IMPRINT DAN FROZEN SECTION

I. FROZEN SECTION

A. Pendahuluan 1,2

Metode pemeriksaan frozen section yang dilakukan di labaratorium saat ini

berdasar pada uraian Dr. Louis B. Wilson pada tahun 1905. Wilson

mengembangkan teknik ini pertama sekali atas permintaan Dr. William Mayo,

seorang ahli bedah dan salah satu pendiri Mayo Klinik. Sebelumnya pernah

dilaporankan oleh Dr. Thomas Cullen pada Rumah Sakit Johns Hopkins di

Baltimore yang menggunakan metode frozen section tetapi hanya memakai formalin

sebagai media fiksasi. Seorang ahli patologi Dr. William Welch, juga pada Rumah

Sakit Johns Hopkins, mengadakan percobaan dengan prosedur Cullen's tetapi tidak

memiliki makna klinis. Oleh karena itu, Dr. Louis B. Wilson dianggap sebagai pelopor

Metode Frozen Section.

Frozen section merupakan metode pengelolaan jaringan dengan tidak

memakai proses dehidrasi, clearing dan embedding. Frozen section merupakan

teknik pemeriksaan histologi, tetapi kemudian digunakan untuk melihat substansi

jaringan dan untuk mendiagnosa penyakit pada biopsi jaringan pada kasus-kasus

darurat. Prosedur standar dapat menimbulkan efek yang mengganggu dalam

melihat unsur-unsur jaringan yang diperiksa (Banccroft & Cook 1994). Peningkatan

teknik frozen section belakangan ini menghasilkan perkembangan yang cepat pada

bidang histokimia dan imunohistokimia.

B. Definisi 2
 Frozen section adalah teknik pengelolaan jaringan dengan cara membekukan

dengan cepat (quenching) suatu jaringan segar pada suhu -160C, dan berikutnya

memindahkan molekul air (di dalam es) dengan proses sublimasi pada ruang

vakum dengan suhu yang lebih tinggi lagi, misalnya -40C. Kemudian blok

diletakkan pada suhu ruangan dan difiksasi dengan uap air atau embedding di

dalam medium yang sesuai.

2,3
C. Aplikasi Frozen Section

Frozen section memiliki banyak aplikasi yang dapat digunakan dalam

pemeriksaan histopatologi, antara lain :

Mendiagnosa keganasan pada durante operasi (on-table)

Digunakan pada diagnosa dan penelitian enzim histokimia dimana enzim

bersifat labil

Digunakan pada metode immunofluorescent

Digunakan pada metode immunohistokimia

Digunakan pada diagnosa dan penelitian non-enzim histokimia, misalnya

lemak dan karbohidrat

Digunakan pada beberapa metode di dalam neuropatologi

D. Metode Frozen Section 3

 Untuk menghasilkan hasil yang baik, ketebalan pemotongan pada cryostat

merupakan salah satu syarat yang harus dipenuhi. Jaringan harus dalam keadaan

baik. Kualitas terbaik pada teknik cryostat section dihasilkan dari jaringan tanpa

fiksasi, dengan membekukan segera oleh salah satu teknik di bawah ini. Kondisi di

dalam cryostat harus optimal, meliputi:

Temperatur blok harus tepat sebelum jaringan dipotong

Kerja microtome harus baik

Penyesuaian anti-roll plate harus tepat

Jaringan yang akan dibekukan harus dalam keadaan segar dan secepat

mungkin dibekukan. Apabila pembekuannya lambat dapat menyebabkan distorsi

dan akan terbentuk artefak kristal es pada jaringan. Metode frozen section pada

umumnya menggunakan:

Nitrogen cair (-190C)

Isopentane yg didinginkan dengan nitrogen cair (-150C)

Karbondioksida cardice (-70C)

Gas karbondioksi (-70C)

Aerosol spray (-50C)

 Penggunaan gas cair dalam keadaan normal sudah dibatasi pada teknik

histokimia. Kelompok gas yang banyak digunakan adalah nitrogen cair.

Keuntungannya yaitu dapat membekukan dengan cepat dan lebih dapat diterima

penggunaannya oleh banyak pihak. Sedangkan kerugiannya adalah pada jaringan

lunak dapat menyebabkan terbentuknya kristal es yang cepat dan luas pada

jaringan.

E. Ketebalan jaringan 5

Ketebalan jaringan yang dianjurkan untuk teknik frozen section adalah 6

(enam) mikron. Pada ketebalan ini zat warna akan diserap dengan baik dan sediaan

akan mudah untuk dibaca sehingga ahli patologi akan dapat mengumpulkan banyak

informasi. Pemotongan yang lebih tipis akan menyebabkan pewarnaan yang pucat

karena zat warna kurang terserap dan akan banyak bagian yang tidak dapat dibaca.

Meskipun demikian ketebalan enam mikron akan lebih banyak membutuhkan

waktu untuk pengeringan artefak. Tetapi akan mengurangi lubang pada inti sel yang

berasal dari artefak kristal es.

Ketebalan harus diperhatikan secara visual. Berikut ini akan ditunjukkan

gambaran Lung Adenocarcinoma dan Uterine Sarcoma dengan ketebalan

pemotongan 6 micron dan 3 micron.

Biasanya ketebalan yang dikehendaki tidak dapat langsung diperoleh, akan

tetapi harus dilakukan berulang-ulang sampai diperoleh ketebalan yang dikehendaki.

Perubahan temperatur pada blok yang telah diambil akan menyebabkan

perubahan suhu menjadi lebih hangat dan jaringan akan mengembang. Oleh karena
itu jaringan dipotong sedikit lebih tipis dari yang diperlukan sehingga ketika

mengembang akan didapat ketebalan jaringan yang diinginkan.

F. Metode Pewarnaan 2,3,5

Metode pewarnaan yang paling sering digunakan adalah Hematoxylin yang

dikombinasikan dengan Eosin. Prosedur pewarnaan sama seperti metode lainnya

yang memakan waktu 1-2 menit. Pewarnaan yang lebih cepat adalah Methylen

Polychromatic Blue yang membutuhkan waktu 1-2 detik. Setelah jaringan diletakkan

diatas 4-5 slide kemudian tetesi dengan Methylen Blue 4% dan segera celupkan ke

dalam air dan larutan glukosa 5%.

Prusedur pewarnaannya dengan menggunakan pewarnaan Hematoxylin

Eosin (HE) adalah sebagai berikut :

1. Fiksasi jaringan dengan formol-acetic alcohol selama 20 detik

2. Bilas dengan air bersih

3. Beri pewarnaan Harriss hematoxylin selama 1,5 menit

4. Bilas dengan cairan lithium carbonate, alcaline tap water atau Scotts tap

water

5. Bilas dengan air bersih

6. Beri perwarnaan Eosin selama 10 detik

7. Bilas dengan air bersih

8. Keringkan dan tutup dengan deckglass

 Kita juga dapat menggunakan teknik frozen section ini dengan pewarnaan

Periodic Acid Schiff (PAS) untuk memperlihatkan sel-sel yang memproduksi mucin.

Khususnya adanya Signet Ring Cell ( pada kasus peritoneal metastasis atau untuk

menentukan batas reseksi pada kanker lambung). Kemudian slide frozen section

dimasukkan ke dalam mikrowave 600 W , lalu ambil slide tersebut dan tambahkan

1% zat warna PAS. Setelah itu dikembalikan ke dalam mirowave selama 10-15 detik.

Kemudian dibilas lagi dengan air dan tempatkan ke dalam suatu cuvette dan

masukkan ke dalam mikcrowave selama 10-15 detik. Terakhir dibilas lagi dengan

air.

PAS bernilai positif apabila jaringan tampak berwarna sedikit kemerahan.

Apabila dilakukan pewarnaan counterstain dengan methylen blue dapat selesai

dalam waktu 30 detik.

G. Prosedur Frozen Section 1, 2, 6

Prosedur frozen section dapat dibagi dalam empat tahap, yaitu :

Quenching (freezing)

Drying

Fixation and embedding

Subsequent treatment

Quenching

Tahap ini merupakan tahap menghentikan reaksi kimia dan difusi di dalam

jaringan. Proses ini menyebabkan air di dalam jaringan akan berubah menjadi kristal

es. Dan tahap berikutnya jaringan akan masuk ke dalam fase drying.
 Drying

Bagian ini merupakan teknik selanjutnya yang akan lebih banyak memakan

waktu, dimana jaringan mengandung 70-80% air dan akan menghilangkannya tanpa

merusak jaringan tersebut. Drying dapat dibagi menjadi 3 (tiga) tahap, yaitu :

Masuknya panas ke jaringan yang menyebabkan proses sublimasi

Perpindahan uap air dari kristal es yang melalui bagian yang kering dari

jaringan

Kembalinya uap air ke permukaan jaringan

H. Kelebihan Frozen Section 2

Teknik frozen section jarang digunakan dalam pemeriksaan patologi rutin,

meskipun memiliki aplikasi pada teknik imunohistokimia. Teknik ini banyak memiliki

kelebihan yang dapat meminimalisasi :

Kehilangan substansi terlarut

Perubahan letak bagian-bagian sel

Perubahan zat kimia yang reaktrif

Denaturasi protein

Kehancuran dan inaktivasi enzim

 4
I. Keterbatasan Frozen Section

Dalam Bab VII buku Surgical Pathology Ackerman's, disebutkan bahwa frozen

section merupakan salah satu prosedur yang penting tetapi sulit dilakukan oleh

seorang ahli patologi karena memerlukan pengetahuan dan pengalaman yang

cukup.

Dalam Manual Surgical Pathology pada bagian yang berjudul" Frozen Section

Not Permanent Section disebutkan ada empat keterbatasan, yaitu: keterbatasan

waktu , keterbatasan pewarnaan khusus, ketiadaan konsultasi dan terbentuknya

artefak kristal es.

1. Keterbatasan waktu

Teknik frozen section harus dilakukan dengan cepat untuk mendapatkan

diagnosa yang cepat pula. Hal-hal yang perlu dilakukan agar tidak terjadi kesalahan

dalam mendiagnosa atau membaca hasil frozen section adalah: percayaan diri,

ketrampilan yang cukup, dan menjalin hubungan baik dengan rekan kerja ahli

bedah. Jika seorang ahli patologi memiliki keterampilan dan pengalaman dalam

frozen section, waktu yang dibutuhkan untuk mengambil jaringan, mewarnai dan

membaca slide tidaklah lama, hanya beberapa menit saja.

Ahli patologi yang berpengalaman dalam potong makros, proses ini dapat

dilakukan dalam 10 menit. Dan beberapa menit lebih lama untuk jaringan yang sulit.

2. Keterbatasan pewarnaan khusus

Pada saat ini dapat disebut malpraktek apabila mendiagnosa lymphoma,

sarcoma dan semua kanker yang memiliki gambaran yang mirip dengannya tanpa
pewarnaan immunoperoxidase untuk melihat ekspresi gen. Barangkali di masa

depan kita akan memiliki studi yang lebih cepat dengan menggunakan teknik frozen

section. Namun untuk sekarang ini masih banyak dijumpai keterbatasan.

3. Ketiadaan konsultasi

Ketika melakukan pemeriksaan, seorang ahli patologi sendirian di dalam

ruangan frozen section dengan hanya ditemani buku untuk membantu pekerjaannya.

Di negara maju, mereka dapat melakukan konsultasi dengan sejawatnya selama

operasi berlangsung. Saat ini sistem telepatologi sudah dapat digunakan untuk

mendiagnosa suatu penyakit khususnya di rumah sakit yang jauh letaknya dari pusat

pendidikan. Apa yang dahulu merupakan teknologi yang lamban dan terbatas, saat

ini telah berkembang menjadi teknologi yang efektif yang menjadi sarana konsultasi.

Diperkirakan di masa depan kita akan melihat bahwa teknologi telepatologi

menjadi sarana konsultasi patologi intraoperasi yang rutin digunakan.

4. Terbentuknya artefak kristal es

Sudah merupakan sifat kimiawi air, bahwa air akan memperluas pembekuan

dalam pembentukan ikatan hidrogen. Oleh karena itulah es akan mengapung.

Seperti pada umumnya artefak dalam ilmu patologi, kita dapat mengenali artefak

yang berada di sekitar objek yang hendak kita periksa sehingga kita tetap dapat

membaca slide dengan benar.

a. Tekanan artefak

Jaringan akan tertekan oleh perluasan gelembung es. Berikut ini adalah

gambaran parenkhim ginjal sebagai contoh yang nyata dari fenomena tersebut.
Gambar yang di sebelah kiri adalah gambaran parenkhim ginjal yang tertekan oleh

kristal es. Gambar sebelah kanan adalah jaringan yang sama tanpa menggunakan

teknik frozen section.

b. Perubahan chromatin inti sel

Gambaran berikut ini merupakan kekurangan frozen section dimana akan

terjadi perubahan gambaran chromatin inti sel. Gambar sebelah kiri adalah contoh

gambaran chromatin dalam jaringan frozen section. Tampak citoplasma bervacuol

dan dijumpai adanya artefak kristal es. Pada gambar sebelah kanan chromatin

tampak padat dan hyperchromatin dibandingkan frozen section.

3
J. Interpretasi Frozen Section

Seperti telah disebutkan di atas, indikasi utama frozen section adalah untuk

mendiagnosa suatu keganasan dan menentukan batas reseksi pada saat

pembedahan.

Membaca gambaran mikroskopik bukan merupakan bagian yang paling sulit

pada teknik frozen section. Diagnosa mikroskopik yang tepat merupakan hal yang

paling penting. Akan terlihat gambaran yang khas di bawah mikroskop. Dianjurkan

pengambilan jaringan dan teknik frozen section ini dilakukan oleh seorang ahli

patologi yang berpengalaman. Jika dilakukan oleh seorang ahli patologi yang tidak

berpengalaman akan dapat menyebabkan kesalahan dalam mendiagnosa suatu

penyakit.

II. TEKNIK IMPRINT 7

 Banyak studi yang mempelajari teknik imprint dan dapat kita temui di

beberapa literatur. Kebanyakan praktisi setuju bahwa teknik imprint ini merupakan

teknik tambahan untuk metode frozen section yang memberikan informasi tambahan

yang sangat berharga. Lebih dari itu, mungkin juga dapat digunakan untuk melihat

gambaran jaringan jika teknik frozen section tidak memadai untuk pemeriksaan

jaringan tersebut. Imprint biasa digunakan untuk pemeriksaan patologi kelenjar

getah bening dan spleen. Moore and Reagen, Mouriquand and Dargent, Triebe, Pilar

and Rubenstone telah memakai teknik imprint ini untuk mendeteksi tumor payudara.

Teknik imprint ini digunakan untuk mengidentifikasi Pneumocystis carinii

Paru-paru dan Scleroderma dengan menggunakan metode fluorescent antibodi.

Teknik ini sangat dianjurkan untuk rutin digunakan pada biopsi operasi kecil dan

biopsi untuk spesimen tulang sebab apabila lambat dalam prosesnya akan

menyebabkan terjadinya proses decalsifikasi.

Metode enzim bisa sangat efektif dengan menggunakan teknik imprint.

Metode enzim untuk menggambarkan berbagai macam tumor sangat efektif

digunakan. Metode alkalin fosfatase biasa digunakan untuk tumor-tumor tulang.