1.

Perhitungan bakteri secara langsung

adalah merupakan perhitungan yang menghitung jumlah total sel (sel mati dan hidup) yang
ada pada sampel. Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak
memerlukan banyak peralatan. Namun mempunyai kelemahan sebagai yakni sel-sel
mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup. Karena itu keduanya
terhitung. Dengan kata lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di dalam
populasi.

Metode yang digunakan adalah :

a. Metode hitungan cawan (Total Plate Count)
menggunakan anggapan bahwa setiap sel akan hidup berkembang menjadi satu koloni.
Jumlah koloni yang muncul menjadi indeks bagi jumlah oganisme yang terkandung di
dalam sampel. Teknik pengitungan ini membutuhkan kemampuan melakukan pengenceran
dan mencawankan hasil pengenceran. Cawan-cawan tersebut kemudian diinkubasi dan
kemudian dihitung jumlah koloni yang terbentuk.

Metode penghitungan cawan

b. Metode Petroff-Hauser
Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan
menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah
Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer.

Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Ruang hitung terdiri dari 9
kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak
sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil.
Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung
ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung
tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.
 Metode petrof

2. Perhitungan bakteri
Perhitungan secara tidak langsung dipakai untuk menentukan jumlah mikroba keseluruhan
baik yang hidup maupun yang mati atau hanya untuk menentukan jumlah mikroba yang
hidup saja tergantung pada cara yang dipergunakan. Diantaranya berdasarkan jumlah
koloni (plate count) yaitu dengan membuat suatu pengenceran bahan dengan kelipatan 10,
Metode MPN (Most Probable Number)

a. Plate Count Method dilakukan dengan cara melarutkan sampel asli dalam berbagai
serial pelarutan. Kemudian masing-masing hasil pelarutan di biakan pada agar, entah
dengan teknik pour plate ataupun streak plate. Setelah itu, inkubasi dilakukan dan koloni di
amati pada cawan agar dan dihitung sebagai jumlah total koloni yang membentuk unit
(CFU= coloni forming unit) (Goldman dan Green, 2009: 18).

Ada dua metode yang umum digunakan dalam plate count, yaitu

1. spread-plate method, volumenya biasanya 0,1 ml atau kurang dari

keseluruhan kultur yang di encerkan
Kelebihan dari spread-plate method adalah perhitungan mudah
dilakukan karena koloni yang dihitung pasti tumbuh di permukaan
(aerob). Kekurangan dari spread-plate method adalah volume yang
digunakan tidak boleh lebih dari 0,1 ml karena dapat menyebabkan
spreader, sehingga perhitungan sulit dilakukan
2. pour-plate method, volume yang biasa digunakan adalah 0,1 1 ml
dari kultur untuk di letakkan pada cawan Petri. Kemudian, cawannya
diinkubasikan hingga koloni muncul (Madigan, dkk., 2012:129-130).
Kelebihan dari pour-plate method adalah volume sampel dapat
mencapai 1 ml. Kekurangan dari pour-plate method adalah
organisme yang akan dihitung jumlahnya harus kuat menghadapai
 suhu dari agar. Selain itu, pengamatan perhitungan juga harus
diamati dengan baik-baik, sebab koloninya dapat tumbuh didalam
medium juga (aerob dan anaerob) (Madigan, dkk., 2012:129-130).
Secara keseluruhan, kelebihan dari metode plate count adalah
menghasilkan estimasi jumlah total sel bakteri yang masih hidup.
Selain itu, teknik ini juga memiliki tingkat sensitifitas pada
kontaminasi oleh mikrobiologi di makanan dan material lainnya.
Kekurangnya adalah dapat terjadi banyak kesalahan yang
diakibatkan oleh inkonsistensi plating, pipetting yang tidak akurat,
dan banyak faktor lainnya
b. Most Probable Number (MPN)
Most Probable Number (MPN) dalam bidang kesehatan masyarakat dari mikrobiologi
pangan, dipergunakan secara luas untuk menghitung jumlah bakteri yang ada dalam bahan
pangan. Media ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri patogenik dalam jumlah
sedikit yang terdapat dalam bahan pangan. Metoda ini berdasarkan atas pengenceran.
Apabila suatu larutan yang mengandung sel-sel mikroorganisme diencerkan terus menerus,
akhirnya akan diperoleh suatu larutan dimana tidak dijumpai sel lagi yaitu dikatakan steril
(Buckle dkk, 1985).

Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungan dilakukan
berdasarkan pada jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah
inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat
dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau timbulnya gas di dalam tabung kecil (tabung
Durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentukan gas.
Untuk setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga tau lima seri tabung. Lebih
banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas
yang digunakan juga lebih banyak. (Fardiaz, 1992).

Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :

1. bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel

2. sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk
rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E. coli terpisah
sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai).
3. media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target
dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel
hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi
tersebut.
4. jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable)
saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif
tidak akan terdeteksi.
c. Turbidimetri
Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri dalam suatu
larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri menyerap cahaya sebanding dengan
volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah). Ketika mikroba bertambah jumlahnya
atau semakin besar ukurannya dalam biakan cair, terjadi peningkatan kekeruhan dalam
biakan. Kekeruhan dapat disebut optical density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada
panjang gelombang 520 nm 700 nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat
memperlihatkan jumlah organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan) hingga
pengukuran optical density (ditentukan dengan spektrofotometer).

3. Prediksi jumlah kepadatan mikroorganisme dalam suatu bahan (minuman, kuah,

padatan)
- Cara perhitungan kuantitas/densitas sel bakteri pada kultur cair yang paling umum adalah
dengan menggunakan nilai kekeruhan suspensi sel yang didapatkan dengan pengukuran
menggunakan spektrofotometer.
Sel bakteri dihitung dengan panjang gelombang 600 nm dan nilai absorbansi yang muncul
kemudian dikonversi untuk mendapatkan nilai densitas sel bakteri dalam kultur.
- Selain itu dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau timbulnya gas di dalam tabung
kecil (tabung Durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik
pembentukan gas

Pengertian Perhitungan Mikroba

Perhitungan bakteri adalah suatu cara yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni
bakteri yang tumbuh pada suatu media pembiakan. Secara mendasar ada dua cara penghitungan bakteri, yaitu
secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain
adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau
tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan secara tidak
langsung hanya mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable
count). Dalam pelaksanaannya ada beberapa cara yaitu perhitungan pada cawan petri (total plate
count/TPC), perhitungan melalui pegenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat
(MPN methode), dan cara kekeruhan atau turbidimetri (Wheeler, 1993).
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif
koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan
metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis
merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat
dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak langsung
yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi
satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat
pada sampel) seperti yang dilakukan pada percobaan ini (Wheeler, 1994).
Pada tiap perhitungan bakteri ketepatan berkurang dengan meningkatnya konsentrasi sel-
sel. Begitu halnya bila jumlah yang dihitung terlalu kecil. Bahan yang mengandung sejumlah
bakteri (kira-kira lebih dari 104/ml) biasanya diencerkan dari 1:105 atau lebih tergantung pada
bahan pemeriksaan atau metode hitung, sehingga hasil hitungan yang diperoleh dapat diandalkan
dan memudahkan perhitungan. Perhitungan dapat dilakukan dengan dua cara yaitu perhitungan
secara langsung dan perhitungan secara tidak langsung (Lay, 1994).
 2.2 Metode Perhitungan Mikroba
Ada banyak metode yang digunakan dalam menghitung jumlah bakteri secara kuantitatif
dari suatu populasi bakteri. Proses penghitungan sel bakteri dapat dilakukan dengan beberapa
metode baik secara langsung maupun tidak langsung, diantaranya adalah metode hitung pada
cawan petri (standard plate count), metode pengamatan langsung dengan kaca objek atau metode
hitung dengan menggunakan haemocytometer, metode ukur kekeruhan (turbidimetri)
menggunakan spektrophotometer dan metode jumlah perkiraan terdekat (Brady, 1999).
1. Metode Hitung Cawan
Metode perhitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang hidup dapat
berkembang menjadi koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada cawan adalah indeks bagi
jumlah mikroorganisme yang terkandung dalam sampel. Teknik yang harus dikuasai dari metode
ini adalah mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut. Setelah inkubasi,
jumlah semua koloni diamati untuk memenuhi persyaratan statistik. Cawan yang dipilih untuk
menghitung koloni adalah cawan yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni. Organisme
yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk
dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Ferdias, 1992).
Pada metode perhitungan cawan dilakukan pengenceran yang bertingkat yang mana
ditujukan untuk membentuk konsentrasi dari suatu suspensi bakteri. Sampel yang telah di
encerkan ini di hitung ke dalam cawan baru kemudian di tuang ke mediumnya (metode tuang).
Kemudian setelah diinkubasi selama 24-48 jam, amati koloni yang tumbuh dan koloni yang
diamati hanyalah koloni yang berjumlah 30-300 koloni (Irianto, 2006).
Tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi bakteri yang
ada dalam contoh. Hasil yang baik adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah contoh yang
diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan pada
pengenceran lebih tinggi contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil uji negatif (tidak
ada pertumbuhan bakteri). Oleh karena itu jumlah populasi bakteri yang ada dalam contoh
diduga tinggi maka contoh harus diencerkan sampai diperoleh tingkat pengenceran yang lebih
tinggi sehingga nilai maksimum dapat dihitung. Metode pengenceran yang paling mudah dengan
melakukan pengenceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 tabung pengenceran
sekaligus (Irianto, 2006).

2. Metode Hitung Langsung

Menurut Lay (1994), menyatakan bahwa perhitungan langsung dapat dilakukan dengan
cara sebagai berikut :
a. Perhitungan sel langsung
Cara ini menggunakan bilik hitung (hemocytometer) yang menghasilkan hitungan total,
karena semua sel terhitung, baik sel yang hidup maupun sel yang mati. Karena bakteri itu kecil,
maka perhitungan yang dilakukan secara statistik dapat diterima, namun harus dibuat suspensi
sekurang-kurangnya 107 / ml.
b. Menghitung dengan alat penghitung elektronik
Dengan alat ini dapat dihitung beribu-ribu bakteri dalam beberapa detik. Penggunaan alat
ini banyak didasarkan atas kerja dengan lubang pengintai elektronik (dapat disamakan dengan
mata elektronik) kerjanya tergantung pada interupsi dari berkas cahaya elektronik yang melintasi
suatu ruang antara dua ruang elektron yang berdekatan letaknya. Tiap partikel yang karena
perbedaan konduktivitas sel dan cairan. Interupsi ini dicetak oleh suatu alat secara elektris.

3. Metode Ukur Kekeruhan (Turbidimetri)

Mikroba dalam suatu bahan cair dapat dideteksi berdasarkan kekeruhannya. Pertumbuhan
sel bakteri didalam suatu medium cair akan meningkatkan kekeruhan media, yang akan
mempengaruhi jumlah sinar yang dapat ditransmisikan menembus medium (Zaraswati, 2004).
Beer dan Lambert menemukan hukum yang menerangkan interaksi bahan kimia dengan
gelombang cahaya (elektromagnetik), yang disimpulkan dalam hukum Beer-
Lambert menyebabkan berkembangnya analisis kimia dengan menggunakan alat instrumentasi
yakni spektrofotometer (Lay, 1994). Suatu spektrofotometer standar terdiri atas spektrofotometer
untuk menghasilkan cahaya dengan panjang gelombang terseleksi yaitu bersifat monokromatik
serta suatu fotometer yaitu suatu piranti untuk mengukur intensitas berkas monokromatik,
penggabungan bersama dinamakan sespektrofotometer. Penggabungan alat optik ini merupakan
elektronika sifat kimia dan fisiknya serta detektor yang digunakan secara langsung mengukur
intensitas dari cahaya yang dipancarkan (It) dan secara tidak lansung cahaya yang diabsorbsi
(Ia). Kemampuan ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb (serap) oleh
benda (Ferdias, 1992).
Fungsi alat spektrofotometer dalam laboratorium adalah mengukur transmitans atau
absorbans suatu contoh yang dinyatakan dalam fungsi panjang gelombang (Ferdias, 1992).
Prinsip kerja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh
pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan dipantulkan, sebagian di serap
dalam medium itu, dan sisanya diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan
dinyatakan dalam nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel. Studi
spektrofotometri dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual yang lebih mendalam dari
absorbsi energi. Hukum Beermenyatakan absorbansi cahaya berbanding lurus dengan dengan
konsentrasi dan ketebalan bahan/medium (Ferdias, 1992).