1.

Komponen Kromatografi cair kinerja tinggi

Wadah Fase gerak

Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan
yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung tandon
harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk
kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit.

Pompa

Untuk menggerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa. Pompa

harus mampu menghasilkan tekanan 6000 Psi pada kecepatan alir 0,110
ml/menit. Pompa ada 2 jenis yaitu pompa volume konstan dan pompa tekanan
konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut. Bahan yang
umum digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon. Aliran pelarut dari pompa
harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor.

Injektor
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom),
diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.

Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu:

a. Hentikan aliran/stop flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada

kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Tehnik ini bisa digunakan
karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
b. Septum: Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama
dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat
digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak
tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu,
partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat
menyebabkan penyumbatan.

c. Katup putaran (loop valve): ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 6,

tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih
besar dari pada 10 l dan sekarang digunakan dengan cara automatis
(dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan
secara manual). Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran)
diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di
dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.

Gambar Tipe injektor katup putaran

Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis
tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom
dapat dibagi menjadi dua kelompok:

Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung
pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikular, panjang yang lumrah
adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikilat, umumnya 10-30
cm. Dewasa ini ada yang 5 cm
 Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan

pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi,
terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan
kolom tergantung pada mode kromatografi cair kinerja tinggi yang digunakan.

Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkkan menjadi 2 golongan yaitu: \
Detektor universal: Mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat
spesifik, dan tidak bersifat selektif, seperti detektor indeks bias dan
detektor spektrometri massa.
Detektor spesifik: Hanya mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,
seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi dan elektrokimia
(Rohman,2007).

Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Johnson 1991; Rohman, 2007)
Terdapat keragaman yang luas dari solvent yang digunakan dalam semua
mode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, tetapi ada beberapa sifat yang diinginkan
yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua solven.

Fase gerak harus:

Murni; tidak ada pencemar/kontaminan
Tidak bereaksi dengan pengemas
Sesuai dengan detektor
Melarutkan cuplikan
 Mempunyai viskositas rendah
Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan
Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas (Hedayana, 2006)

Elusi gradien dan isokratik

Elusi pada kromatografi cair kinerja tinggi dapat dibagi menjadi dua
sistem yaitu:

1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam
atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak
tetap selama elusi)

Gambar Sistem elusi isokratik

2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran
fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu
(komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi).

Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncakpuncak
yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.
Gambar Kromatogram
Kegunaan kromatogram:

1. Kualitatif
waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama.
dapat digunakan untuk identifikasi.

2. Kuantitatif
luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjesikan dan
dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.

3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan

dan kinerja kolom.

1. Cara kerja KCKT

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh
perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan
fase diam. Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok
yaitu: (1) wadah fase gerak, (2) sistem penghantaran fase gerak, (3) alat untuk
memasukkan sampel, (4) kolom, (5) detektor, (6) wadah penampung buangan fase gerak,
(7) tabung penghubung, dan (8) suatu komputer atau integrator atau perekam (Gandjar
dan Rohman, 2008).
Mekanisme kromatografi terdiri atas 4 tipe yaitu adsorpsi, partisi, penukar ion, dan
eksklusi ukuran. Kromatografi adsorpsi didasarkan pada kondisi antara zat terlarut dan
fase diam padat. Umumnya eluen yang digunakan untuk kromatografi adsorpsi kurang
polar dari fase diam (fase normal). Kromatografi partisi melibatkan fase diam cair yang
bercampur dengan eluen. Sistem partisi dapat berupa fase normal (fase diam lebih polar
daripada eluen) atau kromatografi fase terbalik (fase diam kurang polar daripada eluen).
Kromatografi penukar ion melibatkan fase diam padat dengan kelompok anionic atau
kationik pada permukaan zat yang terlarut. Kromatografi eksklusi ukuran melibatkan fase
diam cair dengan ukuran pori yang terkontrol. Pemisahan dilakukan berdasarkan ukuran
molekul suatu zat, dimana molekul berukuan besar akan mengalami elusi terlebih dahulu
(Moffat, 2011).

2. Prosedur Umum KCKT

1. Use only HPLC Grade solvents for analysis.

2. Use only calibrated, clean, dry glass apparatus.
3. All the solutions which are entering the HPLC System i.e. water, mobile phase, etc.
must be filtered through 0.4 membrane filter paper, and properly degassed.
4. In case of mobile phase containing buffer, it is essential to give water washing to the
column prior and after running the mobile phase.
5. Prepare the sample and standard solutions as mentioned in the specifications.
6. Ensure that the HPLC system is equilibrated, and ready to start.
7. Take a clean, dry syringe. Rinse it with water in case of mobile phase containing
buffers, or with the mobile phase.
8. Remove red cap of Rheodyne injector port.
9. Ensure that the injector is on Load position.
10. Suck water / mobile phase in the syringe, ensure that no air bubble is trapped in the
syringe.
11. Inject water / mobile phase in the loop. Rinse the port with water for 5 times.
12. Inject mobile phase or the solvent system used for sample preparation and turn the
injector downward i.e. in Inject position, the channel on the screen gets activated
and shows Run in Progress signal.
13. Turn the injector port on Load position.
14. After completing the injections again rinse the loop with water and then with
Methanol.
15. Preserve the column in Methanol

Daftar Pustaka
Abdul Rohman, Gandjar, Ibnu Gholib. 2007. Kimia Farmasi Analisa. Yogyakarta
:Pustaka Pelajar.

Hendayana, S. (2006), Kimia Pemisahan, Metode Kromatografi dan Elektroforesis

Modern, Universitas Pendidikan Indonesia.

Johnson, E.L. dan Stevenson, R. (1991). Dasar Kromatografi Cair. Penerjemah: Kosasih
Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung. Hal. 70, 119-121

Moffat, A.C., Osselton, M.D., and Widdop, B., 2011, Clarkes Isolation and
Identification of Drug, 4 st edition, 1111,1112. London The Pharmaceutical
Press.