtuvo la banda de 300 pb. Cuando se usaron como iniciadores los
oligonucletidos especficos, el nmero de bandas disminuy notablemente,
pero en la mayora de los casos se conserv la banda de 300 pb.
1 2 3 4 5 6 7 8
1 kb
300 pb
Figura 25 . Amplificacin de caja HMG usando DNA de aislados de

Colletotrichum de diferentes especies y los iniciadores degenerados.
Carril 1, aguacate; Carril 2, chile; Carril 3, frijol1; Carril 4, cacahuate;
Carril 5, jcama; Carril 6, Papaya; Carril 7, frijol2; Carril 8, tejocote.
5.3 TAIL-PCR.
En la primera reaccin de TAIL-PCR se obtuvieron dos productos de
amplificacin utilizando los iniciadores F1, F2, F3, R1, R2, R3, y AD3: uno a cada
extremo de la caja HMG. Hacia el extremo 5 se obtuvo un fragmento de 700
pares de bases y hacia el extremo 3 uno de 400 pares de bases. Estos
fragmentos se clonaron y secuenciaron y con base en sus secuencias se
69
disearon los iniciadores F4, F5, F6, R4, R5, R6 y se us como iniciador para el
otro extremo, AD3. De la segunda reaccin de TAIL-PCR se obtuvo solamente
un fragmento de 700 pares de bases hacia el extremo 5 de la secuencia con la
que contbamos. Estos fragmentos se clonaron y secuenciaron, con base en las
secuencias obtenidas se disearon los iniciadores adecuados para amplificar la
secuencia completa (aproximadamente 2 Kb, Tabla 4). Usando las mismas
condiciones de termociclado que las usadas para amplificar la caja HMG, se
obtuvo la banda esperada para la cepa DGO 02, mientras que para la cepa MU
03 se obtuvo un barrido. Fue necesario bajar la temperatura de alineamiento a
45 C para poder observar la banda en la cepa MU 03. Ambos productos de PCR
se clonaron y secuenciaron. El alineamiento de las secuencias muestr que son
casi idnticas: ambas tienen 2006 pares de bases. Las secuencias de ambas
cepas parentales se depositaron en el GenBank con los nmeros de accesin
EU236949 y EU236950. Al realizar anlisis tipo BLAST, se encontr alta
homologa con genes MAT1-2 de hongos filamentosos, la ms alta homologa se
observ con el gen de Glomerella cingulata y con el gen MAT1-2 de otras
especies pertenecientes a ste y otros gneros de ascomicetos filamentosos.
Analizando las secuencias, se detectaron en ambas tres intrones. Tanto las
amplificaciones por PCR como la secuenciacin se repitieron al menos dos
veces, por lo que es poco probable que las diferencias entre una secuencia y otra
sea debida a fallas en el procedimiento de amplificacin o en la secuenciacin.
Las secuencias obtenidas se ingresaron al programa BLAST con el objetivo de
saber con qu genes presentaban homologa. El programa indic una alta
homologa con genes del Tipo de apareamiento de diferentes ascomicetos
filamentosos, principalmente del gnero Glomerella. En el esquema que muestra
el programa se observ la presencia de dos intrones, sin embargo, analizando la
secuencia detalladamente fue posible localizar el tercer intrn. Luego de editar las
secuencias con el fin de escindir los intrones, stas fueron analizadas con el
programa EditSequence del paquete DNAStar, con la finalidad de localizar los
posibles marcos de lectura abiertos. Se encontraron seis marcos de lectura
abiertos (Figura 26).
70
Los seis marcos de lectura se analizaron por separado en el programa BLAST.
Solamente uno de ellos present homologa con genes contenidos en el banco de
datos. El marco de lectura que va de la posicin 489 a la 1361 present alta
homologa con genes MAT1-2 de hongos filamentosos del gnero Glomerella y
de otros gneros de ascomicetos. En el programa mencionado aparece que este
marco de lectura contiene un dominio HMG tpico en los genes del Tipo de
apareamiento (Figura 26).
DGO02
210
305
489
1361
1438
1583
1693
1712
2006
CA C G G T
1 2 3 4 5 6
MU03
1 2 3 4 5 6
TC T A A A
210
305
489
1361
1438
1583
1693
1712
2006
Figura 26. Esquema de la posicin de los marcos de lectura abiertos e intrones en las cepas
parentales. Los nmeros en posicin horizontal indican los seis diferentes marcos de lectura, los
nmeros en posicin vertical indican la posicin en la secuencia de nucletidos. El rectngulo verde
es el nico marco de lectura para el que se encontr homologa en el banco de datos. Los
rectngulos grises indican marcos de lectura para los que no se encontr homologa en el banco de
datos de nucletidos y de aminocidos. Los rectngulos amarillos representan los intrones presentes
en el segundo marco de lectura y la lnea roja presenta la ubicacin de la caja HMG. Conlneas rosas
se marcan las diferencias puntuales entre las secuencias.
Una vez procesados los posibles intrones y traduciendo el marco de lectura abierto
de ambas cepas parentales, marcado con el nmero 2 en la figura 26, se obtuvo una
secuencia protica de 290 residuos, de los cuales difieren en dos aminocidos.
Dentro de esta secuencia protica se localiz el dominio HMG presente en las
protenas MAT1-2 de ascomicetos filamentosos (marcada con lneas azules). Las
71
diferencias entre las dos secuencias se localizaron fuera del dominio HMG, el cual es
idntico en ambas (Figura 27).
Figura 27. Alineamiento de secuencias de aminocidos obtenidas luego de traducir el segundo marco
de lectura abierto. Con sombra roja se observan los residuos diferentes entre las secuencias y con
lneas azules se resalta el dominio HMG.
Solamente una secuencia de DNA perteneciente a Colletotrichum gloeosporioides

reportada en el banco de datos (BLAST) contiene un fragmento que abarca el gen
72
MAT1-2-1 completo (No. de accesin AY357890). No existen reportes en los que se
analice esta secuencia. La posicin de dos de los tres intrones se encuentra
conservada, uno de ellos presente en todas las cajas HMG del gen MAT1-2-1
reportadas en ascomicetos filamentosos. Cuando se realiz la comparacin de
aminocidos de esta secuencia y la secuencia obtenida en este trabajo para el
ideomorfo MAT1-2 de C. lindemuthianum, se encontr que el 56% de los
aminocidos fueron idnticos y el 81% estaban funcionalmente conservados (Figura
28).
1
C. lind
C. gloe
1
C. lind
C. gloe
C. gloe
C. lind
290
C. lind
C. gloe
241
Figura 28. Comparacin de las secuencias proticas obtenidas al traducir la secuencia genmica de
los ideomorfos MAT1-2 de Colletotrichum lindemuthianum (secuencia superior) y Colletotrichum
gloeosporioides (secuencia inferior). El fondo de color azul indica los aminocidos conservados, la
lnea negra superior muestra la ubicacin de la caja HMG.
5.3.1 Anlisis de la caja HMG.

Una vez localizada la caja HMG, se procedi a analizarla comparndola con las
cajas HMG de las secuencias con las que se obtuvo mayor homologa. Como
se observa en la figura 29, existen residuos que son conservados en todas las
especies (Figura 29). Como ya se ha escrito, la secuencia de la caja HMG del
MAT1-2-1 se ha utilizado como herramienta para el anlisis filogentico. Para
construir un rbol filogentico y observar la posicin de Colletotrichum
lindemuthianum comparada con la de las otras especies del gnero y con los
ascomicetos filamentosos pertenecientes a la misma clase, se tomaron las
secuencias de las cajas HMG de las 100 especies con mayor homologa y se
procesaron para la obtencin del rbol filogentico que se muestra en la figura
(Figura 30).
73
Figura 29. Alineamiento de secuencias de la caja HMG de diferentes ascomicetos. Slo se tom en cuenta una de las
secuencias de las cepas parentales (lnea superior) puesto que en esta regin son idnticas.
74
G lo m e r e lla c in g u la ta 3
47
49
100
C o lle to tr ic h u m m u s a e 1
35
C o lle to tr ic h u m fr a g a r ia e 1
55
G lo m e r e lla m a g n a
71 C o lle to tr ic h u m lin d e m u th ia n u m
G lo m e r e lla g r a m in ic o la
49
96 G lo m e r e lla a c u ta ta
34 Is a r ia te n u ip e s
100 C o r d y c e p s m ilita r is
6 C e r a to c y s tis e u c a ly p ti
M a g n a p o r th e g r is e a
S o rd a rio m yc e te s
+
S c le r o tin ia s c le r o tio r u m
16
6 F u s a r iu m o x y s p o r u m
36
G ib b e r e lla z e a e
96
?
91 C o lle to tr ic h u m m u s a e
D ia p o r th e s p .
77 C r y p h o n e c tr ia p a r a s itic a
O p h io s to m a u lm i
P o d o s p o r a a n s e r in a
25
25 C h a e to m iu m s p .
37
S o r d a r ia m a c r o s p o r a
48
100 N e u ro s p o ra c ra s s a
7 4 G e la s in o s p o r a c e r e a lis
S e p to r ia p a s s e r in ii D o th id io m yc e te s
(C a p n o d ia le s )
C e r c o s p o r a z e in a
16 95
M y c o s p h a e r e lla p in i
32
100 D o th is tr o m a p in i
79 P a s s a lo r a fu lv a
P e n ic illiu m m a r n e ffe i
98 N e o s a r to r y a fis c h e r i
73
E u ro tio m yc e te s
58 A s p e r g illu s fu m ig a tu s
39
E m e r ic e lla n id u la n s
*
65 X a n th o r ia fla m m e a
A s c o s p h a e r a a p is
39
68 A je llo m y c e s c a p s u la tu s
61 C o c c id io id e s im m itis
#
R h y n c h o s p o r iu m s e c a lis
+
93 P y r e n o p e z iz a b r a s s ic a e
*
C la d o n ia g a lin d e z ii
D o th id io m yc e te s
(P le o s p o ra le s )
L e p to s p h a e r ia m a c u la n s
100 S te m p h y liu m s p .
9 9 P le o s p o r a g ig a s p o r a
0 .1
Figura 30. Dendrograma obtenido al analizar las secuencias HMG de diferentes ascomicetos pertenecientes al
subfilum Pezizomycotina. Los grupos asociados a diferentes clases se muestras subrayados. Los nmeros
indican el porcentaje de conservacin de los nodos en muestras de Bootstrap. (*) Pertenecen a
Lecanoromycetes, (+) pertenecen a Leotiomycetes, (#) posicin no definida, (?) posible error de clasificacin.
75
Luego de la hibridacin se observ que el gen es de copia nica en ambas cepas
parentales y que algunas enzimas de restriccin brindaron diferencias ligeras
entre las cepas parentales (marcador RFLP). Una de estas enzimas fue Hind III,
con ella se pudo obsevar que las seales de hibridacin difieren en tamao entre
las cepas parentales (Fig. 31). Se utiliz este resultado para analizar la
segregacin de MAT1-2 en la progenie.
1 2 1 2 1 2
A B C
Figura 31. Hibridacin tipo Southern. Carril 1, DNA
de cepa DGO02; Carril 2, DNA de cepa MU03.
El DNA de cada cepa fue cortado con A, HindIII;
B, EcoRI; C, BamHI.

Se realizaron hibridaciones tipo Southern con 150 de los 168 individuos que
forman parte de la progenie de la cruza DGO 02 X MU 03 (Rodrguez-Guerra y
col., 2005) utilizando la enzima HindIII para cortar el DNA y se analiz el patrn
de segregacin (Figura 32). De las 150 segregantes analizadas, 77 segregaron
igual que la cepa DGO 02 y 73 igual que la cepa MU 03. Al realizar el anlisis de
chi cuadrada, se obtuvo una segregacin en la proporcin 1:1 (Tabla 6).
1 2 3 4 5 6 7
Figura 32. Anlisis de la segregacin del ideomorfo MAT1-2

en los productos de la cruza DGO02 X MU03. Carril 1, DNA
de cepa DGO02; Carril 2, DNA de cepa MU03; Carriles 3 a 7,
DNA de 5 segregantes.
76
2
Segregantes Segregantes P
Tipo DGO02 Tipo MU03
77 73 0.1066 0.7
Tabla 6. Anlisis de Chi cuadrada para mostrar que la progenie
segrega en una relacin 1:1 con respecto al ideomorfo MAT1-2.
Alpha= 0.05.
5.6 Anlisis de expresin del gen MAT1-2-1.

Con el propsito de indagar si la composicin del medio en el que crecan las
cepas parentales y/o la presencia de una de ellas cerca de la otra afecta la
expresin del gen MAT1-2, se inocularon las cepas parentales solas tanto en
PDA como en KG y tambin se inocularon en estos medios ambas cepas juntas,
como se describe en Materiales y Mtodos. La tasa de crecimiento de las cepas
se vio disminuida con el nylon de por medio, ms aun, en el medio KG el
crecimiento es mucho menor que en PDA (Figura 33). Este efecto es ms
evidente en la cepa MU 03. Por este motivo, fue necesario inocular un nmero
mayor de cajas con medio KG. Una vez realizada la hibridacin con la sonda
del ideomorfo MAT1-2 como se describi en Materiales y Mtodos, la cual
abarca una parte el gen MAT1-2-1, ubicada despus de la secuencia del primer
intrn, la caja HMG y el resto de la secuencia clonada; se revel la pelcula, la
membrana fue regenerada y fijada y se someti a una segunda hibridacin
usando como sonda el gen 28S para tener evidencia de la equidad en las
cantidades de RNA cargadas en el gel. Cuando las cepas estuvieron creciendo
individualmente ya sea en PDA o en KG, no se detect la presencia del
transcrito. Lo mismo sucedi cuando las cepas crecieron juntas en medio KG;
sin embargo, se observ la expresin del transcrito cuando la cepa MU03 se
encontr en presencia de la cepa DGO02, ambas creciendo juntas en el medio
PDA (Figura 34 A). La cantidad de RNA cargada en cada pozo fue homognea,
excepto en los carriles 5 y 7 en la que se observa menor cantidad de RNA
(Figura 34 B).
77
A A B B
D D
C C
Figura 33. Fotografas que muestran la diferencia en la tasa de crecimiento de la misma

cepa en diferente medio (A y B). Tambin se observa a las dos cepas parentales creciendo
en la misma caja, en diferente medio (C y D). A, caja con medio KG y micelio de la
cepa MU03: B, caja con medio PDA y micelio de la cepa MU03; C, caja con medio
KG y ambas cepas parentales; D, caja con medio PDA y ambas cepas parentales.
78
A 1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 34. Expresin el gen MAT1-2-1. En el panel A se muestran los resultados obtenidos, al
utilizar como sonda parte del ideomorfo MAT1-2 de C. lindemuthianum obtenido en este
trabajo. Carril 1, RNA de cepa DGO02 crecida individualmente; Carril2, RNA de cepa MU03
crecida individualmente, Carril 3, RNA de cepa DGO02 crecida junto con cepa MU03; Carril 4,
RNA de cepa MU03 crecida junto con cepa DGO02; todas crecidas en placas con PDA.
Carriles 5 a 8 RNA en el orden que los carriles 1 a 4 pero todas las cepas crecidas en placas
con KG. En el panel B se presenta el mismo orden de carriles que en A, pero se muestra la
hibridacin resultante al utilizar como sonda el gen 28S.
5.7 RT-PCR.
El RNA utilizado para la sntesis de cDNA se obtuvo tanto de micelio de las cepas
parentales creiendo individualmente como de ambas creciendo juntas siempre en
medio de cultivo lquido. Cuando se intent realizar RT-PCR partiendo del cDNA
de cada una de las cepas parentales creciendo individualmente, no se obtuvo
amplificacin. Sin embargo, cuando se extrajo RNA de ambas cepas creciendo
juntas, se obtuvo producto de amplificacin. Utilizando esta tcnica se pudo
demostrar la presencia de los tres intrones y su procesamiento. Los fragmentos
amplificados por medio de RT-PCR utilizando los iniciadores que se muestran en
la tabla 5, fueron clonados y secuenciados para demostrar la presencia de los
tres intrones. En las figuras de abajo (Figuras 35 y 36) se muestran las
secuencias del DNA y las secuencias obtenidas luego de la secuenciacin de las
clonas resultantes de la RT-PCR. Los productos de estas amplificaciones
79
muestran claramente que los tres supuestos intrones son procesados como se
supona una vez que es expresado el RNA mensajero.
AGGTGTTGCCTCTCGTACGCTCCTCAAATTTCTCTTCCAATGCCCTGGA
--------------------------------------------------------------------------------------CCCTGGA
GTTTGACCTCTGGAGAACAACTGCCATCAGCCATCCTATTTATCTCTC
--------------------------------------------------------------------------------------------------
CCAAAACCCCTCGAGCATTCAACTCTCTTAGGACTCGATAGCAACAGT
----------------------------------------------------------------GACTCGATAGCAACAGT
GTCTGCTTGACCAGTACTCGCCCACGAACAATCCAGGTCTGCTTGACC
GTCTGCTTGACCAGTACTCGCCCACGAACAATCCAGGTCTGCTTGACC
AGTACTCGCCCACGAACAATCCAGGCTATATTACCTTCAACAATACCC
AGTACTCGCCCACGAACAATCCAGGCTATATTACCTTCAACAATACCC
CCGCTTCTCGTCTTACACCGCCAAACCGCTTCGCAATGTCGTTTAATC
CCGCTTCTCGTCTTACACCGCCAAACCGCTTCGCAATGTCGTTTAATC
CCGGACAGATCATTGCCGGATGTCTGGATGCTGCGAGACTGCGCCCC
CCGGACAGATCATTGCCGGATGTCTGGATGCTGCGAGACTGCGCCCC
GAAGTTCTTCAAATGGCCACCGATAC
GAAGTTCTTCAAATGGCCACCGATAC
Figura 35. Comprobacin de la presencia del intrn 1. En la figura se muestra la comparacin de un

fragmento de la secuencia del ideomorfo MAT1-2. La secuencia superior es la secuencia del DNA,
mientras que la secuencia inferior es la secuencia obtenida al clonar el producto de RT-PCR
correspondiente. Las letras resaltadas en negritas y con fondo amarillo indican la secuencia usada
para disear los iniciadores y mostrar la presencia del primer intrn (base 450 a base 660). Las letras
con fondo verde indican la secuencia procesada y las lneas continuas indican la ausencia de ese
fragmento de DNA.
80
CAAATGGCCACCGATACACTACAGCTCCACTTGAATAGCTTTCAGTCCGTCATA
-----------------------------------------------------------------------GCTTTCAGTCCGTCATA
GCTGTGTCGGGCAGGGACTACGTTTTCATCGGCCAAGATGGCCAGGCATTCAT
GCTGTGTCGGGCAGGGACTACGTTTTCATCGGCCAAGATGGCCAGGCATTCAT
GGCATTTTCCATGGGGTATGGTTCTCCCCTCGTCCATGTAGCCCAATCTTTCAAT
GGCATTTTCCATGGG ----------------------------------------------------------------------------
ATATGATACTAACTGGGGGTAGGCGCATTCTCAACAAGCCTGTAATGTGGGCA
------------------------------------------ GCGCATTCTCAACAAGCCTGTAATGTGGGCA
AAAGACGGTCTGAGTAGCGACGCAGACAGATGGGTCCTCGGTCCCTGCGAGAG
AAAGACGGTCTGAGTAGCGACGCAGACAGATGGGTCCTCGGTCCCTGCGAGAG
ATTCGTCTCCGGTCCTCACATGATCGTCTCAATAAACGGTATCGCCGTCGTTGT
ATTCGTCTCCGGTCCTCACATGATCGTCTCAATAAACGGTATCGCCGTCGTTGT
CCGAAGACCCGCGAGCCAGTTTCTCGAAGAGTTCACTGGATCAGACGCAGGTG
CCGAAGACCCGCGAGCCAGTTTCTCGAAGAGTTCACTGGATCAGACGCAGGTG
TTCACTACGCGGAGAGTCCAGAGCCGCGTAAGATCAAGGTCCCCCGCCCGCCC
TTCACTACGCGGAGAGTCCAGAGCCGCGTAAGATCAAGGTCCCCCGCCCGCCC
AACGCCTACATTCTCTACCGGAGGGACCGACATGCCGCAGTAAAGCAAATGGA
AACGCCTACATTCTCTACCGGAGGGACCGACATGCCGCAGTAAAGCAAATGGA
CAATAGCCTCACCAACAATGAGATCTGTAAGTTGCCCCGCACATCACCGTCA
CAATAGCCTCACCAACAATGAGATCT----------------------------------------------------
ATGCAGTTGCTGATCTTTCAAAGCTGTCAAACTTGGCAAAGCATGGAACGCAG
-----------------------------------------------CTGTCAAACTTGGCAAAGCATGGAAC
Figura 36. Comprobacin de la presencia de los intrones 2 y 3. En la figura se muestra la

comparacin de un fragmento de la secuencia del ideomorfo MAT1-2. La secuencia superior es la
secuencia del DNA, mientras que la secuencia inferior es la secuencia obtenida al clonar el producto
de RT-PCR correspondiente. Las letras resaltadas en negritas y con fondo amarillo indican la
secuencia usada para disear los iniciadores y mostrar la presencia de los intrones 2 y 3 (base 840 a
base 1380). Las letras con fondo verde indican la secuencia procesada y las lneas continuas indican
la ausencia de ese fragmento de DNA.
81
6. Discusin
6.1 Amplificacin de la caja HMG.

Al realizar PCR utilizando los iniciadores degenerados diseados por Arie y col.
(1997) para amplificar la caja HMG, se pudo constatar que ambos parentales
poseen esta secuencia, ambos tienen un ideomorfo MAT1-2. Esto ya se ha
reportado para otros hongos, uno de ellos perteneciente al gnero, Glomerella
graminicola, y otros pertenecientes a otras especies, Bipolaris sacchari y
Cochliobolus victoriae. (Vaillancourt y col., 2000; Sharon y col., 1996 y
Christiansen y col., 1998)
Dentro de los hemiascomicetos tambin se ha presentado este fenmeno. Existe

el reporte de haber encontrado slo MAT1-2 en un aislado de Candida
parapsilosis (Logue et al, 2005). En este trabajo no encontraron el MAT1-1 luego
de utilizar los iniciadores degenerados y hacer PCR, sin embargo, usando como
sonda el gen MAT1-1 de Candida albicans, realizaron una hibridacin Southern
del DNA genmico de la cepa de Candida parapsilosis y encontraron la presencia
del ideomorfo en una localizacin diferente en el cromosoma, fenmeno que no
se haba reportado para otro ascomiceto, por lo que concluyeron que la mayora
de los aislados de esta especie presenta una ruta de apareamiento diferente.
El hallazgo del ideomorfo MAT1-2 en ambas cepas parentales de Glomerella

lindemuthiana parece confirmar lo que se ha publicado desde principios del siglo
pasado por Edgerton y Wheeler (1912-1949) para G. gloeosporioides; las
especies pertenecientes al gnero Glomerella son en esencia homotlicas, pero
la evolucin ha producido mutaciones en ellas, tales que las han transformado en
cepas pseudoheterotlicas, esto es, son autoestriles puesto que no forman
estructuras sexuales cuando crecen aisladamente en una placa con medio. Sin
embargo, tampoco podemos decir que son heterotlicas puras, en virtud de que
poseen ambas el mismo Tipo de apareamiento y de que no se aparean con otras
cepas que pudieran tener un Tipo de apareamiento complementario.
82
Como ya se haba mostrado en una publicacin anterior (Rodrguez-Guerra y col.,
2005), los iniciadores diseados especficamente para amplificar la caja HMG no
amplifican esta regin en especies de otros gneros; sin embargo, son capaces
de amplificar esta regin tanto de Colletotrichum lindemuthianum como de todas
las especies pertenecientes a este gnero que fueron probadas en el presente
trabajo. Esto habla de la conservacin de esta regin. Existen reportes tanto en
basidiomicetos como en ascomicetos patgenos, en los que se ha demostrado
que los genes del Tipo de apareamiento tambin intervienen en el proceso de
patognesis (Hartnan,1996) lo cual brinda la posibilidad de estudiar esta otra
funcin dentro del sistema Colletotrichum lindemuthianum-Phaseolus vulgaris.
Por otra parte, diferentes autores han resaltado la ventaja de utilizar la caja HMG
como herramienta en la construccin de filogenias (Turgeon, 1998; Du-Meizhu,
2005; Debuchy, 2006), razn por la cual las especies de Colletotrichum con las
que contamos en nuestro laboratorio y que representan en gran medida los
aislados existentes en Mxico, pueden ahora ser analizados con esta til
herramienta. Por otra parte, resulta interesante el hecho de que al realizar la
PCR usando los iniciadores degenerados con el DNA de algunas especies del
gnero Colletotrichum, se obtenga ms de una banda; aunque los resultados del
anlisis Southern presentados en este trabajo demuestran que en C.
lindemuthianum slo existe una copia del gen MAT1-2-1, es posible que en otros
miembros del gnero existan copias mltiples y/o pseudogenes. Esta hiptesis
no ha sido explorada en detalle.
Cuando se compar la secuencia que se obtuvo de la caja HMG en las dos cepas
parentales con el banco de datos, se observ que se encuentra altamente
conservada dentro de los ascomicetos filamentosos, incluyendo el intrn que
tambin se conserva en prcticamente todas las cajas HMG del ideomorfo MAT1-
2 de los ascomicetos filamentosos reportados hasta el momento. En el ideomorfo
MAT1-2 de C. heterostrophus el primero de los intrones (hacia el extremo 5)
83
presenta un procesamiento alternativo (Leubner-Metzger y col., 1997). El
segundo intrn est muy conservado en todas las cajas HMG de muchos
organismos, en P. anserina es de 52 nucletidos (Coppin y col., 1997), mientras
que en C. heterostrophus es de 55 nucletidos (Leubner-Metzger y col., 1997) y
en nuestro caso es de 49 nucletidos. Como se observa, la longitud tambin es
semejante entre los ascomicetos filamentosos. Todas estas coincidencias
sugieren que este ideomorfo tiene un ancestro comn para los ascomicetos
filamentosos y quizs para muchos otros organismos de gneros distantes
taxonmicamente.
6.2 TAIL-PCR.
Con la secuencia de 2 Kb que se obtuvo luego de las dos reacciones de TAIL-
PCR, se lograron identificar diferencias puntuales entre las cepas parentales.
Estas diferencias producen cambios solo en dos aminocidos, los cuales estn
fuera del dominio HMG, lo que predice que la funcin de la protena se conserva.
En el banco de datos de secuencias de DNA se encontraron varias secuencias
pertenecientes al ideomorfo MAT1-2 de C. gloeosporioides, una de ellas contiene
alrededor de 11 Kb, proveniente de una clona de un banco genmico. No existe
ningn artculo en el que se discuta el anlisis de esta secuencia; sin embargo,
cuando se compar la secuencia obtenida en este trabajo con la secuencia
completa del ideomorfo para C. gloeosporioides, se encontr una gran similitud,
dos de los tres intrones estaban conservados. La comparacin a nivel de
nucletidos arroj varias diferencias, sin embargo a nivel de aminocidos se
observa una gran homologa y la caja HMG se encuentra en la misma posicin.
En la secuencia reportada para el ideomorfo MAT1-2 de C. gloeosporioides,
adems del marco de lectura abierto para el gen MAT1-2-1, se encuentra otro
marco de lectura abierto incompleto con alta homologa para el gen que codifica
para una DNA liasa. Debido a que no se tiene mayor informacin sobre este
segundo marco de lectura abierto, no se sabe si este segundo gen est
involucrado de alguna manera en los eventos de la reproduccin sexual en los
hongos pertenecientes al gnero Colletotrichum. En la secuencia que se obtuvo
84
en este trabajo, de todos los marcos de lectura abiertos encontrados, solamente
uno tiene homologa con los genes existentes en el banco de datos, el gen MAT1-
2-1. Este marco de lectura abierto es el mayor, los otros son muy pequeos y no
presentan homologa con algn gen reportado. En la mayora de las reportes en
los que se analizan los genes del tipo de apareamiento, se analizan las
similitudes entre las secuencias de DNA genmico, las secuencias de las
regiones aledaas a los ideomorfos y la conservacin del dominio HMG, pero en
pocas referencias se habla sobre la conservacin de la secuencia protica del
gen completo. En C. graminicola se realiz un basto estudio del ideomorfo
MAT1-2-1, especficamente del dominio HMG y en la gran mayora existen varios
residuos de aminocidos que difieren dentro de este dominio (Du y col., 2005).
Hablando de otros ascomicetos filamentosos como N. crassa, P. anserina y C.

heterostrophus, se ha reportado la presencia de dos intrones dentro del marco de
lectura abierto del ideomorfo MAT1-2, uno de los cuales se encuentra hacia el
extremo 5 y el otro dentro del dominio HMG en los tres casos. (Staben y
Yanofsky, 1990; Debuchy y Coppin, 1992; Leubner-Metzger y col, 1997).
Como ya se ha mencionado, la secuencia de la caja HMG se ha utilizado como

herramienta filogentica. En nuestro caso se realiz este anlisis utilizando 100
secuencias con mayor homologa en la caja HMG obtenidas al hacer la
comparacin de secuencias en el banco de datos (BLAST). Utilizando los
programas Jalview y MEGA 4.0 e ingresando las secuencias mencionadas, se
construy un dendrograma el cual muestra el anlisis de 44 de las 100
secuencias con las que se encontr mayor homologa y que se muestra en la
Figura 31. Los grupos que se observan en el dendrograma resultante siguen la
clasificacin taxonmica de la clase Pezizomycota, con algunas excepciones en
las que algunos gneros pertenecientes al mismo grupo se aprecen en grupos
distintos. El grupo de los Dothidiomicetos se observa claramente separado. C.
lindemuthianum aparece en el grupo en donde se situan varias especies del
gnero Glomerella como se esperaba, pero no se incluye en el grupo de G.
85
cingulata, C. musae y C. fragarie y tambin se encuentra separado de G.
graminicola y G. acutata. Una secuencia de G. musae aparece agrupada con
especies de Fusarium, lo cual parece ser un error en la clasificacin. El grupo
Glomerella aparece muy relacionado con los gneros Isaria y Tenuipes. Estos
gneros estn clasificados dentro de los Sordariomicetes como Insertae sedis,
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Tree&id=489
0&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock),sin embargo estos gneros estn
representados por especies de hongos que son patgenos de insectos.
En los hongos que sirven como modelo de estudio de los ideomorfos MAT, se
han encontrado otros genes dentro de este locus. Es necesario en nuestro caso
seguir analizando las secuencias aledaas a este fragmento de 2 Kb para
conocer si existe(n) otro(s) gen (es) y sus funciones.
Antes del primer marco de lectura y entre cada uno de ellos, se encuentran
regiones no codificantes, que son de una longitud variable no mayor a 200 pb. En
otros hongos tambin se han encontrado estas secuencias de hasta 500 pb que
en algunos casos contienen marcos de lectura muy pequeos. Se supone que
estas regiones son reguladores postranscripcionales (Leubner-Metzger y col.,
1997). Hacia el extremo 5 del ATG se han reportado secuencias importantes
tanto para N. crassa, P. anserina y C. heterostrophus. En el caso del primero,
Glass y col. (1990) reportaron la presencia de la secuencia CAACTTC localizada
81 pb hacia el 5 del ATG del mtA-1. Debuchy y Coppin (1991), encontraron
esta misma secuencia a 34 pb hacia el 5 del ATG de ambos ideomorfos, adems
de la secuencia GTCTTTCT la cual se encuentra a 222 pb y 199 pb del ATG de
cada ideomorfo de P. anserina. Por otra parte, Leubner-Metzger y col., (1997)
reportaron la localizacin de las secuencias GCGGAG, GTGGGG y GTGGAG a
1.26 y 1.31 Kb hacia el extremo 5 de cada ideomorfo, respectivamente, que son
sitios de regulacin para el catabolismo del carbono. Tambin encontraron las
secuencias GATTA y GATAA a 2.04 y 1.72 Kb hacia el 5 del ATG de cada
ideomorfo. Estas secuencias son dominios de represin por nitrgeno. En las
86
secuencias que tenemos de cada cepa parental, no encontramos ninguna de
estas secuencias hacia el 5 del ATG, aunque ser necesario secuenciar
fragmentos aledaos ms grandes para establecer la presencia de esas
secuencias, pues en los otros hongos se encontraron a ms de 1 Kb y nosotros
contamos con menos de 1 Kb hacia el 5 del ATG del ideomorfo MAT1-2-1.
Si se retoma el modelo propuesto por Wheeler (Figura 17) y se analiza la

secuencia del MAT1-2-1 en las cepas parentales autoestriles estudiadas en este
trabajo, podramos proponer que las cepas son pseudoheterotlicas y que otros
loci estn involucrados en el apareamiento entre ellas. Esta situacin es muy
distinta a la que se presenta en la mayora de los ascomicetos filamentosos,
donde cada miembro de una pareja porta un ideomorfo MAT diferente y este
hecho es suficiente para determinar las parejas capaces de aparearse. Adems,
la presencia del ideomorfo MAT1-1 no ha sido descrita en el gnero Glomerella,
aunque varios grupos de investigacin incluyendo el nuestro lo han buscado. Es
posible que el MAT1-1 en Glomerella tenga una estructura y/o secuencia
sustancialmente diferente al de los dems ascomicetos, por lo que resulta
intrigante el comportamiento diferente de C. lindemuthianum y de otras especies
de este gnero en cuanto a la reproduccin sexual. Surge la pregunta de por qu
el gen MAT1-2-1 est fuertemente conservado sobretodo en especies que
normalmente no llevan a cabo la reproduccin sexual y si solamente es necesario
para este proceso o interviene en algn otro proceso como la compatibilidad
vegetativa como en el caso de N. crassa (Philley y Staben, 1994) o la
patognesis, como en el caso de Magnaporthe griseae y Ustilago maydis
(Beckerman y col., 1997; Hartnann y col., 1996).
87
Analizando los resultados obtenidos en la hibridacin tipo Southern, se observa
que ambas cepas contienen en copia nica el ideomorfo MAT1-2, sin embargo
existi diferencia en el tamao del fragmento que hibrida, ocasionada por
diferencias en la secuencia de las cepas parentales. Esto permiti establecer al
ideomorfo como un marcador RFLP para analizar la segregacin de la progenie.
La mutacin que afecta el sitio de restriccin no se encuentra dentro de la
secuencia de 2 Kb analizada.

De las 150 segregantes analizadas, 77 segregaron igual que la parental DGO02 y
73 igual que la MU03. Al hacer el anlisis de Chi Cuadrada obtenemos que este
comportamiento se ajusta perfectamente a una segregacin 1:1, lo que confirma
que las cepas segregantes provienen de una cruza sexual entre las cepas
parentales y adems que no se estn observando rearreglos cromosomales o
efectos de cromosomas pequeos supernumerarios no esenciales, como se ha
observado en algunos aislados de C. gloeosporioides (Masel y col., 1993). Estos
resultados se confirmaron analizando el patotipo que presentan las cepas de la
progenie, las cuales presentaron patotipo similar a la de un parental o a la de otro
o un patotipo recombinante (Campos-Victoria, 2005).
6.5 Expresin del gen MAT1-2-1.

Al estudiar la biologa de C. lindemuthianum en el laboratorio, se ha notado un
fenmeno interesante: resulta extremadamente difcil reproducir el evento de
apareamiento; los peritecios nunca llegan a madurar o se encuentran vacos (sin
ascas ni ascosporas). Este fenmeno nos lleva a pensar que posiblemente
existen ms genes y factores que controlan la reproduccin sexual que no se han
tomado en cuenta. Adems, los investigadores que han trabajado con especies
del gnero Colletotrichum (Edgerton, 1914y 1945; Wheeler 1950 y 1954; Kimati y
88
Galli, 1970; Batista y Chaves, 1982; y Bryson 1990) han notado que la
reproduccin sexual depende de las condiciones de luz, temperatura, nutrientes y
edad de los cultivos. En nuestro caso la presencia del transcrito del ideomorfo
MAT1-2 fue detectada solamente cuando las cepas crecieron juntas en medio
PDA, lo que indica por una parte que es necesaria la presencia de la cepa con
Tipo de apareamiento complementario para que la expresin del ideomorfo se
active. Por otra parte con este resultado podemos inferir que el medio influye en
la activacin del ideomorfo. Este resultado parece contradecir los resultados
publicados por Rodrguez-Guerra y col., (2005); pues slo obtuvieron desarrollo
sexual cuando las cepas fueron crecidas en medio KG. Sin embargo en los
experimentos aqu descritos, aunque se observ la expresin del gen MAT1-2-1,
no se encontr evidencia de la formacin de estructuras reproductivas en el
medio PDA. Otro fenmeno interesante es que slo se observa aumentada la
expresin en una de las cepas parentales y no en ambas como se esperara. Es
posible que exista un mecanismo de represin de la expresin del gen en la cepa
en la que no se observa seal, pues esto ya se ha observado en otros hongos (B.
sacchari). De igual forma podra suceder que solamente se est activando el gen
en una de las dos cepas y que el gen de la cepa que no presenta activacin del
mismo requiera alguna otra seal para hacerlo. Para descartar o aceptar
cualquiera de estas opciones, es necesario hacer ms experimentos probando
diferentes condiciones de cultivo y analizando la expresin del ideomorfo en cada
condicin para aclarar esta situacin.
6.6 Presencia de Intrones.

Los resultados de las diferentes pruebas de RT-PCR nos llevan a confirmar la
presencia de los tres intrones ya descritos. El hecho de que slo se pudiera
amplificar el transcrito cuando se obtuvo RNA de las cepas creciendo juntas
confirma los resultados obtenidos en la hibridacin Northern. Sin embargo, con
este experimento no es posible determinar de qu cepa proviene el transcrito. De
la misma forma, es necesario hacer ms anlisis para confirmar que la protena
codificada por el ideomorfo tiene una funcin en el desarrollo sexual.
89
7. Conclusiones
Con base en los resultados obtenidos y a lo discutido en la seccin anterior, se

presentan las siguientes conclusiones:
Las cepas DGO02 y MU03 presentan una regin en su genoma con alta
similitud al ideomorfo MAT1-2 de diferentes ascomicetos filamentosos.
Ambas cepas poseen el ideomorfo MAT1-2, la comparacin entre las
secuencias de DNA muestra diferencias puntuales que solo producen
diferencias en dos aminocidos.
En el ideomorfo MAT1-2 de ambas cepas de Colletotrichum lindemuthianum
se encuentra la secuencia conservada denominada caja HMG presente en
todos los ideomorfos MAT1-2 de ascomicetos filamentosos.
En las cepas parentales no se encontraron secuencias con homologas al
MAT1-1 de ascomicetos filamentosos.
El segundo marco de lectura abierto presenta en ambas cepas alta homologa
a nivel de nucletidos con el ideomorfo MAT1-2 de Glomerella cingulata,
Glomerella graminicola, Glomerella falcatum, con otros hongos pertenecientes
al mismo gnero y con otros Ascomicetos filamentosos.
Cada una de las cepas parentales contiene este ideomorfo en copia nica en
su genoma.
Las segregantes presentan tambin el ideomorfo en una sola copia y por la
segregacin de este se concluye que son producto de la reproduccin sexual
de las cepas parentales.
Tanto el medio de cultivo como la presencia de la cepa con Tipo de
apareamiento complementario influyen en la expresin de este gen.
Con base en la secuencia de la caja HMG se concluye que Glomerella
lindemuthiana est mas cerca filogenticamente de Glomerella magna y de
Glomerella graminicola que del resto de las especies pertenecientes al
gnero.
90
8. Perspectivas
Ser interesante clonar los ideomorfos de los 19 aislados de C. lindemuthianum que

fueron estudiados por Rodrguez-Guerra y col. (2005), puesto que todos producen la
banda correspondiente a la caja HMG, algunos de ellos producen pseudoperitecios
cuando se cultivan juntos y otros producen peritecios que no llegan a tener ascas.
Posiblemente en estos aislados se encuentren diferencias al nivel de secuencia de
DNA. Adems, estos 19 aislados tienen patogenicidad especfica para ciertos
cultivares de frijol, lo que torna aun ms interesante esta investigacin, pues se sabe
que en algunos ascomicetos y basidiomicetos fitopatgenos como M. griseae y U.
maydis, la ruta de sealizacin de feromonas converge en un punto con la ruta de
sealizacin de patognesis (Beckerman y col., 1997; Hartnann y col., 1996).
Tambin ser interesante analizar tanto en las cepas parentales motivo de este
trabajo como en los otros 17 aislados con los que contamos en nuestro laboratorio,
amplificar, clonar y secuenciar los genes que codifican para los precursores de
feromonas y sus receptores, pues como se sabe los ideomorfos MAT son los
encargados de regular a estos genes. En M. griseae y U. maydis se han diseado
iniciadores para amplificar por PCR estos genes, en base a ellos podran disearse
algunos iniciadores degenerados para tratrar de obtener estos genes en C.
lindemuthianum.
Como ya se explic, solamente se intent localizar al ideomorfo MAT1-1 utilizando

estrategias basadas en PCR. Ser un excelente experimento utilizar como sonda el
ideomorfo MAT1-1 de una especie relativamente cercana y realizar una hibridacin
tipo Southern para descartar por completo la posibilidad de encontrar este ideomorfo,
o al menos un gen que tenga homologa con el ideomorfo MAT1-1.
Nuestro grupo de trabajo cuenta con una gran cantidad de aislados de Colletotrichum
lindemuthianum cuyos hospederos pertenecen a los dos grupos principales de
origen del frijol, andino y mesoamericano, de los cuales se tiene estudiada su
91
variabilidad gentica. Por otra parte, como lo reportaron Du y col.(2005) para C.
graminicola, aun entre aislados de la misma especie existen diferencias la secuencia
del DNA del ideomormo MAT1-2, se podra obtener la secuencia de la regin HMG
de todos los aislados y construir rboles filogenticos, para de esta forma tener una
visin ms clara de las diferencias y relacionarlos con la patogenicidad a los
diferentes centros de origen del frijol.
Como tambin contamos con una amplia coleccin de otras especies del gnero con
muy diversos hospederos y en vista de que la mayora de ellos presentan mltiples
productos de amplificacin (adems del producto de 300 pb), sera deseable
secuenciar estos fragmentos primero para conocer la naturaleza de los productos
mayores a lo esperado y despus para construir rboles filogenticos y analizar las
diferencias dependiendo del hospedero, como ha sido sugerido por Turgeon y col.,
(1996) y por Du y col., (2005).
92
9. Apndice
En nuestro grupo de trabajo se tiene inters en el anlisis de genes de avirulencia,

pues existe evidencia que apoya el hecho de que Colletotrichum lindemuthianum y
su hospedero habitual Phaseolus vulgaris establecen una relacin que se ajusta
perfectamente a la teora de gen x gen descrita por Flor en 1971. Tomando esto
como base, como inicio del presente trabajo doctoral se plante un proyecto en el
que se buscaran genes de avirulencia y factores de patogenicidad en C.
lindemuthianum. Para lograr este objetivo, se propuso la construccin de un banco
genmico de la raza cero de C. lindemuthianum que no infecta ninguna de las
variedades diferenciales de P. vulgaris utilizadaspara la clasificacin de C.
lindemuthianum. Siguiendo la teora gen X gen, esta raza del hongo debe contener
un gran nmero de genes de avirulencia. Se plante que con las clonas de este
banco se transformara la raza 1472 del mismo hongo, la cual carece o tiene
mutados al menos cuatro genes de avirulencia (pues infecta a cuatro variedades
diferentes de frijol). Se realizara un escrutinio con las transformantes obtenidas para
ver si cambiaba su patrn de patogenicidad y esto nos permitira localizar y
caracterizar uno o varios genes de avirulencia y/o patogenicidad. Se propuso que el
escrutinio se realizara inoculando hipocotilos con las conidias de cada transformante,
para ahorrar tiempo, incluso se plante la posibilidad de inocular varias
transformantes al mismo tiempo, para lo cual se prob en qu volmenes de conidias
patgenas/no patgenas era posible reconocer una reaccin incompatible. Debido a
que la raza 1472 debera transformarse con las clonas del banco genmico, era
necesario obtener ste en el menor nmero posible de clonas. Por esto se plante la
necesidad de construir el banco genmico utilizando cromosomas artificiales de
bacteria (BACs), vectores de clonacin que aceptan fragmentos de hasta 350 kb y a
la vez en el vector pMSC1, el cual contiene todo lo necesario para replicarse y
mantenerse dentro de clulas de C. lindemuthianum (Rodrguez y Redman, 1987) y
es un csmido, es decir que acepta fragmentos de aproximadamente 50 Kb. Para
poder obtener fragmentos del tamao requerido, era menester obtener DNA de muy
alto peso molecular (alrededor de 500 kb), por lo cual se pens en dos estrategias, la
93
obtencin de ncleos ntegros o bien la obtencin de protoplastos. Por otra parte, la
obtencin de protoplastos tambin sera til para realizar la transformacin de la raza
1472 por medio de la tcnica de cloruro de calcio-PEG, descrita para C.
lindemuthianum por Rodrguez y Redman (1987). Para la obtencin de protoplastos
hubo que estandarizar algunas tcnicas, las cuales se describen en los apartados
siguientes. Una vez establecido el protocolo de formacin de protoplastos, se sigui
con la obtencin de DNA de alto peso molecular, del cual tambin se estandarizaron
dos tcnicas, descritas posteriormente. En uno de los dos protocolos descritos para
la obtencin de protoplastos se obtuvieron mejores resultados, al igual que en uno de
los protocolos de obtencin de DNA de alto peso molecular. Luego de esto, se sigui
con la preparacin de los vectores de clonacin y transformacin. El DNA del vector
pBELOBAC11 se obtuvo en grandes cantidades, pero no fue posible cortarlo
(aparentemente perdi el sitio de corte). Con el vector pMSC1 fue prcticamente
imposible obtener transformantes, aparentemente hubo problemas en la ligacin del
vector con los fragmentos de DNA genmico. Finalmente se prob el vector
pANCOS, desarrollado por el grupo de trabajo del Dr. Alfredo Herrera, el cual
aparentemente dio buenos resultados. Sin embargo, la eficiencia de transformacin
invariablemente fue muy baja. Como alternativa se prob construir el banco en un
vector comercial en el que se empaquetaran los fragmentos de DNA de C.
lindemuthianum. Despus de varios intentos, no fue posible obtener fagos
transformantes que contuvieran los fragmentos de inters, aunque los controles
positivos dieron buenos resultados. En vista de que el tiempo corra y no era posible
la construccin del banco por las cuestiones tcnicas que se han descrito, se
replante el proyecto de investigacin, se present el objetivo de analizar y
caracterizar genes que se expresaran diferencialmente durante las primeras etapas
de infeccin. Para cumplir el objetivo se propuso extraer RNA de clulas que
estuvieran formando apresorio, estructura necesaria para que el hongo penetre a la
clula vegetal. Partiendo del RNA extrado, se sintetizara cDNA. Con ste cDNA y
con DNA extrado del hongo con crecimiento vegetativo micelial, se realizara la
tcnica de AFLPs, para localizar bandas que se expresaran diferencialmente durante
la formacin del apresorio. Para lograr este segundo objetivo, era necesaria la
94
obtencin de clulas que produjeran apresorios in vitro. En varias especies
pertenecientes al gnero se haba descrito la formacin de apresorios, de tal forma
que no pareca difcil la tarea propuesta. Como en secciones posteriores, se
probaron diferentes condiciones de cultivo hasta obtener las idneas para la
formacin de apresorios in vitro. Se observ la formacin de protoplastos en el 90%
de las clulas de la preparacin, pero estas condiciones no fueron reproducibles, lo
que hizo bastante difcil el avance en este proyecto. A continuacin se describen las
tcnicas estandarizadas en los proyectos propuestos y los problemas que se
presentaron, que finalmente representan tambin un gran aprendizaje.
9.1 Obtencin de ncleos de C. lindemuthianum
Se prob un protocolo reportado en el libro Biology and Molecular Biology of Plant

Pathogens (Bailey, 1986) para la obtencin de ncleos de hongos, el cual
despus de varios intentos, no brind buenos resultados.
9.2 Obtencin de protoplastos de C. lindemuthianum
De forma rutinaria, los reportes publicados que trataban el tema de

transformacin de hongos, exponan la tcnica de transformacin obteniendo
primero protoplastos los cuales transformaban por medio de cloruro de calcio o
bien por electroporacin y posteriormente regeneraban en un medio especfico
(Rodrguez y Redman, 1987; Surez y Orejas, 1987; Orbach y Yanofsky, 1988;
Royer y Yamashiro, 1991; Hayes y Lorito, 1992; Randall y Judelson, 1999;
Redman y Rodrguez, 1994;). En estos reportes, la enzima utilizada para la
produccin de protoplastos era Novozyma 234 (Novonordisk), la cual era muy
eficiente para la produccin de protoplastos. Dicha eficiencia dependa del lote
de la enzima y del sistema biolgico con el cual se estuviera trabajando. Sin
embargo, modificando las condiciones como temperatura y tiempo de incubacin
as como concentracin de la enzima, se obtenan excelentes resultados
95
representados por una gran cantidad de micelio que pasaba a protoplastos en
poco tiempo.
Cuando en el inicio de este trabajo surgi la necesidad de producir protoplastos,

la produccin de Novozyma 234 ces. Se intent conseguir este producto en
algn laboratorio en el que aun quedara pero desafortunadamente fue muy poca
la cantidad que se logr conseguir y con baja capacidad para producir
protoplastos, posiblemente por el tiempo que tena almacenada. Sin embargo,
haba reportes en los que se usaban otras enzimas como Driselasa, enzimas
lticas, glucosidasa, etc. Por esta razn se comenz a intentar la obtencin de
protoplastos con algunas de estas enzimas y sus combinaciones. Otro paso que
pareca ser obligado en aquellos experimentos de obtencin de protoplastos
partiendo de micelio, era que ste era previamente molido en una licuadora o bien
agitado junto con perlas de vidrio.
Una vez adquiridas las enzimas citadas, se procedi aprobar en diferentes

combinaciones cada una de ellas y luego en diferentes combinaciones, as como
se prob la utilizacin de micelio ntegro, previamente molido, agitado con perlas,
o ambas. Despus de un gran nmero de pruebas, se estandariz el protocolo
de la manera descrita a continuacin.
9.2.1 Protocolo A para la obtencin de protoplastos
Se utilizaron matraces Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio M3S lquido

(MgSO4. 7 H2O 0.25%, extracto de levadura 0.1%, KH2PO4 0.27%, bacto peptona
0.1%, sacarosa 1%) para inocular micelio de la cepa 1472 de Colletotrichum
lindemuthianum obtenido de una caja de petri con medio M3S slido (igual al M3S
lquido pero adicionado con agar bacteriolgico al 1%). Los matraces se
incubaron a 22C con agitacin orbital constante (250 rpm). Pasados cinco das
de incubacin, se recuper el micelio utilizando un embudo que en el extremo
inferior tena dos capas de tela Miracloth sujetas a l por medio de una liga,
96
estril. El micelio as recuperado se someti a disgregacin y rompimiento por
medio de una licuadora con un vaso para alimentos de 250 ml, estril. El micelio
se filtr utilizando papel filtro 3 MM Whatman con un sistema de filtracin al
vaco y se lav varias veces con solucin OM (MgSO 4. 7 H2O 1.2 M, 10mM de
solucin amortiguadora de fosfatos pH 5.8). El micelio colectado de 3 matraces
de cultivo se pas a un matraz de 50 ml que contena 20 ml de solucin
enzimtica (Driselase, 10mg/ml; Lysing enzymes, 10mg/ml; -glucuronidasa, 150
u/ml). Los matraces con micelio y solucin enzimtica se incubaron a 22C con
agitacin orbital de 60 rpm durante 7-8 horas, luego de las cuales se tom una
alcuota para observar al microscopio. Una vez corroborada la formacin de
protoplastos, el contenido de los matraces se pas por encima de una malla de
fibra de vidrio SpectraMesh y con ayuda de una varilla de vidrio estril se
depositaron dentro de una caja de petri. Esta suspensin se colect con
micropipeta de 1000 ml usando puntas estriles y cortadas de la punta y se
transfiri a tubos COREX de 30 ml (se depositaron 15 ml de suspensin de
protoplastos en cada tubo COREX). A cada tubo se aadieron por la pared 5 ml
de solucin TS (Sorbitol 0.6 M, Tris-HCl 100 mM pH 7.0). Se centrifugaron los
tubos a 7 K rpm y 4C durante 12 minutos en el rotor Beckman JA20. Una vez
terminada la centrifugacin, fueron visibles varias capas dentro del tubo, las dos
capas intermedias eran de color rosa claro se tomaron con una pipeta con punta
cortada y se transfirieron a un tubo de polipropileno de 15 ml de fondo cnico. A
cada uno de estos tubos se adicionaron por la pared del tubo 2 ml de solucin
WS (Manitol 1 M, EDTA Na2 50 mM) y se sometieron a centrifugacin a 3000 rpm
y 4C por 5 minutos en la centrfuga de mesa Beckman). Esta operacin se
repiti hasta obtener el sobrenadante transparente. La pastilla obtenida en cada
tubo se resuspendi en 500 l de solucin WS que se colocaron en tubos de
polipropileno de 1.5 ml en hielo y se dejaron ah mientras se proceda a contarlos
mediante una cmara de Neubauer.
97
A
B
Figura 1. Panel A, micelio en PDB; B, protoplastos obtenidos con el protocolo descrito arriba.
9.2.2 Protocolo B para la obtencin de protoplastos
Con los protoplastos obtenidos en el protocolo descrito antes, no fue posible

obtener DNA del tamao deseado, tampoco se obtuvieron transformantes luego
de transformar los protoplastos con un vector diseado especialmente por
Rodrguez y Redman (1994) para transformar protoplastos de C. lindemuthianum.
De aqu surgi la inquietud de hacer una preparacin diferente de protoplastos,
pues los obtenidos por el mtodo descrito eran muy pocos y como se observa en
la fotografa, formaban estructuras intercelulares semejantes a vacuolas muy
grandes, lo cual posiblemente se deba a que el medio exterior no presentaba la
presin osmtica adecuada lo que produca la ruptura de los protoplastos durante
la tcnica de transformacin.
98
En este segundo protocolo, se parti de un inculo en medio M3S en cajas de
petri de 4.5 cm de dimetro. El medio se cubri con una capa de celofn dulce el
cual previamente se cort del tamao adecuado y se esteriliz. Cuando se
coloc el celofn sobre el medio M3S, ste se enrollaba, por lo que era necesario
adicionar unas gotas de agua desionizada estril para humedecer el celofn y
que esto permitiera su correcta colocacin. Una vez colocado el celofn, se
retiraron todas las burbujas de aire formadas entre ste y el medio slido.
Posteriormente se coloc un cubo de agar de 0.5 cm de lado con inculo de la
raza cero de C. lindemuthianum. Las cajas inoculadas de esta manera, se
incubaron a 22C por cinco das. Pasado este tiempo, las cajas se sacaron de la
incubadora y dentro de la campana de flujo laminar se abrieron por un periodo de
20-30 minutos, con la finalidad de evaporar toda el agua que tenan condensada
en la tapa de la caja y en la superficie del medio. Luego de esta evaporacin, las
cajas se cerraron y regresaron a la incubadora a la temperatura mencionada.
Despus de 5 das ms de incubacin, se observ una abundante esporulacin
en forma de una capa color salmn en la superficie del medio de cultivo. La
evaporacin del agua condensada provoc una falta de humedad para el hongo y
a su vez esto aceler la produccin de esporas, que era la materia prima de la
cual desebamos partir (Figura 2). Una vez presente esta capa de esporas en
todas las cajas, se utilizaron 15 ml de medio PDB para colectar las esporas de 25
cajas de petri, se adicionaban algunos mililitros de PDB a la superficie del medio
con esporas, usando una pipeta pasteur desechables estril, desalojando el
lquido con presin para desprender todas las esporas. Los 15 ml de PDB
utilizados para colectar las esporas de 25 cajas de petri de 4.5 cm de dimetro, se
pasaron a una caja de petri estril de 9 cm de dimetro. Los 15 ml de esporas
formaban una capa muy delgada de lquido sobre la caja de petri, la cual se
homogeniz para que tuviera el mismo volumen en toda la superficie de la caja.
La caja se dej a temperatura ambiente sobre una superficie horizontal durante
2.5 horas, luego de las cuales se tom una alcuota para observar al microscopio
el desarrollo de las esporas. En este momento, las esporas se observaban
puntiagudas de un extremo, lo que indicaba que comenzaba la formacin del tubo
99
germinativo (Figura 3). En este momento se aadieron a la caja petri 15 ml de
solucin enzimtica (0.2 g Driselase, 0.2 g lysing enzymes y 26 l de -
glucuronidasa en 20 ml de solucin OM., filtrada primero con papel filtro 3 MM y
posteriormente con filtro Millipore 0.45 con sistema de vaco). Las esporas as
tratadas se dejaron en incubacin a temperatura ambiente y agitacin vertical de
20 rpm durante toda la noche. Al da siguiente se observ la preparacin y en
caso de observar que la mayora de las conidias se transformaron en
protoplastos, se procedi a separarlos como se explic en el protocolo 2.1.
A evaporacin A
B
B
Figura 2. Esquematizacin del resultado de la evaporacin del agua condensada en las cajas
de petri. El crculo A representa la colonia de C. lindemuthianum en crecimiento que cambia
de micelio (izquierda) a conidias (derecha). El crculo B representa el medio M3S cubierto con
una hoja de celofn dulce.
Figura 3. Comienzo de germinacin en las conidias de C. lindemuthianum luego de 2.5 hr de

incubacin a temperatura ambiente en PDB. Las flechas sealan la punta donde comienza la
germinacin. Dentro del crculo se observa una conidia que aun no empieza a germinar.
100
9.3 Obtencin de DNA de alto peso molecular
Como se coment antes, uno de los propsitos de obtener protoplastos, fue el de

aislar DNA de alto peso molecular, para ello se probaron dos tcnicas que se
describen a continuacin.
a) Obtencin de DNA de alto peso molecular incluyendo los protoplastos en

bloques de agarosa.
A 500 l de la suspensin de protoplastos obtenidos mediante el protocolo A, se

aadieron 500 l de agarosa de bajo punto de fusin (agarosa 1.5%, EDTA 125
mM pH 8.0, sorbitol 0.5 M) recin fundida y a una temperatura mxima de 40C.
Con una punta cortada, se mezcla la suspensin e inmediatamente se vaca a los
moldes de plstico especiales para formar bloques de agarosa. Los moldes se
incubaron a 4C durante 10m minutos, luego de los cuales los bloques fueron
desmoldados y colocados en un tubo de polipropileno de 50 ml que contena el
volumen necesario para cubrirlos de solucin ESP (Proteinasa K 1 mg/ml, N-
Laurilsarcosina 1%, EDTA 0.5 M pH 8.0). El tubo de polipropileno conteniendo
los bloques se incub a 50C durante 48 horas. Pasado este tiempo, se decant
la solucin en la que estaban los bloques y se aadi al tubo un volumen
suficiente de EDTA 0.5 M pH 8.0. Se incub el tubo a 50 C por 30 minutos
luego de los cuales se decant la solucin. Esta operacin se repiti dos veces
ms. Los bloques conteniendo ahora solamente DNA se sometieron a
electroforesis de campos pulsados utilizando un gel de agarosa al 1%, el equipo
CHEF-DRIII. Las condiciones de electroforesis fueron 90 segundos de pulso
inicial y final, 6 Volts/cm, ngulo de 120, temperatura de 14C y 20 horas de
corrida. Se utiliz como buffer de corrida solucin amortiguadora TAE 1 X (0.04
M Tris-HCl, 0.04M Acetato de sodio, 0.001 M EDTA, pH 8.0). Una vez concluida
la electroforesis, el gel fue teido con una solucin de Bromuro de etidio (10
mg/ml) por 20 minutos y luego desteido por un tiempo similar. Posteriormente
101
se visualiz bajo luz ultravioleta y se fotografi. Como se muestra en la
fotografa, se obtuvo DNA de alto peso molecular y sin degradacin.
Figura 4. DNA de alto peso molecular obtenido

partiendo de bloques de agarosa conteniendo
protoplastos que se sometieron a electroforesis
de campos pulsados.
Una vez que se verificaron el tamao y la integridad del DNA obtenido, se procedi a
estandarizar el protocolo de preparacin de los fragmentos de DNA genmico para
ser ligados con el vector pBELOBAC pMSC1, cuyas caractersticas moleculares se
describirn en una seccin posterior. Para ligar con el vector pBELOBAC11e
requeran fragmentos de aproximadamente 350 Kb que se hubieran cortado con la
enzima Hind III. Era necesario establecer la cantidad de DNA, la cantidad de enzima
y el tiempo de incubacin requeridos para obtener los fragmentos del tamao
deseado. A este procedimiento llamaremos en adelante, restriccin parcial del DNA.
El DNA de alto peso molecular se obtuvo en bloques de agarosa de bajo punto de
fusin, como se describi anteriormente. Estos bloques se pasaron a un tubo de
polipropileno nuevo que contena 25 ml de TE (Tris 10 mM pH 8.0, EDTA 1 mM pH
8.0) y 1 mM de Parametilsulfxido (PMSF). El tubo se incub a 4C durante 2 horas.
Esta operacin se repiti una vez ms. Se decant la solucin del tubo de
polipropileno, se aadi ms TE y se incub a 4C por una hora ms. Pasado este
tiempo, cada bloque por separado se coloc en un tubo de polipropileno de 1.5 ml y
102
se le aadi TE en cantidad suficiente para cubrirlo por completo. El tubo de
polipropileno conteniendo el bloque se incub a 50C por 30 minutos, luego de los
cuales se decant el TE y se repiti la operacin. Se sac el bloque del tubo y se
cort en cuatro partes iguales utilizando una hoja de bistur nueva. Cada cuarta parte
de bloque se coloc en un tubo de polipropileno de 1.5 ml nuevo al cual se aadieron
75 l de buffer 10X para enzima Hind III, 4 l de espermidina 100 mM, 1 l de BSA
(10 mg/ml), 57 l de agua desionizada estril y 3 l de enzima Hind III.(1u/ l). Los
tubos de polipropileno conteniendo un cuarto de bloque y la solucin descrita se
incubaron a 4C por toda la noche. Al da siguiente los tubos se incubaron a 37C
por un tiempo diferente cada cinco tubos. Luego de la restriccin, la reaccin se
detuvo aadiendo 1 l de EDTA 0.5 M. Cada cuarto de bloque se coloc en un pozo
de un gel de agarosa al 0.8% y se corri una electroforesis de dos polos para revisar
si hubo restriccin de qu tamao eran los fragmentos obtenidos. En caso necesario
se aument o disminuy la cantidad de enzima. En base a estos experimentos se
tuvo que adicionar ms cantidad de enzima, por lo que se utiliz enzima ms
concentrada y se baj a 2 l la cantidad de enzima concentrada utilizada. Una vez
estandarizadas las condiciones de restriccin, se procedi a someter a restriccin a
un gran nmero de bloques, con la finalidad de obtener una gran cantidad de DNA
cortado con la enzima adecuada. Con un cuarto de bloque se verific que la
restriccin haya sido adecuada mediante un gel de agarosa puesto a electroforesis
de dos electrodos. Posteriormente se prepar un gel de agarosa de bajo punto de
fusin con un pozo central muy grande (ocho pozos juntos). En este pozo central
grande se colocaron todos los cuartos de bloque sometidos a restriccin. El gel se
someti a electroforesis de campos pulsados bajo las condiciones de electroforesis
de 10 segundos de pulso inicial y final, 6 Volts/cm, ngulo de 120, 14C y 13 horas
de corrida. Al da siguiente el gel se sac de la cmara de electroforesis, se cort
una parte del carril grande la cual se ti con bromuro de etidio y se localiz la parte
del gel en donde se localizaban los fragmentos del tamao de inters. El fragmento
teido se coloc junto con el fragmento no teido sobre el transiluminador de luz UV
y se cort con una hoja de bistur la parte del gel no teido en donde se encontraban
los fragmentos de DNA que tenan el tamao adecuado. Como marcadores de peso
103
molecular se utilizaron fragmentos de agarosa conteniendo cromosomas de
levaduras y otros marcadores especiales para electroforesis de campos pulsados
(Figura 5).
+ E tB r
Figura 5. Esquema que muestra la forma en que se cortaron del gel los fragmentos del tamao
deseado. El rombo gris indica los lugares en los que se realiz un corte con la navaja de bistur. Las
bandas de color rosa muestran DNA visto a travs de un transiluminador de luz UV (rectngulo
violeta). Los rectngulos azules representan el gel de agarosa.
Luego de cortar el fragmento de gel que contena el DNA de inters, se cort a su

vez en fragmentos ms pequeos que se colocaron dentro de tubos de polipropileno
de 1.5 ml. Estos tubos se trataron con gelasa o con -agarasa como se describe a
continuacin.
Tratamiento con gelasa: a cada tubo de polipropileno conteniendo un fragmento de

gel de agarosa se le aadieron 150 l de buffer de gelasa 1X, se incub a
temperatura ambiente por una hora. El buffer se decant y el tubo se coloc a 70C
por tres minutos o hasta que se fundiera el gel. El tubo se pas a 45C donde se
mantuvo por dos minutos, se aadieron 0.5 l de gelasa y se incub a esa
temperatura durante una hora. Despus de este tiempo se tom una alcuota de 0.5
l de la solucin obtenida y se someti a electroforesis de con dos electrodos en un
gel de agarosa al 0.5%.
104
Tratamiento con -agarasa: los tubos conteniendo gel de agarosa se incubaron a
65C por 10 minutos. Una vez fundido el gel, se calcul el volumen y se aadi la
dcima parte de buffer de agarasa 10X. La mezcla se incub a 40C por 15minutos
y se aadieron 3 l de la enzima. Los tubos se incubaron a esta temperatura durante
una hora, luego de la cual se tom una alcuota y se someti a electroforesis como
en el apartado anterior.
b) Obtencin de DNA de alto peso molecular colocando los protoplastos en un

gradiente de sacarosa.
Otra tcnica que se prob para la obtencin de DNA de alto peso molecular, fue la de
colocar un volumen de la suspensin de protoplastos mezclados con un volumen de
solucin de lisis (Tris-HCl 100 mM, pH 7.5; NaCl 100 mM; EDTA 10 mM y Laurel-
sarcosina al 2%), sobre un gradiente de sacarosa. El gradiente se prepar como lo
reportaron Guzmn y Ecker (1987) con sacarosa al 50, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, y
15% en una solucin de 1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA y 0.3% lauril-
sarcosina. En un tubo para Ultracentrfuga SW28, se colocaron 5 ml de la solucin al
50%. Enseguida se colocaron 5 ml de la solucin que sigue en menor concentracin
(40%) con mucho cuidado, colocando la solucin por la pared del tubo, sin que
caigan gotas que golpeen la solucin y sin hacer burbujas. Se contino de la misma
forma hasta colocar la solucin menos concentrada. Sobre esta se coloc la
suspensin de protoplastos lisados, con la que adems se equilibraron los tubos.
Los tubos se centrifugaron en una ultracentrfuga Beckman a una temperatura de
16C, a una velocidad de 26,000 rpm en el rotor SW28 en experimentos que llevaron
5 horas de centrifugacin hasta un mximo de 20 horas. Pasado este tiempo, se
retiraron los tubos con mucho cuidado, se elimin la primera mitad de la solucin
contenida en cada tubo, utilizando para ello una pipeta de 5 ml, tratando de no
producir turbulencias dentro de la solucin que quedaba. A partir de la mitad del
volumen del tubo de centrfuga, se tomaron alcuotas de 500 l que se colocaron en
tubos de polipropileno de 1.5 ml. En el fondo del tubo se obtuvo una pastilla
gelatinosa, color marrn, que se disolvi en el menor volumen posible de agua
105
desionizada (200 l) y tambin se pas a un tubo. Se tomaron 2 l de cada alcuota
y se colocaron en un pozo de un gel de agarosa al 0.5% para visualizar la cantidad y
tamao del DNA obtenido (Figura 6).
Figura 6. Gel de agarosa al 1% sometido a electroforesis para

observar el tamao del DNA obtenido luego de las restricciones
parciales.
9.4 Preparacin de los vectores de clonacin y transformacin
Los vectores utilizados para la construccin del banco genmico y la

transformacin fueron pBELOBAC11, pMSC1 y pANCOS. El vector
pBELOBAC11 de 7.4 Kb contena un sitio de clonacin mltiple dentro del gen
LacZ, por lo que se realiz la seleccin de transformantes utilizando IPTG y XGal
(Sambrook y col., 2001). El sitio de clonacin era factible de cortar con las
enzimas de restriccin BamHI, SpHI y Hind III tena adems el gen de resistencia
a Cloramfenicol para la seleccin de transformantes. El vector es de bajo nmero
de copias y para obtener DNA de l fue necesario transformar clulas de E. coli
de la cepa DH10B y seguir un protocolo de extraccin de DNA de plsmido de
bajo nmero de copias. Se sigui el protocolo propuesto por el proveedor de las
columnas Qiagen para la purificacin de plsmidos y durante varias veces en las
que se sigui el protocolo, no hubo problema alguno. Sin embargo, luego de
varias transformaciones, el vector ya no pudo ser cortado con BamHI o Hind III.
Como primera instancia no hubo una explicacin para tal cambio, sin embargo,
tiempo despus en una reunin de especialistas que trabajaban con l, los
investigadores comunicaron que el genoma de este vector contena sitios
106
calientes para la transposicin. Posiblemente esta sea una explicacin para que
se perdiera el sitio de corte para las enzimas mencionadas.
Posteriormente se utiliz el vector pMSC1, un csmido que acepta fragmentos de

40Kb, contiene una secuencia telomrica la cual segn reportaron Rodrguez y
Redman (1994) es til para que el vector no se integre al genoma del hongo y
permanezca replicndose como plsmido. Adems segn los autores, posee una
eficiencia de transformacin mayor a la reportada para otros vectores en especies
de Colletotrichum (1000-5000 transformantes por microgramo de DNA). Se
ligaron a l los fragmentos de DNA obtenidos luego de las restricciones parciales
por gradiente de sacarosa, sin embargo, cuando se someti a restriccin el DNA
de las bacterias transformadas, no se encontr una banda que correspondiera
con el tamao del vector. Por otra parte, se prob la transformacin de
protoplastos con el vector solo (sin inserto), en forma circular y lineal, siguiendo el
protocolo descrito por Rodrguez y Redman (1994). Se lograron obtener
transformantes del hongo solamente cuando se transformaron protoplastos con el
vector lineal, las transformantes crecieron en medio con higromicina despus de
varias generaciones.
Finalmente se prob el vector pANCOS amablemente donado por el Dr. Alfredo

Herrera el cual se haba probado para transformarse en otros hongos pero no en
hongos pertenecientes al gnero Colletotrichum. El vector se cort, defosforil y
lig con los fragmentos de DNA de C. lindemuthianum obtenidos luego de
restricciones parciales. Con las ligaciones se transformaron clonas de E. coli
DH10B. Se obtuvieron en promedio 40-45 transformantes por evento de
transformacin. Se tomaron algunas bacterias transformantes las cuales se
cortaron para liberar el inserto clonado. Se encontraron fragmentos desde 9
hasta 33 kb. El vector se prob para la transformacin de protoplastos de la raza
1472 por el mtodo de Cloruro de Calcio-PEG. Se obtuvieron algunas
transformantes, que fueron estables en medio con higromicina las cuales se
107
muestran en la Figura 7. Debido a que no se obtuvieron fragmentos del tamao
esperado, este procedimiento no se continu.
Figura 7. Transformantes obtenidas luego de la

transformacin de protoplastos de la raza 1472
de C. lindemuthianum con el vector pANCOS.
9.5 Bioensayos en hipocotilos
Como se explic antes, el proyecto inicial propona la transformacin de protoplatos

de la raza 1472 de Colletotrichum lindemuthianum con las clonas del banco
genmico construido con DNA de la raza cero, con el fin de encontrar en la raza
1472 una diferencia en patogenicidad en cuanto a las variedades diferenciales que la
raza 1472 infecta de forma natural. Se plante la estrategia de inocular hipocotilos
de las cuatro variedades que normalmente infecta la raza 1472 (Mxico, To, Pi y
AB136) con grupos de transformantes (10 transformantes diferentes por inculo).
Para poder usar esta estrategia, deberamos asegurarnos de que se poda identificar
una transformante patgena entre un nmero mayor de transformantes no
patgenas. Para esto se mezclaron una determinada cantidad de conidias
patgenas con una cantidad 9 veces mayor de conidias no patgenas sobre
hipocotilos de las variedades diferenciales de frijol descritas. En todos los casos se
logr identificar a las conidias patgenas debido a la reaccin de hipersensibilidad
que desarrollaron aun estando mezcladas con una cantidad mayor de conidias no
patgenas.
108
9.6 Produccin de apresorios
Como proyecto alternativo se plante el anlisis de factores de patogenicidad que se

expresaran de forma exclusiva cuando las clulas de Colletotrichum lindemuthianum
comenzaran a formar apresorios. En la literatura existen diferentes referencias en
las que se producen apresorios de varias especies de hongos. Uno de estos
protocolos establece que un medio adecuado para inducir la formacin de apresorios
es el medio LVLE (100 g de hojas primarias frescas de frijol se congelaron y se
descongelaron en un litro de agua hirviendo. La solucin se enfri, se filtr con
ayuda de un papel filtro y se esteriliz a 121C y 15 lb/in2 por 20 minutos. Esta
solucin se centrifug por 10 minutos a 3000 rpm antes de usarlo. En 10 ml de este
medio se inocularon 106 conidias de C. lindemuthianum (Parisot, 2002). Se prob
este protocolo para la induccin en la formacin de apresorios, se coloc el inculo y
el medio en cajas de petri de plstico o de vidrio, de diferentes dimetros y se
observ al microscopio una alcuota cada 30 minutos durante 48 horas y cada hora
por 48 horas adicionales. Se cambi la concentracin del inculo utilizando menor y
tambin mayor cantidad de conidias por unidad de volumen. Se utilizaron hojas de
seis variedades diferentes de frijol: las cuatro ya mencionadas para las cuales es
patgena la raza 1472 mas las variedades Flor de Mayo Bajo y Victoria, las cuales
son susceptibles a un gran nmero de razas de C. lindemuthianum. En ninguno de
los casos se observ la formacin de apresorios. Luego se probaron otros medios
como PDB y agua destilada estril enlas condiciones ya descritas para el medio
LVLE. Solamente se obtuvo la formacin de apresorios utilizando agua para hacer la
dilucin del inculo y cajas de petri de plstico de 20 cm de dimetro. En estas
condiciones se inocularon un gran nmero de cajas para obtener un gran nmero de
clulas de las cuales extraer RNA y posteriormente someterla a la tcnica de cDNA-
AFLPs. Sin embargo, las condiciones para la formacin de apresorios no fueron
repetibles y se obtuvieron muy pocas clulas luego de inocular 100 cajas de petri. El
volumen ptimo de inoculacin fue de 30 ml de agua conteniendo 5 x 10 6 conidias,
incubadas a temperatura ambiente por 48 horas.
109
A B
C D
Figura 8. Conidias de C. lindemuthianum formando apresorios. A, conidias inoculadas en medio

6
LVLE estril, utilizando 30 ml de un inculo de 5 x 10 conidias/ml luego de 48 horas de incubacin a
temperatura ambiente sin agitacin. B, iguales condiciones que en A, pero con mayor aumento en el
microscopio. C y D Mismas condiciones que en A y B pero utilizando agua destilada estril en la
dilucin del inculo. En los cuadros C y D se observan la ausencia de conidias sin apresorio.
110
9.7 Conclusiones
Se optimiz la tcnica para la obtencin de protoplastos de los cuales se

obtuvo DNA de alto peso molecular y fueron factibles de transformacin por el
mtodo de Cloruro de calcio-Polietilenglicol.
Se obtuvo DNA de alto peso molecular a partir de protoplastos. Este DNA
pudo cortarse con enzimas de restriccin y ligarse a un vector de clonacin.
Tanto el DNA de alto peso molecular como las restricciones parciales fueron
rescatados tanto por medio de geles de agarosa y posterior tratamiento con
agarasa, como por medio de gradientes de sacarosa.
Se obtuvieron clonas de E. coli que contenan fragmentos de DNA de C.
lindemuthianum en tamaos que oscilaban entre las 9 y las 30 kb.
Se realizaron mezclas de conidias patgenas/no patgenas y se inocularon
sobre hipocotilos de diferentes variedades de frijol, encontrando que es
posible distinguir la reaccin de hipersensibilidad en una relacin 1:9 de
conidias patgenas:no patgenas.
Fue posible encontrar las condiciones adecuadas de concentracin, volumen y
temperatura necesarias para que las conidias de C. lindemuthianum formaran
apresorios in vitro.
111
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119
11. ANEXOS
ANEXO 1
Artculo Publicado en Mycologia
120
ANEXO 2
Artculo Publicado en Mycoscience
121
Mycologia, 97(4), 2005, pp. 793803.
q 2005 by The Mycological Society of America, Lawrence, KS 66044-8897
Heterothallic mating observed between Mexican isolates of

Glomerella lindemuthiana
Raul Rodrguez-Guerra cia. From this fertile combination 168 individual as-
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, cospore cultures were isolated, including five from a
Agrcolas y Pecuarias. (INIFAP), Campo Experimental single ascus. Forty-four monoascospore cultures were
del Bajo, Celaya, Guanajuato, Mexico characterized with AFLP, confirming that these indi-
Mara-Teresa Ramrez-Rueda viduals were progeny from a sexual cross between the
Department of Plant Genetic Engineering, original two G. lindemuthiana isolates and that sexual
CINVESTAV, Unidad Irapuato, Apdo. Postal 629, reproduction in G. lindemuthiana is heterothallic in
C.P. 36500, Irapuato, Guanajuato, Mexico nature. Analysis of the parental strains with degen-
erate PCR primers indicated that sequences homol-
Mariandrea Cabral-Enciso
ogous to the HMG box of the MAT1-2 idiomorph are
Unidad Academica de Agronoma, Universidad
Autonoma de Zacatecas, Zacatecas, Mexico present in both parental isolates. This supports pre-
vious observations in other Glomerella species where
Monica Garca-Serrano the standard ascomycete configuration of distinct idi-
Department of Genetic Engineering, CINVESTAV, omorphs at the MAT locus does not hold true. The
Unidad Irapuato, Apdo. Postal 629, C.P. 36500, significance of these results is discussed.
Irapuato, Guanajuato, Mexico
Key words: AFLP, Ascomycete, Colletotrichum lin-
Zoraida Lira-Maldonado demuthianum, HMG, MAT1-2
Ramon Gerardo Guevara-Gonzalez
Instituto Tecnologico de Celaya, Deptamento de
Bioqumica, Avenida Tecnologico Esquina con Garca
INTRODUCTION
Cubas, Sin Numero, Celaya, Guanajuato, Mexico
Mario Gonzalez-Chavira Glomerella lindemuthiana (anamorph, Colletotrichum

lindemuthianum), which causes anthracnose on com-
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales,
Agrcolas y Pecuarias. (INIFAP), Campo Experimental mon bean (Phaseolus vulgaris) and a few other Phas-
del Bajo, Celaya, Guanajuato, Mexico eolus species, is an important pathogen in almost all
bean-growing regions of the world. This pathogen
June Simpson1 has been proposed as a model organism for the anal-
Department of Plant Genetic Engineering, ysis of plant-pathogen interactions because it is hem-
CINVESTAV, Unidad Irapuato, Apdo. Postal 629,
C.P. 36500, Irapuato, Guanajuato, Mexico ibiotrophic and has been used to study many aspects
of plant-pathogen interactions such as phytoalexin
production, cell-wall degrading enzymes and infec-
Abstract: Although several reports have described tion processes (Perfect et al 1999). Diversity of G.
the occurrence of the teleomorphic state of Glomer- lindemuthiana based on molecular markers and path-
ella lindemuthiana (anamorph, Colletotrichum linde- otypes also has been studied to some extent (Fabre
muthianum), there has been a lack of continuity in et al 1995, Balardin et al 1997, Sicard et al 1997, Gon-
this research. To identify G. lindemuthiana isolates zalez et al 1998, Gonzalez 1999). However, although
capable of developing the teleomorphic state, 19 G. lindemuthiana meets most of the criteria for a
Mexican isolates were analyzed. Three types of re- model organism (culturability, transformability, short
sponse were observed: (i) negative, where only my- life cycle, simple inoculation procedure etc.), it lacks
celial growth with or without acervuli was observed; a well characterized sexual reproduction cycle.
(ii) potential, where in addition to the above, spher- This means that the role which sexual reproduc-
ical perithecia-like structures were observed; (iii) pos- tion plays in diversity and the production of new
itive, where perithecia containing asci and ascospores pathotypes cannot be assessed and other interesting
were observed. All strains were self-sterile and only phenomena such as genome organization, the ge-
one combination of strains produced fertile perithe- netic basis of pathogenicity, mating type and vegeta-
tive compatibility, cannot be directly addressed. The
Accepted for publication 19 May 2005. development of classical genetic analysis based on the
1 Corresponding author. E-mail: jsimpson@ira.cinvestav.mx segregating population of a sexual cross would open
793
794 MYCOLOGIA
the possibility of genetic mapping and the cloning crosses between distinct G. lindemuthiana isolates
and characterization of genes of interest as has been while avoiding the inconsistencies associated with the
done for other pathogenic fungi (Xu and Leslie analysis of morphological characteristics.
1996, Pongam et al 1998, Zhong et al 2002). Our objective was to identify sexually compatible
Although the occurrence of a sexual cycle in G. G. lindemuthiana isolates from a collection of Mexi-
lindemuthiana in laboratory cultures was described can isolates, demonstrate with AFLP markers that
first in 1913 (Shear and Wood 1913), investigation in progeny obtained from single ascospore cultures
this field has advanced sporadically since then and were the product of a heterothallic mating between
many aspects of the mechanism of sexual reproduc- two unrelated isolates and characterize the mating-
tion in this fungus remain unclear. types of the parental isolates using degenerate oli-
The genus Glomerella is unusual because some in- gonucleotide primers designed to amplify the HMG
dividual species such as Glomerella cingulata and motif of the MAT1-2 idiomorph of pyrenomycetes
Glomerella graminicola are both heterothallic and ho- (Arie et al 1997).
mothallic (Wheeler 1956, Vaillancourt and Hanau
1991), whereas G. musae has been reported as het-
MATERIALS AND METHODS
erothallic (Rodrguez and Owen 1992). G. lindemu-
thiana was described first as homothallic (Shear and Growth and maintenance of isolates.Nineteen Mexican iso-
Wood 1913) although later studies (Batista and Chav- lates of G. lindemuthiana were evaluated for their ability to
es 1982, Br yson 1990) reported heterothallism. develop perithecia and complete a sexual cycle. Sixteen iso-
These studies reported that fertile perithecia were lates (116, TABLE I) had been characterized in terms of
pathotype and genotype (Gonzalez 1999, Gonzalez et al
produced only when two distinct isolates were
1998) and three new isolates (1719, TABLE I) also were
crossed and identified recombinant phenotypes in included.
the segregating populations; however, only a small Isolates were maintained on acidified potato-dextrose
number of genetic markers and relatively small seg- agar (PDA) (200 mL of 85% lactic acid/liter of PDA) at
regating populations were analyzed in these studies. room temperature. Abundant sporulation of the isolates
The genetic basis of sexual compatibility in Glom- was induced on cornmeal agar, (20 g of MASECA-brand
erella also is unclear because fertile interactions are maize flour, 2 g glucose, 1 g yeast extract, 18 g agar/L) at
not consistent with the single locus/two idiomorph 22 C. Tests for sexual compatibility were carried out on KG
system described for other ascomycetes where the medium, (Kimati and Galli 1970) (8 g glucose, 0.6 g
mating types are distinguished by a single locus con- Ca(NO3)0.4H2O, 1 g KH2PO4, 0.5 g MgSO40.7H2O, 20 g
taining different genetic information (MAT1-1 and agar/L, pH 5) at 20 C.
MAT1-2 idiomorphs, Turgeon and Yoder 2000) in Pathogenicity tests.The pathotypes of the three new iso-
each parent (Kronstad and Staben 1997). The mat- lates, MU 01, MU 02 and MU 03, were determined and the
ing types of the parental strains of diverse ascomy- pathotype of the parental strain DGO 02 also was confirmed
cetes such as Neurospora, Podospora and Magnaporthe in this work with a set of 12 P. vulgaris differential cultivars
often can be determined by the presence or absence (Michelite, Michigan Dark Red Kidney, Perry Marrow, Cor-
of the MAT1-2 idiomorph. However in the genus nell 49242, Widusa, Kaboon, Mexico 222, PI 207262, To,
Tu, AB 136, G2333) and binary nomenclature as described
Glomerella it has been suggested that a single locus
by Pastor-Corrales (1991). In addition cultivars La Victoire
with multiple alleles controls mating in G. cingulata and Flor de Mayo Bajo also were inoculated. Pathotypes of
(Cisar and te Beest 1999), whereas two unlinked loci all other isolates had been determined by Gonzalez et al
control mating in G. graminicola (Vaillancourt et al (1998).
2000). Isolates were grown on cornmeal agar as above at 22 C
All previous reports agree that sexual reproduction to induce abundant sporulation. Spores were harvested and
in G. lindemuthiana is rare and occurs only between a suspension of 1.5 3 106 conidia/mL was produced. Two
a few compatible isolates that produce a few fertile drops of Tween 20 were added to each 100 mL of the co-
perithecia containing asci and ascospores. No reports nidial suspension. Four plants of each of the 12 differential
exist of the occurrence of sexual reproduction in G. cultivars were inoculated 10 d after emergence by spraying
lindemuthiana under field conditions. the conidial suspension on the underside of the primary
leaves. The experiment was repeated at least twice (at least
Phenotypic characteristics, pathotypes or muta-
eight plants of each cultivar were analyzed for each isolate).
tions previously were used to study the progeny of Inoculated plants were incubated at around 95% humidity,
genetic crosses and, although Bryson employed RFLP 22 C and a photoperiod of 12 h light/dark for 3 d and
molecular markers, her results were inconclusive thereafter under conditions of normal humidity with the
(Bryson 1990). With the development of simple mul- same temperature and photoperiod. Ten d after inocula-
tilocus markers such as AFLPs it should be possible tion, symptoms were evaluated with a five-point scale (Gar-
to efficiently study the progeny of putative sexual rido-Ramirez and Romero-Cova 1989). Reactions were clas-
RODRGUEZ-GUERRA ET AL: HETEROTHALLISM IN G. LINDEMUTHIANA 795
TABLE I. Mexican isolates tested for sexual compatibility
Isolate Isolate Isolate Isolate

number1 origin2 Pathotype3 number1 origin2 Pathotype3
1 CHI 01 448 11 JAL 01 0
2 CHI 03 448 12 JAL 06 384
3 CHI 19 448 13 JAL 19 392
4 DGO 02 1088 14 MICH 01 392
5 DGO 05 448 15 MICH 04 264
6 DGO 07 256 16 MEX 05 292
7 ZAC 02 320 17 MU 01 2
8 ZAC 04 1472 18 MU 02 9
9 ZAC 08 448 19 MU 03 1280
10 ZAC 10 256
1
Isolates 115 from Gonzalez et al, 1998. Isolate 16 from Gonzalez 1998. Isolates 1719 donated by Dr. James Kelly, Michigan
State University.
2
CHI 5 Chihuahua; DGO 5 Durango, ZAC 5 Zacatecas, JAL 5 Jalisco, MICH 5 Michoacan, MEX 5 Mexico, MU 5
Mexican isolate but location unknown.
3 Pathotypes were determined using the set of differential P. vulgaris cultivars reported by Pastor-Corrales, (1991) as de-
scribed in MATERIALS AND METHODS.
sified as: 0, no visible symptoms; 1, small lesions on major Monoascospore cultures were preserved at 4 C in acidified
veins visible only on the underside of the leaf; 2, lesions PDA overlaid with mineral oil.
visible on both the top and underside of the leaf; 3, defo-
AFLP analysis of monoascospore cultures and parental
liation of plant and sporulation of fungus; 4, plant death.
strains.DNA was obtained from monoascospore cultures
Reactions classified as 02 were considered resistant where-
and parental strains and subjected to AFLP analysis as de-
as 3 and 4 were considered susceptible.
scribed by Gonzalez et al (1998). Oligonucleotide primers
Tests for sexual compatibility.Disks of Whatman No. 1 filter used for the pre-amplification step were:
paper were placed on Petri dishes containing solidified KG
EcoRI (EcoRI1A) 59-AGACTGCGTACCAATTC/A-39,
medium. Isolates were tested for the ability to undergo sex-
MseI (MseI1A) 59-GACGATGAGTCCTGAGTAA/A-39
ual reproduction by themselves and in pairs, 100 mL of a
104 conidia/mL suspension of each isolate were inoculated The pre-amplification step was followed by a second se-
at the same spot on the center of the filter paper. Petri lective amplification step with two selective nucleotides. An
dishes were incubated in the dark (an essential requirement extra T residue was added to the EcoRI primer whereas a
for development of reproductive structures in this fungus; C residue was added to the Mse I primer. Segregation of
Kimati and Galli 1970, Bryson 1990) for 6 wk at 20 C. The polymorphic bands was analyzed with the Chi2 test.
presence of structures indicating the occurrence of sexual
Characterization of mating types of parental strains.Degen-
reproduction was evaluated by observation of the cultures
erate oligonucleotide primers (NcHMG1 [59-CCYCGYCCY
under a Carl Zeiss stereoscopic microscope.
CCYAAYGCNTAYAT-39] and NcHMG2 [59-
Isolation of monoascospore cultures.Individual perithecia or CGNGGRTTRTARCGRTARTNRGG-39]), designed to am-
masses of spherical structures with rigid walls were isolated plify the HMG motif of the MATa idiomorph of Neurospora
from the Petri dishes, suspended in sterile water and placed crassa and other pyrenomycetes (Arie et al 1997), were used
on a microscope slide where they were broken open care- to determine whether sequences homologous to the HMG
fully with a cover slip under a stereoscopic microscope. Wa- motif were present in the G. lindemuthiana parental strains
ter containing ascospores liberated from these structures DGO 02 and MU 03. The PCR reactions were carried out
was transferred to acidified PDA medium and carefully dis- as described in Arie et al (1997), and the products were
persed with a glass rod to separate individual ascospores. viewed under UV light after electrophoresis in a 2% agarose
After 2448 h germinated ascospores were identified under gel. DNA from N. crassa MATa (MAT1-2) and MATA
a light microscope and transferred to fresh acidified PDA (MAT1-1) strains was used as control.
with an entomological needle on the end of a dissecting Amplified fragments for DGO 02 and N. crassa MATa
needle. In the case of the isolation of ascospores from in- strains were cloned into the vector pCR 2.1 TOPO (Invitro-
dividual asci, the asci first were isolated under a light mi- gen, California.) following the manufacturers instructions
croscope with a fine hair attached to a dissecting needle and sequenced on an ABI 3700 sequencer. Based on the
and transferred to acidified PDA medium. Using the same sequence obtained for DGO 02, specific primers were de-
hair the ascospores were gently liberated from the asci and signed (indicated in bold in FIG. 4) and used to amplify the
distributed over the PDA medium. Germinated ascospores MAT1-2 region in DGO 02, MU 03 and the N. crassa MATa
were transferred to fresh acidified PDA medium as above. strain. The amplified fragments were sequenced as de-
796 MYCOLOGIA
scribed above and compared to the G. graminicola HMG perithecia were observed (FIG. 1A); class iii, positive,
box sequence (AF204961), obtained from Vaillancourt et al perithecia, asci and ascospores were observed (FIG.
(2000) and the G. cingulata sequence accessed as AY357890 1B, C). In class iii interactions the majority of struc-
from GenBank. DNA and protein sequence analysis was car-
tures observed were class ii or protoperithecia with
ried out with NCBI BLAST and the DNAstar/Clustal W ed-
iting and alignment programs.
the sporadic occurrence of mature perithecia (TABLE
II). In all classes both the presence or absence of
acervuli were observed in at least one of the replicate
RESULTS experiments.
Identification of fertile strains.To identify G. linde- All isolates grown individually were found to be
muthiana isolates capable of undergoing the teleo- negative or class i suggesting self-sterility. More than
morphic stage of development, the 19 chosen isolates 80% of the pairwise interactions between different
(TABLE I) were crossed in all possible pairwise com- isolates were also negative. Eight pairwise combina-
binations as described in Materials and Methods or tions (CHI 03 vs. ZAC 02, CHI 19 vs. ZAC 04, CHI
were grown individually under the same conditions. 19 vs. MU 03, DGO 02 vs. JAL 01, ZAC 02 vs. ZAC
In total 190 distinct crosses were tested and all com- 10, ZAC 04 vs. MU 03, JAL 01 vs. MU 03, MU 02 vs.
binations were duplicated. From these experiments MU 03) showed class ii interactions and a single com-
three main classes of interaction were determined: bination (DGO 02 vs. MU 03) was identified as pos-
class i, negative, no perithecia-like structures were ob- itive or class iii (TABLE II). In the first experiment
served; class ii, potential, isolated or clumped spher- combining isolates DGO 02 vs. MU 03, involving two
ical structures with a rigid wall, denominated proto- replicates a large number of protoperithecia were ob-
FIG. 1. Development of sexual structures ater the interaction of isolates DGO 02 and MU 03. A. Spherical protoperithecia.
B. A mature beak-shaped perithecia. C. A group of asci. D. An individual ascus containing ascospores. Bar: A 5 500 mm,
B 5 250 mm, C and D 5 20 mm.
TABLE II. Sexual compatibility of Glomerella lindemuthiana isolates from Mexico
CHI CHI CHI DGO DGO DGO ZAC ZAC ZAC ZAC JAL JAL JAL MICH MICH MEX MU MU MU
Isolate 01 03 19 02 05 07 02 04 08 10 01 06 19 01 04 05 01 02 03
CHI 01 21
CHI 03 2 2
CHI 19 2 2 2
RODRGUEZ-GUERRA
DGO 02 2 2 2 2
DGO 05 2 2 2 2 2
ET AL:
DGO 07 2 2 2 2 2 2
ZAC 02 2 * 2 2 2 2 2
ZAC 04 2 2 * 2 2 2 2 2
ZAC 08 2 2 2 2 2 2 2 2 2
ZAC 10 2 2 2 2 2 2 * 2 2 2
JAL 01 2 2 2 * 2 2 2 2 2 2
JAL 06 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
JAL 19 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
HETEROTHALLISM
MICH 01 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
IN
MICH 04 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
G.
MEX 05 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
MU01 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
MU02 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
MU03 2 2 * 1 2 2 2 * 2 2 * 2 2 2 2 2 * 2 2
1 (2) 5 Negative: Mycelial growth with or without production of acervuli; (*) 5 Potential: Protoperithecia present, with or without acervuli; (1) 5 Positive: Perithecia
and protoperithecia present with acervuli.

LINDEMUTHIANA
797
798 MYCOLOGIA
served but only one perithecium containing asci and dication that sequences homologous to the MAT1-2,
ascospores. On repetition of this combination with a HMG motif are present in both the G. lindemuthiana
greater number of replicates, again many protoperi- parental strains but as expected only in the N. crassa
thecia were observed but it also was possible to detect MATa strain.
up to six perithecia producing ascospores per Petri To confirm that the amplified fragments were ho-
dish. mologous to the MAT1-2 HMG motif, DGO 02 and
N. crassa MATa (MAT1-2) fragments were cloned
Analysis of progeny.From this fertile combination
into vector PCR2.1 TOPO and sequenced as de-
168 monoascospore cultures were obtained. Attempts
scribed above. BLAST analysis indicated that the
to isolate and analyze the eight ascospores from a
DGO 02 (FIG. 4) and MATa sequences showed strong
single ascus were unsuccessful due to the different
homology to other fungal MAT1-2 sequences in the
stages of development of the spores and difficulty in
database.
separation of individual asci (FIG. 1D). In the few
Oligonucleotide primers specific for the DGO 02
cases where this was possible, not all eight ascospores
sequence (FIG. 4) were designed and used to amplify
germinated on PDA. A maximum of five ascospores
genomic DNA from the DGO 02, MU 03 and N. cras-
were isolated from a single ascus.
sa MATa and MATA strains as described above. These
Visible analysis of a selection of 16 monoascospore
specific primers produced fragments of around 200
cultures of the progeny from the interaction between
bp in the DGO 02 and MU 03 strains but no ampli-
DGO 02 and MU 03 showed a wide variation in mor-
fied fragments were obtained from either N. crassa
phology including speed of sporulation and the pro-
strain (data not shown) indicating that these primers
duction of melanized mycelia (data not shown).
are specific for G. lindemuthiana. The amplified frag-
DGO 02 and MU 03 also were used as tester strains
ments obtained for strains DGO 02 and MU 03 using
in crosses with an additional seven isolates to identify
the specific primers were sequenced and found to be
other strains capable of completing a sexual repro-
identical.
ductive cycle. These experiments were carried out as
Comparison of the MAT1-2 sequence from DG0
described in Materials and Methods, and a new com-
02/MU 03 at both the DNA and protein level showed
bination capable of producing fertile perithecia, asci
a high level of similarity to MAT1-2 sequences from
and ascospores (MU 03 and JAL 05) was identified
related Glomerella species (G. graminicola accession
(data not shown).
numbers AF204960, AF204961 and Glomerella cingu-
AFLP patterns for the parental strains DGO 02 and
lata accession number AY357890) (FIG. 4) but a lower
MU 05 and 44 progeny obtained from monoasco-
level of similarity to the MATa sequence of N. crassa
spore cultures, including the five monoascospore cul-
(data not shown).
tures obtained from a single ascus were determined.
The G. lindemuthiana MAT1-2 sequences reported
Eighty-one AFLP bands ranging in size from 50 to
here (FIG. 4) have been deposited in GenBank and
700 bps were identified in the parental isolates and
assigned the accession numbers AY724682 (DGO 02)
of these 23 (28.4%) were polymorphic between the
and AY724683 (MU 03).
parents. All progeny samples showed molecular fin-
gerprints distinct to the parental patterns but com- Determination of pathotypes.Pathotypes of the paren-
posed of bands from each of the parents as would be tal isolates were determined with a set of 12 differ-
expected in a sexually segregating population (FIG. ential cultivars as described in Materials and Meth-
2). Two pairs of isolates showed identical fingerprints ods. Isolate DGO 02 was characterized as pathotype
including one pair from the samples obtained from 1088, infecting cultivars Mexico 222 and AB136,
a single ascus. This would be expected due to the whereas isolate MU 03 was characterized as pathotype
formation of twins by mitotic division of the hap- 1280, which infects cultivars To and AB136 (TABLE
loid cells following meiosis. Statistical analysis of the I). MU 01 and MU 02 were identified respectively as
segregation of the AFLP markers by the x2 test sup- pathotypes 2 and 9. In addition cultivars La Victoire
ported a ratio of 1:1 (TABLE III) in agreement with and Flor de Mayo Bajo were inoculated with both
the segregation of haploid individuals following sex- isolates and found to be susceptible (data not
ual recombination and meiosis. shown).
Detection of MAT1-2 idiomorph.Amplification reac-
tions using the degenerate oligonucleotides Nc- DISCUSSION
HMG1 and NcHMG2 produced a fragment of
around 300 bp for both the G. lindemuthiana paren- Only nine pairwise combinations from a total of 190
tal strains DGO 02 and MU 03 and for the N. crassa combinations involving 19 isolates were capable of
MATa (MAT1-2) isolate (FIG. 3). This is a strong in- producing protoperithecia and of these nine combi-
FIG. 2. AFLP analysis of 44 monoascospore progeny and the parental isolates DGO 02 and MU 03. Lane M, 125500 bp
molecular weight marker. Lanes 2 and 48, DGO 02. Lanes 3 and 49, MU 03. Lanes 48, individual ascospores from a single
ascus. Lanes 947, segregating progeny obtained randomly from different asci. * -Polymorphic bands analyzed.
nations only one produced mature perithecia. These involved in different interactions where protoperithe-
results contradict reports of the occurrence of the cia were observed. These results agree with Kimati
sexual cycle in G. graminicola (Vaillancourt and Ha- and Galli (1970), Batista and Chaves (1982) and Bry-
nau 1991, 1992) where the majority of isolates are son (1990) where the sporadic formation of mature
interfertile and both homothallic and heterothallic perithecia at a low frequency also was observed. On-
strains are found. going analysis involving crosses between each of the
Although only two combinations of isolates pro- segregating individuals and each parental strain has
duced fertile perithecia it is possible that the other not uncovered individuals showing either homothal-
isolates that produced protoperithecia may be capa- lic mating or increased fertility. The capacity for fer-
ble of producing mature perithecia but at a very low tile sexual interactions also seems to be independent
frequency. This is supported by the observation that of vegetative compatibility because the parental
a greater number of mature perithecia were observed strains DGO 02 and MU 03 have been shown to be
as the number of replicate experiments analyzed in- incapable of undergoing successful hyphal anasto-
creased and that more than one common isolate was mosis (Rodrguez et al 2004).
800 MYCOLOGIA
TABLE III. Results of the X2 test to evaluate the segregation

of 23 AFLP markers in 42 distinct monoascopore derived
progeny cultures from the cross between isolates DGO 02
and MU 03.
AFLP Present/
marker Absent X2 P
1,7 20/22 0.09 0.75
2,15,22 21/21 0.00 1.00
3,5,9,18,20 19/23 0.38 0.54
4,10 17/25 1.52 0.22
6,11,19,21 22/20 0.95 0.33
8 24/18 0.86 0.35
12,13 26/16 2.38 0.12
14,16 23/19 0.38 0.54
17 25/17 1.52 0.22
23 16/26 2.38 0.12
The results of this study are in agreement with a

heterothallic interaction because none of the original
19 isolates tested when grown alone were capable of
producing either protoperithecia or mature perithe-
cia. Visual analysis of the morphology of the mon-
oascospore progeny and comparison with the paren-
tal strains showed a range of different rates of colony
growth and sporulation as would be expected in a
segregating population and are similar to the results
of Bryson (1990) who made a detailed study of col-
ony growth and morphology in the progeny of a cross
of G. lindemuthiana isolates.
The possibility of using molecular markers for anal-
ysis of segregating populations has been demonstrat-
ed (Kema et al 1996, Murtagh et al 2000). AFLP anal-
ysis of G. lindemuthiana allowed a large number of
polymorphic markers to be analyzed simultaneously
in comparison to the morphological and RFLP/iso-
zyme markers employed in previous studies (Bryson
1990, Lenne and Burdon 1990, Bonde et al 1991,
Sherriff et al 1994). The AFLP analysis confirmed
FIG. 3. Amplification of the MAT1-2 HMG sequence in
that the progeny were obtained from a sexual cross
DGO 02 and MU 03. Lane 1, DGO 02; Lane 2, MU 03.
both visually in the banding patterns and in the 1:1
Lane 3, N. crassa MATa/12. Lane 4, N. crassa MATA/11.
segregation ratios obtained. All segregating progeny Lane 5, negative control (water). Lane 6, 123 bp molecular
tested showed recombinant genotypes that were com- weight marker.
binations of the parental genotypes. A preliminary
analysis of the pathotypes of individual isolates of the
segregating population also has identified recombi- tide primers indicates that sequences homologous to
nant phenotypes (data not shown). For the first time the HMG box of the MAT1-2 idiomorph found in
progeny of a single ascus were analyzed and showed other ascomycetes are present in both parental iso-
to present four distinct genotypes and the occur- lates. It therefore was not possible to characterize
rence of twins. From these results we conclude that DGO 02 and MU 03 as MAT1-1 or MAT1-2 strains
the segregation patterns were due to heterothallic and suggests that mating type in these G. lindemuthi-
mating during a sexual cross. ana isolates is not directly determined by the MAT1
The mechanism governing sexual compatibility in locus. Further analysis of the 19 isolates (TABLE I)
G. lindemuthiana is unknown. Analysis of the paren- showed that all produced an amplified fragment of
tal strains in this study with the specific oligonucleo- around 200 bp using the specific oligonucleotide
FIG. 4. Comparison of the DNA and protein sequences of the MAT1-2 HMG box in different Glomerella species. G. lind
(DGO 02)-Glomerella lindemuthiana, strain DGO0 02 (AY724682), this study (obtained with degenerate primers); G. cing.
Glomerella cingulata (AY357890, Mudge and Templeton unpublished); G. gram. Glomerella graminicola (AF204960/AF204961;
Vaillancourt et al 2000). Nucleotides conserved between the DNA sequences of the three Glomerella species are boxed, the
underlined sequences indicate the sequences associated with the degenerate primers, dashes in the nucleotide sequence
indicate extra nucleotides identified in the G. cingulata and/or G. graminicola sequences and the sequences shown in bold
indicate the specific oligonucleotides used to amplify the MAT1-2 region from G. lindemuthiana. The shaded regions indicate
amino-acids conserved between G. lindemuthiana, G. cingulata and G. graminicola, dashes in the amino-acid sequence
indicate the presence of an intron.
primers, as did all 12 members of the segregating gions (G. lindemuthiana and G. graminicola in Amer-
population that were tested (data not shown). ica and G. cingulata in Australasia).
Similar results have been observed for G. gramin- A phylogenetic analysis of the sequences indicates
icola (Vaillancourt et al 2000, Chen et al 2002) where that G. lindemuthiana and G. cingulata are more
cross fertility between heterothallic isolates appears closely related to each other than to the G. gramini-
to be regulated by two unlinked loci (Vaillancourt et cola isolate (data not shown). These results also are
al 2000). In G. cingulata (anamorph, Colletotrichum reflected in the homology observed between the de-
gloeosporioides) however a single locus with multiple rived amino-acid sequences. This agrees with the ac-
alleles has been suggested as being responsible for cepted taxonomic classification of these three species
the determination of mating type (Cisar and te Beest (Sutton 1992).
1999). Taken together these data confirm that deter- This study opens the door for detailed genetic
mination of mating type in the genus Glomerella is analysis of G. lindemuthiana. Because the parental
complex and distinct from the bimodal system re- strains show different pathotypes it should be possi-
ported for most other filamentous ascomycetes (Arie ble to determine the patterns of inheritance of the
et al 1997, Turgeon and Yoder 2000). corresponding avirulence genes. Other characteris-
Comparison at the sequence level between three tics that could be studied at the genetic level are mat-
species of the genus Glomerella for the MAT1-2 HMG ing type and genes controlling vegetative compatibil-
region indicates a high level of sequence conserva- ity, neither of which have been studied extensively in
tion among isolates from different species of Glom- G. lindemuthiana. The construction of a genetic map
erella and among isolates obtained from distant re- of G. lindemuthiana based on molecular markers
802 MYCOLOGIA
would allow markers associated with the traits men- toral dissertation]. Irapuato, Mexico. Centro de Inves-
tioned above to be identified, leading to the com- tigacion y de Estudios Avanzados del I.P.N. 105 p
parison of inheritance of these traits across isolates , Rodrguez R, Zavala ME, Jacobo JL, Hernandez F,
and eventually to the isolation and characterization Acosta J, Martnez O, Simpson J. 1998. Characteriza-
tion of Mexican isolates of Colletotrichum lindemuthian-
of the genes responsible. A molecular marker map
um by using differential cultivars and molecular mark-
also would provide information on the size and chro- ers. Phytopathology 88:292299.
mosome number of the G. lindemuthiana genome. Kema GHJ, Verstappen ECP, Todorova M, Waalwijk C. 1996.
Successful crosses and molecular tetrad and progeny
analysis demonstrate heterothallism in Mycosphaerella
ACKNOWLEDGMENTS
graminicola. Curr Genet 30:251258.
We thank Luis Herrera-Estrella for critical reading of the Kimati H, Galli F. 1970. Glomerella cingulata f.sp. phaseoli,
manuscript, Dr James Kelly, Michigan State University, for fase ascogena do agente causal da anthracnose do fei-
the kind gift of G. lindemuthiana isolates MU 01, 02 and joeiro. Anais da Escola Superior de Agricultura Luiz
03, Dr Rosmary Bryson for making her doctoral thesis avail- de Queiroz 27:411437.
able to us, CONACyT, Mexico, for financial support under Kronstad JW, Staben C. 1997. Mating type in filamentous
grant number 28275SIM and CONACyT-SAGARPA for fi- fungi. Ann Rev Genet 31:245276.
nancial support under grant number K159-A9702. Lenne JM, Burdon JJ. 1990. Preliminary study of virulence
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C. lindemuthianum MAT1-2-1
1 Short Communication
3 Analysis of the MAT1-2-1 gene of Colletotrichum lindemuthianum
5 Mnica Garca-Serrano1, Emigdia Alfaro Laguna1, Ral Rodrguez-Guerra2 and June Simpson1
1
6 Department of Genetic Engineering, CINVESTAV, Campus Guanajuato, Apdo. Postal 629,C. P.
2
7 36821, Irapuato, Guanajuato, Mexico, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales,
8 Agrcolas y Pecuarias. (INIFAP), Campo Experimental General Tern, Nuevo Len, Mexico.
10 Corresponding author: June Simpson,
11 Department of Genetic Engineering, CINVESTAV, Campus Guanajuato,
12 KM 9.6 Libramiento Norte Carretera Irapuato-Len, Apdo. Postal 629,
13 C. P. 36821, Irapuato, Guanajuato, Mexico.
14 Tel. +52-462-6239667, Fax. +52-462-6245849
15 E-mail: jsimpson@ira.cinvestav.mx
16
17
18 14 pages, 6 Figures, 1 table
19
20
21
22
23
C. lindemuthianum MAT1-2-1 2
24 Abstract The MAT1-2-1 genes from a mating pair of the filamentous Ascomycete,
25 Colletotrichum lindemuthianum were analyzed. A single MAT1-2-1 gene with an open reading
26 frame of 1062 bp encoding a putative protein of 290 amino acids that includes the highly
27 conserved HMG domain typical of the fungal MAT1-2-1 genes was identified in each isolate.
28 Three introns were confirmed within the C. lindemuthianum coding sequence, two of which were
29 found to be conserved relative to a previously reported MAT1-2-1 gene from C. gloeosporioides.
30 Comparison of the amino acid sequence of the HMG domain with those from other Ascomycetes
31 was also carried out
32 Key words Ascomycetes; Colletotrichum lindemuthianum; Glomerella MAT1-2-1; TAIL-PCR;
33
34
35 In most heterothallic, filamentous Ascomycetes, a single locus (the MAT 1 or mating type locus)
36 first described for Neurospora crassa (Glass et al. 1988) controls sexual development. The MAT
37 locus has now been characterized in many different Ascomycetes and in the cases where sexual
38 reproduction and mating have been studied in detail, the MAT locus was shown to have 2 alleles
39 or idiomorphs which are distinct in each of the members of a heterothallic mating pair (Coppin et
40 al. 1997; Turgeon 1998; Poggeler 2001).
41 These idiomorphs have been named MAT1-1 and MAT1-2 (Turgeon and Yoder 2000).
42 MAT1-1 contains an ORF which encodes a protein with an box domain and in some genera
43 additional ORFs are also found. The MAT1-2 idiomorph normally contains a unique ORF which
44 invariably encodes a protein with a highly conserved HMG domain.
45 Heterothallic Ascomycete strains carry either MAT1-1 or MAT1-2 and are sexually
46 compatible when in contact with strains of the opposite mating type. In homothallic Ascomycete
47 strains a single individual normally contains both MAT1-1 and MAT1-2 idiomorphs (Coppin et
48 al. 1997; Turgeon 1998; Poggeler 2001). However, a series of articles (Edgerton 1914; Lucas et
49 al. 1944; Wheeler et al. 1948; Chilton and Wheeler 1949; Wheeler 1954) on Glomerella
50 cingulata (anamorph Colletotrichum gloeosporiodes) and more recent reports on different species
51 within the genus Glomerella (Cisar et al. 1996; Cisar and TeBeest 1999; Vaillancourt et al. 2000;
52 Rodrguez-Guerra et al. 2005) suggest that control of sexual reproduction within this genus is
53 distinct to that described for other filamentous Ascomycetes.
54 Based on results obtained from classical genetic studies Wheeler (1954) developed a
55 model to describe how mating could be controlled genetically in Glomerella proposing that most
56 Glomerella strains are basically homothallic but that pseudo or unbalanced heterothallic strains
57 may arise due to mutations in genes involved in the mating process. These strains are no longer
58 capable of completing the sexual cycle by themselves but on contact with another strain carrying
59 a different mutation, complementation may occur and sexual reproduction achieved. More recent
60 molecular data on the MAT1 locus in Glomerella has shown that in contrast to other filamentous
61 Ascomycetes, both members of a mating pair carry the MAT1-2 idiomorph (Vaillancourt et al.
62 2000; Rodrguez-Guerra et al. 2005). This situation could arise under the model of Wheeler if
63 different mutations either in the MAT1-2 idiomorph or in other genes involved in the mating
64 process occurred in each member of the mating pair and were complemented. Cisar and TeBeest
65 (1999) reported that in G. cingulata multiple alleles occur at MAT1-2 which would also agree
66 with the unbalanced heterothallism model if mutations between strains occurred mainly within
67 this locus. The presence of the MAT1-1 idiomorph has not been reported for any member of the
68 genus Glomerella to date.
69 Colletotrichum lindemuthianum is a haploid hemibiotroph which is easily manipulated
70 and transformed genetically under laboratory conditions (Perfect et al. 1999). Shear and Wood
71 published the first report of sexual reproduction in C. lindemuthianum in 1913 however this
72 phenomenon was not reported again until 1970 by Kimati and Galli who observed mating in
73 laboratory cultures, followed by Batista and Chaves (1982), Bryson (1990) and Rodrguez-Guerra
74 et al. (2005). The perfect state (Glomerella lindemuthiana) has never been observed under field
75 conditions and this species is generally still described as a filamentous Deuteromycete for which
76 no classical genetic analysis has been carried out. For other members of the genus, such as C.
77 gloeosporioides (G. cingulata) sexual reproduction is common under field conditions.
78 The objective of this work was to characterize the MAT1-2-1 gene from a mating pair of
79 C. lindemuthianum strains.
80 All strains were isolated and purified as described in Gonzlez et al. (1998) and
81 Rodriguez-Guerra et al. (2005). The sexually compatible C. lindemuthianum strains DGO 02 and
82 MU 03 and the F1 progeny of a cross between these strains have been described previously
83 (Rodriguez-Guerra et al. 2005). All strains were maintained on acidified PDA (200 l of 85%
84 lactic acid L-1) and grown at 22oC for 10-15 days. DNA was obtained by the method of Raeder
85 and Broda (1985) as described by Gonzlez et al. (1998). The degenerate primers for
86 amplification of the MAT 1-2 HMG domain reported by Arie et al. (1997) (HMGDF and
87 HMGDR, Table 1) were used to amplify the MAT1-2-1 HMG domain from the parental MU 03
88 and DGO 02 strains and from other Colletotrichum isolates obtained from different plant species
89 as described in Rodrguez-Guerra et al. (2005). Amplification products were separated on a 2%
90 agarose gel and visualized by staining with ethidium bromide and exposure to U.V. light.
91 Southern blotting was carried out using standard protocols (Sambrook et al. 1989). A 780bp
92 fragment obtained by PCR using oligonucleotides C3 and C5 (Table 1) was used as a probe.
93 Amplification of the MAT1-2-1 HMG domain from C. lindemuthianum using specific primers
94 (HMGCLF/HMGCLR, Table 1) was carried out under the same conditions (Rodrguez-Guerra et
95 al. 2005). The TAIL-PCR technique (Liu and Whittier 1995) was used to characterize the MAT1-
96 2-1 gene sequences flanking the conserved MAT1-2-1 HMG domain from both MU 03 and DGO
97 02 strains. The degenerate primers AD1, 2, 3 (Table 1) and PCR conditions were those described
98 in Liu and Whittier (1995). Amplified fragments were visualized as described above.
99 Amplified DNA fragments from the HMG domain, the TAIL-PCR reactions and complete
100 2Kb sequences spanning the MAT1-2 gene were cloned into the vector TOPO 4 (Invitrogen,
101 Carlsbad, CA) according to the manufacturers instructions and sequenced on an ABI3700
102 sequencer. DNA sequences were analyzed using the NCBI BLAST utilities and the Genescan
103 program (Burge and Karlin 1997). Amino acid sequences were compared using Clustal W
104 (Chenna et al. 2003), Jalview (Clamp et al. 2004) and the MEGA 4.0 program (Tamura et al.
105 2007). A consensus bootstrap dendrogram was produced using MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007)
106 and the Neighbour Joining method.
107 Amplification of the conserved HMG region of the MAT1-2-1 gene in C. lindemuthianum
108 isolates MU 03 and DGO 02 revealed that the MAT1-2-1 idiomorph was present in both partners
109 of the mating pair (Rodrguez-Guerra et al. 2005). To extend this result, isolates of
110 Colletotrichum from different plant species were analyzed using degenerate primers and the
111 MAT1-2-1 gene was found to be present in all isolates tested (Fig.1). One possible explanation is
112 that Colletotrichum species have various copies of MAT1-2-1 within their genome and outside
113 the MAT locus. However, Southern blot analysis of MU 03 and DGO 02, showed the presence of
114 a single gene in both strains (Fig.2).A Hind III based RFLP analyzed in 150 F1 individuals of the
115 MU 03 X DGO 02 cross, indicated that the MAT1-2-1 gene segregates in a 1:1 ratio with 77
116 individuals having the DGO02 genotype and 73 individuals the MU03 genotype. An example of
117 part of the Southern blot data is shown for 15 F1 segregants in Figure 2.
118 In order to characterize the MAT1-2-1 gene in more detail in both members of the C.
119 lindemuthianum mating pair, TAIL-PCR reactions (Liu and Whittier 1995) were carried out using
120 the primers described in Table 1. A 2Kb sequence spanning the MAT1-2-1 gene was obtained for
121 both MU 03 and DGO 02 (GeneBank EU23649, EU23650). The sequences obtained from both
122 strains were essentially identical, differing only in single base substitutions and BLAST analysis
123 of the sequences confirmed homology to the MAT1-2-1 gene.
124 As mentioned above members of mating pairs of most filamentous Ascomycetes carry
125 either the MAT1-1 or the MAT1-2 idiomorph at the MAT locus, however as shown here and in
126 other reports in the genus Glomerella (Cisar et al. 1996; Cisar and TeBeest 1999; Vaillancourt et
127 al. 2000; Rodrguez-Guerra et al. 2005), both members of a mating pair carry the MAT1-2
128 idiomorph. However, if one of the partners in the Glomerella mating pair carries a defective
129 MAT1-2 idiomorph or non-transcribed MAT1-2-1 gene this would effectively reproduce the
130 situation in other filamentous Ascomycetes where a functional MAT1-2 idiomorph is present in
131 only one member of the mating pair (Glass et al. 1988) and be in agreement with the model
132 proposed by Wheeler (1954). However the characterization of essentially identical sequences
133 from both the DGO02 and MU03 C. lindemuthianum strains suggests that this gene is probably
134 functional in both isolates.
135 Comparisons using the Genescan (Burge and Karlin 1997) program and the proposed
136 protein sequence for a G. cingulata MAT1-2-1 gene (GenBank accession number AY357890),
137 revealed an ORF comprising 1062 nucleotides and including 3 potential introns (Fig. 3).
138 Sequence analysis of cloned cDNAs produced by RT-PCR confirmed the presence of all three
139 putative introns. Comparisons of relevant sections of the electropherograms obtained from
140 sequencing genomic and cDNA clones are shown in Figure 4. Translation of the putative
141 messenger RNA gives a 290 amino acid protein with a strong homology to other fungal MAT1-2-
142 1 proteins. Only two amino acid differences were identified between the strains MU 03 and DGO
143 02 (Fig.5) and several in-frame ATGs were identified (data not shown).
144 Only one other complete sequence for a Colletotrichum MAT1-2-1 gene is publicly
145 available (C. gloeosporioides, GenBank AY357890). Based on Clustal W analysis a comparison
146 between the putative protein sequences for the C. lindemuthianum MAT1-2-1 and the C.
147 gleosporioides MAT1-2-1 were carried out (Fig. 5). Of the 241 amino acids in the putative C.
148 gloeosporioides protein, 159 (66%) were identical to those of the C. lindemuthianum protein and
149 222 (92%) were functionally conserved (Clustal conservation threshold >6). The positions of
150 two introns, shown by solid arrows in Fig. 5 were found to correspond to the same amino acids
151 within the two proteins. The putative C. lindemuthianum protein includes a stretch of 38 amino
152 acids at the amino terminal and 12 at the carboxy terminal which are not found in the putative C.
153 gloeosporioides protein reported in GenBank. The confirmed presence and conservation of the
154 position of the introns in MAT1-2-1 between C. gloeosporioides and C. lindemuthianum suggests
155 that the deduced amino acid sequence for the C. lindemuthianum MAT1-2-1 protein is the most
156 probable.
157 No significant homology was observed in a search for regulatory sequences such as
158 5CTTTG 3 (Philley and Staben 1994) or those associated with carbon metabolism or other
159 regulatory factors (Glass et al. 1990; Debuchy and Coppin 1992; Leubner-Metzger et al. 1997) in
160 either the 3 or 5 untranslated regions.
161 To compare the amino acid sequence of the highly conserved MAT1-2-1 HMG box across
162 other species and genera of Ascomycetes, a comparison was first carried out using Protein
163 BLAST. All of the 100 sequences showing significant alignment with the C. lindemuthianum
164 MAT1-2-1 sequence (e values from 2e-88 to 1e-11), corresponded to MAT1-2-1 genes from other
165 Ascomycetes within the sub-phylum Pezizomycotina, with the exception of
166 Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces kambucha (Taphrinomycotina). All
167 samples from the genus Glomerella (anamorph Colletotrichum) and one example from each
168 genus (including both anamorph and teleomorph in some cases) of the Pezizomycotina were
169 chosen to carry out cluster analysis using a conserved sequence of 58 amino acids spanning the
170 highly conserved HMG domain (indicated as a solid line above the sequence in Fig. 5). The
171 groups observed in the resulting dendrogram (Fig. 6), reflect the taxonomic classification within
172 the Pezizomycotina with few exceptions down to the level of different orders. One group
173 comprised of Pleosporales however is found to separate from the other group of
174 Dothidiomycetes. The few examples of Lecanoromycetes and Leotiomycetes available were
175 found to be dispersed throughout the cluster. C. lindemuthianum groups within the genus
176 Glomerella, but was not included in the G. cingulata group as are C. musae and C. fragariae and
177 is also separated from G. graminicola and G. acutata. One sample of G. musae was found to
178 group with samples of Fusarium and may indicate a mistaken classification. The Glomerella
179 group is closely associated with examples from the Isaria and Cordyceps genera although these
180 are insect pathogens rather than plant pathogens.
181 The cluster analysis confirmed the usefulness of the HMG domain as a taxonomic tool
182 even at the levels of order and family as reported by Du et al. (2005). Previously C.
183 lindemuthianum, C. fragariae and C. musae were considered to be forms of C. gloeosporioides
184 (Sutton 1992). The present results lend support for this classification in the case of C. fragariae
185 and C. musae but not in the case of C. lindemuthianum which is separated from the C.
186 gloeosporioides group.
187 In conclusion, the MAT1-2-1 genes from C. lindemuthianum and C. gloeosporioides are
188 strongly conserved in both gene structure and in the putative amino acid sequence of the encoded
189 proteins. The presence of almost identical sequences in both parental C. lindemuthianum strains
190 lends support to the hypothesis of pseudo-heterothallism proposed by Wheeler (1954). Further
191 research should address the differences at the molecular and evolutionary levels which have led
192 to the apparently unique mating system found in the genus Colletotrichum.
193 Acknowledgements We are grateful to Luis Herrera Estrella for critical reading of the
194 manuscript and to CONACyT, Mexico for financial support under grants SIM 28275 and 40369-
195 Q. MGS received a doctoral fellowship from CONACyT, Mexico and a terminal fellowship from
196 CONCYTEG, Guanajuato State.
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308
309
310
311
312
313 Figure legends

314
315 Fig. 1. MAT1-2 is found in all Colletotrichum isolates tested. Common names for each plant
316 species from which samples were obtained are given. Hawthorne apples: Crataegus mexicana,
317 Mexican turnip: Pachyrizus erosus
318 Fig. 2. RFLP analysis of F1 segregants of the DGO02 x MU03 cross. DGO 02 and MU 03
319 indicate the parental strains, numbers indicate F1 segregants obtained from monoascospore
320 cultures.
321 Fig. 3. Structure of Colletotrichum lindemuthianum MAT1-2-1 gene. Black boxes indicate exons,
322 introns are indicated by open boxes. GenBank accession numbers are EU236949 and EU236950
323 for MU 03 and DGO 02 respectively.
324 Fig. 4. Comparison of electropherograms of genomic and cDNA sequences. Outlined boxes
325 indicate the position of sequences flanking the introns in both the cDNA and genomic DNA
326 sequences.
327 Fig. 5. Comparison of C. lindemuthianum strain DGO 02 and C. gloeosporioides MAT1-2-1
328 protein sequences. Shaded boxes indicate conserved amino acids, solid arrows indicate conserved
329 intron positions the hatched arrow indicates the position of a third intron in C. lindemuthianum,
330 the line above the sequence indicates the HMG domain, open boxes indicate amino-acid
331 differences (R-K and G-S) between DGO 02 and MU 03. GenBank accession numbers
332 EU236949, EU236950 and AY357890 for MU 03, DGO 02 and the C. gloeosporioides sequence
333 respectively.
334 Fig. 6. Comparison of the MAT1-2-1 HMG domain in the Pezizomycotina. Groups associated
335 with different classes are shown and underlined. Numbers indicate percentage conservation of
336 nodes in 1000 Bootstrap samples. * Lecanoromycetes, + Leotiomycetes, # no definitive rank
337 available, ? possible mistaken classification
338
339
340
341
342
343
344
345
346
347
348
349
350
Table 1. Primers used to span the MAT1-2-1 gene

Primer Sequence Primer Sequence
F1 CATGCCGCAGTAAAGCAAATGGAC AD1 NTCGASTWTSGWGTT
F2 AAACTTGGCAAAGCATGGAACGCA AD2 NGTCGASWGANAWGAA
F3 CCTACTACCGCTACAACCC AD3 NGTGNAGNANCANAGA
F4 TGGCAAAGGTTACTCCCATCGCCT HMGDF CCYCGYCCYCCYAAYGCNTAYAT
F5 TATTTTACATGCTGGTCAC HMGDR CGNGGRTTRTARCGRTARTNRGG
R1 CTGTAGCGGTAGTCGGGATG HMGCLF CATGCCGCAGTAAAGCAAAT
R2 TTTCGACAGTTTGAACCGA HMGCLR ATCATCAGACGTTCTTTGTG
R3 TTTGCTTTACTGCGGCATG P5 GGGGTAGTCGAAAGAAACTG
R4 CGCCTACCCCCAGTTAGTATCATA P3 CCAGACATCCTAGAATGATCTGTC
R5 CCGATGAAAACGTAGTCCC C5 GATGCTGCGAGACTGTGCCAAGTT
R6 CAGTCTCGCAGCATCCAGA C3 TTGGGGTATTTGCTCGCTAAACTG
351
Figure 1
MAT1-2 is found in all Colletotrichum sp. Isolates tested
Avocado
Chile
Bean
Peanut
Mexican turnip
Papaya
Bean
Hawthorne apple
MWM
Figure 2
RFLP analysis of F1 segregants of the DGO02 x MU03 cross
DGO02 MU03 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Figure 3 Structure of Colletotrichum lindemuthianum MAT1-2-1 gene
Putative TAG
ATG Stop
1 489 499 577 882 943 1267 1315 1551 2006
Int1 Int2 Int3

Figure 4 Comparison of electropherograms of genomic and cDNA sequences
Genomic DNA sequence Genomic DNA sequence
Intron 1 Intron 2
cDNA sequence cDNA sequence
Genomic DNA sequence

Intron 3
cDNA sequence
Figure 4
Comparison of C. lindemuthianum and C. gloeosporioides MAT1-2-1 protein
sequences
1
C. lind
C. gloe
1
C. lind
C. gloe
C. lind
C. gloe
290
C. lind
C. gloe
241
Glomerella cingulata3
47
Figure 4. Comparison of the amino acid sequence of the MAT1-2-1 HMG domain in
49
100
Colletotrichum musae1
35
Colletotrichum fragariae1
55
Glomerella magna
71 Colletotrichum lindemuthianum
Glomerella graminicola
49
96 Glomerella acutata
34 Isaria tenuipes
100 Cordyceps militaris
6 Ceratocystis eucalypti
Magnaporthegrisea
Sordariomycetes
+
Sclerotinia sclerotiorum
16
6 Fusarium oxysporum
36
96 Gibberella zeae
91
?
Colletotrichum musae
Diaporthe sp.
the Pezizomycotina.
77 Cryphonectria parasitica
Ophiostoma ulmi
Podospora anserina
25
25 Chaetomium sp.
37
48 Sordaria macrospora
100 Neurospora crassa
74 Gelasinospora cerealis
Septoria passerinii
Dothidiomycetes
(Capnodiales)
16 Cercospora zeina
95
Mycosphaerella pini
32
100 Dothistroma pini
79 Passalora fulva
Penicillium marneffei
98 Neosartorya fischeri
73 Aspergillus fumigatus
Eurotiomycetes
58 39
Emericella nidulans
*
65 Xanthoria flammea
Ascosphaera apis
39
68 Ajellomyces capsulatus
61 Coccidioides immitis
#
Rhynchosporium secalis
93 Pyrenopeziza brassicae
+
*
Cladonia galindezii
Bottom
Dothidiomycetes
Leptosphaeria maculans
(Pleosporales)
100 Stemphylium sp.
Top
99 Pleospora gigaspora
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CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS

AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITECNICO

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA GENETICA

Anlisis de ideomorfos MAT en

Tesis que presenta

QFB MNICA DEL CARMEN GARCA SERRANO

Para Obtener el Grado de

Directora de Tesis: Dra. June K. Simpson Williamson

Irapuato, Gto. Abril del 2008

ndice de Tablas y Figuras ................................................................................................. iii

Figura 1. Reproduccin asexual de S.cerevisiae 25

Figura 26. Esquema de la posicin de los marcos de lectura

A los tres amores de mi vida

Agradezco al CONACYT el apoyo brindado para la realizacin de este trabajo y

Agradezco a CONCYTEG el apoyo otorgado al final del doctorado.

Agradezco infinitamente a la Dra. June Simpson su apoyo y paciencia, a todos los

Agradezco el apoyo laboral y moral brindado por mis compaeros de laboratorio,

Agradezco la amistad que encontr en todos mis compaeros de generacin,

Agradezco a mi familia, incluyendo adems de pap y hermana a suegros, cuados y

Agradezco de especial forma el apoyo y la amistad brindados por las autoridades y

Necesitara muchas pginas para poder plasmar el agradecimiento que le debo a mi

Colletotrichum lindemuthianum is a fungal pathogen of common bean, Phaseolus

1.1 Genmica y protemica aplicadas al estudio de hongos modelo

1.2 Saccharomyces cerevisiae

Uno de los hongos que ms se ha estudiado desde hace muchos aos es el

Actualmente existe un alelo mutado para cada gen que se ha caracterizado en S.

Como ya se mencion, el desarrollo de la genmica en los hongos comenz con la

Usando la metodologa basada en arreglos genticos, Tucker y Fields (2004),

1.3 Candida albicans

Candida albicans es el principal hongo patgeno en humanos, existe como comensal

El genoma de C. albicans tiene 8 cromosomas, el tamao de su genoma haploide es

Hablando de la infeccin localizada causada por C. albicans, se han publicado

Existe un trabajo reciente sobre la tipificacin de secuencias multilocus en el que C.

A pesar de que se han comenzado a desarrollar todas estas nuevas tecnologas en

1.4 Neurospora crassa

Cuando se empezaron a obtener los primeros resultados de los estudios de

El genoma de nueve especies de Aspergillus ha sido parcial o totalmente

1.6 Magnaporthe grisea

Este hongo filamentosos se ha utilizado como modelo de estudio para estudiar

1.7 Fusarium spp

La principal meta en la investigacin de la biologa molecular de los hongos de

1.8 Ustilago maydis

Fitzpatrick y col. (2006), utilizaron dos tecnologas computacionales para inferir la

Hablando de diferencias entre organismos ms cercanos genticamente, Gash

En cuanto a los hongos filamentosos, a pesar de que Neurospora no se asocia

El estudio de la biologa de los hongos fitopatgenos tiene una gran importancia a

Dentro de los hongos fitopatgenos, diferentes especies pertenecientes al gnero

1.11 Colletotrichum lindemuthianum como modelo de estudio

En el laboratorio de Gentica Molecular del CINVESTAV-unidad Guanajuato, donde

2.1 Reproduccin asexual en hongos

Los hongos son organismos que pueden reproducirse utilizando diferentes

Figura 1. Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae.

En el caso de los ascomicetos filamentosos una hifa crece, replica su material

2.2 Reproduccin sexual en Ascomicetos

Otro mecanismo de reproduccin de los hongos es la reproduccin sexual, que tiene

Para que se lleve a cabo el acercamiento y fusin de clulas sexualmente

a) Hemiascomicetos. Las clulas sexualmente compatibles se reconocen, unen sus

El locus MAT se encuentra en el cromosoma III, que adems de tener el locus

Figura 6. Activacin-desactivacin de los genes involucrados en el desarrollo sexual en S.

Cada tipo celular haploide secreta un factor de apareamiento diferente, una

Siguiendo con el anlisis de la reproduccin sexual en los hemiascomicetos,

b) Ascomicetos filamentosos heterotlicos. Un importante modelo de hongo

Los ideomorfos MAT en Podospora anserina, un ascomiceto filamentoso, son