Prctica 10.

Fundamentos Tericos Tcnicas Experimentales

SEPARACIONES CROMATOGRFICAS

La gran mayora de los compuestos qumicos, ya sean naturales o sintticos no

se encuentran puros, para determinar sus propiedades fsicas y qumicas o poderlos usar
como medicamentos, conservantes, edulcorantes, intermedios de reaccin, etc. es
necesario que lo sean. Una tcnica muy utilizada en todas las ramas de la ciencia y que
permite la separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en
mezclas complejas es la cromatografa. Ningn otro mtodo de separacin es tan
potente y de aplicacin tan general como la cromatografa.
Todo ello se logra utilizando un sistema bifsico: fase estacionaria donde se
retienen los compuestos a separar y fase mvil que desplaza de forma diferencial los
compuestos a travs de la fase estacionaria. La mezcla a separar se deposita sobre la
fase estacionaria y la fase mvil atraviesa el sistema desplazando los componentes de la
mezcla a distintas velocidades que dependen de la afinidad de los mismos por cada una
de las fases. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase
estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario, los
componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez.
Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan
en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente; a la
migracin de los componentes de la mezcla a lo largo de la fase estacionaria impulsados
por la mvil se denomina elucin.

Figura 1.- Elucin de los componentes de una mezcla

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Existen varias clasificaciones para los distintos tipos de cromatografa:

1) Dependiendo de la naturaleza de las fases, se pueden distinguir distintos tipos de
cromatografa:
Cromatografa slido-lquido: la fase estacionaria es un slido y la mvil un
lquido.
Cromatografa lquido-lquido: ambas fases son lquidos y en la estacionaria el
lquido se ancla a un soporte slido.
Cromatografa lquido-gas: la fase estacionaria es un lquido no voltil sobre
soporte slido y la fase mvil un gas.
Cromatografa slido-gas: la fase estacionaria es un slido y la mvil un gas.

2) En funcin de la interaccin o fenmeno fsico-qumico que se establece entre los

componentes de la mezcla y las fases mvil y estacionaria:
Cromatografa de adsorcin, se producen interacciones de tipo polar siendo la
fase estacionaria un slido.
Cromatografa de particin: la separacin se basa en las diferencias de
solubilidad de los componentes de la mezcla entre las dos fases siendo ambas
lquidas. Cuando la estacionaria es menos polar que la mvil se denomina
cromatografa en fase inversa.
Cromatografa de intercambio inico: se producen intercambios entre iones
presentes en la fase estacionaria y los del compuesto orgnico soluble e ionizado
en la fase mvil.
3) En funcin del tipo de soporte empleado para la fase estacionaria.
Cromatografa en columna: utiliza como soporte una columna de vidrio.
Cromatografa en capa fina: el soporte es una placa de vidrio, aluminio o
plstico.
4) Dependiendo de la finalidad o empleo de la cromatografa.
Cromatografa analtica: con la finalidad de conocer el nmero de
componentes de una mezcla e identificarlos por comparacin con patrones.
Cromatografa preparativa: o con la finalidad de separar mezclas de
compuestos y como mtodo de purificacin.
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CROMOGRAFA DE ADSORCIN
La cromatografa de adsorcin es una de las tcnicas cromatogrficas mas
utilizadas en los laboratorios de qumica y otras ramas de la ciencia, tanto con fines
analticos como preparativos. Emplea una fase estacionaria slida de carcter polar,
adsorbente y una fase mvil lquida, eluyente.
Fase estacionaria: adsorbente
La adsorcin se debe a interacciones intermoleculares del tipo dipolo-dipolo,
dipolo-dipolo inducido o enlaces de hidrgeno entre el adsorbente y el soluto. El
adsorbente ms utilizado es la gel de slice, donde las interacciones tienen lugar entre
los grupos SiOH y SiOSi; tambin se emplea con relativa frecuencia almina
(Al2O3).

Figura 2.- Estructura de la gel de slice e interacciones con algunos compuestos polares

El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a separar. La gel de slice
presenta carcter cido y la almina puede adquirirse con carcter neutro, cido o
bsico.
Fase mvil: Eluyente
Como eluyente se puede utilizar un nico disolvente o una mezcla de disolventes
e incluso llevar a cabo la elucin con un gradiente de polaridad aumentando
progresivamente la proporcin del disolvente ms polar. En el que los componentes de
las mezcla son, al menos, parcialmente solubles. Al aumentar la polaridad del disolvente
aumenta la velocidad de elucin de los compuestos de la mezcla.
Retencin
Las molculas de soluto se adsorben en los centros polares de la fase
estacionaria y, a medida que se produce la elucin, van siendo desplazadas por las
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molculas de disolvente/s que constituyen la fase mvil. La retencin de un soluto se

puede justificar por la competencia que se establece entre las molculas del soluto y las
del eluyente por los centros polares del adsorbente, por lo tanto la retencin depende
de:
Polaridad del compuesto a eluir (est en funcin de sus grupos funcionales).
Naturaleza del adsorbente
Naturaleza del disolvente
Orden de polaridad de los compuestos orgnicos:
cidos carboxlicos > Fenoles > Alcoholes y Tioles > Aminas > steres >
Aldehdos y Cetonas > Hidrocarburos Aromticos > Hidrocarburos Halogenados >
teres > Hidrocarburos Insaturados > Alcanos.
Cuanto ms polar sea un compuesto mas se retendr en la fase estacionaria. Por
ejemplo, se retiene ms un alcohol que un hidrocarburo
Orden de polaridad de los eluyentes ms habituales:
Agua > Metanol > 2-Propanol > Acetonitrilo > Dioxano > Acetato de etilo
>Tetrahidrofurano > Diclorometano (Cloruro de metileno) > Cloroformo > Tetracloruro
de carbono > Hexano
Para un mismo compuesto, un aumento en la polaridad de la fase mvil hace que
se desplace con ms facilidad de la fase estacionaria. Por ejemplo, se eluir ms
rpidamente una amina en acetonitrilo que en hexano.
Para compuestos poco polares, que se retienen poco en el adsorbente, se utilizan
eluyentes apolares o poco polares como, por ejemplo, hexano. Para compuestos muy
polares, que quedan muy retenidos en el adsorbente, se emplean eluyentes muy polares
como, por ejemplo, metanol o mezclas metanol-diclorometano. Para compuestos de
polaridad media se emplean eluyentes de polaridad intermedia y son muy aconsejables
en estos caso las mezclas en distintas proporciones de hexano-acetato de etilo.

CROMATOGRAFA ANALTICA EN CAPA FINA

La cromatografa en capa fina (CCF) que comenz a usarse hacia 1950, es muy
simple, sensible y eficiente. La fase estacionaria (adsorbente) se encuentra depositada,
formando una capa fina de un espesor uniforme sobre una placa de vidrio, plstico o una
lmina metlica. Las siglas TLC (thin layer chromatogaphy) corresponden a la
denominacin inglesa de esta tcnica.
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Aplicaciones de la cromatografa en capa fina

La CCF es una tcnica cualitativa especialmente til en los laboratorios de
Qumica para:
1) Determinar el nmero de componentes de una muestra: Precaucin si solo
hay una mancha muy retenida o aparece junto al frente del disolvente hay que probar
otro eluyente.

Figura 3.- Separacin de dos componentes A y B de una mezcla. (a) Eluyente poco polar
(b) Eluyente de polaridad adecuada (c) Eluyente muy polar.

2) Comprobar la pureza de un compuesto: aparecer una sola mancha. Se debe

comprobar que solo hay una mancha utilizando distintos eluyentes.
3) Identificar compuestos: Hay que tener precaucin, pues valores de Rf iguales
(o prcticamente iguales) para dos compuestos en una misma placa no garantizan
inequvocamente su identidad. En la misma placa hay que cromatografiar una mezcla de
los compuestos cuya identidad se quiere comprobar.

Figura 4.- Comprobacin de la no identidad de dos compuestos A y B.

M, mezcla de ambos.

4) Seguir la evolucin de una reaccin: cada cierto tiempo se cromatografan en

una misma placa los reactivos y la mezcla de reaccin.
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Figura 5.- Evolucin de una reaccin entre dos compuestos A y B (reactivos) para dar lugar a
un componente C. Mezcla de reaccin = MR

5) Determinar el disolvente ms apropiado para llevar a cabo una separacin

mediante una cromatografa preparativa (en columna o en placa).

Figura 3.- Separacin de dos componentes A y B de una mezcla. (a) Eluyente poco polar
(b) Eluyente de polaridad adecuada (c) Eluyente muy polar.

6) Seguir el progreso de una cromatografa en columna (CC).

Figura 6.- Anlisis de las fracciones (1, 28) de una Cromatografa en Columna.
M = mezcla antes de cromatografiar.
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Determinacin del Rf
Se conoce como Rf (rate factor) la relacin entre las distancias recorridas por un
compuesto y por el disolvente desde el origen del cromatograma. Para calcular el Rf se
aplica la siguiente frmula:

Cada compuesto en unas condiciones cromatogrficas determinadas: adsorbente,

disolvente, temperatura, etc..., tiene un valor constante y caracterstico de Rf. Sin
embargo, solo se pueden establecer comparaciones entre los Rf de dos compuestos
cuando los dos se eluyan juntos en la misma placa. La distancia recorrida por el
compuesto se mide desde el centro de la mancha.

Figura 7.- Determinacin del Rf de dos compuestos A y B.

Visualizacin del Cromatgrama

Salvo en los casos en los que la muestra sea coloreada, ser necesario tratar la
placa de alguna manera que permita ver los puntos donde se encuentran los compuestos.
Existen varios mtodos que permiten visualizar estos compuestos.
1) Con luz ultravioleta (UV). La mayor parte de las placas de cromatografa
llevan un indicador fluorescente que permite la visualizacin de los
compuestos activos a la luz ultravioleta (254 nm). El indicador adsorbe luz
UV y emite luz visible, generalmente de color verde. La presencia de un
compuesto activo en el UV evita que el indicador adsorba luz en la zona en
la que se encuentra el producto, resultando en la visualizacin de una
mancha en la placa que indica la presencia de un compuesto.
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2) Con un agente revelador. Se emplea cuando las sustancias no absorben

radiacin UV. El revelador reacciona con los productos absorbidos dando
lugar a compuestos coloreados y por tanto se utilizar uno u otro en funcin
del compuesto que se quiera visualizar. Por tanto el revelador a utilizar
depende del tipo de compuesto que se pretenda visualizar.

Tabla 1.- Agentes reveladores mas frecuentes

Agente revelador Composicin Compuestos a revelar
Yodo Yodo adsorbido en gel de Insaturados y aromticos
slice
cido fosfomolbdico 10% (peso) c. Compuestos fcilmente
fosfomolbdico en etanol oxidables
leum H2O/H2SO4/AcOH (4:1:20) Azcares y compuestos que
sufran deshidratacin
Vainillina 0.5 g de vainillina en 100 Alcoholes y fenoles
ml de H2SO4/EtOH (1:3)
Permanganato potsico 1% (peso) de KMnO4 en Compuestos insaturados o
agua fcilmente oxidables

Estos reveladores, a excepcin del yodo, se aplican a la placa eluda en forma

de spray, a continuacin se calienta la capa fina en una placa calefactora (que se
encuentra dispuesta en el laboratorio para ese uso exclusivo y en el interior de una
campana extractora).
Para el revelado con yodo se introduce la placa eluda en un recipiente (cubeta o
vaso de precipitado alto con tapa) que contiene unos pocos cristales de yodo adsorbidos
en gel de slice o arena. Al cabo de varios minutos, el yodo se adsorbe tambin en la
placa, y permite visualizar los puntos (manchas ms oscuras) donde se encuentran los
compuestos.

Cmo realizar una cromatografa analtica en capa fina?

Preparacin de la cromatplaca o cromatfolio. En primer lugar el folio de
CCF (20 x 20 cm) se divide en los correspondientes cromatplacas (6.5 x 5 cm);
seguidamente se marca con una lpiz la lnea base (aproximadamente 1 cm) del borde
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inferior de la placa. Realizar una cruz sobre la lnea base para cada muestra que se vaya
a analizar.
La mezcla se deposita, haciendo uso de un capilar. La mezcla que se va a
analizar ha de estar disuelta en un disolvente voltil. La concentracin de esta
disolucin es importante ya que al ser la cromatografa en capa fina una tcnica muy
sensible, slo pueden aadirse a cada punto una pequesima cantidad de producto, que
sin embargo debe ser suficiente par ser posteriormente visualizada. Slo la prctica
permite conocer la cantidad adecuada. Si en la capa fina se comparan dos o ms
muestras, se debe sealar previamente, con la punta de un lpiz, las posiciones donde se
van a colocar dichas muestras. Se han de situar a una distancia igual respecto al borde
de la placa, y con una separacin entre ellas que no produzca solapamiento de los
compuestos cuando sean eludos.

Figura 8.- Aplicacin de la muestra Figura 9.- Elucin de la placa

Elucin de la cromatplaca. A continuacin, la placa se introduce (con los

dedos o con una pinza) en una cubeta, que contiene la fase mvil (eluyente). Las
cubetas en las que se introduce la placa para su elucin deben ser transparentes, para
observar cuando sta ha finalizado. Las cubetas deben estar tapadas para conseguir una
atmsfera saturada en el vapor del disolvente, lo que favorece una elucin ms rpida.
La cantidad de eluyente que debe contener la cubeta es un volumen que cubriendo
totalmente la base de la cubeta no alcance una altura ni igual ni superior a la distancia
donde se encuentran las muestras en la capa fina, es decir, aproximadamente debe tener
una altura de 0.5 cm. En caso contrario, las muestras se disolveran en el eluyente y la
tcnica no sera vlida.
El eluyente asciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los
componentes de la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su separacin.
Cuando el disolvente (frente del disolvente) se encuentra prximo al extremo superior
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de la placa, sta se saca de la cubeta, inmediatamente se marca con lpiz el frente del
eluyente, se deja secar al aire y se procede a la visualizacin de las manchas.
Determinacin del Rf de cada compuesto de la mezcla. La distancia recorrida
por el compuesto se mide desde el centro de la mancha. Si sta es excesivamente grande
(dimetro mayor de 4 mm) se obtendra un valor errneo del Rf, cuanto ms polar es un
compuesto ms retenido queda en el adsorbente y menor ser su Rf. Por el contrario, los
poco polares se desplazan a mayor distancia del origen. La polaridad del disolvente
tambin influye en el valor del Rf, as, para un mismo compuesto, un incremento en la
polaridad del disolvente aumentar su desplazamiento en la placa y, por tanto, su Rf.
Se recomienda elegir un disolvente en el que los componentes de la mezcla
presenten un Rf medio en torno a 0.3-0.5. La bsqueda del eluyente idneo requiere
probar con varios disolventes de diferente polaridad o con mezclas. Cuando un
compuesto eluye a un Rf inferior a 0.2 o superior a 0.7, puede ocurrir que lo que parece
un compuesto nico sea en realidad una mezcla de varios. En estos casos se debe
cambiar a otro disolvente ms o menos polar, respectivamente.

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Cromatografa en columna (CC), es el mtodo ms utilizado para la separacin y
purificacin de compuestos orgnicos, slidos o lquidos, a escala preparativa. Los
principios vistos para la cromatografa en capa fina, sobre fase mvil y fase
estacionaria, son aplicables a la cromatografa en columna. La principal diferencia
estriba en el soporte de la fase estacionaria y en la cantidad de muestra que puede
introducirse, ya que la cromatografa en columna no es una tcnica analtica, sino que se
utiliza a escala preparativa (los compuestos separados se recuperan). La fase
estacionaria (adsorbente) se coloca en una columna de vidrio, metal u otro material que
termina en un estrechamiento con una llave y se impregna con el eluyente (fase mvil).
La mezcla a separar se deposita en la parte superior de la columna y la fase mvil
atraviesa el sistema. Los compuestos se van eluyendo disueltos en el eluyente, se van
recogiendo ordenadamente en fracciones de pequeo volumen y se analizan por CCF.
Los productos van saliendo de la columna segn su polaridad, primero salen los menos
polares que son los menos retenidos por el adsorbente y los ltimos los ms polares por
su mayor retencin en la fase estacionaria.
El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna recibe el nombre de
tiempo de retencin. Es caracterstico para cada compuesto en unas determinadas
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condiciones cromatogrficas (adsorbente, disolvente, dimetro de la columna, presin,

etc.).
El adsorbente ms utilizado para este tipo de cromatografa es la gel de slice y
en segundo lugar la almina. El tamao de partcula del adsorbente es importante para
la separacin y su eleccin depende en gran medida de que la elucin de la
cromatografa se realice por gravedad o a media presin. En una elucin a media
presin se pueden emplear tamaos de partcula ms pequeos, que permiten una
separacin ms eficaz. Sin embargo, en una elucin por gravedad el uso de tamaos de
partcula pequeos impedira el flujo del disolvente.
Eleccin del disolvente.
La eleccin de la fase mvil (disolvente o mezclas de disolventes) es muy
importante para conseguir una separacin eficaz de los componentes de la mezcla a
separar. Este anlisis se realiza mediante cromatografa en capa fina. El disolvente ideal
es aquel que permite una diferencia de Rf de 0.2 a 0.3 entre los componentes de la
mezcla, y siempre que site al componente ms polar a un Rf prximo a 0.3.
Generalmente, como eluyente se utiliza una mezcla de disolventes,
especialmente hexano/acetato de etilo. Tanto en este caso, como si se emplea un nico
disolvente, puede que los componentes de la mezcla a separar difieran bastante en sus
polaridades, y sea necesario variar la naturaleza o la proporcin de los disolventes en la
mezcla, a lo largo de la cromatografa en columna. Esta variacin en la polaridad del
eluyente recibe el nombre de elucin con gradiente, y siempre se lleva a cabo
incrementando la proporcin del componente ms polar de la mezcla de disolventes.
Eleccin de la columna.
Las columnas de vidrio que se comercializan para la cromatografa en columna
se presentan con diferentes dimetros y longitudes. Dependiendo de la cantidad (peso)
de la muestra a separar, as como de la separacin observada para sus componentes por
cromatografa en capa fina, se elegir la columna adecuada en base a los criterios que se
comentan a continuacin.
En general, las columnas deben rellenarse con el adsorbente (gel de slice) hasta
una altura de entre 1525 cm. La relacin aproximada entre el peso de muestra y el peso
de gel, para una cromatografa por gravedad, es de 100 a 300 veces el peso en gel
respecto al de muestra. La cromatografa a media presin requiere menor cantidad de
gel de slice. La cantidad de gel de slice depender del nmero de componentes de la
mezcla a separar y de sus Rf relativos. Para una cromatografa de dificultad media, se
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recomienda rellenar la columna con gel de slice hasta una altura de aproximadamente
15-20 cm. Para separaciones de mayor dificultad, se requiere ms gel de slice,
incrementar la altura de relleno hasta 25 cm.
Por otra parte, la elucin de la cromatografa en columna puede realizarse por
gravedad o a media presin (flash chromatography). El tamao de partcula de la gel de
slice para cromatografa a media presin (0.040-0.063 mm) es ms pequeo que el que
se utiliza para cromatografa por gravedad (0.063-0.200 mm). Debido a que la
disminucin del tamao de partcula del adsorbente conduce a una separacin ms
eficaz, la cromatografa a media presin proporciona generalmente mejores resultados
que la cromatografa por gravedad. Adems, al ser mucho ms rpida, es la tcnica que
ms se emplea.
Preparacin de la columna.
Existen diferentes maneras de introducir la fase estacionaria en la columna
cromatogrfica. Vamos a considerar dos de estos procedimientos: columnaseca y
columna hmeda.
a) Columna seca. En este caso, el adsorbente se introduce en la columna en
forma seca, es decir, sin mezclar con el eluyente. Esta forma de relleno se emplea para
eluciones por gravedad.
Antes de depositar la gel de slice en el interior de la columna, debemos observar si la
columna presenta una placa porosa en su parte inferior interna, que retenga el
adsorbente. En caso contrario, se debe introducir un poco de algodn. Sobre la placa
porosa (o sobre el algodn) se vierte un poco de arena (1-2 cm). A continuacin se
aade la gel de slice, en el interior de la columna, mediante un embudo, sin distorsionar
la capa de arena. Al mismo tiempo se golpea ligeramente la columna con la mano (o
con un soporte de corcho) para compactar el adsorbente y minimizar la formacin de
intersticios. Un mtodo alternativo consiste en hacer vaco por la parte inferior de la
columna, a travs de la llave, mientras se va introduciendo la gel de slice en la
columna. Otra forma consiste en llenar la columna con el eluyente y aadir despus la
gel de slice que se deposita por gravedad.
b) Columna hmeda. El nombre alude a que el adsorbente que se adiciona a
la columna se ha suspendido previamente en el eluyente. Este procedimiento, que es
uno de los ms habituales, permite un compactado mejor de la fase estacionaria. Esta
forma de relleno se utiliza tanto para elucin por gravedad o a media presin.
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Una vez rellenada la columna cromatogrfica, el paso siguiente implica la

adicin del eluyente a la columna, mientras se mantiene la llave abierta para permitir la
salida del mismo. El paso del eluyente a travs de la columna ha de mantenerse hasta
que se observe que la fase estacionaria est completamente compactada (no hay
burbujas, ni cambia el volumen). El eluyente debe quedar, despus de la compactacin a
la altura del nivel superior del adsorbente, el cual nunca debe secarse, ya que se
formaran grietas y burbujas de aire.
En la parte superior del adsorbente puede colocarse una pequea cantidad de
arena (1-2 cm), que evite la distorsin del frente del adsorbente cuando se introduzca la
mezcla a separar. Para mantener un flujo continuo de eluyente existen diferentes
alternativas, principalmente en funcin de si la cromatografa es por gravedad o a media
presin. Las columnas cromatogrficas pueden estar equipadas con un recipiente en su
parte superior para introducir una cierta cantidad de disolvente, o el eluyente puede
introducirse en un embudo de decantacin que se coloca en la parte superior de la
columna.
Introduccin de la mezcla a separar.
Una parte muy importante en la realizacin de la cromatografa en columna, es
una correcta introduccin de la mezcla a separar sobre el frente del adsorbente, como
una banda lo ms fina posible. Existen diferentes maneras de introducir la muestra,
vamos a considerar dos de estos procedimientos.
1) Disolucin.- Para esto se disuelve la mezcla (slida o lquida) en la mnima
cantidad del mismo disolvente en el que se va a empezar la elucin. Se deposita a
continuacin la disolucin sobre la arena con una pipeta. Si la pipeta Pasteur no alcanza
el frente de la columna, la disolucin debe dejarse resbalar por las paredes de sta. En
ambos casos, se debe conseguir una franja horizontal uniforme. Siempre hay que dejar
en un vial unas gotas de la disolucin para utilizarla como referencia a la hora de
analizar las fracciones recogidas.
A continuacin, hay que abrir la llave de la columna para que la disolucin quede
inmersa en la arena. Despus, cerrar la llave y aadir con una pipeta una pequea
cantidad de eluyente para lavar el recipiente en el que se encontraba la disolucin y la
pared interior de la columna. Si es necesario, repetir esta operacin un par de veces. La
adicin debe realizarse con cuidado para no modificar el frente horizontal. De nuevo,
hay que abrir la llave hasta que el disolvente quede al nivel de la arena. Posteriormente
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hay que colocar arena (1-2 cm) y finalmente un poco de algodn para evitar que la
adicin de fase mvil modifique la horizontalidad del frente.

1) Slida: A) Si la muestra resultara insoluble en dichas condiciones, el

sembrado se realiza adsorbiendo la muestra en el adsorbente antes de introducirla en la
columna. Para ello, se disuelve la muestra en un disolvente ms polar y se aade una
cantidad de adsorbente proporcional a la cantidad de muestra. El disolvente de la mezcla
se elimina con cuidado en el rotavapor. Una vez que el disolvente se ha eliminado, tiene
que obtenerse una mezcla homognea, homognea, pulverulenta y exenta de disolvente,
que se incorpora a la columna utilizando un embudo. A este procedimiento se le
denomina preparar una cabeza. B) Si la muestra es un slido se mezcla con una
cantidad aproximadamente similar de gel de slice fina y se mezcla en un mortero hasta
obtenerse una mezcla homognea, homognea, pulverulenta y exenta de grumos, que se
incorpora a la columna utilizando un embudo.

Figura 10.- Esquema de montaje de una Cromatografa en Columna.

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Eluir la columna.
Para eluir la columna cromatogrfica se aade el eluyente o fase movil con
cuidado por la pared de la columna, para no modificar la horizontalidad del frente. Los
componentes de la mezcla a separar deben eluirse manteniendo un flujo continuo de
disolvente. La velocidad de elucin depende del tipo de columna (gravedad o media
presin), pero tambin de la composicin de la mezcla a separar. Para una
cromatografa de difcil separacin la velocidad del eluyente debe ser menor. En
general, las separaciones por columna, una vez empezadas, deben de finalizarse en la
misma sesin.
Si la elucin se lleva a cabo a media presin, hay que conectar la cabeza de la
columna al sistema de presin. Esta media presin se puede conseguir mediante la
utilizacin de peras Richardson o bien utilizando una bomba de presin media. En este
ltimo caso, la velocidad de flujo del eluyente, para mezclas hexano/acetato de etilo
debe regularse de forma que el eluyente descienda de columna 5 cm por minuto.
Para la recogida de las distintas fracciones se utilizan erlenmeyers, viales o tubos
de ensayo. El volumen de estas fracciones depender de la composicin de la mezcla a
separar, a mayor dificultad menor volumen. El volumen inicial de eluyente que se
recoge corresponde al volumen muerto de la columna y no contendr ningn producto.
El adsorbente nunca debe secarse. Los componentes de la mezcla eluyen en orden de
polaridad creciente.

Figura 11.- Esquema de separacin de dos componentes por Cromatografa en Columna

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Anlisis de las fracciones.

Las fracciones recogidas debern analizarse mediante cromatografa en capa
fina, para comprobar su contenido, su pureza y seguir el curso de la separacin. Las
fracciones que tienen el mismo contenido se renen en el mismo matraz, previamente
pesado, y el disolvente se elimina a presin reducida en el rotavapor. Finalmente se pesa
cada reunin para determinar la cantidad de producto que contiene y de este modo
determinar el rendimiento de dicho proceso cromatogrfico