Pengertian Mikroskop dan Mikroskopi

Mikroskop merupakan instrument yang paling banyak digunakan dan juga paling
bermanfaat di laboratorium. Mikroskop adalah alat yang menggunakan lensa untuk mendapatkan
gambar yang diperbesar dari obyek yang terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang.
Mikroskop memungkinkan pembesaran dalam kisaran luas dari seratus kali sampai ribuan kali.
Mikroskop yang umum digunakan dalam mikrobiologi biasanya dilengkapi dengan tiga
lensa objektif, masing-masing lensa memberikan derajat pembesaran yang berlainan, yang
terpancang pada turret yaitu suatu alas (platform) yang dapat diputar untuk menggerakkan
masing-masing objektif sehingga letaknya segaris dengan kondensor. Pembesaran total yang
dapat dicapai dengan salah satu objektif manapun ditentukan dengan mengalikan daya
pembesaran lensa objektif dengan daya pembesaran lensa mata, yang biasanya 10 kali.
Mikroskopi merupakan keahlian dalam menggunakan mikroskop, atau teknik yang
digunakan untuk menghasilkan detail struktur gambar dari obyek kecil yang tidak dapat dilihat
dengan mata telanjang.
Jenis jenis mikroskop

1. Mikroskop medan terang

Mikroskop medan terang digunakan untuk memperbesar gambar objek yang diuji, untuk
menentukan ukuran, susunan karakteristik dan motilitas bakteri. Dalam mikroskop medan terang,
medan mikroskop yang diamati diterangi dengan benderang sehingga objek yang sedang diamati
tampak lebih gelap dari pada latar belakangnya. Perbedaran terbatas oleh daya pisah suatu
mikroskop yaitu kemampuannya untuk menghasilkan bayangan berlainan dari dua objek yang
berdekatan. Daya pisah suatu mikroskop cahaya ditentukan oleh panjang gelombang cahaya dan
sifat lensa objektif dan lensa kondensor yang dikenal dengan aperture numeric. Lensa objektif
memperbesar gambaran objek biasanya 4-100 kali dan lensa okuler umumnya memperbesar
gambaran semu antara 10-15 kali. Jadi yang memberikan perbesaran permulaan adalah system
lensa objektif kemudian diperbesar lagi oleh system lensa okuler.

2. Mikroskop medan gelap

Objek yang diamati dalam mikroskop ini terang benderang dan sangat nyata terhadap medan
gelap. Mikroskop ini sering digunakan untuk melihat spirochaeta seperti Treponema. Dengan
menahan sebagian berkas cahaya yang masuk kedalam kondensor, cincin medan gelap hanya
melewatkan berkas cahaya yang mengenai objek pada slide specimen agar memasuki objektif.
Karena itu objeknya (mikroba) menjadi diterangi dalam medan mikroskopik yang seharusnya
gelap.

3. Mikroskop fluoresensi
Mikroskop fluoresensi digunakan untuk mengamati keberadaan mikroba dalam kultur campuran
atau jaringan tumbuhan dan hewan dengan pewarnaan khusus dapat menghasilkan bayangan
yang berpendar sehingga mudah untuk diamati. Mikroskop ini menggunakan sinar ultra violet
yang tidak terlihat. Organism diwarnai dengan zat warna yang sinarnya terlihat berfluoresen jika
dikenai oleh sinar ultra violet.
Pewarnaan dibuat spesifik, bila zat warna melekat pada antibody yang hanya mengikat pada satu
tipe organism sebagai contoh jika seseorang mempunyai luka dan dikhawatirkan luka tersebut
disebabkan oleh Treponema palidum maka cairan dari luka tersebut dapat diperiksa secara
mikroskopis dengan tehnik antibody-fluoresen seperti penjelasan diatas.

4. Mikroskop fase kontras

mikroskop ini digunakan untuk menambah kontras antara sel dengan latar belakangnya antara
struktur dalam sel dengan sitoplasma. Mikroskop ini digunakan untuk melihat objek dengan
indeks refraksi sinar yang berbeda. System lensa objektif mengubah sinar sehingga ada
perbedaan dalam fase antara sinar yang terdefraksi dengan sinar yang tidak mengalami defraksi.
Jika sinar yang mengalami defraksi dan yang tidak terdefraksi bersama-sama lagi, ada penurunan
intensitas sinar sebab adanya perbedaan fase. Dengan tehnik ini dapat ditemukan letak struktur
didalam sel yang tidak diwarnai yang tak teramati dengan mikroskop medan terang.

5. Mikroskop electron
Mikroskop ini memberikan perbesaran yang jauh lebih besar daripada mikroskop cahaya. Ini
dimungkinkan karena daya pisah yang lebih besar yang diperoleh karena berkas-berkas electron
yang digunakan untuk perbesaran yang mempunyai panjang gelombang yang sangat pendek
dibandingkan dengan cahaya. Berkas electron yang digunakan dalam berkas mikroskop electron
mempunyai panjang gelombang antara 0,005 sampai 0,0003 nm. Panjang gelombang yang
teramat pendek ini memungkinkan dicapainya daya pisah beberapa ratus kali lebih besar dari
pada yang dapat diperoleh oleh mikroskop cahaya. Untuk mikroskop electron, specimen yang
akan diperiksa dipersiapkan sebagai suatu lapisan kering yang teramat tipis pada layar kecil dan
dimasukan diantara kondensor magnetic dan objek magnetic. Bayangan yang diperbesar tampak
pada layar fluorensen atau terekam pada film fotografik oleh kamera yang terpasang pada
instrument tersebut.
Ada dua macam mikroskop electron yaitu Transmission Electron Microscope (TEM) dan
Scanning Electron Microscope (SEM). TEM digunakan untuk mempelajari struktur selular dan
hubungan dengan lainnya. Didalam TEM electron menembus specimen yang digunakan untuk
membentuk gambar objek. Pelapisan logam berat menambah kontras antara bagian-bagian objek
yang berbeda oleh refleksi electron. SEM lebih sering digunakan untuk menjelaskan tentang
struktur permukaan mikroba. Dalam SEM, electron yang mengenai specimen menyebabkan
pembebasan electron sekunder dari specimen. Electron sekunder dan electron refleksi digunakan
untuk membentuk objek.

1. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat
bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai
macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam
zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut.
Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara
umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik),
ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik)

2.Pewarnaan differensial

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan
pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:

Pewarnaan Gram

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu
bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh
bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan
beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini
diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya
sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-
zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode
pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan
Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna
untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya.
Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram
positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran
tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi
suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan
bakteri Gram negatif yaitu:

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

Peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

 Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

Tidak peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi
tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus
misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan
akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti
asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).
Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab
tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis .
Pewarnaan Spora

Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan
teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak
digunakan.
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu
dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti
halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus
dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium .
Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat
sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan
 dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar
belakang. Yang berwana biru gelap.

3.Pewarnaan negatif

Tujuan
Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi
organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi
mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
Cara pewarnaan negatif

Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskop

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang
keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar
kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini
menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam
memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel
karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna
mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.