Anda di halaman 1dari 15

i

TUGAS MAKALAH

ANALISIS INSTRUMENT

MICROPLATE READER ATAU ELISA PLATE READER

DISUSUN OLEH:

PUTRI INDAH RINI

NIM:1500070

DOSEN PEMBIMBING:

HAIYUL FADHLI M.Farm.Apt

PROGRAM STUDI DIII-FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU

2017
ii
KATA PENGANTAR

Dengan memanjatkan puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena atas rahmat dan
karunia-Nyalah, maka Makalah ini dapat diselesaikan sesuai kemampuan dan tanpa mengalami
suatu hambatan yang berarti.

Adapun tujuan dari pembuatan Makalah ini adalah untuk memenuhi tugas dari mata kuliah
Analisis instrumen. Makalah ini dapat terselesaikan dengan bantuan beberapa literature yg
didapatkan oleh penyusun sehingga penulisan Makalah ini dapat terselesaikan.

Penyusun menyadari bahwa Makalah ini jauh dari sempurna. Oleh sebab itu, kritik dan saran
yang sifatnya membangun, penyusun sangat harapkan demi sempurnanya penulisan Makalah ke
depannya

Pekanbaru,03 april 2017


iii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL.................................................................................................i
KATA PENGANTAR.............................................................................................ii
DAFTAR ISI...........................................................................................................iii
BAB I PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang....................................................................................1
1.2Rumusan Masalah...............................................................................2
1.3Tujuan.............................................................................2
BAB II ISI
2.1 Definisi microplate reader.......3
2.1.1 prinsip microplate reader....4
2.1.2 kelebihan microplate reader...4
2.1.3 kekurangan microplate reader.5
2.1.4 macam-macam teknik elisa plate reader.5-8
2.1.5 langkah kerja teknik elisa plate reader.9
BAB III PENUTUP
A. Kesimpulan.......................................................................................10
DAFTAR PUSTAKA11
1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva
Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi (ELISA konvensional)
untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi
tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor/ reporter/
signal.

Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simpel dapat dijabarkan sebagai berikut:Enzyme-
Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan
dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.
ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga
berbagai bidang industri.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen
tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan
solid(biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui
penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik
untuk antigen yang sama, disebut sandwich ELISA).

Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks


dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi
secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di
antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan
protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate
ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan
kuantitas antigen dalam sampel.
2

Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode metode
terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitive. Dalam perkembangan
selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi
atau antigen dengan menggunakan antibodi atau antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat
diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur kadar antibodi atau antigen yang diuji
dengan menggunakan alat bantu berupa spektrofotometer atau dengan cara menentukan jumlah
penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu kurva standar dan
kadar antigen atau antibodi yang tidak diketahui dapat ditentukan.

ELISA tradisional secara khusus memiliki reporter dan substrat yang menghasilkan beberapa
bentuk perubahan warna yang dapat diamati untuk mengetahui kehadiran antigen atau analyte.
Bentuk teknik ELISA terbaru seperti teknik flurogenic,electro chemiluminescent , dan real-time
PCR dibuat untuk mengetahui sinyal kuantitatif. Metode ini dapat memberikan berbagai
keuntungan diantaranya sensitifitas yang tinggi dan bersifat multiplexing.

1.2 RUMUSAN MASALAH

1.apa itu elisa microplate reader?


2.apa prinsip dari elisa microplate reader?
3.apa saja kelebihan dan kekurang dalam elisa microplate reader?
4.bagaimana teknik dalam pengerjaan elisa microplate reader?
5.apa saja metode-metode dalam elisa plate reader?

1.3 TUJUAN
Untuk mengetahui dan memahami metode dari penggunaan elisa microplate reader serta
memahami teknik-teknik pengerjaannya

BAB 2
PEMBAHASAN

2.1 DEFINISI MICROPLATE READER


ELISA adalah salah satu metode yang sensitif untuk mendeteksi antibodi, antigen, hormon
maupun bahan toksik. Metode ini merupakan pengembangan dari sistem deteksi dengan
imunofluorescence atau radioaktif. Dalam teknik ini beberapa enzim dapat dikonjugasi pada
antigen dan antibodi. Dalam praktiknya, enzim yang dipilih menunjukkan kinetika sederhana,
dan dapat diuji dengan prosedur sederhana. Pertimbangan lain dalam penggunaan teknik ini
adalah murah, ketersediaan dan kestabilan substrat.

Microplate reader merupakan alat untuk melakukan analisis senyawa aktif atau mikrobacepat
berdasarkan kekeruhan (OD). Fungsi microplate raider sama dengan spektrofotometerakan
tetapi, pada mikroplate raider ukurannya lebih kecil dibandingkan spektrofotometer.

Cara kerja alat :

a.Hubungkan dengan arus listrik.

b.Tekan tombol ON.

c.Hubungkan dengan printer

d.Warm up selama 15 menit.

e.Letakkan mikro plate yang berisi sampel pada tempat yang telah ada
f.Pembacaan sampel mikro plate.

g.Tunggu hasilnya secara langsung akan di print (dicetak)

2.1.1 PRINSIP

ELISA adalah suatu teknik deteksi dengan metode serologis yang berdasarkan atas reaksi
spesifik antara antigen dan antibodi, mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan
menggunakan enzim sebagai indikator.

Prinsip dasar ELISA adalah analisis interaksi antara antigen dan antibodi yang teradsorpsi
secara pasif pada permukaan fase padat dengan menggunakan konjugat antibody atau antigen
yang dilabel enzim. Enzim ini akan bereaksi dengan substrat dan menghasilkan warna. Warna
yang timbul dapat ditentukan secara kualitatif dengan pandangan mata atau kuantitatif dengan
pembacaan nilai absorbansi (OD) pada ELISA plate reader .

2.1.2KELEBIHAN ELISA MICROPLATE READER


Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :
1. Teknik pengerjaan relatif sederhana
2. Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
3. Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
4. Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut
sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat
sangat spesifik)
5. Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

2.1.3 KEKURANGAN ELISA MICROPLATE READER


Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :
1. Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis
antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen)
2. Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga
pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.
3. Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol
negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan
blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan
antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.
4. Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan
harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan
memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).

2.1.4 MACAM-MACAM TEKNIK ELISA

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA kompetitif
yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan teknik ELISA
nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA
nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi
sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA
sandwich.

A. Indirect ELISA
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan konsentrasi
antibodi dalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada
permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik
6
dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan
kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang
akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA)
atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai
blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum
dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan
untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-
spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan
dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang,
bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan
dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik.
Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal
kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan Elisa Reader / spektrofotometer, spektrofluorometer atau
alat optik/ elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang
tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari
metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap
protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit
yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada
permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

7
B. Sandwich ELISA
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan
antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodienzim yang tidak terikat dapat dibuang
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/
elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang
tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan
pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat
diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang
terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

8
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas
dari hasil pengujian, antara lain:
Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang
microtiter
Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen
Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA
terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada
tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat
berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun
demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat
diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis
antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya
harus berbeda).

9
2.1.5 LANGKAH KERJA TEKNIK ELISA MICROPLATE READER
Secara singkat tahapan kerja dalam metode elisa dapat digambarkan sebagai berikut :

10
BAB III
KESIMPULAN

1. Metode ELISA dibedakan menjadi direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA,
capture ELISA, dan sel ELISA.
2. ELISA diaplikasikan untuk deteksi virus, deteksi infeksi bakteri, deteksi infeksi parasit,
diagnostik hormon, dan aplikasi klinik.
3. Beberapa macam model ELISA dikembangkan melalui produk PCR dan selanjutnya
direaksikan dengan probe (antibody anti DNA/RNA) dan akhirnya divisualisasikan
dengan penambahan substrat.

11
DAFTAR PUSTAKA

Modul Training Elisa Microplate Reader


Lab.Biologi FMIPA UNNES
Semarang, 11 Nopember 2012

Burgess, G.W. 1995. Prinsip dasar ELISA dan variasi konfigurasinya, Teknologi ELISA dalam
diagnosis dan penelitian. G.W. Burgess (Ed.) Wayan T. Ariana (terjemahan). Gadjah Mada
University Press, Yogyakarta. hlm. 506

Brooks, G.F., dkk., 2005, Mikrobiologi Kedokteran, Salemba Medika; Jakarta

Rantam, F.A., 2003, Metode Imunologi, Airlangga University Press; Surabaya

Sofro, A.S.M, 1994, Imuno Kimia, Penerbit Andi Offset; Yogyakarta