TUGAS ANALISA MAKANAN DAN MINUMAN

METODE ANALISA VITAMIN LARUT LEMAK

DAN LARUT AIR

DISUSUN OLEH
ANGGOTA :
Nur Azizah
(145070500111002)

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
TA 2016/2017
 VITAMIN LARUT AIR
B2 (RIBOFLAVIN)
Metode HPLC
- Prinsip : Sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka
sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-
senyawa kimia (analit) sesuai dengan perbedaan afinitasnya pada fase diam
atau fase gerak.
- Prosedur :

Ditimbang 50 mg
Riboflavin
Dilarutkan dalam 0,02 mol asam asetat hingga 500 ml
Dibuat fase gerak (komposisi sodium acetate (0.10 mol L-1),
calcium chloride (35.0 mmol L-1) and EDTA (25.0 mmol L-
1):methanol (65:35 v/v), kemudian disaring0.45 m cellulose
membrane filters (Millipore))
Dilakukan validasi metode HPLC menggunakan larutan
standar, apabila parameter validasi baik maka metode dapat
dilakukan
Sampel susu direaksikan dengan TCA
Sampel kemudian dianalisis melalui HPLC dengan dektektor
fluorosens

HASIL
- Kelebihan dan Kekurangan
Kelebihan Kekurangan
Hasilnya dapat langsung dilihat Membutuhkan pretreatment sampel
Kuantitatif seperti ekstraksi dan filtrasi
Akurat Membutuhkan standar internal,
Sensitif dan spesifik kalibrator dan reagen HPLC
Otomatis Harganya mahal
Kerja lebih mudah dan volume Perlu preparasi sampel
sampel kecil Fase gerak dan laju pemompaan
Presisi dan akurasi tinggi harus diperhatikan
High throughput Memerlukan optimasi
 Sampel dalam jumlah kecil

Metode Fluorometer
- Prinsip : beberapa vitamin memiliki kemampuan untuk dapat
menibulkan fluorosens ketika dicampurkan dengan fluorophore. Fluorosens
yang dihasilkan pada pencampuran sebanding dengan konsentrasi vitamin.
- Prosedur :

Galvanometer
Larutan Sodium Florosendiset 0
Diletakkan pada sumber cahaya
Galvano di set pada 25 unit

dilarutkan pada larutan asam asetat 10% dan metanol (1:2)

Riboflavin
Dibaca pada galvanometer
Dibuat kurva antara nilai yang didapat dengan
konsentrasi riboflavin sebagai kurva baku
2 gram sampel yang mengandung riboflavin dicampur dengan
Waring Blendor 200ml selama 5 menit
Pencampuran dilanjutkan 10 menit dengan kecepatan tinggi
Didiamkan selama 2 menit
Diambil supernatannya 25 ml
Dicampur dengan metanol 50 ml
Disaring dengan kertas whatmann no 1
Diukur pada galvanometer
Convert hasil dengan cara /ml x 1/1000 x 3 x 200ml x28,4/2 =
...mg/oz

HASIL

- Kelebihan dan Kekurangan

Kelebihan
Reaksi terjadi langsung
cepat
pengerjaan dapat dilakukan
beberapa sampel
Sampel dalam jumlah kecil
Kekurangan
Sensitifitas dan spesifisitas rendah
karna adanya beberapa substansi
yang dapat mengganggu chromogen
Kontrol dan kalibrasi harus tepat
Hanya dapat dilakukan pda vitamin
tertentu
 Metode Elektroforesis Kapiler pada Plasma Manusia
- Prinsip : elektroforesis kapiler dapat memisahkan asam
amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi yang
dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer, sehingga dapat memurnikan analit
yang diinginkan, dalam hal ini riboflavin.
- Prosedur :
Preparasi Sampel :

PlasmaDiambil
Ditambahkan EDTA sebanyak 4 mmol
Didinginkan
Disentrifuga selama 60 menit
Disimpan pada suhu 280C
500mL sampel kemudian dicampur dengan 1500 mL 100 g/L
TCA dingin yang mengandung 15 nmol/L isoriboflavin
(internal standart)
Protein yang mengendap dipisahkan melalui sentrifugasi

Supernatan
Diambil 1500 mL
dinetralkan dengan 480 mL K2HPO4 2 mol/L
Dilakukan ekstraksi solid menggunakan Bond Elut C-18
columns (1 mL/50 mg; Varian) dan Gilson ASPEC sample
processor
Kolom diberi 500 mL of methanol kemudian 1000 mL of 25
mmol/L sodium phosphate buffer, pH 7.0.
Kolom diberi 1900 mL plasma yang telah diberi TCA dan
dicuci dengan phosphate buffer
Analit dielusi dengan 200 mL of 600 mL/L methanol dalam
phosphate buffer, dan kolom diberi 220 mL phosphate buffer

HASILKapiler :
Elektroforesis

Dibuat dari 100 mmol/L sodium borate, pH 7.9, containing 50

Lerutan Penyangga
mmol/L sodium dodecyl sulfate, 100 mL/L methanol, and 20
mL/L N-methylformamide.
di saring melalui membran 0.2 mm
 Pipa kapiler dicuci dengan with 0.1 mol/L NaOH selama 60
detik dan larutan penyangga selama 120 s dengan tekanan
tinggi (137 kPa)
Sebanyak 25 nL disuntikkan selama 7 detik dengan tekanan
rendah (3.5 kPa)
Larutan penyangga disuntikkan selama 5 menit
Electrophoresis dilakukan pada kondisi 24 kV (358 V/cm),
polaritas normal (positive potential pada bagian inlet) dan suhu
29 C
Setelah perlakuan kapiler di bilas dengan larutan penyangga
selama 60 detik dengan tekanan tinggi (137 kPa)

HASIL
Kelebihan dan Kekurangan
Kelebihan Kekurangan
Sampel dan reagen dalam jumlah Memerlukan proses preparasi
kecil Jenis reagen banyak
Pemisahan cepat Memerlukan energi (sumber listrik)
Resolusi tinggi
 VITAMIN LARUT LEMAK

VITAMIN D

Metode Pewarnaan
- Prinsip : dilakukan dengan penambahan pereaksi carr Priece seperti
analisa pada vitamin A dan akan benrnilai positif jika muncul warna jingga-
kuning
- Prosedur :
Ditim
Dimasukkan 10 tetes zat ke dalam tabung reaksi
Minyak Ikan
Di tambahkan 10 tetes larutan H2O2 5%
Dikocok campuran selama 10 menit
di panaskan di atas api kecil perlahan-lahan sampai tidak ada
gelembung-gelembung gas keluar. Usahakan jangan sampai
mendidih
didinginkan tabung di bawah air kran
Lalu lakukan uji dengan pereaksi Carr-Price seperti pada
penentuan vitamin A
Diamati perubahan warna yang terjadi

- Kelebihan dan Kerugian

HASIL

Kelebihan
tes kuantitatif langsung
Membutuhkan volume sampel kecil
Otomatis
fast turn around time
Bisa diterapkan untuk sampel
tunggal atau beberapa pada satu
waktu
Kekurangan
sensitivitas dan spesifisitas rendah
maka beberapa zat lainnya dapat
mengganggu chromogen atau enzim
yang digunakan.
Tidak bisa digunakan untuk semua
jenis vitamin
Kontrol yang tepat dan kalibrator
harus digunakan

Metode HPLC
- Prinsip : Vitamin yang larut dalam lemak bersifat peka terhadap
cahaya, maka selama analisis cahaya Iangsung dihindarkan dengan
menggunakan wadah yang dilapisi kertas karbon atau aluminium
- Prosedur :
DagingDiiris-iris dan dikeringkan selama 3 hari
digiling halus berukuran 1 mm mengunakan blender dan
disimpan pada suhu 4C sampai siap dianalisis.
ditimbang 3 - 5 gr lalu diekstrak 3 kali dengan 30 ml campuran
chloroform : etanol (2 : 1) dengan blender selama masing-
masing 3 menit.
Larutan disaring dengan corong Buchner menggunakan kertas
saring Whatman 41, kemudian hasil saringan diuapkan dengan
vakum.
Residu dicuci atau dilarutkan dengan 50 ml etanol absolut dan
dipindahkan ke dalam erlenmeyer bertutup teflon.
Larutan residu dalam etanol ditambahkan 1,5 ml kalium
hidroksida 15% (w/v) dan 0,5 gr vitamin C sambil dialiri gas
N2 lalu ditutup dengan cepat .
Campuran tersebut dikocok di dalam ultra sonik selama 30
menit, kemudian didiamkan semalam pada suhu kamar lalu
dikocok kembali selama 30 menit dengan ultra sonik.
Campuran tersebut diekstrak dengan 2 x 75 ml dietileter, lalu
lapisan eter dicuci 2 kali dengan 40 ml larutan dapar fosfat pH
7,4 dan akhirnya dengan air suling hingga bebas basa (uji
kertas pH).
Lapisan eter dipisahkan dan diuapkan dengan vakum dan
residunya dilarutkan kembali dengan 3 ml metanol HPLC
grade .
Larutan disaring dengan kertas saring FGWP 0,22 m .
Larutan contoh 10 l disuntikkan pada HPLC dan dielusi
dengan larutan metanol 90% dan 95% . Begitu pula kecepatan
alir fasa gerak yaitu 1,5 ml dan 2,0 ml/menit pada 2 jenis
kolom C18 dan C8.

HASIL
- Kelebihan dan Kekurangan
 Kelebihan Kekurangan
Hasilnya dapat langsung dilihat Membutuhkan pretreatment sampel
Kuantitatif seperti ekstraksi dan filtrasi
Akurat Membutuhkan standar internal,
Sensitif dan spesifik kalibrator dan reagen HPLC
Otomatis Harganya mahal
Kerja lebih mudah dan volume Perlu preparasi sampel
sampel kecil Fase gerak dan laju pemompaan
Presisi dan akurasi tinggi harus diperhatikan
High throughput Memerlukan optimasi
Sampel dalam jumlah kecil

Analisis Vitamin D metabolit vitamin D2 dan Vitamin D3 di Serum Manusia

dengan IONICS 3Q 110
- Prinsip : Vitamin D2 dan D3 adalah metabolit yang dapat diukur dalam
serum darah untuk menentukan tingkat vitamin D. ini dapat memperoleh
LLOQ pada 1 ng / mL untuk vitamin D3 dan 2 ng / mL untuk vitamin D2

- Prosedur :

dicampur dengan dua volume asetonitril dingin (-20 C).

Serum manusia
Campuran divortex sekitar 1 menit
disentrifugasi sekitar 30 menit.
supernatan dipindahkan untuk membersihkan wadah dan
digunakan sebagai matriks untuk vitamin D2 dan vitamin D3
kuantisasi.
Vitamin D2 dan vitamin D3 standar yang dibubuhi ke bersih
vitamin D serum manusia bebas untuk membuat konsentrasi
pada 2000 ng / mL.
diencerkan dengan faktor 2-0,5 ng / mL, yang akan digunakan
untuk menghasilkan kurva kalibrasi dengan empat suntikan
ulangan untuk masing-masing konsentrasi.
Semua pelarut yang digunakan dalam aplikasi ini adalah kelas
HPLC.
 IONICS 3Q 110 dilengkapi dengan sumber ESI digunakan
untuk menganalisis vitamin D2 dan D3.
Pemisahan itu dilakukan pada sistem Shimadzu UFLC yang
mencakup dua pompa, autosampler, degasser, kolom oven.
10 sampel uL dimuat pada Cadenza C-18 kolom (50x2.1mm,
3) pada 40 C. Laju aliran adalah 500 mL / menit dengan
total waktu siklus LC dari 5 menit.
Pelarut B adalah 0,1% asam format dalam metanol dengan 1
mM amonium asetat. Pelarut A adalah 0,1% asam format
dalam air dengan 1 mM amonium asetat. LC gradien dengan
perubahan pelarut Bdigiling halus berukuran 1 mm
mengunakan blender dan disimpan pada suhu 4C sampai siap
dianalisis.

- Kelebihan
Serumdan Kekurangan
manusia

Kelebihan Kekurangan
Dekat dengan fakta metode tidak langsung
Dapat diteliti lebih lanjut Membutuhkan pemantauan
Sulit untuk mempertahankan data
yang konsisten karena gangguan oleh
faktor lain
Tidak berlaku untuk semua vitamin