Anda di halaman 1dari 11

BAB V

PEMBAHASAN

Pada praktikum isolasi protein, organ yang digunakan adalah insang dari
ikan mas (Cyprinus carpio). Pada isolasi protein dikenal adanya dua prinsip yaitu
homogenisasi dan fraksinasi. Homogenisasi merupakan pengeluaran protein dari
organ serta pencampuran reagen dengan organ target. Fraksinasi dilakukan
melalui sentrifugasi, yaitu pemisahan protein dari membran dan organel lain
berdasarkan berat molekulnya. Menurut Fatchiyah, dkk (2012), untuk
menganalisa protein yang ada di dalam sel diperlukan prosedur fraksinasi sel yaitu
(1) memisahkan sel dari jaringannya, (2) menghancurkan membran sel untuk
mengambil kandungan sitoplasma dan organelnya serta (3) memisahkan organel-
organel dan molekul penyusunnya. Prosedur (1) dan (2) dinamakan homogenasi
dapat dilakukan dengan menggunakan alat yang paling sederhana seperti
homogeniser atau mortal sampai alat yang paling mutakhir seperti pemakaian
vibrasi dan sonikasi tergantung pada bahan yang akan dihomogenasi. Prosedur (3)
dilakukan dengan menggunakan sentrifus dengan kecepatan dan lama sentrifugasi
tertentu. Sebagian besar protein merupakan molekul yang mudah rusak bila tidak
berada pada kondisi fisiologisnya. Karena itu, untuk mempertahankan struktur
dan fungsi protein, fraksinasi dilakukan pada suhu rendah (0-4C) dalam buffer
dan pH tertentu (tergantung dari jenis protein yang akan dianalisa).

Pada tahapan isolasi protein, organ insang ikan mas (Cyprinus carpio)
ditimbang sebanyak 0,5 gram dengan menggunakan neraca analitik dan dicuci tiga
kali dengan PBS (Phosphat Buffer Saline). Menurut Michael, et al (2016), fungsi
PBS (Phosphat Buffer Saline) ialah untuk pengenceran, mencuci suspensi sel,
pembilasan, serta bahan aditif untuk media kultur sel. 1 liter PBS mengandung
NaCl, Na2H2PO4, NaH2PO4, dan aquades (Mohan, 2003). PBS ini juga digunakan
untuk membantu penghalusan sampel, sebagai ringer, buffer, dan mencegah sel-
sel pecah akibat tekanan osmosis (Martin, et al, 2006). Hal yang perlu
diperhatikan dalam proses penghalusan sampel adalah penghalusan sampel tidak
boleh terlalu lama agar protein tidak rusak. Selanjutnya dilakukan penambahan
PBS Tween PMSF. Tween merupakan bahan yang bersifat seperti detergen. PBS
Tween dicampur dengan PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Flouride) dengan
perbandingan 9:1. PMSF terbuat dari Tris Base, EDTA, NaCl, PMSF dan NP 40.
PMSF bekerja sebagai inhibitor protease, dalam hal ini PMSF menghambat kerja
enzim protease agar tidak melisiskan protein (Yulianti, 2006). Sampel kemudian
dipipet dan dimasukkan ke tabung Eppendorf 1,5 ml agar lebih mudah dalam
pengukuran. Setelah itu, sampel disonifikasi dengan sonikator selama 10 menit.
Sonifikasi merupakan proses pemecahan membran dengan bantuan gelombang
ultrasonik (Mohan, 2003), dan sonifikasi ini dilakukan dengan alat sonikator.

Tahapan selanjutnya adalah sampel disentrifus dengan kecepatan 6000


rpm selama 15 menit pada suhu 4C. Proses sentrifus dilakukan pada suhu ini agar
protein tidak terdenaturasi. Fatchiyah, dkk (2012) juga menjelaskan bahwa untuk
mempertahankan struktur dan fungsi protein, fraksinasi dilakukan pada suhu
rendah (0-4C). Pada proses sentrifus pertama ini yang diambil adalah
supernatannya karena berat molekul debris sel lebih berat daripada protein
sehingga debris sel akan mengendap dibawah dan protein akan berada di bagian
atas. Supernatan yang telah diambil dimasukkan ke Eppendorf baru dan diukur
volumenya untuk selanjutnya ditambahkan dengan ethanol PA dengan
perbandingan 1:1. Penambahan Ethanol PA berfungsi untuk tahapan presipitasi
(Fatchiyah, dkk, 2012). Setelah ditambahkan Ethanol PA sampel kemudian
divortex agar homogen dan didiamkan di freezer selama 24 jam supaya etanol bisa
terpresipitasi dengan sempurna.

Setelah diinkubasi di freezer selama 24 jam, sampel kembali disentrifus


dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4C selama 15 menit dan kemudian
etanol dibuang lalu sampel dibiarkan dalam keadaan terbuka di kulkas. Sampel
kemudian ditutup dengan aluminium foil dan dimasukkan ke dalam kulkas (4C
selama 24 jam). Setelah 24 jam, sampel dikeluarkan dari kulkas dan ditambahkan
dengan Tris-HCl pH 6,8. Menurut Rawat, et al (2016), Tris HCl berfungsi untuk
menjaga pH protein. Setelah ditambahkan Tris-HCl, sampel dikocok sampai
tercampur dan disimpan dalam freezer. Sampai pada tahapan ini, yang didapat
adalah berupa supernatan dalam tabung.
Tahapan selanjutnya setelah didapatkan crude protein adalah analisis
kualitatif dan kuantitatif dari crude protein tersebut. Analisis kuantitatif dilakukan
dengan menggunakan nanodrop spektrofotometer. Nanodrop spektrofotometer
merupakan alat untuk mengukur kuantitas hasil isolasi DNA, RNA, dan protein
serta kontaminasi sampel. Spektrofotometer terdiri dari spektrometer di bagian
atas dan fotometer di bagian bawah. Prinsip kerjanya adalah spektrometer akan
menembak sinar yang selanjutnya akan diserap oleh bahan dan diukur oleh
fotometer. Sinar yang diserap oleh protein adalah sinar dengan panjang
gelombang 280 nm. Dari hasil pengukuran menggunakan nanodrop
spektrofotometer, diketahui bahwa konsentrasi protein pada organ insang ikan
mas (Cyprinus carpio) adalah sebesar 16,891 mg/ml, 22,690 mg/ml, 13,285
mg/ml, dan 13,456 mg/ml. Konsentrasi protein dalam organ insang ini tergolong
lebih tinggi dibandingkan dengan organ-organ ikan mas yang lain seperti otot,
ginjal, lambung dan usus.

Pengujian crude protein secara kualitatif dilakukan dengan menggunakan


elektroforesis SDS-PAGE (Sodium Dodesil Sulfat Polyacrylamide Gel
Electrophoresis). Elektroforesis adalah teknik pemisahan molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik, atau bisa
diartikan sebagai suatu metode untuk memisahkan molekul (Protein atau DNA
berdasarkan berat molekulnya menggunakan medium listrik. Protein nantinya
bergerak dari muatan negatif ke positif. Elektroforesis SDS-PAGE hanya melihat
pita protein untuk selanjutnya diketahui berat molekulnya (Mayangsari, 2012).
Dalam elektroforesis SDS-PAGE, digunakan dua macam gel yaitu separating gel
12,5% yang berfungsi menahan protein supaya tetap berada di sumuran sebelum
dilakukan elektroforesis dan stacking gel 3% yang berfungsi memisahkan protein
berdasarkan berat molekul. Bahan-bahan separating gel 12,5% diantaranya
Akrilamide-Bis 30%, Tris-Cl 1,5 M pH 8,8, dH 2O, SDS (Sodium Dodesil Sulfat)
10%, APS (Ammonium Persulfate) 10% dan TEMED (Tetramethylethyl diamine).
Bahan untuk stacking gel 3% sama dengan bahan untuk separating gel 12,5%,
hanya saja Tris-Cl yang digunakan adalah 0,5M dengan pH 8,8.
Bahan-bahan untuk membuat stacking gel maupun separating gel sebagian
besar memiliki fungsi yang sama. Akrilamide-Bis 30% berfungsi sebagai bahan
utama pembuat gel dan bahan ini tersusun dari Akrilamide dan bis-Akrilamide.
Tris-Cl berfungsi sebagai buffer. dH20 berfungsi sebagai campuran bahan gel.
SDS 10% berfungsi menguraikan ikatan disulfida dalam protein. APS dan
TEMED berfungsi membentuk radikal bebas yang membantu polimerisasi
akrilamid Bis 30% (membentuk ikatan polimer). Hal yang perlu diperhatikan
adalah APS 10% dan TEMED harus dimasukkan secara bersamaan lalu diaduk.

Tahapan selanjutnya adalah running elektroforesis, dan alat yang


digunakan adalah chamber elektroforesis. Larutan Running Buffer yang terdiri
dari glisin (sebagai penghantar listrik), Tris Base (sebagai buffer),SDS, dan
aquades diatur dalam pH 8,8 (dikondisikan sesuai kisaran pH protein yaitu 6,5-
8,5) dan dituangkan ke dalam chamber elektroforesis. Selanjutnya RSB
(Reducing Sample Buffer) dicampurkan dengan sampel (perbandingan 1:1) di
dalam tabung eppendorf untuk kemudian dididihkan selama 5 menit pada suhu
100C agar bisa ereaksi dengan sempurna. Isolat yang telah tercampur dengan
RSB dimasukkan ke dalam sumuran gel. Reducing Sample Buffer (RSB)
berfungsi untuk disosiasi protein dan tersusun dari 0,3 M Tris HCl pH 6,8
(sebagai buffer), Gliserol 25% (menambah berat molekul protein supaya tidak
mengambang di gel, SDS 10% (menguraikan ikatan disulfida dan menyamakan
muatan protein menjadi muatan negatif, -mercaptoetanol (bekerja sinergis
dengan SDS 10% untuk merusak ikatan disulfida, dan Bromophenol Blue
(sebagai Tracking Dye dan pewarna yang berikatan dengan protein dan menjadi
pewarna pita protein. Selanjutnya marker protein dimasukkan dalam salah satu
sumuran. Set alat elektroforesis kemudian di set dengan voltase 130V, kuat arus
60mA, dan waktu 90 menit dan dilakukan elektroforesis hingga tracking dye 0,5
cm diatas dasar.

Setelah elektroforesis selesai, gel hasil elektroforesis diletakkan di wadah


plastik dan diberi larutan staining hingga terendam untuk selanjutnya di shaker
dengan shaking rotary selama 30 menit lalu larutan staining dibuang. Bahan untuk
staining adalah Methanol absolut (untuk mengendapkan protein), CBB (Coomasie
Brilliant Blue) sebagai bahan pewarna utama gel dan CBB akan berikatan dengan
pita protein yang ada, serta asam asetat glasial (membantu kerja CBB). Tahap
selanjutnya adalah destaining I selama 15 menit dan destaining II selama
overnight. Bahan larutan destaining sama dengan larutan staining hanya saja tidak
mengandung CBB.

Tahapan selanjutnya adalah penghitungan berat molekul protein. Pada


organ insang, tidak dapat dilakukan penghitungan berat molekul protein karena
pita protein tidak dapat teramati dengan jelas pada gel. Hal ini disebabkan proses
elektroforesis yang terlalu lama. Karena tidak bisa dilakukan perhitungan berat
molekul protein untuk insang, makan dilakukan perhitungan berat molekul protein
untuk organ lain yaitu usus. Elektroforesis dengan kondisi protein yang sudah
terdisosiasi dapat dipakai untuk memperkirakan berat molekul suatu protein. Berat
molekul tersebut dapat ditentukan dengan mengukur mobilitas molekul protein
dalam gel poliakrilamid (yang mengandung SDS) berdasarkan kurva standar berat
molekul dari protein standart. Protein standar yang diketahui berat molekulnya
dapat dielektroforesis dan mobilitasnya pada gel poliakrilamid dapat diukur.
Mobilitas rate (Mr atau Rf) diukur dengan memakai rumus berikut (Fatchiyah,
dkk, 2012).

Perhitungan berat molekul protein dilakukan dengan bantuan program


Microsoft Excel dan SPSS 16.0. Dari hasil perhitungan berat molekul protein,
diketahui bahwa berat molekul protein dari sampel usus ikan mas (Cyprinus
carpio), adalah sebesar 138,32 kDa, 116,36 kDa, 97,88 kDa, 92,40 kDa, 77,73
kDa, 61,73 kDa, 58,27 kDa, 51,92 kDa, 43,69 kDa, 34,69 kDa, 32,75 kDa, 26
kDa,18,40 kDa, 14,62 kDa, 13,02 kDa, dan 8,7 kDa dari total 16 pita protein yang
terbentuk. Berbagai jenis protein pada suatu sampel akan terpisah-pisah pada gel
poliakrilamid yang tergantung pada mobilitasnya, dengan demikian pada jalur
pergerakan protein akan didapatkan jajaran protein yang disebut sebagai pita
protein yang akan memisah berdasar ukuran BM protein (Gunanti, 2010).Pada
penelitian Gunanti (2010) menjelaskan bahwa tebal dan tipisnya pita protein pada
hasil SDS-PAGE disebabkan karena terdapat perbedaan secara genetik antara
protein tersebut. Tebal dan tipisnya pita-pita protein pada gel yang berisi sampel
serum juga dapat dikarenakan perbedaan konsentrasi protein dalam sampel.

Kesulitan atau kendala yang dihadapi selama praktikum diantaranya


adalah kesulitan memperkirakan batas gel dan membuat sumuran yang baik (yang
tidak terlalu dangkal), serta terlalu lama ketika elektroforesis sehingga pita proein
tidak bisa teramati di gel yang mengakibatkan berat molekul protein tidak bisa
dianalisis. Solusi yang bisa dilakukan diantaranya berhati-hati dan teliti dalam
memperkirakan batas gel dan membuat sumuran sehingga sumuran yang
dihasilkan tidak terlalu dangkal serta lebih memperhatikan waktu untuk tahapan
elektroforesis dengan benar, agar nantinya tidak terlalu lama sehingga
mengakibatkan pita proein tidak bisa teramati di gel dan mengakibatkan berat
molekul protein tidak bisa dianalisis
BAB VI

SIMPULAN

1. Pada isolasi protein dikenal adanya dua prinsip yaitu homogenisasi dan
fraksinasi. Homogenisasi merupakan pengeluaran protein dari organ serta
pencampuran reagen dengan organ target. Fraksinasi dilakukan melalui
sentrifugasi, yaitu pemisahan protein dari membran dan organel lain
berdasarkan berat molekulnya.
2. Elektroforesis adalah teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan
perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik, atau bisa
diartikan sebagai suatu metode untuk memisahkan molekul (Protein atau
DNA berdasarkan berat molekulnya menggunakan medium listrik. Protein
nantinya bergerak dari muatan negatif ke positif. Elektroforesis SDS-
PAGE hanya melihat pita protein untuk selanjutnya diketahui berat
molekulnya.
3. Berat molekul protein dari sampel usus ikan mas (Cyprinus carpio),
adalah sebesar 138,32 kDa, 116,36 kDa, 97,88 kDa, 92,40 kDa, 77,73
kDa, 61,73 kDa, 58,27 kDa, 51,92 kDa, 43,69 kDa, 34,69 kDa, 32,75 kDa,
26 kDa,18,40 kDa, 14,62 kDa, 13,02 kDa, dan 8,7 kDa dari total 16 pita
protein yang terbentuk.

Daftar Rujukan

Fatchiyah, Sri, W., Estri, L.A. & Sofi, P. 2012. Buku Analisis Teknik Analisis
Biologi Molekuler. Malang: Jurusan Biologi Universitas Brawijaya.

Gunanti, M., Ulia, F., Sri, D. 2010. Karakterisasi protein Larnea cyprinacea
dengan metode elektroforesis SDS PAGE. Jurnal Ilmiah Perikanan dan
Kelautan, 2(1), 61-66.

Martin, N.C., Pirie, A.A., Ford, L.V., Callaghan, C.L., McTurk, K., Lucy, D &
Scrimger, D.G. 2006. The use of phosphate buffered saline for the recovery
of cells and spermatozoa from swabs. Science & Justice, (Online),
46(3);179:184, (www.scienceandjusticejournal.com), diakses 10 Desember
2016.

Mayangsari, Yunika. 2012. Electrophoresis. Yogyakarta: Universitas Gajah Mada.

Michael Lichtenauer., MD, Stefanie Nickl., MD, Konrad Hoetzenecker., MD,


Andreas Mangold., MD, Bernhard Moser., MD, Matthias Zimmermann.,
MD, Stefan Hacker., MD, Tina Niederpold., MD, Andreas Mitterbauer., MD
& Hendrik Jan. Phosphate Buffered Saline Containing Calcium and
Magnesium Elicits Increased Secretion of Interleukin-1 Receptor
Antagonist. Journal Of Lab Medicine, (Online), 40(5): 290-293,
(http://labmed.oxfordjournals.org/), diakses 10 Desember 2016.

Mohan, Chandra. 20303. Buffers : A Guide For The Preparation And Use
Ofbuffers In Biological Systems. Germany: Calbiochem.

Rawat, S., Geeta, J., Annapurna, D., Arunkumar, A.N. & Karaba, N. 2016.
Standardization of DNA Extraction Method from Mature Dried Leaves and
ISSR-PCR Conditions for Melia dubia Cav. A Fast Growing
Multipurpose Tree Species. American Journal of Plant Sciences, (Online),
7: 437-445, (http://file.scirp.org), diakses 10 Desember 2016.

Yulianti, Evy. 2006. Pengembangan Teknik Isolasi DNA Tumbuhan Menggunakan


Detergen Komersial. Dipresentaskan dalam SEMINAR NASIONAL MIPA
2006 dengan tema Penelitian, Pendidikan, dan Penerapan MIPA serta
Peranannya dalam Peningkatan Keprofesionalan Pendidik dan Tenaga
Kependidikan yang diselenggarakan oleh FakultasMatematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam UNY, Yogyakartapada tanggal 1 Agustus 2006.

Lampiran
Hasil Analisis Nanodrop

Gel Hasil Elektroforesis