UNIVERSIDAD POLITCNICA DE PUEBLA

Laboratorio de Ingeniera Gentica

CLONACIN DE PRODUCTOS DE PCR EN VECTORES BACTERIANOS Y ANALISIS

DE CLONAS BACTERIANAS PARA EL RASTREO DE RECOMBINANTES.
Cesar Arturo Coln, Belinda Hernndez, Edgar Alvarado, Rosario Saldvar, Mara Fernanda Moscoso.

Introduccin.
La clonacin puede definirse como el proceso por el que se consiguen copias idnticas de un organismo, clula
o molcula ya desarrollado de forma asexual.
Los genes contienen una enorme cantidad de ADN. Consecuentemente cada gen contiene un genoma que
representa solo una pequea fraccin del tamao real del genoma. La clonacin tradicional de ADN est
constituida por 4 partes, la generacin de fragmentos de ADN de inters, la insercin del ADN de inters en un
vector de clonacin y la transformacin del ADN recombinante en una clula hospedadora en donde se replicara
nuestro vector de clonacin, las clulas son replicadas y seleccionadas por el mtodo screening para identificar
aquellas clulas que contienen el gen recombinante de las que no lo poseen (John.Wiley2004).
Dicho proceso se ha llevado a cabo in vivo, mediante la construccin de bibliotecas (libraries) gnicas o de
cDNA. Tpicamente, el DNA de inters es cortado con una o varias enzimas de restriccin y ligado a un vector
como el fago lambda, con el que luego se infecta un cultivo de Escherichiacoli que se hace crecer en medio
slido.

Las bibliotecas gnicas o de cDNA contienen representaciones de los miles de genes y fragmentos de DNA de
la muestra de partida generados tras su restriccin.El desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) ha permitido simplificar la clonacin clsica del DNA e incluso prescindir completamente de ella en
algunos casos. De hecho, podra considerarse la PCR como una clonacin in vitro, ya que el material gentico
se amplifica en el tubo de ensayo y no en una bacteria. El proceso es muy rpido, llevndose a cabo en tan slo
en unas horas. Una vez que el DNA ha sido amplificado mediante PCR, se dispone de suficiente nmero de
copias del fragmento como para proceder a su anlisis de restriccin, identificacin por Southern o
secuenciacin. La PCR puede realizarse a partir de cDNA, pero tambin directamente de DNA genmico 0
RNA.

Esquema de general.
 Encender la lmpara de UV en el
espectrofotmetro para su
calentamiento y seleccionar la
longitud de onda (20 min a 260 y
280nm).
longitud de onda a 260 y 280nm.
Usar agua bidestilada en una
celda de cuarzo y utilizarla como
blanco de referencia
longitud de onda a 260 y 280nm.
A colocar en tubo agua bidestilada
y agregar la solucin de ADN. (10
l)
Colocar agua inyectable para
completar el volumen de 3ml y
homogenizar.
Leer absorbancia (260 y 280nm) y
verificar pureza.
Prepara agarosa al 1.5% y disolver
en amortiguador TAE 1X.
Calentar la mezcla y homogenizar,
enfriar y aadir aadir 1l de
bromuro de etidio por cada 30ml
de solucin.
Vaciar la agarosa en la cmara de
electroforesis y colocar el peine
peine. Los pozos deben quedar
orientados hacia el ctodo (-).
(dejar solidificar y quitar el peine)
pozos la
Llenar deben quedar
cmara con orientados
TAE hasta
hacia el ctodo(-)
cubrir el de
gel.la cmara
Preparar las muestras colocando
en un cuadrito de parafilm 1l de
la solucin de carga 6X de azul de
bromofenol y colocar el marcador
de ADN en el primer carril y las
muestras en c/u de los siguientes
carriles.
Conectar la cmara a la fuente de
poder y aplicar 100 volts por 30-40
min para el ADN procedente de
producto de PCR.
Sacar el gel y observarlo en el
transiluminador de UV.
Clonacin
Extraccin de ADN
Cuantificacin y
Pureza de Ac.
Nucleicos.
Electroforesis de Ac.
Nucleicos
Reaccin en cadena
de la polimerasa
(PCR)
Clonacin
Rotular los tubos de PCR de
manera adecuada.
En otro tubo eppendorf estril de
1.5 ml realizar la mezcla de
reaccin de acuerdo al nmero de
muestras. (volumen final de cada
reaccin 25 l).
Inmediatamente despus guardar
los reactivos y la Taq polimerasa
al congelador. Por otro lado llevar
los tubos en hielo al termociclador.
Analizar el producto de PCR en un
gel de agarosa al 1.5 %.
Agregar la muestra de ADN en un
tuvo con lisis BashingBead ZR.
Homogenizar en un vortex durante
10 min
Centrifugar el tubo de lisis
BashingBead de ZR en una
microcentrfuga a 10.000 rpm g
durante 1 minuto.
.
Tranferir 400 l de sobrenadante a
un tubo de recogida y centrifugar a
7.000 rpm durante 1 minuto.
.
Aadir 1,200 l de tampn de lisis
genmico al filtrado en el tubo de
recogida del paso 4 y mezclar.
Transferir 800 l. de la mezcla en
un tubo de recoleccin y
centrifugar a 10.000 x g durante 1
minuto.
Desechar el flujo y repetir el paso
anterior
.
Aadir 200 l de tampn de pre-
lavado de ADN a la columna IC
.
Zymo-Spin en un nuevo tubo de
recoleccin y centrifugar a 10.000
x g durante 1 minuto.
Aadir 500 l de tampn de lavado
de ADN-g a la columna IC Zymo-
Spin y centrifugar a 10.000 x g
durante 1. minuto.
Transferir a un tubo de
microcentrfuga de 1,5 ml limpio y
aadir 10 l de tampn de
elucin de ADN directamente a la
matriz de columna.. Centrifugar a
10.000 x g durante 30 segundos
para diluir el ADN.
.
Metodologia.

Da 1
Esterilizar el siguiente material:
Puntas blancas y amarillas
Tubos de microcentrfuga de 2 ml y
de 200 l
Hisopos (4 por equipo)
Preparar los siguiente reactivos:
Medio LB lquido (5 ml por tubo, dos
tubos por equipo, uno con ampicilina
y otro sin ampicilina) Medio LB slido
(2 placas p60 por equipo, una con
ampicilina y otra sin ampicilina) CaCl 2
0.1M frio
Ampicilina, solucin estril de 100
mg/ml
Da 2
Preparacin del inserto
Tratamiento para productos de PCR
con extremos sobresalientes 3-dA
Hacer uso de este tratamiento para:
*La clonacin de productos de PCR
con 3'-dA salientes, generados por la
Taq DNA polimerasa, por ejemplo la
enzima incluida en el sistema
comercial PyroStart Fast PCR Master
Mix.
*La clonacin de productos de PCR
cuando el extremo del producto
generado no es especificada por el
proveedor de la ADN polimerasa.
*La clonacin de fragmentos de ADN
con salientes 5'-o 3' generados por la
digestin con enzimas de restriccin.
purificar en gel el fragmento de ADN
antes de la ligacin y usar una
proporcin molar de 3:1 con
pJET1.2/blunt
Para eliminacin de extremos
salientes, mezclar las siguientes
cantidades de reactivos :
Amortiguador de reaccin 2X = 10l
Producto de PCR no purificado = 2 l
Agua libre de nucleasas = 5 l
(c.b.p. 17 l)
DNA Blunting Enzyme = 1 l
Volumen total = 18 l
*Mezclar en Vrtex brevemente y
centrifugar, para bajar las gotas de
las paredes del tubo, durante 3-5
segundos a 4000 rpm.
*Incubar la mezcla a 70 C durante 5
min. Colocar la reaccin en hielo.
Ligacin
Para ligar el producto de PCR en el
vector agregar lo siguiente a la
mezcla de reaccin:
COMPONENTES
vector de clonacin pJET1.2/blunt =
1 l
ligasa T4 de ADN = 1 l
Volumen total = l
*Mezclar en vrtex brevemente y
centrifugar, para bajar las gotas de
las paredes del tubo, durante 3-5
segundos a 4000 rpm.
*Incubar la mezcla de ligacin a
temperatura ambiente (22C) por 15
min. Use la mezcla de ligacin
directamente para la transformacin.
Nota: Mantenga la mezcla de ligacin
a -20 C si la transformacin se
pospone. Descongelar en hielo y
mezclar con cuidado antes de la
transformacin.
Da 3
TRANSFORMACIN
Preparacin de clulas competentes
1 De un preinoculo de E. coli Top-10
de toda la noche (16 h a 37C en
agitacin a 250 rpm), se inoculan 100
l en un tubo de 5 ml de medio LB, y
se incuba por 3 horas a 37 C a 250
rpm (densidad ptica de ~0.6-0.7).
2 Se empaquetan los 5 ml de cultivo
a 4000 rpm por 5 minutos a 4 C, se
adicionan 350 l de CaCl2 0.1M fro y
se incuba por 15 minutos en hielo,
posteriormente se centrifuga a 4000
rpm por 5 minutos a 4 C.
3 Se elimina el sobrenadante y la
pastilla se resuspende en 200 l de
CaCl2 0.1M frio. Las clulas pueden
ser utilizadas inmediatamente o ser
almacenadas a -70C con glicerol
estril a una concentracin final del
15%.
Transformacin de bacterias
1 Un tubo con clulas E. coli Top 10
competentes se coloca en hielo por
15 minutos, se incorporan 5 l de la
reaccin de ligacin a las clulas
competentes suavemente con ayuda
de una micropipeta y se incuba en
hielo por 15 minutos.
2 El tubo con clulas se incuba a
42C por 90 segundos, y se coloca en
hielo, agregando 1 ml de medio LB
sin antibitico. Este tubo se incuba en
una estufa de agitacin por 30
minutos a 37C y 250 rpm.
3 Las bacterias se sedimentan por
centrifugacin a 4000 rpm por 5
minutos y se resuspenden en
200 l de LB, de esta suspensin se
inoculan 100 l en una placa con agar
LB y antibitico (ampicilina 200 g/ml
de medio). El proceso termina por la
incubacin en una estufa estacionaria
a 37C por aproximadamente 16
horas.

Tabla1.1 : Metodologa para la Clonacin de los Productos de PCR.

Medio Luria Bertani (LB)

Medio lquido
Bacto triptona (puede usarse en lugar de
ste bacto peptona de casena) 10 g
Bacto extracto de levadura 5 g

Preparacion NaCl 5 g
Aforar a 1 litro con agua destilada y
esterilizar en autoclave en tubos con
de taparosca con 10 mililitros cada uno.
Medio slido (para cajas de Petri)
Agregar al medio LB lquido de la receta
soluciones anterior 15 g de agar bacteriolgico.
Aforar a 1 litro con agua destilada
Esterilizar en autoclave
El antibitico se agrega hasta que el medio
enfre aproximadamente a 40 C para
preparar en las cajas de Petri.
Oligonucletidos

1. Cul es el gen que amplifican? Partial secuence.

2. Cul es el microorganismo que contiene el gen que amplifican? Bacillus rigiliprofundi.
3. Cul es el tamao en pares de bases, del fragmento que amplifican los primers? 1512 pdb
GAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGATCTTT
GGGAGCTTGCTCCCAAAGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACT
GGGATAGCTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATGCATTCCCTCTCATGAGGGAATGCTGAAA
GACGGCCTCTCGCTGTCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTC
ACCAAGGCCACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGATTGAGACACGGCCCA
GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGC
GTGAGCGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTATCGGAGTAACTG
CCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG
TAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTCTTTAAGTCTGATG
TGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAG
TGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTT
CTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC
CACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATT
AAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAA
GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTATGC
CTTCTCTGGAGACAGAGCGTTCCCTTCGGGGACATAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCT
CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCATTTA
GTTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCAT
GCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATAGAACAAAGGGCAGCAAAGCCGCGAGGT
CAAGCAAATCCCATAAATCTATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCACCTCGCCTGCATGAAGCCGGA
ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT
CACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGGGCCAGCCGCCTAAGGT
GGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCC

4. cul sera la Tm adecuada, y las condiciones adecuadas para amplificar la secuencia?

Las condiciones para poder amplificar una secuencia y saber si nuestra muestra de ADN no
est contaminada ya que puede estar contaminado con protenas o alguna sustancia que inhibe
la reaccin de PCR, Revisar la concentracin y el manejo de los dNTPs Pequeos incrementos
en la concentracin de dNTPs pueden inhibir la reaccin, Revisar el buffer y agregar aditivos
En general cada polimerasa viene con un buffer ya preparado con los reactivos necesarios para
que funcione de forma adecuada y Revisar los oligonucletidos Podran estar degradados,
defectuosos, mal diseados o incluso que la cantidad utilizada no sea la correcta. Si hay mucha
cantidad aumenta el rendimiento del PCR, pero podran formarse productos inespecficos, y si
se agrega an mayor cantidad los oligos pueden formar dmeros, en vez de unirse al ADN, y eso
impide la amplificacin del producto. Si utilizamos muy poco podramos tener mayor
 especificidad en el producto, pero puede suceder que no veremos el amplificado (pues baja el
rendimiento), as que ser necesario encontrar el ptimo para nuestra reacci
5. Dibuje el gel con un marcador de 100 pares de bases y con los carriles necesarios, para representar
los resultados esperados por todo el grupo. Seale en el carril 1 el ADN ladder, carril 2: equipo 1, carril
3: equipo 2, y as sucesivamente

Vector de clonacin
En la mayora de los experimentos de clonacin son usadas las bacterias E. Coli para la propagacin de
fragmentos de DNA. Incluyendo clonaciones de fragmentos eucaritico, Las construcciones de ADN se
producen invariablemente en E. coli antes de ser transportadas a su husped final y tiene una serie de ventajas
distintas como los vectores de clonacin.
Los vectores son molculas de ADN de replicacin autnoma que pueden usarse para transportar fragmentos
de ADN de inters.
Los fragmentos de ADN clonados en vectores pueden aislarse en cantidades suficientes para la mayora de las
manipulaciones de laboratorio.
Los vectores se basan en secuencias de ADN naturales que han sido modificadas y combinadas para servir
funciones particulares. Del vector depende en gran medida del tamao de las molculas de ADN que deben ser
insertadas en l.Se han desarrollado vectores para una variedad de propsitos especficos, incluyendo la
produccin de ADN monocatenario, la expresin de alto nivel de genes que codifican protenas y la produccin
De ARN (J. Wiley & Sons Ltd. 2004)

Cmo funciona

Una vez aislado y caracterizado nuestro vector con una secuencia de mapas de restriccin se introduce a la
clula hospedadora y una vez a con la capacidad autnoma de replicacin es decir. Independiente de la
replicacin del genoma de la clula anfitriona. Es conveniente que el vector posea el mayor nmero de sitios de
restriccin, para insertar el Fragmento de ADN que se quiere clonar, y que incluya a menos un gen marcador
de resistencia a un antibitico que permita identificar y/o seleccionar las clulas que lleva el ADN recombinante.
Lo comn es que los vectores naturales no posean todas estas caractersticas, por lo que habitualmente se
emplean vectores modificados La misin del vector es unirse a el fragmento de ADN que se quiere clonar
(Llamado entonces inserto) para facilitar su entrada a la clula hospedadora y su replicacin. Para poder unir
con facilidad se debe cortar el vector con las mismas enzimas de restriccin que se usaron para escindir el ADN
de la muestra o con enzimas que proporcionen extremo compatibles; de ese modo sus secuencias
complementarias pueden asociarse y ser unidos por la ligasa, dado lugar a una solo molcula de ADN de doble
hebra, llamada ADN recombinante (Jose Luque C. 2001)

Cmo se detectan las:

Transformantes
Generalmente el vector en que se ha ligado el DNA de inters suele codificar una o varias enzimas que confieren
resistencia a antibiticos, de forma que slo las clulas que han incorporado dicho vector sern capaces de
crecer en un medio selectivo suplementado con dicho antibitico. Para diferenciar entre los transformantes con
y sin inserto suele emplearse la capacidad de las clulas transformadas con un vector + el inserto. Este mtodo
tiene la ventaja de eliminar las transformantes sin inserto. En otras palabras, en las cajas selectivas slo
crecern los transformantes que porten vectores ligados con el DNA de inters. (G. Prez)

Recombinantes
Para distinguir las clulas transformadas con el DNA recombinante que con el vector intacto, se resiembra
rplicas de cada colonia transformante en dos tipos de cajas (en posiciones equivalentes): unas que contienen
tetraciclina y otras que contienen ampicilina. Las colonias que crezcan en ambas cajas probablemente porten
vectores recircularizados sin DNA pasajero. Las colonias que crezcan slo en presencia de ampicilina portarn
probablemente vectores recombinantes con DNA de inters ligado. (G. Prez).
 Resultados y Discusiones.

Figura 1.1 Preparacin de inserto. Tratamiento Figura 1.2. Ligacin del producto
de los productos de PCR. de PCR en el vector

Figura 1.3. Transformacin para clulas competentes. Preparacin de clulas competentes

Figura 1.3. Transformacin para clulas competentes. Preparacin de clulas competentes

Figura 1.4. Transformacin de bacterias

Figura 1.4. Transformacin de bacterias

Fig. 1.5 : Caja Petri con ampicilina, se Fig. 1.6 : Caja Petri sin ampicilina, se
observ crecimiento. observe crecimiento.
Discusion
El kit de clonacin de productos duplicados mediante PCR CloneJET contiene un novedoso vector de clonacin
de seleccin listo para su uso pJET1.2/blunt. El vector contiene un gen enzimas de restriccin letal que se
interrumpe con la ligadura de un inserto de ADN en el sitio de clonacin. Como resultado, solo las clulas
bacterianas con plsmidos recombinantes pueden formar colonias. Las molculas del vector pJET1.2/blunt que
no disponen de insertos expresan una enzima de restriccin letal, que mata la clula de E. coli husped despus
de la transformacin.

Conclusin
La clonacion fue realizada con exito ya que realizamos el proceso paso a paso como vena en la descrito por o
consiguiente obtuvimos los resultados deseados.

Bibliografa.
portalacademico.cch.unam.mx/.../ADNrecombinante/clonacionVectores