SESI III

Tehnik & Evaluasi Validasi

Metode
Beberapa alasan dalam mengembangkan metode:
Karena tidak ada metode yang tepat untuk
menguji analit dalam matriks contoh
Metode yang ada terlalu menyimpang/tidak layak
(akurasi dan presisi rendah)
Metode yang ada terlalu mahal, waktu lama, kon-
sumsi energi tinggi, bahaya terhadap safety, tidak
otomatis
Metode yang ada kurang sensitif atau selektif
Instrumen/peralatan dan teknik yang lebih baru
Kebutuhan akan metode alternatif untuk keperluan
legal atau ilmiah

Chaerul2007
Tujuan dari pengembangan metode baru :
Identifikasi kualitatif analit yang diuji termasuk
informasi struktural untuk mengetahui perilakunya
(waktu retensi, perubahan warna, pH).
Penentuan kuantitatif; secara akurat, presisi dan
reprodusibel.
Mudah dilaksanakan; secara otomatis dan cepat.
Menurunkan biaya melalui penyederhanaan
prosedur jaminan mutu dan pengendalian mutu.
Penyiapan contoh yang cepat, sederhana, hemat
bahan dan sampel yang diperlukan.
Output langsung data kualitatif dan kuantitatif ke
dalam komputer sehingga mudah diinterpretasi,
disimpan, dicetak atau dikirim melalui jaringan Chaerul2007
Akurasi

Terdapat sedikitnya tiga macam metode untuk

mengevaluasi akurasi suatu metode uji, harus dipilih
salah satunya sesuai dengan ketersediaan
prasyarat dan metode uji.

Analisis Certified Reference Material (CRM)

Spike Recovery
Uji Komparatif
Akurasi; Analisis CRM

Metode ini hanya

dilakukan jika
tersedia CRM
(Certified Reference
Material) yang
sesuai yang dibuat
oleh lembaga yang
berwenang.
Akurasi; Analisis CRM

CRM merupakan suatu matriks contoh atau

simulasi produk yang diketahui secara pasti
secara analitik konsentrasi salah satu atau
lebih konstituennya yang disertai oleh
sertifikat yang dikeluarkan oleh lembaga yang
berwenang. (Canada Center for Inland Waters,
1994).
Akurasi; Prosedur Analisis CRM
Lakukan analisis berulang sebanyak
minimal enam kali ulangan terhadap Certified
Reference Material (CRM) yang memiliki
konsentrasi analit dan matriks sama dengan
contoh uji.
Reratakan kadar hasil uji, lalu uji beda
nyata (t-student test) dengan konsentrasi analit
sebenarnya dalam CRM pada confidence level
95%.
Metode uji terbukti akurat jika rerata hasil
uji tidak memberikan perbedaan nyata dengan
nilai analit sebenarnya.
 Akurasi; Perhitungan Analisis
CRM Tabel hasil uji
Ulangan % Teoretis () % Perolehan (x x)
n
2

x=
x
1 x1 (x x)
1
2
n
(x x)
(x x )
2
2 x2 2
2
3 x3 (x x) 2

S=
Nilainya didapat 3 i
4 dari sertifikat CRM x4 (x x)
4
2

n 1
5 x5 (x x)
5
2

6 x6 (x x)
6
2

x (x x)
2
Jumlah n

Rata-rata x -
Akurasi; Perhitungan Analisis CRM
t student two sided test:
1. Tetapkan hipotesis awal (H0) dan
hipotesis tandingan (H1):
H0 : x = ; Rerata nilai hasil uji sama
dengan nilai CRM, rerata nilai hasil
uji tidak berbeda nyata dengan nilai
CRM, metode akurat.
H1 : x ; Rerata nilai hasil uji
tidak sama dengan nilai CRM; rerata
nilai hasil uji berbeda nyata dengan
nilai CRM, metode tidak akurat.
Akurasi; Perhitungan Analisis CRM
t student two sided test, lanjutan:
2.Hitung nilai thitung dari data
menggunakan rumus:

x n n = jumlah data
t hitung =
S
3. Hitung nilai ttabel dari tabel nilai t
dengan derjat bebas,db (degree of
freedom,df) = n-1
Akurasi; Perhitungan Analisis CRM
t table: Critical values for the t-test
df Batas kepercayaan(Level of Confidence)
Two Sided Test One Sided Test
90% 95% 99% 90% 95% 99%
1 6,31 12,71 63,66 3,08 6,31 31,82
2 2,92 4,30 9,92 1,89 2,92 6,97
3 2,35 3,18 5,84 1,64 2,35 4,54
4 2,13 2,78 4,60 1,53 2,13 3,75
5 2,02 2,57 4,03 1,48 2,02 3,36
6 1,94 2,45 3,71 1,44 1,94 3,14
Akurasi; Perhitungan Analisis CRM
df = n1 Level of Confidence = 95%
4.Bandingkan nilai ttabel terhadap thitung:
Jika thitung < ttabel; maka terima H0;
Rerata nilai hasil uji sama dengan
nilai CRM, rerata nilai hasil uji tidak
berbeda nyata dengan nilai CRM, metode
akurat.
Jika thitung > ttabel; maka terima H1;
Rerata nilai hasil uji tidak sama
dengan nilai CRM; rerata nilai hasil
uji berbeda nyata dengan nilai CRM,
metode tidak akurat.
 Akurasi; Perhitungan Analisis CRM
Contoh Soal
Lab Air mengevaluasi akurasi dari metode pengujian
kadar klorida dalam contoh AMDK secara Titrimetri.
Beliau menganalisis sebanyak 7 kali ulangan suatu CRM
AMDK yang memiliki nilai benar klorida sebesar 200
mg/L di dalamnya sehingga didapatkan data kadar klorida
hasil pengujian sebagai berikut: 200,30; 199,80; 200,36;
201,10; 200,20; 200,40; 200,10 mg/L. Apakah metode
Lab Air tersebut akurat?
Penyelesaian
n=7
Akurasi; Perhitungan Analisis CRM
Lanjutan Penyelesaian Soal
Ulangan Nilai Benar
Klorida () (mg/L)
Kadar Klorida
Hasil Pengujian (mg/L) (x
n x )
2

1 200,30 0,0004
2 199,80 0,2704
3 200,36 0,0014
4 200,00 201,10 0,6084
5 200,20 0,0144
6 200,40 0,0064
7 200,10 0,0484
Jumlah 1402,26 0,9498
Rata-rata 200,32 -
Akurasi; Perhitungan Analisis CRM
Lanjutan Penyelesaian Soal

S=
i
( x x ) 2
x n
n 1 t hitung =
S
0,9498 200,32 200,00 7
S= t hitung =
7 1 0,3980
t hitung = 2,13
S = 0,3980
Df = n-1 = 7-1 = 6 ; P = 95%
Dari tabel nilai kritis t: ttabel = 2,45
thitung < ttabel; maka terima H0; Rerata nilai hasil uji sama
dengan nilai CRM; rerata nilai hasil uji tidak berbeda
nyata dengan nilai CRM, metode akurat.
Akurasi; Prosedur Spike Recovery
Menggunakan Blangko Matriks/Blangko
Contoh:
Buat plasebo sejumlah yang diperlukan,
simulasi objek uji tanpa analit dalam skala
lab.
Bagi plasebo tersebut menjadi 3 bagian.
Tambahkan analit ke dalamnya masing-
masing sebesar 50, 100 dan 150% dari
konsentrasi uji.
Lakukan analisis berulang terhadap contoh
tersebut di atas minimal 6 kali untuk tiap-
tiap level konsentrasi.
Akurasi; Prosedur Spike Recovery
Menggunakan Blangko Matriks
Hitung hasil ukur, kemudian bandingkan
terhadap konsentrasi analit teoretis.
Metode dikatakan akurat jika didapatkan %
Recovery sesuai syarat keberterimaan.
Recovery dihitung sebagai berikut:
(C x C o )
% Re cov ery = x100 %

Dimana Cx= Konsentrasi analit hasil ukur; Co=
Konsentrasi awal analit dalam blangko (baseline
concentration); = Konsentrasi analit teoretis
Akurasi; Prosedur Spike Recovery
Catatan:
Blangko Matriks/Contoh = Suatu preparat
koreksi latar belakang yang terdiri dari
semua zat dalam contoh, atau setidaknya
mendekati contoh, tanpa analit.
Konsentrasi Uji = Merupakan konsentrasi
analit yang dijadikan patokan dalam
pengujian. Pada produk-produk hasil
buatan, konsentrasi uji sama dengan
konsentrasi analit yuang tertera pada
etiket/label produk. Pada kasus tidak
ditemui label pada objek uji, misalnya
limbah, maka konsentrasi uji sama dengan
urutan prioritas berikut:
Akurasi; Prosedur Spike Recovery
Catatan, konsentrasi uji:
1. Rerata konsentrasi analit dalam
seluruh objek uji sejenis yang
dianalisis selama 3 bulan ke
belakang.
2. Nilai kandungan analit yang yang
menjadi syarat keberterimaan objek
uji berdasar standar yang berlaku
(untuk produk : SNI; limbah : BML).
3. Nilai tengah dari dynamic range
(rentang) metode, jika diketahui.
Akurasi; Spike Recovery

Syarat keberterimaan dalam % recovery

bergantung pada official dokumen apa
yang menjadi acuan dalam validasi
tersebut. Dalam verifikasi metode yang
telah divalidasi sebelumnya yang
berasal dari official method biasanya
sudah terdapat keterangan besarnya %
recovery metode, disebutkan dalam
bagian bias & precision metode. Berikut
beberapa contoh syarat keberterimaan %
recovery:
Akurasi; Spike Recovery
Syarat keberterimaan % recovery
CPOB (Cara Pembuatan Obat yang Baik),
ed. 2001 hlm. 423 mensyaratkan % recovery
100 2%.
Europe Union (EU)
Fraksi Massa Rentang Keberterimaan
< 1g/kg -50% s.d. +20% (50-120%)
> 1g/kg s.d. 10g/kg -30% s.d. +10% (70-110%)
> 10g/kg -20% s.d. +10% (80-110%)
Sumber: EU-RI Trade Support Programme (TSP)
Akurasi; Syarat keberterimaan % recovery
Standard Methods for the Examination
of Water & Wastewater, 18th Edition,
1992, Page 1-4, Table 1020:I.
Analysis % Recovery
Metals 80-120
Volatile Organics 70-130
Volatile Gases 50-150
Base/neutrals 70-130
Acids 60-140
Anions 80-120
Nutrients 80-120
Akurasi; Syarat keberterimaan %
recovery
Analysis % Recovery
Other Inorganics 80-120
Total Organic Carbon 80-120
Total Organic Halogens 80-120
Herbicides 40-160
Organochlorine Pesticides 50-140
Captan 20-130
Endosulfans 25-140
Endrin Aldehyde 25-140
Organophosphorus Pesticides 50-200
Akurasi; Syarat keberterimaan %
recovery
Analysis % Recovery
Trichlorophon 20-200
Triazine Pesticides 50-200
Carbamat Pesticides 50-150
Akurasi; Prosedur Spike Recovery
Jika Tidak Tersedia Blangko Matriks:
Pilih suatu contoh homogen dan stabil
yang memiliki kandungan matriks mewakili
dengan volume yang cukup.
Lakukan analisis berulang sebanyak
minimal enam kali ulangan terhadap
contoh tersebut guna menetapkan
konsentrasi uji baseline.
Bagi contoh tersebut menjadi 3 bagian.
Tambahkan analit ke dalamnya masing-
masing sebesar 50, 75 dan 100% dari
konsentrasi uji.
Akurasi; Prosedur Spike Recovery
Jika Tidak Tersedia Blangko Matriks
Lakukan analisis berulang terhadap
contoh tersebut di atas minimal 6 kali
untuk tiap-tiap level konsentrasi.
Hitung hasil ukur, kurangkan hasil ukur
dengan konsentrasi uji contoh seperti
pada perhitungan %Recovery dengan
menggunakan blangko matriks.
Bandingkan terhadap konsentrasi analit
teoretis yang ditambahkan ke dalam
contoh tersebut, metode akurat jika
didapat % Recovery sesuai syarat
keberterimaan.
Akurasi; Uji Komparatif
Uji komparatif dalam evaluasi akurasi
suatu metode menjadi alternatif yang
dapat dilakukan jika terdapat metode
analisis lain yang telah diakui dan
tersedia data validasinya.
Pada prinsipnya prosedur uji komparatif mirip
dengan uji CRM, namun yang dibandingkan di
sini adalah hasil analisis metode yang akan
divalidasi terhadap hasil metode
baku/pembanding terhadap suatu contoh
homogen yang sama, menggunakan Uji Beda
Nyata Terkecil pada tingkat kepercayaan 95%.
Akurasi; Uji Komparatif
Pilih suatu contoh homogen dan stabil yang
memiliki kandungan matriks mewakili
dengan volume yang cukup.
Lakukan analisis berulang terhadap contoh
tersebut menggunakan metode pembanding
dan metode yang akan divalidasi masing-
masing sebanyak minimal enam kali ulangan.
Reratakan kadar hasil uji, hitung standar
deviasinya, lalu uji beda nyata terkecil
dengan confidence level 95%.
Akurasi; Uji Komparatif
Metode uji terbukti
akurat jika rerata
hasil uji tidak
memberikan
perbedaan nyata
dengan rerata hasil
uji dari metode
pembanding.
Akurasi; Perbandingan Tehnik Perhitungan
Untuk membandingkan tingkat presisi kedua metode
lakukan uji F dua arah terhadap S (standar deviasi)
masing-masing kumpulan data; H0: S1=S2; H1: S1S2 S1>S2..
2
S1
Fhitung = 2
S2
F tabel dicari berdasar tabel F dua arah dengan
menentukan titik potong dari kordinat v1 = n1-1 sebagai
sumbu X, dan v2 = n2-1 sebagai sumbu Y.
Akurasi; Perbandingan Tehnik Perhitungan
Untuk membandingkan tingkat akurasi kedua metode
lakukan uji t-student dua arah terhadap rata-rata masing-
masing kumpulan data; H0: x1=x2; H1: x1x2 yang rumus-
rumusnya ditentukan oleh simpulan uji F.
Jika simpulan uji F : S1 = S 2 , maka :
( n1 1) S1 + ( n 2 1) S 2
2 2

S gabungan =
( n1 + n 2 2)
( x1 x 2 )
t hitung =
1 1
S gabungan x +
n1 n 2
db = n1 + n 2 2
Akurasi; Perbandingan Tehnik Perhitungan
Jika simpulan uji F : S 1 S 2 ,maka :
(x1 x 2 )
t hitung =
S12 S2
2
+
n n
1 2

S1
2
S
2

+ 2
n1 n2
db = 2 2 2
S1 2
S2 2

n1

n2

+
n 1 + 1 n2 + 1
Akurasi; Perbandingan Tehnik Perhitungan
Contoh soal
Sebuah laboratorium ingin menggunakan metode baru
untuk analisis protein sebagai alternatif dari metode
Kjeldahl yang selama ini sudah rutin dikerjakan
sebagai official method yang telah diketahui tingkat
akurasi dan presisinya. Dari 6 kali pengulangan contoh
yang sama didapat data berikut:
Metode Kjeldahl (%): 1,84; 1,92; 1,94; 1,92; 1,85; 1,91.
Metode Baru (%): 1,94; 2,01; 2,03; 2,03; 1,96; 2,00.
Apakah metode baru tersebut sama tingkatan akurasi
dan presisinya?
Akurasi; Perbandingan Tehnik Perhitungan
Penyelesaian soal
Metode Kjeldahl: Rata-rata = 1,90; S = 0,0413; n = 6
Metode Baru: Rata-rata = 2,00; S = 0,0373; n = 6
0,04132 Ftabel (v1=5, v2=5); P=95%
Fhitung = =1,2260 7,146; F
hitung < Ftabel; terima H0.
2
0,0373
( 6 1) 0 ,0413 2 + ( 6 1) 0 ,0373 2 Simpulan:
S gabungan = = 0 ,0393
(6 + 6 2) thitung>ttabel;
1,90 2 ,00 tolak H0:
t hitung = = 4 , 4073
0 ,0393 x
1 1
+
akurasi kedua
6 6 metode tidak
db = 6 + 6 2 = 10
t tabel = 2 , 23
sama
Presisi
Terdapat tiga tingkatan dalam mengevaluasi presisi
suatu metode uji, pelaksanaannya sesuai dengan
ketersediaan prasyarat dan jenis metode uji, yaitu:
Repeatability; sinonim dengan
repitabilitas, keberulangan.
Intra Reproducibility (r); sinonim
dengan presisi intermediet, presisi
antara.
Inter Reproducibility (R); sinonim
dengan reprodusibilitas.
Presisi
Repitabilitas
Merupakan tingkatan presisi yang hanya
mengevaluasi galat yang berasal dari
metode. Diasses menggunakan beberapa
teknik pendekatan, yaitu:
A. Analisis berulang pada level 100%
konsentrasi uji.
Suatu contoh homogen dan representatif
dianalisis sebanyak minimal 7 kali
ulangan oleh analis yang sama pada waktu
yang berdekatan, menggunakan peralatan
dan pereaksi dari batch yang sama.
Presisi
Repitabilitas, Analisis berulang pada level
100% konsentrasi uji
Dari hasil analisis berulang tersebut
hitunglah %RSD (% Relative Standard
Deviation) = %SBR (% Simpangan Baku
Relatif), lalu bandingkan dengan nilai
2/3 x CVHorwitz. Metode memiliki
repeatability yang baik jika diperoleh
nilai %RSD 2/3 x CVHorwitz.
CVHorwitz = 2(1 0,5logC)
Dimana C = Konsentrasi analit dalam
fraksi desimal, konsentrasi analit
dikonversi menjadi sama satuan antara
pembilang dan penyebut.
Presisi
Repitabilitas, Analisis berulang pada level
100% konsentrasi uji

x =
x
n
(x x)
2

S =
i

n 1
S
% RSD = CV = % SBR = 100 %
x
(1 0 , 5 log C )
CV Horwitz = 2
Presisi
Repitabilitas, Analisis berulang pada level
100% konsentrasi uji, contoh soal
Guna mengetahui presisi metode pengujian
kadar H2S secara spektrofotometri dari
contoh air dilakukan 7 kali analisis
berulang terhadap suatu sampel yang
homogen sehingga didapat data kadar
sebagai berikut: 0.035; 0.042; 0.040;
0.038; 0.045; 0.036; dan 0.045 ppm.
Apakah metode tersebut terbukti presisi?

Penyelesaian
Presisi
Repitabilitas, Analisis berulang pada level 100%
konsentrasi uji, contoh soal
Ulangan ppm H2S (x i x )2 0.281
x= = 0.040ppm
1 0.035 2.64e-05 7
2 0.042 3.45e-06 9.89e 05
S= = 0.0041
3 0.040 2.04e-08 7 1
4 0.038 4.59e-06
5 0.045 2.36e-05
6 0.036 1.72e-05
7 0.045 2.36e-05
Jumlah 0.281 9.89e-05
Presisi
Repitabilitas, Analisis berulang pada level 100%
konsentrasi uji, contoh soal
0.0041 Simpulan: %RSD
% RSD = 100% = 10.25% < 2/3CVHorwitz,
0.040
C = 0,040 mg / L sehingga
repeatability
C = 0.040 mg / kg
metode dapat
C = 0.040 mg / 1000.000mg dikatakan
6 8
C = 0.040 x10 = 4.0 x10 memenuhi syarat
(1 0 , 5 log 4.0 x10 8 )
CV Horwitz = 2 = 25.97
2 CV Horwitz = 2 x 25.97 = 17.31
3 3
Presisi
Repitabilitas
B. Analisis berulang pada 3 level
konsentrasi berbeda.
Teknik pendekatan ini merupakan suatu
usaha sinergisasi dengan evaluasi akurasi
(spike recovery) karena data bisa didapat
dari pengerjaan spike recovery. Dihitung
%RSD dari kadar yang didapat pada masing-
masing level konsentrasi spike recovery
untuk kemudian dibandingkan dengan nilai
2/
3 x CVHorwitz.
Presisi
Repitabilitas
Hal mendasar yang perlu diingat dalam
mengevaluasi repeatability adalah
analisis berulang dilakukan oleh satu
orang analis dan dalam waktu yang tidak
berjauhan (dalam hari yang sama jika
memungkinkan), guna mengeliminasi sumber
galat yang berasal dari perubahan
kondisi lingkungan (temperatur, tekanan,
humidity, dsb.)terutama pada
laboratorium-laboratorium yang kurang
terkontrol kondisi lingkungan ambiennya.

Intra Reprodusibilitas
Presisi
Intra Reprodusibilitas (r)
Adalah tingkatan presisi yang selain
mengevaluasi galat yang berasal dari
metode, juga galat yang berasal dari
operator.
Pada prinsipnya teknik evaluasi Intra
Reproducibility dilakukan sama dengan
repeatability, hanya saja dilakukan oleh
operator yang berbeda dan pada waktu
pelaksanaan yang berbeda pula (berbeda
hari)terhadap suatu sampel homogen dan
representatif yang sama.
Presisi, Intra Reprodusibilitas
Diasses menggunakan beberapa teknik
pendekatan, yaitu:
1. Analisis Berulang pada Level 100%
Konsentrasi Uji
Suatu contoh homogen dan representatif
dianalisis sebanyak minimal 7 kali
ulangan oleh analis pertama dan 7 kali
ulangan lagi oleh analis kedua pada waktu
yang berjauhan, menggunakan peralatan dan
pereaksi dari batch yang berbeda jika
memungkinkan. Dari hasil analisis
berulang oleh kedua analis tersebut
sehingga total menghasilkan 14 buah data,
hitunglah %RSD-nya.
Presisi
Intra Reprodusibilitas, Analisis berulang
pada level 100% konsentrasi uji
%RSD yang didapat dari total 14 buah data
tersebut lalu dibandingkan dengan nilai
2/
3 x CVHorwitz.
Metode memiliki intra reproducibility
yang baik jika diperoleh nilai %RSD 2/3
x CVHorwitz.

2. Analisis berulang pada 3 level

konsentrasi berbeda
Presisi
Intra Reprodusibilitas, analisis berulang
pada 3 level konsentrasi berbeda
Merupakan suatu usaha sinergisasi dengan
evaluasi akurasi (spike recovery) karena
data bisa didapat dari pengerjaan spike
recovery. Analis kedua pun harus
mengerjakan analisis berulang contoh
spike recovery yang sama dengan analis
pertama, setidaknya untuk level 100%
konsentrasi uji. Dihitung %RSD dari kadar
yang didapat oleh kedua analis pada
masing-masing level konsentrasi spike
recovery untuk kemudian dibandingkan
dengan nilai 2/3 x CVHorwitz.
Presisi
Inter Reprodusibilitas (R)
Merupakan tingkatan
presisi tertinggi karena
mengevaluasi secara
lengkap galat yang berasal
dari metode, operator dan
laboratorium (System
Suitability).
Presisi
Inter Reprodusibilitas (R)
Mekanisme pelaksanaan Inter
Reproducibility dapat dikatakan sama
dengan Uji Profisiensi, namun dalam hal
ini juga disertakan metode yang harus
digunakan dengan tujuan khusus untuk
mengetahui tingkat presisi dari suatu
metode baru.
Suatu contoh yang terjamin homogenitas
dan kestabilannya setidaknya hingga waktu
pelaksanaan yang dibutuhkan, disiapkan
dalam jumlah yang memadai.
 Presisi
Inter Reprodusibilitas (R)
Contoh tersebut didistribusikan kepada
minimal 8 laboratorium (untuk keperluan
publikasi, sedang untuk validasi
internal cukup 3 laboratorium)yang telah
meyanggupi untuk melakukan analisis
sesuai dengan metode yang diminta secara
duplo pengulangan. Dalam batas waktu
tertentu data dikumpulkan untuk kemudian
dilakukan seleksi data dan perhitungan
%RSD. Jika didapat %RSD CVHorwitz maka
metode dikatakan memiliki Inter
Reproducibility yang baik.
Linieritas
A. Jika Tersedia Blangko Matriks:
Dibuat preparat deret kalibrasi
menggunakan blangko matriks yang ke
dalamnya ditambahkan secara kuantitatif
analit standar yang diketahui
konsentrasinya secara pasti.
Konsentrasi preparat yang dibuat minimal
enam level konsentrasi yang melingkupi
konsentrasi uji contoh (0, 50, 80, 100,
120, dan 150%).
Linieritas, Jika Tersedia Blangko Matriks
Konsentrasi preparat yang dibuat minimal
enam level konsentrasi yang melingkupi
konsentrasi uji contoh (0, 50, 80, 100,
120, dan 150%).
Dilakukan analisis pada masing-masing
preparat menggunakan metode yang akan
divalidasi dengan jumlah pengulangan
sebanyak tiga kali.
Dihitung korelasi antara respon analitik
rata-rata yang didapat dengan konsentrasi
teoretis analit dalam preparat.
Metode dikatakan linier pada rentang
konsentrasi tertentu jika didapat nilai
koefisien korelasi ( r ) nilai tabel
Pearson.
Linieritas
B. Jika Tidak Tersedia Blangko Matriks:
Pilih suatu contoh homogen dan stabil
yang memiliki kandungan matriks mewakili
dengan volume yang cukup.
Lakukan analisis berulang sebanyak
minimal enam kali ulangan terhadap contoh
tersebut guna menetapkan konsentrasi uji
baseline.
Dibuat preparat deret kalibrasi dengan
menambahkan secara kuantitatif analit
standar yang diketahui konsentrasinya
secara pasti ke dalam contoh yang telah
dipilih tadi.
Linieritas, Jika Tidak Tersedia Blangko Matriks
Konsentrasi preparat yang dibuat minimal
enam level konsentrasi yang melingkupi
konsentrasi uji contoh (0, 50, 80, 100, 120,
dan 150%).
Dilakukan analisis pada masing-masing
preparat menggunakan metode yang akan
divalidasi dengan jumlah pengulangan
sebanyak tiga kali.
Dihitung korelasi antara respon analitik
rata-rata yang didapat dengan konsentrasi
teoretis analit dalam preparat.
Metode dikatakan linier pada rentang
konsentrasi tertentu jika didapat nilai
koefisien korelasi ( r ) nilai tabel
Pearson.
Linieritas, Rumus Perhitungan
Replikat Konsentrasi Rerata Respon Anlitik Rerata Koefisien
(n) Analit dalam
Preparat (x)
(x) Analit dalam
Preparat ( y )
( y) Korelasi (r )
Tabel data di
1
2
x 1a
x 1b
y 1a
y 1b
samping
x1 y1
3
1
x 1c
x 2a
y 1c
y 2a
dirancang untuk
2 x 2b
x2
y 2b y2 6 titik
3 x 2c y 2c
1 x 3a y 3a konsentrasi dan
2 x 3b y 3b
3 x 3c
x3
y 3c
y3
masing-masing
1 x 4a y 4a
2 x 4b
x4
y 4b y4
titik diulang
3
1
x 4c
x 5a
y 4c
y 5a
sebanyak 3 kali,
2
3
x 5b
x 5c
x5
y 5b
y 5c
y5 sehingga akan
1
2
x 6a
x 6b
y 6a
y 6b
menghasilkan 3
x6 y6
3 x 6c y 6c r kurva linieritas.
Linieritas
x y
xy i i
Rumus
i i
r= n
Perhitungan

x2 ( x ) 2

y ( y )2

Koefisien
i i
i 2 i

n n Korelasi

Keterangan :
x i = Datum konsentrasi ke i; y i = Datum respon analitik

analit ke i; x = Konsentrasi rerata; y = Respon analitik

rerata; n = Jumlah datum setelah direratakan
Linieritas, Tabel Pearson
Tabel Pearson untuk Nilai Koefisien Korelasi
DF (n-2) 95% 99%
2 0.950 0.990
3 0.878 0.959
4 0.811 0.917
5 0.754 0.875
6 0.707 0.834
7 0.666 0.798
Sumber : RC Chem, Puslit Kimia LIPI
 Linieritas, Limit of Linearity-LOL (Limit
Linieritas-LL)
Sebenarnya terdapat parameter tambahan
yang bisa sekaligus dilakukan dalam
pengerjaan linieritas, yaitu Limit of
Linearity yang oleh beberapa literatur
dijadikan parameter pengganti Limit of
Detection bagi metode-metode analisis
yang diperuntukkan untuk pengujian
contoh-contoh yang kandungan analitnya
besar.
Limit of Linearity didefinisikan sebagai
 Linieritas, Limit of Linearity-LOL (Limit
Linieritas-LL)
Limit of Linearity didefinisikan sebagai
konsentrasi analit terbesar yang dapat
dikuantitasi dengan handal oleh suatu
metode dan secara statistik masih
memberikan hubungan yang linear terhadap
respon analitiknya, dievaluasi melalui
perlakuan lengkap metode, termasuk
ekstraksi kimia dan/atau preparasi awal
contoh.
 Linieritas, LOL
Secara praktis evaluasi LOL sama dengan
linieritas.
Dibuat preparat LOL seperti pada
evaluasi linieritas, hanya saja
konsentrasi yang dibuat minimal enam
level konsentrasi yang melingkupi
konsentrasi uji contoh hingga sedikit di
atas ( 50%) konsentrasi yang
diperkirakan sudah tidak lagi memberikan
respon linier.
 Linieritas, LOL
Dilakukan analisis pada masing-masing
preparat menggunakan metode yang akan
divalidasi dengan jumlah pengulangan
sebanyak tiga kali.
Dihitung korelasi antara respon analitik
rata-rata yang didapat dengan konsentrasi
teoretis analit dalam preparat.
Konsentrasi terbesar yang masih
memberikan nilai koefisien korelasi (r)
nilai (r) tabel Pearson dinyatakan
sebagai LOL.
 Linieritas, LOL
Pada beberapa acuan seperti yang berkaitan
dengan makanan dan/atau obat-obatan kriteria
keberterimaan LOL adalah konsentrasi
terbesar yang masih memberikan koefisien
korelasi 0,98 (CPOB, hlm. 418), tidak
tergantung pada jumlah titik konsentrasi.
Jika diamati, ketentuan ini memberikan acuan
lebih ketat dibandingkan Pearson. Acuan ini
dapat pula digunakan pada bidang yang lain,
terutama dikarenakan tingkat ketelitian yang
lebih memuaskan dan sesuai dengan pengamatan
visual kurva kalibrasi yang didapat.
 Linieritas, LOL
KURVA KALIBRASI
25.000
RESPON ANALITIK

20.000 LOL
Ulangan I
15.000
Dynamic Ulangan II
10.000 Range Ulangan III
LOQ
5.000 MDL
IDL
0.000
0 5 10 15 20 25 30

KONSENTRASI
 Selektivitas
Prinsip dari evaluasi selektivitas (= spesifitas =
konfirmasi identitas) adalah suatu studi untuk
meyakinkan bahwa respon analitik yang
dihasilkan oleh mekanisme pengukuran hanya
berasal dari analit dan bukan berasal dari
senyawa lain atau bukan merupakan
campuran respon analitik dari analit +
senyawa lain yang memiliki sifat serupa
dengan analit. Parameter ini terutama
menunjukkan kualitas pemisahan analitik dari
suatu metode.
 Selektivitas
Selektifitas dievaluasi dengan dua cara, yaitu:

A. Jika Terdapat Blangko Matriks

Lakukan analisis berulang terhadap
blangko matriks sebanyak minimal 7
kali ulangan.
Lakukan analisis berulang pula
terhadap blangko matriks yang
ditambahi analit sehingga konsentrasi
akhir preparat 100% konsentrasi uji
sebanyak minimal 7 kali ulangan.
 Selektivitas
A. Jika Terdapat Blangko Matriks
Metode dikatakan memiliki selektivitas
yang baik jika respon analitik yang
didapat dari blangko matriks 2% dari
respon analitik 100% konsentrasi uji.

B. Jika Tidak Terdapat Blangko Matriks

Pilih suatu contoh homogen dan stabil
yang memiliki kandungan matriks mewakili
dengan volume yang cukup
 Selektivitas
B. Jika Tidak Terdapat Blangko Matriks
Bagi contoh tersebut menjadi 2.
Lakukan minimal 7 kali ulangan analisis
terhadap bagian contoh pertama.
Tambahkan senyawaan yang memiliki
kesamaan sifat yang diduga biasa terdapat
di dalam objek uji yang dapat mengganggu
analisis. Disesuaikan penambahan
senyawaan sehingga didapatkan konsentrasi
analit dalam preparat akhir sama dengan
konsentrasi analit yang terdapat dalam
contoh yang tidak diberikan perlakuan.
 Selektivitas
B. Jika Tidak Terdapat Blangko Matriks
Rata-ratakan masing-masing kumpulan
data yang didapat.
Hitung standar deviasi masing-masing
kumpulan data yang didapat.
Lakukan Uji Beda Nyata Terkecil (BNT)
terhadap kedua kumpulan data dengan
tatacara seperti pada perhitungan uji
akurasi teknik komparasi.
Metode dikatakan memiliki selektivitas
yang baik jika tidak terdapat perbedaan
yang nyata antara kumpulan data I dan
kumpulan data II.
 Limit Deteksi, LOD
Method Detection Limit-MDL (Limit Deteksi
Metode-LDM)
Limit deteksi metode dapat ditentukan
dengan setidaknya tiga cara, yaitu:
(1). menggunakan blangko matriks jika
diperkirakan akan meghasilkan respon
(misal pada metode spektrofotometri),
(2). menggunakan standar adisi jika tidak
diperoleh respon dari blangko atau tidak
tersedia blangko matriks (misal pada
metode kromatografi), dan
(3). menggunakan pendekatan statistik
berdasar kurva kalibrasi (teknik korelasi
dan regresi).
 Limit Deteksi, LOD
MDL,(1). Menggunakan Blangko Matriks
Jika teridentifikasi bahwa blangko
matriks memberikan respon, maka lakukan
analisis berulang terhadap blangko
matriks tersebut minimal 7 kali
pengulangan.
Hitung kadar yang didapat dari respon
blangko matriks tersebut (gunakan slope
dari deret standar jika diperlukan, misal
pada pengukuran absorbansi).
Hitung rata-rata (x)dan standar deviasi
(S) dari kadar-kadar tersebut.
MDL ditetapkan sebagai x + 3S.
Limit Deteksi, LOD
MDL,(1). Menggunakan Blangko Matriks
Ulangan Respon Blangko (y) (yi-)2
1 y1 (y1-)2
2 y2 (y2-)2
3 y3 (y3-)2
4 y4 (y4-)2
5 y5 (y5-)2
6 y6 (y6-)2
7 y7 (y7-)2
Jumlah y (yi-)2
Limit Deteksi, LOD
MDL,(1). Menggunakan Blangko Matriks

y=
y
n
(y y)
2

S=
i

n 1
y MDL = y + 3S
y MDL
C MDL =
Slope
 Limit Deteksi, LOD
MDL,(2). Menggunakan Standar Adisi
Jika analisis berulang terhadap blangko
tidak menunjukkan respon maka tambahkan
ke dalam blangko matriks tesebut standar
analit hingga didapat konsentrasi analit
dalam preparat sebesar lima kali
konsentrasi MDL yang telah diperkirakan
(dapat menggunakan nilai intercept dari
kurva standar operasional).
Lakukan minimal 7 kali ulangan analisis
terhadap preparat standar adisi tersebut.
 Limit Deteksi, LOD
MDL-Menggunakan Standar Adisi
Hitung kadar yang didapat dari respon
blangko matriks tersebut (gunakan slope
dari deret standar jika diperlukan, misal
pada pengukuran absorbansi).
Hitung kadar yang didapat dari respon
preparat standar adisi tersebut (gunakan
slope dari deret standar jika diperlukan,
misal pada pengukuran absorbansi).
Hitung rata-rata (x)dan standar deviasi
(S) dari kadar-kadar tersebut.
MDL ditetapkan sebagai x + 3S.
 Limit Deteksi, LOD
MDL,(3) Berdasar Kurva Kalibrasi
Kurva kalibrasi yang dimaksudkan dalam
hal ini adalah kurva hubungan antara
respon analitik sebagai sumbu Y terhadap
konsentrasi analit (di dalam preparat
blangko matriks yang telah ditambahkan ke
dalamnya secara kuantitatif analit pada
konsentrasi tertentu yang lalu
diperlakukan sama dengan contoh, melewati
perlakuan lengkap metode, termasuk
ekstraksi kimia dan/atau preparasi awal
contoh) sebagai sumbu X. Data kurva
kalibrasi ini dapat diperoleh dari
pengerjaan limit linieritas.
 Limit Deteksi, LOD
MDL-Berdasar kurva kalibrasi
Dari data kurva kalibrasi pada Limit of
Linearity (data yang digunakan cukup
hingga konsentrasi LOL saja, konsentrasi
selebihnya dibuang)hitunglah nilai dari
persamaan linier yang didapat =a+bx
(dimana a=intercept, x=konsentrasi,
b=slope) dan (yi- )2. Respon analitik
MDL didefinisikan sebagai a + 3Sy/x,
dimana: a = intercept, dan
Sy/x = {(yi- )2/(n-2)}1/2
 Limit Deteksi, LOD
MDL-Berdasar kurva kalibrasi
Pola pendekatan secara statistik ini dipandang
praktis karena dapat menggunakan data kurva
kalibrasi yang telah ada, namun beberapa literatur
kurang menyetujuinya dan lebih memandangnya
hanya sebagai cara untuk memperkirakan nilai MDL
yang harus dibuktikan lebih lanjut lagi dengan
analisis berulang preparat pada konsentrasi MDL
perolehan. Nilai MDL diterima jika diperoleh sebaran
50% data nilai dan 50% data nilai. Jika
masih didapat akurasi & presisi yang baik,
konsentrasi harus diencerkan.
 Limit Deteksi, LOD
Instrument Detection Limit-IDL dan
Practical Detection Limit-PDL
IDL dan PDL dievaluasi dengan cara yang
sama sebagaimana mengevaluasi MDL, hanya
saja yang blangko matriks pada MDL
diganti oleh blangko pereaksi pada IDL
dan contoh sebenarnya yang memiliki
kandungan analit amat kecil pada PDL.
Terutama sekali yang sering dikerjakan
adalah IDL dan MDL. PDL hanya dikerjakan
dalam bidang-bidang tertentu saja yang
amat sulit sekali mendapatkan blangko
matriks seperti halnya dalam kimia
lingkungan.
 Limit Kuantitasi, LOQ
Demikian pula halnya dengan LOQ,
dievaluasi menggunakan teknik
pendekatan yang sama dengan MDL, hanya
saja berbeda dalam perhitungan, angka 3
yang ditemui dalam tiap perhitungan MDL
diganti menjadi 10.
LOQ = yB + 10S, dimana yB = respon
blangko, dan S = Standar deviasi respon
blangko.
 Limit Kuantitasi, LOQ
Sebagai tambahan, dalam LOQ nilai yang
didapat harus kemudian dibuktikan
tingkat presisinya dengan analisis
berulang preparat LOQ (konsentrasi
analit = 10xMDL) sebanyak minimal 7
kali pengulangan. Terhadap 7 data yang
didapat dihitung %RSD-nya untuk
dibandingkan dengan CVHorwitz. Nilai yang
didapat ditetapkan sebagai LOQ jika
%RSD 2/3CVHorwitz.
 Robustness
Sebagai variasi dalam uji robustnes
biasanya diambil variabel yang mungkin
terjadi di lapangan, atau dapat juga
sebagai pembuktian dari suatu dugaan
terhadap tahapan metode. Guna keperluan
yang terakhir perlu pemahaman titik-
titik kritis metode.
Akan lebih mudah dalam penentuan
variasi yang akan diteliti pengaruhnya
dengan pertanyaan-pertanyaan seperti
berikut:
Berapa lama larutan uji stabil?
 Robustness
Berapa lama waktu ekstraksi yang
optimum?
Apa pengaruh varisi pH dalam fasa gerak
terhadap hasil analisis HPLC?
Apa pengaruh variasi komposisi fasa
gerak terhadap hasil analisis HPLC?
Apa pengaruh perbedaan merk atau nomor
lot kolom terhadap hasil analisis
kromatografi?
Apa pengaruh perbedaan suhu dan laju
alir terhadap hasil analisis HPLC?
 Robustness
Setelah menentukan variasi yang akan
diteliti pengaruhnya, langkah
selanjutnya adalah menyusun suatu
rancangan percobaan. Rancangan paling
sederhana yang sering digunakan adalah
dengan memberikan 1 jenis perlakuan
dengan level berbeda terhadap 1 contoh
homogen dan stabil yang sama guna
melihat pengaruh perlakuan tersebut,
biasa disebut perbandingan beberapa
rataan.
 Robustness
Contoh kasus
Percobaan dilakukan terhadap 1 contoh yang
sama untuk meneliti pengaruh cahaya terhadap
hasil ukur analisis fluorometri.

Kondisi Hasil 3x analisis Rerata S

A; Fresh 102; 100; 101 101 1.0000
B; 1 jam dalam gelap 101; 101; 104 102 1.7321
C; 1 jam dalam cahaya redup 97; 95; 99 97 2.0000
D; 1 jam dalam terang 90; 92; 94 92 2.0000
Grand Mean 98 -
 Robustness
Contoh kasus
Rata-rata perlakuan B, C, dan D masing-
masing dibandingkan terhadap A menggunakan
uji beda nyata terkecil seperti pada uji
akurasi teknik komparasi. Dalam uji
tersebut terdapat 2 bagian; uji F untuk
mengetahui tingkat presisi, dan uji t
untuk mengetahui tingkat akurasi dengan
acuan nilai dari perlakuan kontrol. Dengan
demikian akan diketahui selain pengaruh
cahaya, juga lebih tajam sampai selama apa
pengaruh cahaya masih dapat ditolerir.
 Robustness
Sim
Perla Rera t
S Fhitung Ftabel Sgab thitung db tabel pula
kuan ta
n
A 101 1.000 - - -

B 102 1.732 3.000 1.414 0.866

39.00 4 2.78
C 97 2.000 4.000 1.581 3.099 *

D 92 2.000 4.000 1.581 6.972 *

* Beda nyata; Tidak beda nyata

 Robustness
Metode
Analisis
Variasi

Metode Ya Presisi Tidak Metode Tidak

Robust Baik? Robust

Modifikasi
Metode
TERIMA KASIH