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Journal of Bacteriology, 1969 de septiembre, p. 720-729

Copyright 1969 Sociedad Americana de Microbiologa
Complejo Nitrato Reductasa de Escherichia coli K-12:
Participacin de formiato deshidrogenasa especfica
y citocromo b, componentes en nitrato reduccin.
JOSE RUIZ-HERRERA' AND J. A. DEMOSS Department ofBiology, University of California, San
Diego, La Jolla, California 92037 Received for publication 9 June 1969.

Se estudi la participacin de distintas deshidrogenasas de formiato y componentes del citocromo en la

reduccin de nitratos por Escherichia coli. La actividad de formiato deshidrogenasa presente en extractos
preparados a partir de clulas inducidas por nitrato de la cepa HfrH fue activa con varios aceptores de
electrones, incluyendo azul de metileno, metosulfato de fenazina y viroleno de bencilo. Ciertos mutantes que
son incapaces de reducir el nitrato tenan niveles bajos o indetectables de actividad de formiato
deshidrogenasa ensayados con azul de metileno o metosulfato de fenazina como aceptor de electrones. De
nueve de estos mutantes, cinco produjeron gas cuando se crecieron anaerobicamente sin nitrato y posean una
actividad de formiato deshidrogenasa ligada a vitileno de bencilo, lo que sugiere que distintas
deshidrogenasas de formiato participan en los sistemas de nitrato reductasa y dimrica.
Los otros cuatro mutantes formaron poco gas cuando se crecieron anaerobicamente en ausencia de nitrato y
carecan de la decil-formiato deshidrogenasa ligada a viroleno de bencilo as como la actividad unida al azul
de metileno o al metosulfato de fenazina. El citocromo b1 presentin nitrato inducida por las clulas se
distingue por sus propiedades espectrales y su control gentico de los principales componentes del citocromo
b1 de las clulas aerbicas y de las clulas cultivadas anaerobically en ausencia de nitrato. El citocromo bk
especfico de nitrato se redujo completa y rpidamente en 1 mm de formiato pero no se redujo en 1 mm de
nicotinamida adenina dinucletido reducido; El ascorbato redujo slo una parte del citocromo b1 que se
redujo por formiato. Cuando se aadi nitrato, el citocromo b1, reducido en formiato, se oxid con cintica
bifsica, pero el citocromo bk reducido en ascorbato se oxid con cintica monofsica. Los efectos
inhibitorios del N-xido de n-heptil hidroxiquinolina sobre la oxidacin del citocromo b1 por nitrato
proporcionaron evidencia de que el citocromo especfico del nitrato est compuesto de dos componentes que
tienen potenciales redox diferentes pero propiedades espectrales idnticas. Concluimos de estos estudios que
la reduccin de nitratos en E. coli est mediada por la operacin secuencial de una deshidrogenasa de
formiato especfica, dos citocromos especficos b, componentes y nitrato reductasa.

Un nmero de observaciones indican que la cuestiones importantes sobre la relacin de esta va

reduccin de nitrato en Escherichia coli se produce
principalmente por una va que implica la
deshidrogenasa formiato, el citocromo bl y la nitrato
reductasa. Entre los diversos sustratos que son
metabolizados por E. coli, el formiato es el donador
de electrones ms efectivo para la reduccin de
nitrato en clulas cultivadas anaerobicamente en
presencia de nitrato (2, 23).
En tales clulas, se induce la formate
deshidrogenasa, el citocromo b1 y la nitrato
reductasa a niveles relativamente altos en
comparacin con los de las clulas cultivadas en
ausencia de nitrato (2, 17, 23). Estos tres
componentes estn presentes en las fracciones de
membrana (6) y han sido parcialmente purificados
como una unidad a partir de extractos celulares (8).
Finalmente, los mutantes de E. coli que son
incapaces de producir nitrito a partir de nitrato
(mutantes NR7) carecen de formiato
Deshidrogenasa o nitrato reductasa o combinaciones
de estas actividades y el citocromo b (1, 16, 17, 22).
La propuesta de que formiato deshidrogenasa y
citocromo bi son componentes especficos del
sistema de reduccin de nitrato plantea algunas
con otras vas de transporte de electrones
En E. coli. La formamida deshidrogenasa debe ser
tambin un componente del sistema de
hidrogenidasa (15), as como de la formiato oxidasa.
Estas funciones mltiples de la deshidrogenasa
formiato han sido previamente reconocidas, y se ha
sugerido que al menos dos formaciones distintas de
deshidrogenasas, en forma de partculas y solubles,
estn formadas por E. coli (4, 5).
La participacin del citocromo b en la reduccin del
nitrato crea una situacin an ms compleja, ya que
el citocromo b1 es uno de los principales
citocromos presentes en las clulas aerbicas y
anaerobias de E. coli y por lo tanto debe funcionar
en otros sistemas de transporte de electrones (3, 10,
18). En la actualidad no se conoce si el citocromo
B1 componentes estn involucrados en diferentes
vas de electrones o en qu grado interactan tales
vas.
Para definir los componentes del complejo de
nitrato reductasa y su relacin con otras vas
metablicas, se estudiaron los eventos bioqumicos
involucrados en la reduccin de nitratos en el E. coli
de tipo salvaje y en un nmero de mutantes NR.
Se presenta la evidencia de que una forma
especfica de deshidrogenasa, dos componentes
distintos del citocromo b1 y la nitrato reductasa son
componentes obligatorios de un complejo de nitrato
reductasa en E. coli.
MATERIALES Y MTODOS
Las cepas de E. coli usadas en estos estudios, HfrH
y AB2102, y los mutantes NR- derivados de ellos se
describieron previamente (17). Todas las cepas se
cultivaron en un medio completo que contena una
base de sal (20), clorhidrato de tiamina (5 g / ml),
caldo nutriente (Difco) al 0,4% y glucosa al 1%
(esterilizada por separado).
Cuando se indic, el medio se suplement con
nitrato de potasio al 1% y formiato sdico al 0,5%.
Para medir las actividades, los cultivos se cultivaron
en matraces con brazos laterales del tubo de Klett a
37C en un bao de agua con agitacin. Para
condiciones aerobias, el medio se burbuje
vigorosamente con aire estril. Para condiciones
anaerbicas, se burbuje el medio con una mezcla
estril de N2 al 95% ms CO _ {2} al 5%. Los
cultivos se inocularon con un 2 a 5% de inculo de
un cultivo durante la noche cultivado en medio
similar y se dej crecer hasta el centro de la fase
exponencial. Las clulas se recogieron por
centrifugacin, se lavaron dos veces con tampn
fosfato de potasio 0,05 M (pH 6,8 7,3), y
Resuspendido en el mismo tampn. Esta suspensin
se us como tal (clulas enteras) o se congel
durante la noche a -15C antes de su uso (clulas
congeladas-descongeladas). Los extractos libres de
clulas se prepararon mediante tres tratamientos de
15 segundos cada uno en un sonificador Branson de
10 kc, seguido de centrifugacin a 3000 x g durante
10 minutos para eliminar clulas enteras.
La forma deshidrogenasa se midi con diferentes
aceptores de electrones utilizando un radioensayo o
un ensayo espectrofotomtrico descrito
anteriormente (17), o mediante el siguiente
procedimiento manomtrico usando un aparato de
Warburg. En el compartimento principal se
colocaron 0,2 ml de celdas o extracto, 10 mol de
aceptor de electrones y 0,05 M de tampn de
fosfato de potasio (pH 6,8) en un volumen total de
2,7 ml; 30, se colocaron pocillos de formiato en el
brazo lateral. Los frascos y los manmetros se
lavaron con N2 y se equilibraron a 37C antes de
inclinar el formiato en el compartimiento principal.
La actividad se expres como microlitros de CO2
evolucionado por minuto por miligramo de protena.
No se produjo CO2 en ausencia de receptores de
electrones aadidos.
En algunos experimentos, se midi la formiato
deshidrogenasa especfica de vi- nil-benzilo
mediante el siguiente procedimiento cualitativo. En
tubos de Thunberg, 140 umoles
De tampn de fosfato de potasio (pH 6,8), 1,0,
burbujas de viroleno de bencilo, 60 \ mu l de
formiato sdico y clulas o extracto en un volumen
final de 5,0 ml.
Los tubos se enjuagaron con N2, y la reduccin del
vitileno de bencilo se sigui por el uso de un
colormetro Klett con un filtro de 660 nm. El
desarrollo del color no fue lineal y, por lo tanto, los
resultados se expresaron cualitativamente.
La hidrogenidasa frmica se ensay
manomtricamente siguiendo el desprendimiento de
hidrgeno del formiato (15).
La produccin de gas por cultivos en crecimiento se
evalu observando la acumulacin de gas en viales
invertidos sumergidos en tubos del medio de
cultivo.
La nitrato reductasa se ensay con formiato o
viologeno de metilo reducido como donadores de
electrones, como se describi anteriormente (17).
Con otros donantes de electrones se sigui el
procedimiento utilizado con formiato, sustituyendo
el donante de electrones por formiato.
* Los espectros de absorcin de los citocromos se
determinaron con un espectrofotmetro de
grabacin de haz simple construido y amablemente
disponible por Warren Butler en la Universidad de
California en San Diego. La luz monocromtica de
1,0 nm de ancho de banda fue proporcionada por un
monocromador de rejilla Bausch & Lomb. La salida
del fotmetro y un potencimetro orientado al
tambor de longitud de onda proporcionaron las
seales de entrada a una grabadora Moseley 7000
AM X-Y. Para la medicin de espectros reducidos
absolutos a temperatura de nitrgeno lquido, se
coloc una muestra de 1,0 ml en una clula de
absorcin de lado metlico, se redujo con ditionito
sdico slido, se mezcl con 500 mg de Al203 (1
m de dimetro), se congel en N2 lquido, Y se
coloca en un matraz de Dewar que contiene N2 en
el compartimento celular del instrumento. Para la
medicin de la reduccin absoluta
A temperatura ambiente, se sigui el mismo
procedimiento general, omitiendo el N2 lquido.
Para determinar los espectros diferenciales, se
utiliz un accesorio que proporcion un haz
dividido. En este caso, se colocaron muestras
idnticas de 3,0 ml en clulas de absorcin de vidrio
(va luminosa de 10 nm). El contenido de una
cubeta se oxid enjuagando con aire durante 30
segundos, y el otro se redujo con ditionito sdico
slido
Para obtener el espectro reducido-menos-oxidado.
Los niveles de citocromo se calcularon como sigue.
Se dibuj una lnea basal entre 540 y 570 nm, y se
midi la altura del pico de la banda a desde esta
lnea de base. Las unidades de densidad ptica se
calcularon, y el nivel de citocromo se expresa como
unidades de densidad ptica por miligramo de
protena. La cintica de reduccin y oxidacin del
citocromo b1 se sigui con un espectrofotmetro de

longitud de onda doble Aminco-Chance a 35C oa
temperatura ambiente.
La protena se determin mediante el procedimiento
de Lowry et al. (12).
RESULTADOS
Las propiedades generales del sistema de reduccin
de nitratos presentes en las cepas silvestres
utilizadas en estos estudios correspondieron a las
descritas anteriormente (2, 6, 8). En las clulas
inducidas por nitratos de las cepas HfrH, el formiato
fue un donador de electrones ms efectivo para la
reduccin de nitratos que la glucosa (Tabla 1). En
clulas congeladas-descongeladas o en extractos
celulares, varios reactivos actan como donadores
de electrones para la reduccin de nitratos (Tabla 1).
El metil violgeno reducido, que transfiere
electrones directamente a la nitrato reductasa (21),
fue el donador de electrones ms eficaz, pero el
formiato fue del 30 al 40% tan activo como el metil
violgeno reducido en las clulas congeladas-
descongeladas. La reduccin de nitrato con formiato
como donador de electrones fue completamente
inhibida por n-heptil hidroxiquinolina-N-xido
(HOQNO) 0,01 mM, mientras que un aumento de
100 veces en la concentracin del inhibidor no
afect a la reduccin de nitrato con metil violgeno
o ascorbato reducido como el donador de
electrones. La formiato deshidrogenasa presente en
las clulas inducidas por nitrato de la cepa HfrH
utiliz varios aceptores de electrones (Tabla 2).
a
Las clulas inducidas por nitrato se cultivaron y se
trataron como se describe. La reduccin de nitrato
se ensay como se ha descrito, con los siguientes
niveles de donadores de electrones en un volumen
final de 2,5 ml: 48 moles de glucosa, 48 moles de
formiato, 0.25 moles de metil violgeno
(reducido), 2.8 moles de ditionito sdico, 10
moles de ascorbato, 6 moles de formiato.
b
Expresado como micromoles de nitrato por minuto
por miligramo de protena.
_______________________________________
El azul de metileno y el metosulfato de fenazina
fueron los aceptores ms eficaces, mientras que el
ferricianuro de potasio, el vi- lenzol de bencilo y el
cloruro de trifeniltetrazolio fueron mucho menos
eficaces. Hemos medido rutinariamente la formiato
deshidrogenasa siguiendo la reduccin de
diclorofenol indofenol (DCPIP) en presencia de
cantidades catalticas metosulfato de fenazina (17).
Aunque el DCPIP slo se reduce lentamente
mediante una mezcla de extracto crudo y formiato,
en presencia de pequeas cantidades de metosulfato
de fenazina se reduce a una velocidad que
corresponde a la velocidad observada con el azul de
metileno. Este ensayo no implica un flujo indirecto
de electrones a travs del citocromo b1, ya que el
citocromo b1 no se oxida por el metosulfato de
fenazina en nuestras preparaciones y la formiato
deshidrogenasa puede ensayarse mediante este
procedimiento en mutantes que carecen de
citocromo b1. La disponibilidad de una serie de
mutantes que carecen de formiato deshidrogenasa
en las clulas inducidas por nitrato (17) nos
permiti probar directamente la posibilidad de que
distintas formaciones deshidrogenasas estn
implicadas en el metabolismo de E. coli. Aunque la
actividad de formiato deshidrogenasa que utiliza
azul de metileno o metosulfato de fenazina como
aceptor de electrones no pudo ser detectada o era
muy baja en tales mutantes, algunos de los mutantes
todava formaban gas cuando se cultivaban en
condiciones que conducan a la formacin del
sistema de hidrogenasa formica en el medio
silvestre (Tabla 3)
a
La concentracin de aceptores de electrones
utilizada fue de 3,1 jsmoles / ml (excepto para el
aire).
b
Las clulas inducidas por nitrato de HfrH se
cultivaron y se rompieron en un Branson Sonifier, y
el extracto se prepar como se indic en Materiales
y Mtodos, pero se congel antes de su uso. La
forma deshidrogenasa se ensay mediante la
liberacin de CO2 radiactivo a partir del formiato
4C, y los nanomoles de CO2 se calcularon a partir
de la actividad especfica del formiato (8,230
cuentas por minuto por mol) utilizado. Los
resultados mostrados se expresan como nanomoles
de CO2 por minuto por miligramo de protena.
Cuando se us virgeno de bencilo como aceptor de
electrones, la evolucin del CO2 a partir del
formiato o la reduccin del colorante en presencia
de formiato no fue lineal con el tiempo y, por lo
tanto, se expres cualitativamente. Estos resultados
apoyan la hiptesis de que dos deshidrogenasas de
formiato bioqumicamente distintas estn
implicadas en la reduccin de nitratos y la
formacin de hidrgeno en E. coli. Sin embargo, las
deshidrogenasas de formiato pueden no ser
genticamente distintas ya que en algunos de los
mutantes NR-, se pierden tanto la formiato
deshidrogenasa especfica de nitrato como la
formiato deshidrogenasa implicada en el sistema de
hidrogenasa formica (Tabla 3) como resultado de
mutaciones que aparecen Para ser nico, mutaciones
puntuales sobre la base de las tasas de reversin
(17).
Cuando E. coli se desarrolla anaerobiamente, la
adicin de nitrato provoca un aumento en el nivel de
citocromo b1 (17, 23).__________________
a
S (identificados por sus picos de una banda a la
e temperatura del nitrgeno lquido) fue evidente en
evalu la formacin de gas en cultivos que crecen
anaerobicamente en medio completo sin nitrato en
tubos que contienen viales invertidos para atrapar
gas. Los cultivos se dejaron incubar al menos 5 das
y se consideraron positivos (+) si formaban ms del
10% del gas observado en el tipo salvaje.
b componente b555 en clulas aerbicas. NR-
El ensayo de formiato deshidrogenasa con benziol
viologeno fue cualitativo. Todos los ensayos se
realizaron con extractos celulares frescos
preparados a partir de clulas cultivadas
anaerobiamente en medio completo (ensayo de
vitileno de bencilo) o en medio completo
suplementado con nitrato (radioensayo y ensayo
colorimtrico). Los resultados se expresan como
micromoles de C02 por minuto por miligramo de
protena; Los resultados para benzyl viologen se
expresan cualitativamente.
c
La actividad con azul de metileno se calcul como
micromoles de CO2 liberado de formiato (actividad
especfica, 22.800 cuentas por minuto por mol).
_______________________________________
El siguiente anlisis espectral demuestra que los
componentes del citocromo b1 formados en
presencia y ausencia de nitrato son tambin
cualitativamente distintos. Los espectros absolutos
de las clulas congeladas-descongeladas reducidas
con ditionito se muestran en la Fig. 1. Las clulas
cultivadas en presencia de nitrato mostraron
solamente dos picos mayores entre 500 y 600 nm.
stos eran 526 nm (bandas ) y 555 nm (banda ) a
temperaturas de nitrgeno lquido y 528 y 558 nm a
temperatura ambiente. Por otro lado, las clulas
cultivadas en ausencia de nitrato presentaron picos
mayores a 528 y 558 nm, un hombro a 549 nm
(citocromo c) a temperatura de nitrgeno lquido y
picos a 530 y 560 nm a temperatura ambiente. La
distincin entre estos componentes b555 y b558
algunos mutantes NR- que haban reducido los
niveles de citocromo b1. Cuando tales mutantes se
hicieron crecer en condiciones anaerobias en
presencia de nitrato, ambos componentes eran
evidentes en el espectro reducido (Figura 2, mutante
TW-15). Adems, un segundo tipo de mutante, que
no formaba ningn componente citocromo b555
detectable cuando se creci anaerbicamente con
nitrato (Figura 2, cepa RB-12), form niveles
normales de los componentes b558 cuando creci
anaerbicamente en ausencia de nitrato (no
mostrado, Ver espectro no inducido de tipo silvestre,
Fig. 1). Cuando las cepas de tipo silvestre se
cultivaron aerbicamente, las bandas de los
principales componentes del citocromo b se
encontraban a 555 y 562 nm (a temperatura de
nitrgeno lquido). Sobre la base de las
observaciones siguientes con mutantes NR, los
componentes b555 encontrados en clulas anaerobias
inducidas por nitrato pareceran ser distintos del
mutantes, que han alterado los niveles de la b555
componente cuando se creci anaerobicamente con
nitrato, form una distribucin normal de los
componentes del citocromo, incluido un
componente b555, cuando se cultivaron en
condiciones aerobias (Fig. 2]. Los espectros
absolutos mostrados para las clulas aerbicas son
idnticos a los encontrados en las clulas de tipo
salvaje aerbico cultivadas bajo estas condiciones,
mostrando picos a 555 y 562 nm. Por lo tanto, el
principal componente del citocromo b encontrado
en las clulas cultivadas anaerbicamente en
presencia de nitrato parece ser fisiolgica y
genticamente distintos de los componentes del
citocromo b encontrados en otras condiciones de
crecimiento. Las siguientes observaciones implican
directamente al componente b555 en el sistema de
reduccin de nitrato y proporcionan evidencia de
que est compuesto de dos citocromos distintos que
poseen caractersticas espectrales idnticas.
FIG. 1. Espectro absoluto ditionito-reducido de la cepa HfrH cultivada con y sin nitrato. Las clulas se
cultivaron anaerobicamente en medio completo con (clulas inducidas) y sin (clulas no inducidas) nitrato de
potasio y se trataron como se indica. Se usaron suspensiones de clulas congeladas-descongeladas a una
concentracin de protena de 3,08 mg / ml para las clulas no inducidas y de 1,74 mg / ml para las clulas
inducidas. Los espectros se determinaron a temperatura N2 (A) y temperatura ambiente (B). Las barras en el
centro de la figura muestran la escala de unidades de densidad ptica para cada una de las curvas.

Cuando se sigui la cintica de reduccin y
oxidacin del citocromo b1 en un espectrofotmetro
de registro de longitud de onda doble
AmincoChance, se encontr que las adiciones
repetidas de dinucletido de nicotinamida adenina
(NADH) reducido de 1 mm no causaron la
reduccin del componente citocromo b1 presente en
reparaciones de clulas inducidas por nitrato c-
descongelado (Fig. 3).
Al aumentar la concentracin de NADH a 100 mM,
fue posible efectuar una reduccin del citocromo b1,
pero consideramos esto como un nivel no fisiolgico
de NADH. Se obtuvieron resultados similares
utilizando extractos brutos. Cuando se aadi
formiato de 1 mm, se produjo una reduccin
inmediata del citocromo b. La adicin posterior de
nitrato caus la oxidacin completa del citocromo,
pero con una cintica peculiar (Fig. 3). Slo una
parte del citocromo se oxid inmediatamente y el
resto se oxid despus de un desfase temporal
definido. Con algn tiempo de retraso, el ascorbato
tambin caus la reduccin del citocromo 1. Sin
embargo, en este caso el citocromo reducido se
oxid completamente en una sola etapa tras la
adicin de nitrato (Figura 4A). Al parecer, slo se
redujo una parte del citocromo b1, ya que la adicin
posterior de formiato caus la reduccin de ms
citocromo, y en este caso la cintica bifsica se
observ para la oxidacin por nitrato.
Esta diferencia en la extensin de la reduccin del
componente citocromo causada por formiato y
ascorbato se verific mediante el experimento
mostrado en la Fig. 4B, en la que la adicin de
formiato inmediatamente despus del ascorbato
provoc un incremento adicional de la reduccin del
citocromo. Estos resultados sugieren que dos
componentes del citocromo b, se redujeron por el
formiato, uno de los cuales se reduce por el
ascorbato, y que el nitrato oxidado ambos
componentes del citocromo, pero uno de ellos slo
despus de un desfase definitivo en el tiempo lag.
Figura 2. Los espectros de citocromo de dos mutantes NR crecen bajo diferentes condiciones. Los espectros se
determinaron a una temperatura de N2 lquido sobre suspensiones de clulas heladas-descongeladas y se
prepararon como se ha descrito. Las concentraciones de protena fueron 6,25 mg / ml para RB-12 (anaerbico),
4,32 mg / ml (aerbico), 6,82 mg / ml para TW-15 mg / ml (anaerbico) y 5,72 mg / ml para TW-15 (aerobio).

Los efectos de HOQNO sobre la oxidacin del
citocromo b1 Proporcion evidencia adicional de
que dos citocromos distinguibles estaban siendo
reducidos y oxidados en este experimento.Cuando se
aadi HOQNO 0,1 nM despus de la reduccin
completa del citocromo (Figura 4B), slo una parte
de la reduccin del citocromo se reoxid mediante
nitrato y la oxidacin se produjo inmediatamente en
un solo paso. Se obtuvieron resultados idnticos
cuando el citocromo se redujo slo por formiato, es
decir, el segundo paso de la cintica bifsica fue
completamente inhibido por HOQNO. Adems, otra
vez la reduccin de del citocromo oxidado por
fomato fue evitada por HOQNO (Figura 4B). Por el
contrario, la porcin de citocromo b1 que se redujo
por ascorbato no fue impedida por HOQNO de ser
oxidado por nitrato (Figura 4G). La adicin de ms
nitrato no tuvo efecto adicional y, en este caso,
HOQNO no impidi que el formiato redujera al
menos parte del citocromo.
La forma reducida citocromo b exhibi una banda
alfa, a 558 nm a temperatura ambiente, que
corresponde al componente b555 (figura 1B).
El nitrato reoxid completamente al citocromo, pero
cuando se aadi HOQNO a la preparacin reducida
en formiato, el nitrato caus la oxidacin de slo una
parte de este, dejando un citocromo reducido con un
mximo de absorcin idntico. Los resultados
presentados en la Fig. 5B tambin confirman los
resultados obtenidos con ascorbato como donador de
electrones y demostr que un citocromo con un
mximo de absorcin de 558 nm a temperatura
ambiente. Los cambios cinticos observados, por lo
tanto, reflejan los cambios que se producen
especficamente en el citocromo b555 componentes.

Para demostrar que estos resultados se debieron

especficamente al comportamiento del citocromo
b555, se llev a cabo una serie similar de
experimentos en los que se determinaron los
espectros a temperatura ambiente con la fijacin por
haz dividido para el espectrofotmetro (Figura 5A).

Estos resultados pueden explicarse asumiendo la
participacin en la reduccin de nitrato de dos
citocromos con espectros idnticos que difieren slo
en sus potenciales redox (ver Fig. 7).
Otra evidencia de tal hiptesis se obtuvo al analizar
la autooxidacin del citocromo b1 en las clulas
inducidas por nitrato (Figura 6).
El formiato a una concentracin de 8,3 X 103 M
redujo rpidamente el citocromo bi (curva a).
Despus de burbujear aire a travs de la suspensin
de clulas durante 1 minuto, el citocromo se oxid
completamente (curva b). Cuando se aadi 8,3 X
10 M de HOQNO, burbujear con aire durante 1
minuto caus oxidacin rpida de slo la mitad del
citocromo, y el resto del citocromo reducido no se
oxid, incluso despus de 8 min de burbujas
continuas
Con aire (curva c). Cuando la concentracin de
formiato era menor (5 X 10-4 M), HOQNO no
inhibi la oxidacin del citocromo (curvas d, e, f).
Nuevamente, estos resultados pueden interpretarse
asumiendo la existencia de dos citocromos en las
clulas inducidas por nitrato que pueden ser
reducidas por el formiato y oxidadas por el oxgeno
(Figura 7). La presencia de HOQNO inhibira el
flujo de electrones entre ambos citocromos,
permitiendo que slo un citocromo se oxidase
rpidamente en presencia de exceso de formiato, ya
que el formate continuara reduciendo el citocromo
antes del bloque. El hecho de que HOQNO no tuvo
ningn efecto sobre la oxidacin de citocromos
cuando se utiliz un bajo nivel de formiato sugiere
que ambos citocromos son autooxidables.
DISCUSIN
La participacin de la formiato deshidrogenasa,
citocromo b1 y nitrato reductasa en la reduccin de
nitratos por E. coli ha sido propuesta por varios
investigadores (6, 8, 17, 23). Los resultados
presentados aqu, junto con los resultados de los
estudios sobre NR-mutantes (17), indican que
diferentes formas de estos componentes estn
involucrados en el sistema de reduccin de nitratos y
que hay poca interaccin con otras cadenas de
transporte de electrones, es decir, la reduccin de
nitratos se produce Principalmente por el
funcionamiento secuencial de la deshidrogenasa
formiato, el citocromo b555 y la nitrato reductasa.
Los investigadores de Severla han demostrado que el
NADH puede servir como donante de electrones
para la reduccin de nitratos en extractos libres de
clulas de E. coli (2, 5, 6, 13). Sin embargo, los
mutantes NR- que carecen de formiato
deshidrogenasa pero poseen nitrato reductasa no
forman nitrito ni eliminan nitrato del medio durante
el crecimiento (datos no publicados). Sin embargo,
cuando tales mutantes llegan a la fase estacionaria,
el nitrito comienza a acumularse, lo que sugiere que
el NADH puede servir como donante de electrones
para la reduccin de nitratos slo en clulas de fase
estacionaria. En contraste, el padre de tipo salvaje
acumula grandes cantidades de nitrito durante el
crecimiento en las mismas condiciones, y esta
acumulacin contina durante la fase estacionaria.
En ninguno de estos casos se reduce an ms el
nitrito, presumiblemente porque utilizamos 1% de
nitrato, una condicin que suprime la formacin del
sistema de nitritos reductasa en E. coli (2). El papel
especfico de la actividad nitrato reductasa ligada al
NADH y su relacin con la actividad nitrato
reductasa asociada con formiato deshidrogenasa es,
en la actualidad, desconocida.

FIG. 4. Reduccin y oxidacin del
citocromo b1 y efecto de HOQNO. Se
prepararon las clulas y las
condiciones fueron como en la Fig. 3,
excepto que la suspensin celular
frozenthawed se trat con
desoxirribonucleasa (2.5 g / ml) para
reducir la viscosidad. Se aadieron
formiato sdico y ascorbato sdico
(cido ascrbico ajustado a pH 7.0
con hidrxido sdico) como 0.01 ml
de soluciones 1.0 M a 4.0 ml de
suspensin celular (4.8 mg / ml).
Fig. 5. Espectro diferencial del citocromo b 1
reducido por formiato y ascorbato y oxidado por
nitrato en presencia de HOQNO. Las clulas de
HfrH se cultivaron anaerbicamente en medio
completo suplementado con nitrato de potasio al 1%
y se usaron como una suspensin congelada-
descongelada. En este caso, se aadieron 10 g de
desoxirribonucleasa por ml de suspensin para
reducir la viscosidad. Los espectros diferenciales se
obtuvieron con el espectrofotmetro de haz dividido
a temperatura ambiente. Se aadi una muestra de
suspensin celular (3,0 ml que contena 2.0 mg de
protena por ml) a cada cubeta. A la cubeta de
referencia, se aadieron 0.05 ml de nitrato de potasio
1M para oxidar el citocromo b1. En las cubetas
reducidas, se aadieron 0.05 ml de formiato 0.06 M
o cido ascrbico slido.
FIG. 6. Auto-oxidacin del citocromo b1 y efecto de
HOQNO. Las clulas se prepararon como en la Fig.
4 y se us a una concentracin de protena de 2.3 mg
/ ml. Los espectros de diferencia se determinaron a
temperatura ambiente con el espectrofotmetro de
haz dividido. La suspensin de clulas de referencia
se oxid burbujeando con aire a travs de una pipeta
pasteur. (a) Suspensin celular ms 8.3 moles de
formato de sodio por ml; (b) la suspensin (a)
burbuje con aire por 1 min; (c) suspensin (a) ms
8.3 X 10-5 M HOQNO, burbuje con aire durante 8
min; (d) suspensin de clulas ms 0.5 moles de
formiato sdico por ml; (e) la suspensin (d)
burbuje con aire durante 1 minuto: (f) suspensin
(d) ms 8.3 X 10-3 M HOQNO, burbuje con aire
durante 1 min.
FIG. 7. Esquema sugerido para el
complejo de nitrato reductasa de
Escherichia coli.
La formiato deshidrogenasa implicada en la
reduccin de nitratos parece ser distinta de la
formiato deshidrogenasa implicada en el sistema
formiato de hidrogenidasa. Esta distincin se basa en
parte en la especificidad de aceptor de electrones de
la formiato deshidrogenasa asociada con estos dos
sistemas (5), pero se demuestra ms claramente por
la existencia de un sistema formiato de hidrogenasa
formiato y una deshidrogenasa de formiato
especfica de benzilo viologeno en mutantes NR-
que carecen La formiato deshidrogenasa especfica
de metosulfato de fenazina asociada con la
reduccin de nitrato. El hecho de que algunos NR-
mutantes carezcan de estas dos deshidrogenasas
formadas, como se muestra aqu y por otros (14, 22),
sugiere que ambas actividades dependen de un
elemento gentico comn, tal vez el gen estructural
para la deshidrogenasa formiato. Si ambos son
especificados por el mismo gen, las variaciones
genticas y fisiolgicas observadas para las dos
deshidrogenasas de formiato deben resultar de una
interaccin y asociacin del producto gnico con
distintos componentes de transporte de electrones.
Una interpretacin alternativa es que ambas
actividades se pierden como resultado de una
alteracin pleiotrpica que afecta a los componentes
de membrana de la clula (1). En cualquier caso, una
comprensin clara de las variaciones genticas
observadas para las deshidrogenasas de formiato
requerir un anlisis gentico y bioqumico detallado Estas observaciones no establecen si es el mismo
de esta enzima y su participacin en distintas vas.
El esquema de la Fig. 7 se propone explicar la
interaccin del citocromo b, con los diferentes
donantes de electrones, su oxidacin por nitrato y los
efectos del inhibidor HOQNO sobre estos procesos.
Varios de los hechos presentados aqu sugieren que
dos componentes distintos del citocromo b555 son
oxidados por el nitrato. (I) El nitrato provoca una
oxidacin bifsica del citocromo b555. (II) El
ascorbato, un donador de electrones de potencial
redox moderadamente alto, redujo slo una parte
(aproximadamente el 50%) del citocromo b555
especfico del nitrato que reducen el ditionito o el
formiato. (III) HOQNO inhibe la oxidacin de nitro
de la parte del citocromo b555 formada por formiato
(aproximadamente 50%), pero no inhibe la
oxidacin del citocromo b555 reducido por
ascorbato por nitrato. Estas observaciones, junto con
el hecho de que HOQNO inhibe completamente la
reduccin de nitrato por formiato, se explican ms
fcilmente por la propuesta de la Fig. 7 que dos
componentes del citocromo b555 con diferentes
potenciales de oxidacin-reduccin funcionan
secuencialmente en la transferencia de electrones de
formiato a nitrato. Mientras que ditionito y formiato
(va formiato deshidrogenasa) reduciran ambos
componentes, el ascorbato reducira solamente el
segundo componente del citocromo. Los efectos
selectivos de HOQNO resultaran de su inhibicin
de la transferencia de electrones entre los dos
componentes del citocromo. La cintica bifsica de
la oxidacin por nitrato se debe a la capacidad del
formiato, mientras est presente, de mantener el
citocromo I reducido incluso en presencia de
citocromo II oxidado.
Este modelo podra explicar por qu muchos NR-
mutantes que carecen de nitrato reductasa o formiato
deshidrogenasa tambin presentan niveles
disminuidos pero intermedios del citocromo b 555
(17); yo. E., Uno o el otro de los dos componentes
del citocromo puede no ser formado. Adems, los
informes de que el citocromo bi est asociado tanto
con formiato deshidrogenasa (7, 11) y con nitrato
reductasa (9) despus de que estas enzimas haban
sido resueltas unas de otras puede explicarse
asumiendo que un componente citocromo
b1permanece asociado con formiato deshidrogenasa
y el otro con nitrato reductasa durante los
procedimientos de purificacin. Est claro que los
componentes del citocromo b555 especficos del
nitrato son distintos del componente citocromo b555
formado en condiciones aerobias, ya que los
mutantes NR-que carecen del citocromo b 555
inducido por nitrato todava forman componentes
normales del citocromo b1 en condiciones aerobias.
citocromo b1 asociado con diferentes componentes o
que E. coli especifica una serie de componentes
distintos de citocromo b1 para diversos sistemas de
transporte de electrones. En cualquier caso, la
formacin de componentes del citocromo debe ser
regulada especficamente por los otros componentes
catalticos con los que estn normalmente asociados.
Esa reduccin de nitratos es catalizada por un
complejo de enzimas asociado fsicamente que slo
puede establecerse por el aislamiento de la unidad
cataltica. Sin embargo, la asociacin de membranas
de los componentes, la existencia de mutaciones
pleiotrpicas que afectan las actividades y la
aparente falta de interaccin de este sistema con
otras cadenas de transporte de electrones argumentan
la existencia de tal complejo.