Anda di halaman 1dari 5

Laporan

ISOLASI DNA KROMOSOM BAKTERI

OLEH

NAMA : AENI HALAWIYA

NIM : P07134114050

D-IV/B

KELOMPOK B1

ANALIS KESEHATAN

POLITEKNIK KESEHATAN MATARAM


KEMENTRIAN KESEHATAN RI

I. Tujuan

Tujuan praktikum kali ini adalah untuk mengetahui prinsip dan proses dari isolasi kromosom dan
melakukan isolasi DNA kromosom bakteri E. coli.
II. Prinsip Kerja

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain.

III. Landasan Teori

Isolasi plasmid dari bakteri E.coli biasanya disebut dengan istilah Miniprep, kependekan dari Mini-
Preparation. Sesuai dengan istilahnya, pekerjaan ini tidak banyak memakan waktu dan tidak pula berat untuk
dilakukan. Bakteri E. Coli yang digunakan dalam transformasi gen atau lebih dikenal dengan istilah kloning
gen, pada awalnya hanya mempunyai satu macam untaian DNA atau kromosom (kromosom genomik atau
kromosom utama). Setelah ditransformasi dengan DNA plasmid rekombinan , maka bakteri tersebut
mempunyai dua macam DNA yaitu kromosm genomik dan ekstra kromosom (DNA plasmid) yang mempunyai
karakter yang berbeda. Untuk dapat mengisolasi kedua macam DNA tersebut digunakan metode yang berbeda.
Dalam praktikum akan diisolasi DNA plasmid dengan mengunakan metode mini prep yaitu metode isolasi
plasmid pada skala kecil. DNA rekombinan dibuat dengan cara sebagai berikut : Sepotong DNA dari organisme
yang diminati, disambungkan ke dalam atau ke suatu plasmida ataupun pemakan bakteri lamda (disebut wahana
atau vektor) dan molekul kimerik yang dihasilkan, masing-masing berturut-turut digunakan untuk
mentransformasikan atau menginjeksi sel bakteri inang. Bakteri inang biasanya merupakan suatu galur khas
E.coli yang tidak mampu memperbanyak diri tanpa kondisi biakan yang khusus.
Agar sepotong DNA dapat diklonkan untuk penelitian, lebih dahulu DNA itu harus diikat pada suatu
wahana kloning atau vektor. Salah satu tipe wahana kloning yang digunakan untuk percobaan ini adalah
plasmid. DNA disambungkan pada DNA plasmid dan molekul kimeriknya digunakan untuk mengubah bentuk
bakteri inang seperti E. Coli. Kemudian plasmid mengadakan replikasi dalam inang, sewaktu inang tumbuh dan
membelah, dan potongan DNA yang diinginkan terklonkan.
Plasmida adalah unsur genetik di luar kromosom (ekstrakromosoma) yang mengadakan replikasi secara
autonom di dalam sel bakteri. DNA-nya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda. Dan plasmida itu mendukung
gen yang diperlukan baik untuk replikasi plasmida maupun untuk fungsi lain. Umumnya wahana plasmida
mempunya densitas apungan berlainan daripada DNA inang dan dengan mudah dapat dimurnikan. Beberapa
plasmida memiliki beberapa kemampuan untuk berintegrasi ke dalam kromosom inang, dan plasmida ini
disebut episom (Widyastuti, 2006).
Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui
teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah
dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil
yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti,
2006).
Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning,
antara lain adalah :
a. plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan
dimanipulasi;
b. DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia;
c. mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di
dalam sel inang secara otonomi;
d. jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak
dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;
e. mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih
memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu. (Brock, et al., 1994).
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel
prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi
pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk
resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk
membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan
mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim Isolasi DNA
merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada
bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).

IV. Alat dan Bahan


A. Alat
Mikro pipet
Mesin vortex
Mesin sentrifugasi
Tabung ependorf
Incubator
B. Bahan
0,5 M EDTA pH 8,0
25 % Larutan Sukrosa
SDS 20 %
NaCl 5 M
Proteinase-K 5 mg/mL
Buffer Tris-EDTA (TE) pH 7,6 : 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) ditambah dengan 1mM
Na2EDTA.2H2O pH 8,0
V. Cara Kerja
Sentrifugasi kultur bakteri sebanyak 1,0 mL dengan kecepatan 4000 rpm pada suhu 4 C selama 20

menit
Suspensikan kembali pellet yang didapatkan dengan 60 L EDTA 50 mM, kemudian disentrifugasi lagi
dengan kecepatan 4000 rpm pada suhu 4 C selama 15 menit
Tambahkan pellet yang diperoleh dengan 40 L larutan sukrosa25% dan 10,5 L EDTA 0,5 M pH 8.
Kemudian,tambahkan dengan 1,5 L Lisozim 10 mg/mL dan inkubasi pada suhu 37C selama 1 jam.
Tambahkan 18 L NaCl 5 M; 10,5 L EDTA 0,5 M; 22,5 L SDS 20% dan 1,5 L proteinase-K 5
mg/mL,kemudian di vortex.
Inkubasi sediaan pada suhu 50C selama 1 jam, kemudian ditambahkan kloroform 1 : 1 dan kocok
secara perlaha-lahan selama 20 menit.
Sentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm pada suhu 4C selama 30 menit.
Pindahkan supernatant (larutan yang terlihat bening yang berisi 2X volume etanol dingin)
Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit, selanjutnya tambahkan pellet dengan 30 L
buffer TE pH 7,6.
Larutan DNA siap digunakan untuk analisis PCR
VI. HASIL

Dari praktikum isolasi DNA didapatkan hasil bahwa terdapat endapan putih (pellet) yang didaratkan
setelah kultur bakteri disentrifugasi.
VII. PEMBAHASAN
Isolasi DNA kromosomal E.coli, isolasi dilakukan untuk mendaptkan DNA murni dari suatu
sel. Isolasi DNA memiliki prinsip yaitu memisahkan DNA kromosom dari komponen-komponen
lainnya, serta prinsip prespitari yaitu pengendapan DNA agar terpisah dari zat lain yang terdapat
dalam sel.
Isolasi DNA menggunakan teknik sentrifugasi. Hasil dari sentrifugasi akan menunjukkan dua
macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pellet dibagian bawah.
Bakteri yang diambil plasmidnya adalah E.coli. langkah pertama adalah mengambil 1 mL
bakteri dalam kultur cair. Kemudian dengan mengendapkan bakteri dengan mensentrifugasinya
sehingga terbentuk pellet dan supernatan. Tahap kedua yaitu resuspension yang berfungsi untuk
menghancurkan RNA sehingga DNA dapt diisolasi secara utuh.kemudian divortex untuk
menghomogenkan larutan. Tahpa ketiga lysis yang berfungsi untuk melisiskan membran sel,
kemudian kock tabung dengan hati-hati yang berfungsi agar proses lisis berjalan dengan sempurna,
lalu diinkubasi. Tahap keempat neutralization yang bertujuan untuk memisahkan kontaminan yang
mungkin masih terdapat dalam supernatan. Tahap kelima yaitu DNA binding. Tahap keenam, wash
dengan menambahkan ethanol agar DNA dapat dipertifikasi. Tahap ketujuh, yaitu DNA elution
merupakan tahap terakhir untuk mendapatkan DNA murni dari bakteri E.coli.

VIII. KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa, pada dasar tabung terlihat endapan
putih (pellet) yang dihasilkan dari praktikum dengan isolasi DNA.

Tahap isolasi DNA secara umum ialah perusakan dinding sel, lisis sel, pembuangan remukan sel, dan
pemisahan DNA dari protein dan RNA. Isolasi DNA kromosom ditandai dengan adanya kabut putih.
Mataram, Juni 2015

Dosen pembimbing Praktikkan

(Fihiruddin, S.Si.M.Sc) ( Aeni Halawiyai)