Anda di halaman 1dari 76

LAPORAN HASIL

PENELITJAN RISET PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN


DAN TEKNOLOGJ KEDOKTERAN
TAHUN ANGGARAN 2012

PENGEMBANGAN PROTOTIPE KIT DIAGNOSTIK


LEPTOSPIROSIS DENGAN MENGGUNAKAN
METODE ELISA BERBASIS PADA
PROTEIN REKOMBINAN LIPL32

Tim Peneliti:

_ drh. Hevi Wihad_madyatami, M.Sc.


dr. Rizka Humardewayanti Asdie., SpPD-KPTI
Etty Widayanti, S.Si., M.Biotech.

Pembimbing:
Dr. drh. Aris Haryanto, M.Si

DILAKSANAKAN ATAS BIAYA:


BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
BERDASARKAN PERJANJIAN KERJASAMA ANTARA BADAN
PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN Rl DAN FAKULTAS
KEDOKTERAN UNIVERSlTAS GADJAH MADA NOM OR:
HK.06.01/1/1693/2012 TANGGAL: 1 MARET 2012
LAPORAN HASIL
PENELITIAN RISET PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN
DAN TEKNOLOGI KEDOKTERAN
TAHUN ANGGARAN 2012

PENGEMBANGAN PROTOTIPE KIT DIAGNOSTIK


LEPTOSPIROSIS DENGAN MENGGUNAKAN
METODE ELISA BERBASIS PADA
PROTEIN REKOMBINAN LIPL32

Tim Peneliti:

drh. Hevi Wihadmadyatami, M.Sc.


dr. Rizka Humardewayanti Asdie., SpPD-KPTI
Etty Widayanti, S.Si., M.Biotech.

Pembimbing:
Dr. drh. Aris Haryanto, M.Si

DILAKSANAKAN ATAS BIAYA:


BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
BERDASARKAN PERJANJIAN KERJASAMA ANTARA BADAN
PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN Rl DAN FAKUL TAS
KEDOKTERAN UNIVERSITAS GADJAH MADA NOMOR:
HK.06.01/1/1693/2012 TANGGAL: 1 MARET 2012


. .
--- - ....
-. --- ---- _.,

1
b. Lembar ldentitas dan Pengesahan

LEMBAR IDENTIT AS DAN PENGESAHAN


LAPORAN AKHIR PENELITIAN RISBINIPTEKDOK 2012

1. Judul Penelitian : PENGEMBANqAN PROTOTIPE KIT


DIAGNOSTIK lEPTOSPIR OSI S
DENGAN
MENGGUNAKAN METODE ELISA BERBASIS
PADA PROTEIN R EKOMBINAN LIPL32

2. Ketua Peneliti
a. Nama
.. drh. Hevi Wihadmadyatami, M.Sc.
b. Jenis Kelamin : Perempuan
c. Pangkat/Golongan : Penata Muda Tk. 1/ lllb
d. NIP : 198509032010122006
e. Handphone : 08 1329095771
f. NPWP : -
g. Jabatan Fungsional : -
h. Fakultas/Pusat Sb.Jdi : Fakultas Kedokteran Hewan
i. Alamat Kantor &TelpJFax/E-mail : Jalan Fauna No.2 Karangmalang Yogyakarta
j. Alamat Rumah &TelpJFax/E-mail : Jalan Yudistira 89 GrogoJ lndah Solo Baru
Sektor 7
3. Perguruan Tinggi : Universitas Gadjah Mada
4. Jangka Waktu (Bulan) : 6 (enam) bulan /180 hari
5. Biayatotalyang disetujui
a. Balitbangkes : Rp. 150.000.000,00
b. lnstansi lain: : Rp.-
6. Luaran Penelitian : 1. Laporan akhir
2. X-Banner ukuran 60 em x 160 em
3. Manuskrip publikasi

Yogyakarta, 26 Desember 2012

Penetiti

drh. Hevi Wihadmadyatami, M.Sc.


NIP. 198503092010122006

.
SUSUNAN TIM PENELITI
1. Peneliti utama

Nama Gelar
Hevi \Vihadmadyatami .
drh; M.Sc
.

Tempat lahir Tanggal lahir Kelamin


Sukoharjo 9 Maret 1985 Perempuan

Jabatan Golongan
CPNS fib
Bagi an!Divisi
Biokimia dan Biologi Molekuler

Institusi asal
Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjab Mada, Yogyakarta

Telepon Faksimile
(0274)560860, 560865 (0274)560861

Alamat Korespondeni Pos


JL Fauna No. 2, Karangmalang, Yogyakarta 55281

Alamat E-mail
bevi.srihartono@yahoo.com

Telepon Rumah Telepon Genggam (HP)


0271-623008 081329095771

Kualifikasi Akademik
Tahun Institusi Gelar
2006 Fakultas Kedokteran S.K.H.
Dewan, UGM

Tahun Institusi Gelar


2007 Fakultas Kedokteran drh.
Hewan, UGM

Tahun Institusi Gel ar


2009 Fakultas Kedokteran M.Sc.
Dewan, UGM

4
2. Peneliti 1
Nama Gelar
Rizka Humardewayanti Asdie dr., SpPD-KPTI
Tempat lahir Tanggat lahir Kelamin
Yogyakarta 21 Agustus 1971 Perempuan
Jabatan Golohgan
Staf Sub Bagian Penyakit Infeksi illd
Bagian!Divisi
Bagian llmu Penyakit Dalam FK UG:M/RSUP Dr. Sardjito
Institusi asal
Fakultas Kedokteran UGMIRSUP Dr. Sardjito, Yogyakarta

Telepon Faksimile
(0274) 561616 (0274) 583745
Alamat Korespondeni Pos
Bagian Ilmu Penyakit Dalam RSUP Dr. Sardjito,
JI. Kesehatan no. 1, Yogyakarta 55281
..

Alamat E-mail
rizkaasdie@yahoo.com
Telepon Rumah Telepon Genggam (HP)
08121561383

Kuali:fikasi Akademik
Tahun Institusi Gelar
1998 Fakultas Kedokteran, UGM S.Ked

Tahun Institusi Gelar


2000 Fakultas Kedokteran, UGM dr.
Tahun Institusi Gelar
2004 Fakultas Kedokteran, UGM Sj!_PD.

5
3.Peneliti 2

Nama Gelar
Etty Widayanti S.Si., M.Biotech.

I
Tempat lahir Tanggallahir Kelamin
Jakarta 1 Juni 1977 Perempuan
Jabatan Golongan
Staf Sub Bagian Biologi Molekuler .mb
Bagian!Divisi
Bagian BioJogi Fakultas Kedokteran Universitas YARSI
Institusi asal
Fakultas Kedokteran Universitas YARSI, Jakar.ta
Telepon Faksimile
(021) 4244574, 4206674-76 Ext. 3106 J02H4243171
Alamat Korespondeni Pos
Jl. Letjen Suprapto, Cempaka Putih, Jakarta Pusat, 10510

Alamat E-mail
etthvw04@vahoo. com
Telepon Rumah Telepon Genggam (HP)
021-78884485 08174903877

Kualifikasi Akademik
Tahun Institusi Gelar
2000 Fakultas Biologi S.Si.
Universitas Indonesia
Tahun Institusi Gelar
2008 PS Bioteknologi, UGM M.Biotech.

6
KATAPENGANTAR

Alhamdulillah, puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan

karunia yang diberikanNya sehingga dapat menyelesaikan laporan hasi1 penelitian yang

berjudul Pengembangan Prototipe Kit Diagnostik Leptospirosis dengan


:Menggunakan Metode ELISA Berbasis pada Protein Re kombinan lipl32.
. Laporan hasil penelitian ini disusun sebagai salah satu bentuk pertanggung

jawaban penelitian dari Hibah RISet Pembinaan ilmu Pengetahuan dan Teknologi

Kedokteran tahun 2012 yang didanai oleh Badan Penelitian dan Pengembangan

Kesehatan Kementerian Kesehatan. Laporan hasil penelitian ini didasarkan atas basil

penelitian yang telah di)akukan di Laboratorium Biokimia, Fakultas Kedokteran Hewan,

Universitas Gadjah Mada.

Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari semua pibak yang terkait, laporan basil
ini tidak mungkin terselesaikan dengan baik. Untuk itu penulis mengucapkan terima

kasih kepada:

1. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan Republik

Indonesia yang telah mendanai hingga dapat terselenggaranya penelitian ini

2. Dr. drh. Aris Haryanto, M.Si sebagai pembimbing penelitian

3. Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada yang telah memfasilitasi

penelitian ini hingga dapat terlaksana

4. Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada yang telah

memfasilitasi penelitian ini hingga dapat terlaksana

5. Ketua Bagian Biokimia beserta staf

6. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu atas segala bentuk bantuan

baik moral maupun material.

Semoga Allah SWT senantiasa melimpahkan karunia-Nya kepada semua pihak yang

telah membantu pelaksanaan penelitian dan penyelesaian laporan ini. Semoga Laporan

7
dapat bennanfaat bagi ilmu pengetahuan dan bagi siapapun yang membutuhkan informasi

tentang leptospirosis. Penyusun menyadari sepenuhnya bahwa laporan ini jauh dari

kesempurnaan sehingga diharapkan saran dan kritik yang membangun untuk perbaikan

dan penyempurnn laporan ini.

Yogyakarta, Desember 2012

Penyusun

8
RINGKASAN EKSEKUTIF

PENGEMBANGAN PROTOTIPE KIT DIAGNOSTIK


LEPTOSPIROSIS DENGAN MENGGUNAKAN
METODE ELISA BERBASIS PADA
PROTEIN REKOMBINAN LIPL32

Hevi Wihadmadyatami\ Rizka Humardewayanti A2., Etty Widayanti3


1Ba gin Anatomi, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada
2Ba ian llmu Penyakit Dalam, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
g
3Ba ian Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas YARSI
g

A. Latar Belakang

Leptospirosis atau yang dikenal juga dengan Weil's diseases merupakan penyakit

zoonosis yang disebabkan oleh infeksi bakteri dari genus Leptospira sp. Bakteri
Leptospira sp. memiliki antigen yang beragam, namun yang berkaitan langsung dengan

imunopatogenesis dan invasi ke dalam sel adalah antigen yang berasal dari protein
permukaan. Lip L32 adalah lipoprotein permukaan yang dominan dan ditemukan dalam

jumlah besar terutama pada Leptospira strain patogenik dan tidak ditemukan pacta non

patogenik leptospira (Haake et al, 2000; Guerraro et al., 2001)

Leptospirosis terdistribusi di seluruh belahan dunia. Manusia dapat terinfeksi

leptospira melalui kontak dengan air, tanah atau tanaman yang telah dikotori oleh air seni

hewan yang menderita leptospirosis. Bakteri masuk ke dalarn tubuh manusia melalui

selaput lendir (mukosa) mata, hidung, kulit yang lecet atau atau makanan yang

terkontaminasi oleh urine hewan terinfeksi leptospira. Leptosp irosi s masih menjadi
masalah kesehatan masyarakat, terutama di daerah beriklim tropis dan subtropi s, yang

memiliki curah hujan tinggi khususnya di negara berkembang, dimana kesehatan

lingkungannya kurang diperhatikan terutama untuk masalah pembuangan sampah dan


penanganan pasca banjir. Berdasarkan data resmi dari WHO (2010) diketahui bahwa

setiap tahun terjadi 500.000 kasus Leptospirosis di seluruh dunia dan apabila terjadi
outbreak diperkirakan insidensi leptospirosis mencapai lebih dari 1.00 kasus per 100.000

penduduk. Indonesia berdasarkan data dari kementerian kesehatan di tahun 20 10 terdapat


delapan propinsi yang melaporkan kasus Leptospirosis yaitu, DIG Jakarta, Jawa Barat,

Jawa Tengah, DI Yogyakarta, Jawa Timur, Bengkulu, Kepulauan Riau dan Sulawesi

9
Selatan, khusus untuk DI Yogyakarta dilaporkan bahwa di kabupaten Sleman sejak tahun

2007 sampai dengan tahun 2011 terjadi 201 kasus, dengan rincian 1 kasus tahun 2007,35
kasus tahun 2008 (2 meninggal), 85 kasus tahun 2009 (5 meninggal), 67 kasus tahun

2010 (3 meninggal) dan tahun 2011 sampai dengan bulan maret sudah ada 23 kasus dari
17 kecamatan, kecarnatan dengan kasus terbanyak adalah Moyudan (4 desa), disusul

kecamatan minggir (4 desa),seyegan (2 desa), godean I desa, prambanan 1 desa, kalasan

1 desa, Ngaglik 1 desa, tempel 1 desa, Gamping 1 desa, dan berbah 1 desa. Berdasarkan

data tersebut diatas tidaklah mengherankan apabila Leptospirosis Society menyatakan

Indonesia sebagai Negara dengan insiden leptospirosis yang tinggi.

Penanganan pada pasien dengan gejala leptospirosis menunjukkan adanya banyak

kendala, hal tersebut disebabkan karena gejala klinis infeksi Leptospira sangat sulit

dibedakan dengan penyakit yang lain seperti influensa, meningitis, hepatitis, dan demam

berdarah dengue sehingga seringkali tidak terdiagnosis.

Saat ini ada berbagai macam metode untuk mendiagnosis leptospirosis seperti

menggunakan mik:roskop medan gelap, Microscopic Aglutination Tests (MAT), dan

Polymerase Chain Reaction (PCR). Teknik yg digunakan tersebut masih memiliki

kelemahan yaitu pengujian dengan MAT sangat membutuhkan fasilitas untuk:

mempertahankan hidup dari leptospirosis, memakan waktu terutama apabila diterapkan

pada sarnpel dalam jumlah besar,ada kemungkinan tidak terdeteksi antibodi dikarenakan

titer yang rendah, dan MAT tidak dapat di standarisasi, sedangkan untuk Polymerase
Chain Reaction (PCR), teknik ini membutuhkan peralatan khusus, teknisi yang terampil,

ada kemungkinan positif palsu diseababkan sarnpel yang terkontaminasi dan nilai umum

PCR sebagai teknik diagnosis cepat belum dievalusi karena belum secara luas diterapkan

terutama di negara tropis dan sub tropis.

Berdasarkan hal tersebut di atas ketersediaan metode deteksi yang spesifik dan

sensitif sangat diperlukan terutama bagi leptospirosis yang sangat berpotensi mengancam

kesehatan publik, dan untuk pencegahan terjadinya outbreak atau kejadian luar biasa.

Dalarn hal ini penelitian tentang protein rekombinan LipL32 sebagai perangkat diagnosis

sangat penting dilakukan untuk meningkatkan akurasi, sensitifitas, mudah digunakan, dan

dapat digunakan untuk deteksi dini,

10
B. Tujuan

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengernbangkan alat deteksi dini yang
sederhana, tidak mahal, cepat dan sensitif dengan berbasis pada rekombinan protein Lip
132 sehingga dapat membantu dalam diagnosis leptospirosis. Tahapan selanjutnya

diharapkan dapat digunakan untuk menentukan prevalensi ieptospirosis demi


kepentingan rnanajemen pengendalian, pencegahan penyakit baik pada manusia maupun

bewan. Deteksi dini juga diharapkan mampu mengurangi kejadian leptospirosis di

masyarakat.

C. Hasil Utama
DNA dari isolat reference Leptospira interogans serovar icterohaernoraghie diisolasi

dengan menggunakan genomic DNA mini kit dan basil isolasi digunakan sebagai

template untuk proses PCR. Reaksi PCR satu siklus pada suhu 94oc selama 5 menit,

diikuti 35 siklus untuk denaturasi 94C selama 1 menit, annealing 53C selama 45 detik,
elongasi 72C selama 1 menit dan post elongasi 72C selama 5 menit.Hasil

elektroforesis dari PCR pada penelitian ini menunjukkan pita dengan panjang 819 bp,

dapat Agarose gel elek:troferesis 1%. Hasil PCR kemudian dipurifi.kasi dengan

menggunakan purifikasi gel (Biobasic Inc) untuk selanjutnya digunakan dalam proses

ligasi ke dalam pET SUMO. Proses selanjutnya adalah proses ligasi, yaitu

menyarnbungkan gen yang diinginkan ke dalam vektor dengan bantuan enzim ligase.

Vektor plasmid yang digunakan dalam penelitian ini adalah pET SUMO, dan dilanjutkan

dengan proses transformasi .menggunakan hospes E. coli, metode yang digunakan adalah

metode heat shock. Hasil transformasi pada penelitian ini menunjukkan adanya 3 koloni

pada plat LB padat. Semua koloni yang tumbuh kemudian direkultur ke LB cair untuk

selanjutnya diisolasi plasmidnya. Proses selanjutnya setelah transformasi adalah isolasi

11
plasmid dan pengujian gen insert dengan PCR untuk mengetahui apakah gen yang

diinginkan ter-insert ke dalam plasmid menggunakan primer forward dan backward dari

LipL32. Hasil amplifikasi PCR plasmid gen LipL32 pada gel agarose dengan konsentrasi

l%.diketahui plasmid menunjukkan basil positif dengan terbentuknya pita DNA dengan

panjang 819 bp dan dilanjutkan dengan sekuensin, kemudian gen penyandi LipL32

ditrausfonnasikan kembali pada BL21 (DE3) One Shot' Cells dan diekspresikan proteinnya.

ldentiftkasi protein rekombinan dilakukan dengan Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide

Gel Electrophoresis dengan konsentrasi 12%. dan imunobloting dan menunjukkan

adanya protein rekombinan LipL32 dengan berat molekul 32 kDa.

D. Kesimpulan

Berdasarkan penelitian dapat disimpulkan bahwa basil penelitian menunjukkan

panjang gen penyandi protein LipL32 telah berhasil diamplifikasi dengan panjang 819 bp dan

berat protein LipL32 yang diekspresikan sebesar 32 kDa, protein berhasil diidentifikasi dengan

menggunakan SDS-PAGE akan tetapi untuk basil imunoblotting dengan menggunakan antibodi

poliklonal Anti-LipL32 belum berhasil diidentifikasi secarajelas.

12
DAFTARISI

Halaman

Halaman Judul .. ... . .. . .. . . . .. . . . . .. . . . . ... . .. . . . . . . . .. .. . . . . .. . ... ... ... .. . .. . . .. ..


. 1

Lembar Identitas dan lembar Pengesahan .. . . . . . . . . . .. . .. . . . . . .. ... . . . . . . ... .. . . 2

Susunan Tim Peneliti... ... .. . .. . .. . . .. . .. .. .. ... .. .. .. . .. . .. . ... .. . ... ... .. . . . . .. ... 3

Kata Pengantar . . . . . . .. . ... . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . .. . .. . .. . . . . . . . .. . . .. . .. . . . .. . . . . . 6

Ringkasan Eksekutif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 8

Daftar lsi . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . .. . .. . .. . . . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . .. .. . . .. .. . ... .. . . .. ... .. 12

Daftar Gambar . . . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . . . . 13

BAB I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang . . . ...... ............ ......... . . ... .... ........... ......... . 17

B. Tujuan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . .. 18

BAB II. STUDI PUSTAKA

A Leptospirosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. . . .. .
.. . . . . . . . . .. .
. 20

B. Polymerase Chain reaction........................ ... ... .. . ............. . 20

C. Elektroforesis GelAgarose .. .... . .. . .. ... . .. . . .... .. .. . . ...... ... .. . .


. 21

D. Cloning Gen . .. . . . ... ............... ........... ...... ............. ...... . 21

E. Sekuensing ... ................... ........ ... ... ........ .... ... .... . . . . . . . .

23
F. Elektroforesis protein . . . . ........ ............ ...... ..... .......... .... . . 24
24
G. Imunobloting ............ ......... .......... . . ...... ...... ....... ........ .

BAB III. Materi dan Metode .. . ............. ........ . ........ ...... .............. . 26

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............ ... . ........... ........... . 36

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...... ...... ............ ......... . ..... . 51

DAFTAR PUSTAKA ..... . ... . ..... ...... ... ... ... . . ...... .... ......... . . . . . . .... . 52

13
DRAFT PUBLIKASI . . . . . . .. . ... . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . .. . . . .. . . .. . . . .. . . . . . . . . . . .. 53

LAlvfPffiAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . 69

14
DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Peta vektor plasmid pET SUMO . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 11

Gambar 2. Cloning Site dari produk PCR ke vector plasmid pET SUMO 11

Gambar 3. Hasil arnplifikasi PCR gen LipL32 pada gel agarose dengan 37
konsentrasi 1%. Keterangan: Marker 100 bp (M), basil negatif
amplifikasi gen dengan menggunakan DNA tctal Leptospira
interogans ser. Bataviae (lajur 1 dan 2, hasil positif
amplifikasi gen dengan menggunakan DNA total Leptospira
interogans ser. Icterohaemoraghie (lajur 3 dan lajur 4).

Gambar 4. Hasil
pertumbuhan bakteri transforman pada media LB padat. 40
Keterangan: Koloni bakteri transforman ditunjukkan dengan
penanda Ll, L2 dan L3.

Gambar 5. Hasil amplifikasi PCR plasmid gen LipL32 pada gel agarose 42
dengan konsentrasi 1%. Keterangan: Marker 100 bp (M),
Plasmid dari koloni Ll menunjukkan basil positif dengan
terbentuknya pita DNA (lajur 1), Plasmid dari koloni L2
menunjukkan basil positif dengan terbentuknya pita DNA
(lajur 2), Plasmid dari koloni L3 menunjukkan basil negatif
tidak terbentuk pita DNA (lajur 3).

Gambar 6. Identifikasi protein rekombinan LipL32 pada SDS-PAGE 46


dengan konsentrasi 12%. Keterangan: Marker (M), Protein
rekombinan dari koloni Ll dengan induksi IPTG menunjukkan
adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 1), Protein
rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan
adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 2), Protein
rekombinan dari koloni Ll 1anpa induksi IPTG (Lajur 3),
Protein rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi IPTG (Lajur
4).

Gambar 7. Transfer Blotter dari gel SDS-PAGE menuju membrane 48


nitroselulose. Keterangan: Marker (M), Protein rekombinan
dari koloni Ll dengan induksi IPTG menunjukkan adanya
protein rekombinan LipL32 (Lajur 1), Protein rekombinan dari
koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein
rekombinan LipL32 (Lajur 2}, Protein rekombinan dari koloni
L 1 tanpa induksi IPTG (Lajur 3) , Protein rekombinan dari
koloni L2 tanpa induksi IPTG (Lajur 4).

15
Gambar 8. Hasil imunobloting dengan menggunakan 49
WesternBreezeChemiluminescent Western Blot
Immunodetection Kit. Keterangan: Marker (M), Protein
rekombinan dari koloni L l dengan induksi IPTG menunjukkan
adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur I), Protein
rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan
adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 2), Protein
rekombinan dari koloni L l tanpa induksi IPTG (Lajur 3),
Protein rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi IPTG (Lajur
4 ).

Gambar 9. Hasil imunobloting pada membrane nitocelulose dengan 50


menggunakan antibodi monoklonal anti LipL32. Keterangan:
Marker (M), Protein rekombinan dari koloni Ll dengan
induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan
LipL32 (Lajur 1), Protein rekombinan dari koloni L2 dengan
induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan
LipL32 (Lajur 2), Protein rekombinan dari koloni L l tanpa
induksi IPTG (Lajur 3), Protein rekombinan dari koloni L2
tanpa induksi IPTG (Lajur 4), Protein rekombinan dari koloni
L 1 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein
rekombinan LipL32 (lajur 5)

16
INTISARI

PENGEMBANGAN PROTOTIPE KIT DIAGNOSTIK LEPTOSPIROSIS


DENGAN MENGGUNAKAN METODE ELISA BERBASIS PADA
PROTEIN REKOMBINAN LIPL32

Hevi Wihadmadyatami1, RieskaHumardewayanti A 2 , Etty Wiaayant i3


..

1
Bagian Anatomi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada
2
Bagian Penyakit Dalam, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada
Jsagian Anatomi, Fakultas Kedokteran, Universitas YARSJ

Leptospirosis atau yang dikenal juga dengan Wei/'s diseases merupakan penyak it
zoonosis yang disebabkan oleh infeksi bakteri dari genus Leptospira sp. Leptospirosis
terdistribusi di selurul1 belahan dunia dan masih menjadi masalali kesehatan masyarakat,
terutama di daerali beriklim tropis dan subtropis, yang memiliki curall hujan tinggi khususnya d i
negara berkembang, dimana kesehatan lingkungannya kurang diperhatikan terutama untuk
masalall pembuangan sampall dan penanganan pasca banjir. Berdasarkan data resmi dari WHO
(2010) diketallui bahwa setiap tallun terjadi 500.000 kasus Leptospirosis di seluruh dtmia
Leptospirosis Society menyatakan Indonesia sebagai Negara dengan insiden leptospirosis yang
tinggi. Penanganan pada pasien dengan gjala leptospirosis menunjukkan adanya banyak kendala,
.hal tersebut disebabkan karena gejala klinis infeksi Leptospira sangat sulit dibedakan dengan
penyakit yang lain seperti influensa, meningitis, hepatitis, dan demam berdarall dengue sehingga
seringkali tidak terdiagnosis. Saat ini ada berbagai macam metode untuk mendiagnosis
leptospirosis seperti menggunakan mikroskop medan gelap, Microscopic Aglutination Tests
(MAT), dan Polymerase Chain Reaction (PCR). Teknik yg digunakan tersebut masih memiliki
kelemallan. Berdasarkan hal tersebut di atas ketersediaan metode deteksi yang spesifik dan
sensitif sangat diperlukan terutama bagi leptospirosis yang sangat berpotensi mengancam
kesehatan publik, dan untuk pencegallan tetjadinya outbreak atau kejadian luar biasa. Dalam hal
ini penelitian tentang protein rekombinan LipL32 sebagai perangkat diagnosis sangat penting
dilakukan untuk meningkatkan akurasi, sensitifitas, mudall digunak an, dan dapat digunakan untuk
deteksi dini,
Rancangan penelitian dimulai dari isolasi DNA dengan menggunaka n isolate reference
Leptospira interogans serovar icterohaemorhagie, PCR dengan menggunakan primer spesifJ.k
LipL32, gen yang teramplifikasi kemudian di puri:fikasi dengan menggunakan EZ- Spin Coloumn
DNA Gel Extraction Kit, dan dilanjutkan dengan ligasi ke dalam vector pET SUMO dan
transformasi pada sel kompeten Mach-1, plasmid basil transformasi kemudian diisolasi dengan
GeneJet .Plasmid Miniprep Kit, dan disequencing, dilanjutkan dengan transformasi pada sel
competent BL-21, basil transformasi kemudian diinokulasikan pada media LB yang mengandung
kanamycin dengan diinduksi IPTG, kemud:ian protein diekstraksi dengan enzymatic digestion,
Protein rekombinan diperoleh dengan cara mengambil supernatan dan diidentifikasi dengan SDS
pAGE dan imunobloting
Hasil penelitian menunjukkan bahwa panjang gen penyandi protein LipL32 telah berhasil
diamplifikasi dengan panjang 819 bp dan berat protein LipL32 yang diekspresikan sebesar 32
kDa, protein berhasil diidentifikasi dengan menggunakan SDS-P AGE dan imunoblotting dengan
menggunakan antibodi monoklonal Anti-LipL32.

Kata kunci: Leptospirosis, Leptospira interogans ser. icterohaeomarghi, protein Lip-L32, cloning,
ekspresi

17
BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Leptospirosis atau yang dikenal juga dengan Weil's diseases merupak:an penyakit

zoonosis yang disebabkan oleh infeksi bakteri dari genus Leptospira sp. Bakteri

Leptospira sp. memiliki antigen yang beragam, namun yang berkaitan langsung dengan

imunopatogenesis dan invasi ke dalam sel adalah antigen yang bcrasal dari protein

permukaan. Lip L32 adalah lipoprotein permukaan yang dominan dan ditemukan dalam

jumlah besar terutama pada Leptospira strain patogenik dan tidak ditemukan pada non

patogenik leptospira (Haake et al, 2000; Guerraro et al., 2001)

Leptospirosis terdistribusi di seluruh belahan dunia. Manusia dapat terinfeksi

leptospira melalui kontak dengan air, tanah atau tanaman yang telah dikotori oleh air seni

hewan yang menderita leptospirosis. Bakteri masuk ke dalam tubuh manusia melalui

selaput lendir (mukosa) mata, hidung, kulit yang lecet atau atau makanan yang

terkontaminasi oleh urine hewan terinfeksi leptospira. Leptospirosis masih menjadi

masalah kesehatan masyarak:at, terutama di daerah beriklim tropis dan subtropis, yang

memiliki curah hujan tinggi khususnya di negara berkembang, dimana kesehatan

lingkungannya kurang diperhatikan terutama untuk masalah pembuangan sampah dan


penanganan pasca banjir. Berdasarkan data resmi dari WHO (2010) diketahui bahwa
setiap tahun terjadi 500.000 kasus Leptospirosis di seluruh dunia dan apabila terjadi

outbreak diperkirak:an insidensi leptospirosis mencapai lebih dari 100 kasus per 100.000

penduduk. Indonesia berdasarkan data dari kementerian kesehatan di tahun 201 0 terdapat

delapan propinsi yang melaporkan kasus Leptospirosis yaitu, DKI Jakarta, Jawa Barat,

Jawa Tengah, DI Yogyak:arta, Jawa Timur, Bengkulu, Kepulauan Riau dan Sulawesi

Selatan, khusus untuk DI Yogyakarta dilaporkan bahwa di kabupaten Sleman sejak tahun

2007 sampai dengan tahun 20 1 1 teijadi 2 0 1 kasus, dengan rincian 1 kasus tahun 2007, 35

kasus tahun 2008 (2 meninggal), 85 kasus tahun 2009 (5 meninggal), 67 kasus tahun

2010 (3 meninggal) dan tahun 20 1 1 sampai dengan bulan maret sudah ada 23 kasus dari

17 kecamatan, kecamatan dengan kasus terbanyak adalah Moyudan (4 desa), disusul

kecamatan minggir (4 des a), seyegan (2 desa), godean 1 desa, prambanan 1 desa, kalasan

1 desa, Ngaglik 1 desa, tempel 1 desa, Gamping 1 desa, dan berbah 1 desa. Berdasarkan

18
data tersebut diatas tidaklah mengherankan apabila Leptospirosis Society menyatakan

Indonesia sebagai Negara dengan insiden leptospirosis yang tinggi.

Penanganan pada pasien dengan gejala leptospirosis menunjukkan adanya banyak

kendala, hal tersebut disebabkan karena gejala ldinis infeksi Leptospira sangat sulit

<hbedakan dengan penyakit yang lain seperti influensa, meningitis, hepatitis, dan demam

berdarah dengue sehingga seringkali tidak terdiagnosis.

Saat ini ada berbagai macam metode untuk: mendiagnosis leptospirosis seperti

menggunakan mikroskop medan gelap, Microscopic Aglutination Tests (MAT), dan

Polymerase Chain Reaction (PCR). Teknik yg digunakan tersebut masih memiliki

k.elemahan yaitu pengujian dengan MAT sangat membutuhkan fasilitas untuk

mernpertahankan hidup dari leptospirosis, memakan waktu terutama apabila diterapkan

pada sarnpel dalarn jumlah besar, ada kemungkinan tidak terdeteksi antibodi dikarenakan

titer yang rendah, dan MAT tidak dapat di standarisasi, sedangkan untuk Polymerase
Chain Reaction (PCR), teknik ini membutuhkan peralatan khusus, teknisi yang terampil,

ada kemungkinan positif palsu diseababkan sampel yang terkontaminasi dan nilai umum

PCR sebagai teknik diagnosis cepat belum dievalusi karena belum secara luas diterapkan

rerutama di negara tropis dan sub tropis.

Berdasarkan hal tersebut di atas ketersediaan metode deteksi yang spesifik dan
sensitif sangat diperlukan terutama bagi leptospirosis yang sangat berpotensi mengancam

kesehatan publik, dan untuk pencegahan terjadinya outbreak atau kejadian luar biasa.

Dalam hal ini penelitian tentang protein rekombinan LipL32 sebagai perangkat diagnosis
sangat penting dilakukan untuk meningkatkan akurasi, sensitifitas, mudah digunakan, dan
dapat digunakan untuk deteksi dini,

:B. Tujuan

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan alat deteksi dini yang

sederhana, tidak mahal, cepat dan sensitif dengan berbasis pada rekombinan protein Lip

L32 sehingga dapat membantu dalam diagnosis leptospirosis. Tahapan selanjutnya

diharapkan dapat digunakan untuk menentukan prevalensi leptospirosis demi

kepentingan manajemen pengendalian, pencegahan penyakit baik pada manusia maupun

19
hewan. Deteksi dini juga diharapkan mampu mengurangi kejadian leptospirosis di
masyarakat.

20
BABll

STUDI PUSTAK A

A. Leptospirosis

Leptospirosis dicirikan dengan gejala klinis yang bervariasi mulai dari ringan
hingga flu like illness hingga kondisi akut. Leptospirosis dapat berefek patogenik
ataupun saprofitik. Infeksi endemic terutama teljadi pada daerah tropis dan
subtropics, baik. manusia ataupun hewan dapat terifeksi secara langsung melalui
kontak langsung dengan jaringan terinfeksi atau urin atau secara tidak langsung
dengan tanah dan air yang terkontaminasi. Leptospirosis pada manusia timbul dengan
menunjukkan 2 gejala klinis yang spesifik yaitu anicteric atau jinak dan icteric yang
lebih dikenal dengan weil disease. Kebanyakan kasus leptospirosis didiagnosis secara
serologis. Antibodi dapat terdeteksi di darah kira-kira pada 5-7 hari setelah
menunjukkan gejala klinis , microscopic agglutination test hingga saat ini masih
merupakan metode yang paling dipercaya hingga saat ini. Pengobatan leptospirosis
tergantung pada gejala klinis yang tampak, spesifik antibiotic treatment yang umwn

digunakan adalah doxycycline (100 mg dua kali sehari selarna 7 hari). Pernberian
antibiotik secara intravena seperti penicillin
G, amoxicillin, ampicillin atau
erythromycin dapat diberikan pada beberapa kasus yang serius

B. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) tetdiiji'H il g''i8J1giih}ut .ak>tgallGJ.ertania


:
adalah degasidari:dSpff,A::. pada 9s 6;.:. -
ehingga <iffejadi dua. uD.Uii>al! yang

terpisah Ptitri .dap) ;mn8!lmplifiF ;Jebali pada.:slibil- yang 1e11i--rend


eiti::,.;:yg ; bii.f-)RmMiit
dan ni,iUill!:Jr;ei'- t ; silh,,li P;in.sfttiJpai .!Pi. qap
suh ali.2' ;/yg;t 9Pt;i"Bervaiis' :,.:(1:: ' ia
' .:pf
fiiief:'da::6.ii$1J.tri yang
digunakan): Pit t iil!bang!a .. saaJ rnil1I!il:19,hu, optunal : :avnealin_ g adal3.Jl suhu
Ieleh (Tmfa.:J?nm,.r.;al!aii terakhir:a\r3,glplifikasi P--PNA _adaielongasi ..

Pro s. :i J;li."41:r 4nff,,epggoo-:1:f?Jii?\:J)oiitn;i.-' d#s\WW7


:-- 9;; , y(ltu.
.

.
..

subti': H]:!1f).ii
. !#. e f.j '9P#.m
. t
i '-

21
C. Elektroforesis Gel Agarose

Elektroforesis merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memisahkan dan atau

melakukan karakterisasi dari suatu partie} berdasarkan rnigrasi spesifik partikel tersebut

dalam lir;gkm1gan listrik Elektroforesis gel agarose merupakan metode tmtuk

memisahk:an dan memvisualisasikan fragmen DNA, dimana terjagi proses migrasi dari

fiagmen DNA di dalam gel yang direndam dalam larutan buffer TBE. Fragmen DNA

dipisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya, dengan melewatkan DNA melalui

matriks gel agarose yang diletakkan dalam medan listrik (Subagiyo, 2006). Fragmen

DNA yang lebih kecil berat molekulnya akan bergerak lebih cepat daripada molekul
DNA yang besar. Petjalanan molekul DNA di dalam gel mengikuti arus listrik dari kutub

negative menuju kutub positif Semakin besar tegangan arus listrik, perjalanan molekul
DNA akan semakin cepat, demikian pula sebaliknya (Sulandari dan Zein, 2003; Devlin,

2006).

D. Cloning Gen
:.t Plasmid pET SUMO

Vektor plasmid yang digunakan dalam penelitian ini adalah The ChampionpET

SUMO Protein Expression System, yang dapat digunakan untuk ekspresi, purifikasi, dan

generasi dari native protein pada E. coli. Vektor plasmid pET SUMO dirancang untuk

memfasilitasi kloning dari produk PCR untuk ekspresi pada E. coli. Komponen vektor

plasmid pET SUMO dan peta plasmidnya dapat dilihat pada Gambar 10 (Invitrogen,

2010).

Plasmid pET SUMO menyediakan tempat insersi produk PCR yang langsung ke

dalam plasmid. Enzim Taq polymerase menghasilkan tambahan single deoxyadenosine

(A) ke ujung 3' dari produk PCR. Vektor plasmid pET SUMO memiliki residu single

deoxythymidine (T) pada ujung 3' sehingga insert PCR dapat diligasi dengan efisien ke

dalam plasmid (Invitrogen. 2010).

22
pET SUMO
5643 bp

Cann,...,. brpf.'f $\JMO


S$n"dooS-
'rt prcrn<lliF: b.llXts-aJ'J..22!>
I<ICi<JP""'O<T ..:
); -2262
Ri>- tirdng!SIIIIlfSt.bZGSZS:I-:!611
IIJII ATG ,b.l - 2!1121111
lliiG li'C9'1 b.>oos i9
SUMOORJ': bZaS lSOl!
S,,U,f() ioMord ;nn ngs4o: b3:;u 5l9 ..S/1
TJI CIO: b- >1 1 (iS
n-- .,m,ingst.. b.lr CC)
T1llO<mn::o:xr;b.>too7m
.I(.Jrumjdnti<ICI'Qa".:l;!oJ:seslQI-22AG'(C)
p9Rl22n:- 21o
.!te\P-c.R!'ob.>...,..574
locJ OR!': - 43SS. SQ4 tCl
(C)';COtt.r/ S'nind

Gambar 1. Peta vektor plasmid pET SUMO (Invitrogen, 2010).

3'

Gambar 2. Cloning site dari produk PCR ke vek:tor plasmid pET SUMO
(Invitrogen! 201 0).

3. Escherichia coli BL21 sebagai inang dalam cloning

Escherichia coli strain BL21 sering digunakan dalam penelitian sebagai inang
untuk overproduksi protein dari gen klon. Ada dua strategi yang sering digunakan yaitu
gen target yang dioverekspresi (langsung atau tidak langsung) dengan induksi suhu oleh
promotor phage I atau induksi dengan IPTG promotor lac dan variannya (Bhandari
andGowrishankar, 1997). Plasmid rekombinan ditransfer ke strain E. coli yang
mengandung kopi kromosom gen untuk T7 RNA polimerase {T7 gen 1) untuk
memproduksi protein. Inang yang biasanya digunakan adalah bacteriophage DE3

23
lysogens, derivate lambda yang memiliki daerah imunitas phage 21 dan membawa

fragmen DNA yang mengandung gen lac I, promotor lacUV5, dan gen yang

mengkodeT7 RNA polimerase. Fragmen ini disisipkan ke dalam gen inti untuk

mencegah DE3 dari integrasi ke dalam atau keluar dari kromosom tanpa helper phage.
Sekali DE3 lysogen dibentuk, hanya promotor lacUV5 yang dapat mengenali transkripsi

langsung gen T7 RNA polimerase, yang diinduksi oleh IPTG. Penambahan IPTG untuk

menumbuhkan k:ultur lysogen menginduksi produksi T7 RNA polimerase yang kembali

mentranskripsi DNA target pada plasmid. Strain DE3 lysogen dipilih antara lain untuk

wjuan defisiensi protease, amino acid auxotrophy, dan peningkatan solubilitas


(kelarutan).
3. Transformasi

Transformasi adalah proses memasukkan DNA ke dalam sel bakteri. Sel bakteri yang

memiliki kemampuan untuk memasukkan DNA ke dalam dirinya disebut sebagai sel

kompeten. Escherichia coli merupakan sel inang yang umumnya digunakan untuk

penelitian DNA rekombinan. Untuk dapat melakukan transformasi secara efisien, bakteri

E. coli hams mengalarni perlakuan fisik atau kimiawi tertentu yang akan meningkatkan

kemampuannya untuk memasukkan DNA. Masuk nya DNA dengan cara memperlakukan

sel menggunakan larutan CaCI 2dingin diikuti dengan paparan suhu tingi (42C) yang
dapat menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri. Plasmid masuk ke

dalam sel melalui dinding sel yang telah terbuka. Probabilitas masuknya plasmid ke

dalam sel kompeten yang dapat dicapai, yaitu satu sel tertransformasi di antara 1000 sel

dengan metode ini (Brown, 1990; Glick and Pasternak, 1994).

E. Sekuensing

Selcuensing DNA meliputi beberapa metode dan teknologi yang digunakan

untuk menentukan urutan basa nukleotida berupa adenin, guanin, sitosin dan timin pada

suatu molelcul DNA Pengetahuan mengenai sek:uen DNA menjadi sangat penting dalam

penelitian biologi dasar dan beberapa bidang terapan seperti diagnostik, bioteknologi,

biologi forensik dan biologi sistematik (Petterson et at., 2009). Ada dua metode yang

24
dapat digunakan untuk sekuensing DNA yaitu metode degradasi kimia (Metode Maxam

Gilbert) dan metode terminasi rantai (metode Sanger) (Maxam dan Gilbert, 1977 Sanger

et a/., 1 977). Dewasa ini, hampir semua sekuensing DNA dilakukan dengan

menggunakan metode terminasi rantai dimana metode ini melibatkan terminasi atau

penghentian reaksi sintesis DNA in vitro yang spesifik untuk sekuen tertentu

menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi (Pettersen et al., 2009).

F. Elekroforesis Protein

Protein dapat dipisahkan dengan metode elektroforesis. Gel yang dipakai poliakrilamid

kemudiandiberi pewamaan comassie blueatau untuk memperoleh basil yang lebih sensitif dapat

digunakan pewarnaan silver. Protein dielektroforesis pararel dengan standar protein marker. Hasil

elektroforesis protein dibandingkan dengan marker protein sesuaidengan berat molekulnya

(Wong, 2006). Polyacrilamide gel electrophoresis(PAGE) berfungsi untuk menganalisa ekspresi

gen. Protein rekombinan yang dipoduksi melalui kloning, diidentifikasi dari pita protein yang

terbentuk dibandingkan dengan kontrol (transforman tanpa insert gen). Hasil ekstrak sel pasti

banyak mengandung protein-protein lainnya, sehingga ketika gel diwarnai diperoleh pita-pita

banyak dan smear. Maka dari itu protein perlu dipuriftkasi hila menginginkan basil protein berupa

antigen atau antibodi (Wong, 2006).

G. Imunobloting atau Western Blotting

Imunobloting atau Western blotting merupakan metode identifikasi menggunakan

antibodi untuk mendeteksi keberadaan antigen pada matrik padat seperti kertas filter

(Abbas et a!. , 2007). Imunobloting digunakan untuk identifikasi keberadaan antigen atau

antibodi. Protein atau antigen yang spesifik terdeteksi dengan pengujian menggunakan

antibodi yang mampu bereaksi dengan protein yang telah dipisahkan berdasarkan berat

25
molekul dan muatan protein melalui elektroforesis dalam gel seperti poliakrilamid.

Protein setelah dielektroforesis menggunakan Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide

Gel Elektrophoresis, kemudian ditransfer pada membran nitroselulosa (blots) dengan cara

transverse electrophoresis, dan dideteksi menggunakan antibodi spesifik yang telah

dilabel (Roitt, 1993; Janeway et a/., 200 1).

26
BAB ID

MATERI DAN METODE

A. MATERI

Alat

Alat utama yang diperlukan dalam penelitian ini adalah sentrifus, penangas air,

mesin thermal cycler (Infinigen), transilluminator ultra violet, elektroforesis horizontal

apparatus (Bio-Rad), elektroforesis vertical apparatus (Bio-Rad), mikropipet, Erlenmeyer

(Iwaki Pyrex), plate (Iwaki Pyrex), tabung reaksi (Iwaki Pyrex), konikel, inkubator

shaker 37C, inkubator 37C, dan blotter.

Bahan

Bahan penelitian yang digunakan adalah isolate reference Leptospira interogans

serovar icterohaemorhagie yang diperoleh dari dr. Bambang Isbandrio, SpPD. Fakultas

Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang, kit isolasi DNA (Genomic DNA mini kit

Geneaid). pnmer spesifik outer membrane protein LipL32 yaitu: 5'

CTAAGTICATACCGTGAT TI-3 ' (forward), 5'-ATTACTIAGTCGCGTCAGAA-3'

(reverse), ChampionpET SUMO Protein Expression System, One Shot Machi - T1

Chemically Competent E. coli, GeneJel111 Plasmid Miniprep Kit (Fermentas), Kit

komersial PCR Mix K.APA 2G Fast readymix with loading dye (Geneaid), agarose

(Invitrogen), marker DNA lOObp (invitrogen), Good view (SBS), Broad way prestained

protein marker (Intron), IPTG (Sigma), kanamycin sulfat (Invitrogen), LB agar (Sigma),

Tryptone (Sigma), Yeast Extract (Sigma), Tris (Nacalai Tesque), NaCl (Nacalai Tesque),

TBE (Invitrogen), Glycin (Nacalai Tesque), Metanol, Aquadest steril, nuclease .free water

antibody monoclonal anti LipL32 diperoleh dari Kasertsart University Thailand, NBT.

27
BCIP dan WesternBreezeChemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit.

B. Metode
Penelitian ini dibagi menjadi tiga betas tahap yaitu (1) Isolasi DNA dari Isolate

Reference Leptospira interogans ser icterohaemoraghi (2) Polymerase Chain Reaction

(3)Purifikasi Gen (Biobasic Inc) (4) Ligasi (5) Tahap transformasi One Shot Machl
TJR Chemically Competent E. coli.dan (6) Tahap isolasi plasmid (7) Tahap pengujian gen

insert dalarn plasmid dengan Polymerase Chain Reaction (8) Tahap Sequensing (9) Tahap
Transformasi BL21 (DE3) One ShotR Cells (10) Ekspresi Protein (11) Identifikasi protein
rekombinan dengan Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (12)
produksi antibodi poliklonal (13) Jmunobloting. Alur penelitian secara lengkap dapat
diiihat sebagai berikut:

Isolasi DNA
bakteri

( Isolasi Plasmid )-__. ( Sequencing

Leptospira sp. +
t Identifikasi dng
elektroforesis
Identifikasi dengan horisontal
elektroforesis
horisontal
t Transfonnasi
BL21 (DE3)

Polymerase Chain
Reaction dan Purifikasi
gel Ekspresi protein

t
Ligasi gen LipL32 ke Identiflkasi Imunisasi Mencit
dalam PET Sumo (Produksi AB
dengan SDS-
PAGE Poliklonn
+
+
Transformasi
One Shot Machi-
(.....__]Imunobloting
28
1. lsolasi DNA dari Isolate Reference Leptospira interogans ser icterohaemoraghi

Isolasi DNA menggunakan Genomic DNA mini kit (Gene Aid) untuk bakteri gram

negatif. Tahap isolasi DNA adalah sebagai berikut kultur isolat reference ditransfer

hingga 200 ).ll ke dalam 1,5 ml sentrifuge tube kemudian dilanjutkan sentrifus 1 menit

dengan kecepatan 14.000-16.000xg, kemudian supernatant dibuang, tambahkan 200 J..tl

GT buffer ke dalam tube kemudian resuspensikan pellet cell dengan shaking secara

perlahan atau dengan menggunakan pipet, inkubasikan pada temperature ruang selama 5

menit, tambahkan 250 ).ll GB Buffer ke dalam sampel dan campur secara perlahan selama


5 detik, inkubasikan pada 60 C selama 1 0 menit sampai lysate bersih (dibolak-balik tiap


3 menit), bersamaan panaskan elution buffer pada 70 C, tambahkan 5)11 RNAse untuk

membersihkan lysate dan campur dengan perlahan, inkubasikan pada suhu ruang selama

5 menit, tambahkan 200 J.d etanol absolut dan campur selama 10 detik, tempatkan GD

colom ke dalam 2 ml collection tube, kemudian masukkan seluruh campuran ke dalam 2

ml collection tube, sentrifuge 14.000 - 16.000 xg selama 2 menit, dan buang supernatan

pada collection tube kemudian tempatkan kernbali collection tube, tambahkan 400 ).ll W1

buffer ke dalam GD colom, sentrifuse 14.000 - 16.000 xg selama 30 detik, huang

supematan melalui dinding dan tempatkan GD colom kembali ke dalam 2 ml collection

tube, tambahkan wash buffer sebanyak 600 J!l dan sentrifuse selama 1 menit, sentrifuse

kembali selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 - 16.000 xg untu.k mengeringkan

matriks, masuk.kan GD colom kering ke dalam 1.5 ml sentriguge tube bersih, tambahkan

100 J!l preheated elution buffer (TE Buffer) pada permu.kaan tengah dari matriks,

diamkan 3 menit, dan sentrifuse kembali pada 14.000 - 16.000 xg selama 30 detik dan

hasil elusi berupa DNA.

29
2. Polymerase Chain Reaction

Reaksi PCR disiapkan sebanyak 25 111 sebagai berikut: template sebanyak 1 111, PCR

mix sebanyak 12,5 111,. primer forward dan backward masing-masing 1 111, dan

ditambahkan ddH20 sebanyak 9,5 111 agar total reaksi PCR menjadi 25 111. Reaksi PCR

dimasukkan dalam thermal cycler dengan program PCR sebagai berikut: tahap persiapan

(predenaturasi) satu siklus pada suhu 94C selama 5 menit, diikuti 35 siklus untuk

denaturasi 94C selama 1 menit, annealing 53C selama 45 detik, elongasi 72C selama 1

menit dan post elongasi 72C selama 5 menit. Gel agarose 1% dibuat dengan cara

mencampurkan 0,25 g agarose dengan 25 ml Tris Base EDTA (TBE). Campuran di

panaskan dengan mikrowave selama 1 menit kemudian didinginkan. Campuran

ditambahkan Goodview kemudian dibiarkan mengeras dalam sumuran. Elekroforesis

dijalankan pada tegangan IOOV selama 30 menit. DNA marker yang digunakan adalah

100 bp. Hasil positif dapat dilihat pada transiluminator ultraviolet yang ditandai dengan

terbentuknya pita.

3. Pu rifikasi Gen (Biobasic Inc)

Fragmen gen pada gel elektroforesis di potong kemudian ditimbang dan diletakkan

pada 1.5 ml microcentrifuge tube, tambahkan 400-700 111 binding buffer tiap 100 mg slice

gel, tempatkan pada EZ- 10 coloum, diamkan selama 2 menit, sentrifuge 10.000 rpm

selama 2 menit, huang melalui dinding tabung kemudian tarnbahkan 500 111 wash solution

dan sentrifuge 10.000 rpm selama 1 menit (tahap ini diulang satu kali ) kemudian

tempatkan coloum pada 1.5 ml microcentrifuge dan tambahkan 30 - 50 111 elution buffer

pada permukaan tengah dari coloum, inkubasikan pada suhu ruang selama 2 menit

30
lanjutkan dengan centrifuge 10.000 rpm selama 2 menit DNA yang telah terpurifikasi


dapat disimpan pada -20 C.

4. Ligasi

Reaksi ligasi dipersiapkan sebanyak 10 Jll dengan komposisi sebagai berikut: Produk

PCR fresh sebanyak 5 J.Ll, 1 OX Ligation Buffer sebanyak 1 Jll, 2 Jll vektor plasmid pET

SUMO (25 ng/Jll) dan T4 DNA Ligase sebanyak 1 J.d. Reaksi ligasi kemudian diinkubasi

pada suhu 4 C selama 24 jam.

5. Tahap transformasi One Shot lachJTM..TJR Chemically Competent E. coli.

Proses transfonnasi dilakukan dengan mencampurkan 2 J.Ll produk ligasi dan

dimasukkan dalam vial One Shot Machl-TJR Chemically Competent E. coli.

Campuran tersebut dicampur dengan perlahan dan tidak boleh dipipetting naik turun,

karena kondisi sel kompeten yang masih rapuh sehingga proses pipetting dapat merusak

sel kompeten tersebut. Campuran kemudian diinkubasi pada es selama 20 rnl!nit.

Campuran di-heatshock selama 30 detik pada waterbath 42C tanpa shaking, kemudian

vial langsung dipindahkan ke es selama kurang lebih 2 menit. Vial kemudian

ditambahkan Super Optimal Broth (SOC) medium dengan suhu ruangan sebanyak 400

J.LL Vial ditutup dengan rapat kemudian digoyang secara horizontal (200 rpm) pada

inkubator shaker dengan suhu 37C selama 1 jam. Hasil transformasi sebanya.k masing

masing 200 J.Ll kemudian dituang pada 2 plat LB yang mengandung kanamycin. Plat

selanjutnya diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37C selama 24 jam.

31
6. Tahap isolasi plasmid

Hasil transformasi positif dihmju.kkan dengan adanya pertumbuhan koloni pada

plat LB. Sebelum isolasi plasmid, koloni dari LB padat direkultur terlebih dahulu ke LB

cair. Proses rekultur koloni bakteri yang tumbuh dari LB plat ke LB cair yaitu dengan

cara koloni bakteri masing-masing diambil dan dikultur pada 5 ml media LB cair yang

mengandung kanamycin. Tiap koloni bakteri dikultur ke tabung LB cair secara terpisah.

Tabung kemudian diinkubasi pada inkubator shaker 37C selama semalam dengan posisi

tabung miring.

Proses isolasi plasmid dimulai dengan melakukan sentrifus 5 ml kultur E. coli dari

media LB cair selama 1 0 menit dengan kecepatan 6000 g. Supernatan kemudian dibuang

dan pelet diresuspensi dengan 250 f.d Resuspension solution, kemudian ditambahkan 250
111 Lysis Bzif.fer dan dicampur dengan pelan selama 4-6 menit hingga larutan bercampur

dan tampak cerah, tambahkan 350 Jll neutralization solution, campur dengan membolak

balikan tube sebanyak 4-6 x, sentrifuse selama 5 menit masukkan supernatan ke dalam

Gene Jet TM spin colown (hindari pipetting white precipitate), sentrifuse selama 1 menit

dan huang supernatant, tambahkan 500 111 wash solution sentrifuse selama 1 menit

(ulangi sebanyak 1 kali), dilanjutkan dengan sentrifuse 1 menit, letakkan spin coloum ke

dalam microcentrifuge tube, tambahkan 50 111 elution buffer kemudian diinkubasikan

pada suhu ruang selama 2 menit, sentifuse selama 2 menit, hasil yang didapat berupa

Purified plasmid DNA.

32
7. Tabap pengujian gen insert dalam plasmid denganPolymerilse Chain Reaction

Reaksi PCR disiapkan sebanyak 25 fll sebagai berikut: template sebanyak 1 )ll,

PCR mix sebanyak 12,5 fll, primer forward dan backward masing-masing 1 Ill, dan

ditambahkan ddH20 sebanyak 9,5 fll agar total reaksi PCR menjadi 25 Jll. Reaksi PCR

dimasukkan dalam thennal cycler dengan program PCR sebagai berikut: tahap persiapan

(predenaturasi) satu siklus pada suhu 94C selama 5 menit, diikuti 40 siklus untuk

denaturasi 94C selama 1 menit, annealing 55C selama 45 detik, elongasi 72C selama 1

menit dan postelongasi 72C selama 1 menit Gel agarose 1 % dibuat dengan cara

mencampurkan 0,25 g agarose dengan 25 ml Tris Base EDTA (TBE). Campuran di

panaskan dengan mikrowave. selama 1 menit kemudian didinginkan. Campuran

ditambahkan Goodview kemudian dibiarkan mengeras dalam sumuran. Elekroforesis

dijalankan pada tegangan IOOV selama 30 menit DNA marker yang digunakan adalah

100 bp. Hasil positif dapat dilihat pada transiluminator ultraviolet yang ditandai dengan

terbentuknya pita.

8. Tahap sekuensing

Sekuensing DNA dilakukan di PT. 1st BASE Sequencing dengan menggunakan

metode Sanger (metode terminasi rantai). Sekuensing DNA dilakukan dengan dua kali

reaksi menggunakan primer Lip L32 forward dan reverse masing-masing dengan

konsentrasi 1 0 pmol. Basil PCR digunakan sebagai cetakan untuk reaksi selruensing.

Komposisi reaksi sekuensing DNA terdiri dari produk PCR, enzyme Taq Polymerase,

primer, dNTP dan. ddNTP. Kondisi reaksi sekuensing DNA yaitu tahap persiapan

(predenaturasi) satu siklus pada suhu 94C selama 5 menit, diikuti 40 siklus untu.k

33
denaturasi 94C selama 1 menit, annealng55C
i selama 45 detik, elongasi 72C selama 1

menit dan postelongasi 72C selama 1 menit

R
9. Tahap Transformasi BL21 (DE3) One Shot Cells

Masukkan l-5J.1l plasmid DNA ke dalam tiap vial BL2 l(DE3) One ShorR Cells dan campur

secara perlahan dengan menggunakan tip micropipet tetapi jangan di pipet naik dan turun.

Inkubasikan dalam es selama 30 enit kemudian pindahkan sel dalam incubator 42 C tanpa

shaking, kemudian transfer tube ke dalam es, tambahkan 250 J.ll SOB mediwn , tutup rapat tube

kemudian diinkubasikan selama 37C selama I jam dengan kecepatan shaker 200 rpm,

tumbuhkan selama 24 jam pada suhu 37 C dengan shaking (pada ta.hap ini digunakan 4 vial

BL21 (D3) One Shot Cells).

10. Ekspresi Protein

Ino.kulasikan 1000 J.ll overnight kultur basil transformasi dalam 20 ml LB cair media

yang mengandung kanamycin kemudian tumbuhkan selama 24 jam pada inkubator shaker 37C,

kemudian kultur dibagi menjadi 2 masing-masing sebanyak 10 m1 dan tambahkan pada salab satu

tabung IPTG sampai mencapai konsentrasi 1 mM. kemudian dilakukan pengukuran optical

density (OD) protein hingga mencapai nilai 0.600, kemudian sentrifuse untuk m.endapatkan pellet

yang digunakan sebagai sampel Pada pellet kemudian ditambahkan 200 J.ll PBS kemudian

tambabkan 20 J.ll lysosime dan diinkubasikan pada waterbatb selama 30 menit pada suhu 37C

dilanjutkan freeze ke dalam N2 cair selama 30 menit ta.hapan ini diulang sebanyak 3 kali.

Sentrfifuse dilakukan pada kecepatan 10.000 rpm dan diambil supernatant sebagai sampel protein

Protein diidentifikasi dengan menggunakan elektroforesis protein.

34
11. ldentifikasi protein rekombinan dengan Sodium Dodecyl Sulphate

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Protein rekombinan dipisahkan dengan 12% SDS-P AGE menurut metode Laemmli

(1 970) dengan alat elektroforesis. Gel poliakrilamid 12% dituang pada plat dan diratakan

pennukaana
ny dengan butanol, setelah gel berpolimerisasi, butanol dibuang dan gel

dicuci dengan aquadest. Stacking gel (3%) dituang di atas gel, selanjutnya sisir dipasang

untuk membuat sumuran, setelah stacking gel berpolimerisasi, plat dirangkai dengan

aparatus elektroforesis. Bufer elektroda dituang ke dalam tangki dan sisir diangk:at

Sampel ditambah sampel buffer (4 : 1 ) direbus dalam air mendidih selama 2 menit.

Sampel masing-masing sebanyak 20J.Ll dan protein marker (intron) sebanyak: 10 J.U

dimasukkan ke dalam sumuran stacking gel. Aparatus elektroforesis d.ihubungkan dengan

power supply (100 volt selama 2 jam) untuk dielektroforesis. Setelah sampel mencapai

front, gel diambil dan diwarnai dengan commasie brilliant blue R.250 0,2 % selama

semalam. Gel yang telah diwamai dibersihkan denga.n larutan destaining hingga

transparan dan disimpan dalam asam asetat 10%.

12. Imunisasi.

Crude protein LipL32 sebanyak 5 Jlg/Jll dilarutkan dalam akuabides steril dan

diemulsikan dengan Freund's complete adjuvant (perbandingan 1 : 1) untuk penyuntikan

pertama, sedangkan untuk penyuntikan kedua dan seterusnya digunakan incomplete

adjuvant. Emulsi disuntikk:an pada rongga peritoneum dari menct


i Balb/C betina umur

8-10 minggu denganjarum 25 gauge. Penyuntikan diulang 5 kali dengan interval waktu

14 hari.

35
13. Imu1wbloting

Holzel blotter dibasahi dengan buffer blotting dan dilapisi dengan kertas whatman

sebanyak 4 lembar yang telah dibasahi dengan buffer blotting. Membran nitroselulose

yang telah dibasahi dengan buffer blotting diletakkan pada tumpukan kertas whatman.

Gel poliakrilamid diletakkan di atas membran dan diberi penanda denganj arum 20 gauge

sebagai orientasi letak sampel. Gel kemudian ditutup dengan kertas whatman 4 lapis yang

telah dibasahi dengan buffer blotting. Blotter ditutup dengan penutup blotter. Transfer

protein dilakukan pada red current menunjukkan angka 500, selama 1-2 jam, kemudian

dilanjutkan dengan meletakkan membran pada disc yang telah berisi 10 ml blocking

solution, inkubasikan selama 30 menit dengan menggunakan rotary shaker, cuci

membran dengan 20 ml air selama 5 menit sebanyak 2 kali, ink.ubasikan dengan antibody

primer selama 24 jam dilanjutkan dengan pencucian dengan antibody wash selama 5

menit sebanyak 5 kali, inkubasikan dengan 10 ml secondary antibody selama 30 menit

kemudian cuci membrane selama 5 menit dengan 20 ml antibody wash selama 2 menit

sebanyak 3 kali kemudian membrane yang telah dicuci diletakkapan pada plastic

transparan kemudian dengan menggunakan mikropipet tambahkan 25 ml

chemilluminescent substrat hilangkan ekses chemiluminescent substrat dengan

menggunakan paper pada kit, kemudian tutup permukaan membrane dengan transparan

plastic, dan membrane siap untuk proses luminography

36
BAB IV
BASIL DAN PEMBABASAN

1. Isolasi DNA dan Polymerase Chain Reaction

DNA dari isolatreference diisolasi dengan menggunakan genomic DNA mini kit dan

hasil isolasi digunakan sebagai template untuk proses PCR. Reaksi PCR disiapkan

sebanyak 25 Jll sebagai berikut: template sebanyak 1 Jll, PCR mix sebanyak 12,5 1,

primer forward dan backward masing-masing 1 Jll, dan ditambahk:an dd.H20 sebanyak

9,5 Jll agar total reaksi PCR menjadi 25 Jll. Reaksi PCR dimasukkan dalam thermal

cycler dengan program PCR sebagai berikut: tahap persiapan (predenaturasi) satu siklus

pada suhu 94C selama 5 menit, diikuti 35 siklus untuk denaturasi 94C selama 1 menit,

annealing 53C selama 45 detik, elongasi 72C selama 1 menit dan post elongasi 72C

selama 5 menit. Gel agarose 1% dibuat dengan cara mencampurkan 0,25 g agarose

dengan 25 ml Tris Base EDTA (TBE). Campuran di panaskan dengan mikrowave selama

1 menit kemudian didinginkan. Campuran ditambahk:an Goodview kemudian dibiarkan

mengeras dalam sumuran. Elekroforesis dijalankan pada tegangan lOOV selama 30 menit.

DNA marker yang digunakan adalah 100 bp. Hasil positif dapat dilihat pada

transilurninator ultraviolet yang ditandai dengan terbentuknya pita. Hasil elektroforesis

dari PCR pada penelitian ini menunjukkan pita dengan panjang 819 bp, dapat dilihat pada

Gambar 3.

37
600

100

Gambar 3. Hasil amplifikasi PCR gen LipL32 pada gel agarose dengan konsentrasi 1%.
Keterangan: Marker 1 00 bp (M), hasil negatif ampliftkasi gen dengan
menggunakan DNA total Leptospira interogans ser. Bataviae (lajur 1 dan 2,
hasil positif ampliftkasi gen dengan menggunakan DNA total Leptospira
interogans ser. Icterohaemoraghie (lajur 3 dan lajur 4).

Hasil PCR kemudian dipuriftkasi dengan menggunakan purifikasi gel (Biobasic Inc)

untuk selanjutnya digunakan dalam proses ligasi ke dalam pET SUMO.

2. Ligasi

Proses selanjutnya ada1ah proses ligasi, yaitu menyambungkan gen yang diinginkan ke

dalam vektor dengan bantuan enzim ligase. Vektor yang digunakan dalam kloning ada

beberapa macam antara lain vektor plasmid, bacteriophage, kosmid, Bacterial Artificial

Chromosomes (BAC), dan Yeast Artificial Chromosomes (YAC). Pemilihan vektor

didasarkan pada ukuran gen yang akan di.klon (Russell dan Sambrook, 2001). Pada

penelitian ini vektor yang digunakan adalah vektor plasmid.. Vektor plasmid yang

digunakan dalam penelitian ini adalah pET SUMO. Salah satu aspek yang penting dalam

melakukan proses ligasi adalah mengatur temperatur yang optimal. Kebanyakan proses

38
ligasi menggunakan T4 DNA Ligase (diisolasi dari bacteriophage T4), yang aktif pada

temperatur 25C. Namun demikian, temperatur optimal yang efisien untuk ligasi dengan

vektor plasmid yang memiliki cohesive-ended fragment (sticky end) membutuhkan

keseimbangan antara suhu optimal enzim dan Tm yang juga suhu armealing dari sticky

end yang diligasi. Jika suhu yang dipakai melebihi Tllb pasangan homolog dari sticky end

tidak akan stabil karena suhu yang tinggi mengganggu ikatan hidrogen. Reaksi ligasi

paling efisien jika sticky end telah menempel dengan stabil dan adanya gangguan pada

ujung yang menempel akan menyebabkan efisiensi ligasi yang rendah. Semakin pendek

overhang, semakin rendah Tm yang digunakan. Umumnya 4-basa overhang memiliki Tm

antara 12-l6C (Tabor, 2001 ). Reaksi ligasi pada penelitian ini diinkubasi pada

temperatur 4oc selama semalam (24 jam) pada refrigerator Produk ligasi ini selanjutnya

ditransfonnasi pada plat E. coli yang kompeten.

3. Tahap transformasi One Shot Maclzl-Tl R Chemically Competent E. coli.

Umumnya penelitian mengenai kloning menggunakan vektor plasmid dan E.coli sebagai

sel hospesnya. Plasmid vektor dan E. coli banyak digunakan oleh karena mudah

diadaptasikan, mudah didapat, dan organisme rekombinan ini dapat tumbuh secara cepat

dengan peralatan minimal . Origin of replication membantu plasmid DNA bereplikasi

secara independen tanpa dipengaruhi oleh replikasi kromosom sel bakteri itu sendiri

(Hanahan, 1983). Pada penelitian ini sel kompeten yang digunakan adalah Mach 1

Chemically Competent E. coli. Transformasi memiliki pengertian dimana material

genetik eksogenous dimasukkan ke dalam sel bakteri. Ada beberapa metode dalam proses

transfonnasi, antara lain dengan senyawa kalsium klorida, heat shock, maupun dengan

elektrotransformasi (Russel dan Sambrook, 2001 ). Pada penelitian ini metode yang

39
digunakan adalah metode heat shock karena vektor plasmid yang digunakan yaitu pET

SUMO merupakan plasmid sirkuler. Transformasi biasanya menghasilkan campuran sel

bakteri yang telah mengalami transfonnasi dan mengandung plasmid rekombinan serta

sekumpulan sel yang tidak mengalami transformasi. Sebuah rnetode diperlukan untuk

menyeleksi sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Plasmid membawa

marker yang spesifik dimana sel yang tidak mengandung plasmid rekombinan dapat mati

atau pertumbuhannya terhambat. Resistensi terhadap antibiotik tertentu merupakan

indikator yang paling sering digunakan untuk bakteri yang membawa plasmid

rekombinan, karcna plasmid memiliki gen yang resisten terhadap antibiotik tertentu. Sel-

sel bakteri lain yang tidak mengalami transformasi dan tidak membawa plasmid

rekombinan akan bersifat sensitif terhadap antibiotik sehingga hanya bakteri yang telah

mengalami transfonnasi yang dapat turnbuh pacta media yang mengandung antibiotik

tertentu (Russell dan Sambrook, 2001 ). Antibiotik yang digunakan pacta penelitian ini

adalah kanamycin dengan dosis 50 Jlg/ml pada media LB. Proses transformasi

menggunakan media LB padat dalam plat untuk menumbuhkan E. coli. Media LB

merupakan media yang kaya akan nutrisi, dan digunakan secara umum untuk

menumbuhkan bakteri. Media LB sudah diformulasikan secara standar untuk kultivasi E.

coli sejak tahun 1950an. Media ini sudah digunakan secara luas dalam aplikasi

mikrobiologi molekuler sebagai media preparasi plasmid DNA dan protein rekombinan.

Media LB menjadi media yang paling banyak digunakan di laboratorium untuk

pertumbuhan strain E. coli rekombinan (Anonim, 2009). Hasil positif dari proses

transformasi adalah adanya koloni bak:t:eri yang tumbuh pada plat LB. Hasil transfonnasi

positif dapat dilihat pacta Gambar 4. Hasil transformasi pacta penelitian ini menunjukkan

40
adanya 3 koloni pada plat. Semua koloni yang tumbuh kemudian direkultur ke LB cair

untuk: selanjutnya diisolasi plasmidnya.

Gambar 4. Hasil pertumbuhan bakteri transforman pada media LB padat.


Keterangan: Koloni bakteri transforman ditunjukkan dengan penanda Ll, 12
dan L3.

4. Tahap isolasi plasmid

Proses selanjutnya setelah transformasi adalah isolasi plasmid. Plasmid yang terdapat

dalam sel bakteri diisolasi untuk selanjutnya diuji apakah gen yang diinginkan ter-insert

ke dalam plasmid. Isolasi plasmid pada penelitian ini menggunakan GeneJe1111 Plasmid
Miniprep Kit (Fennentas), dan diawali dengan rekultur terlebih dahulu. Plasmid yang

mengalami transformasi tidak semuanya mengandung gen yang diinginkan. Beberapa

plasmid mungkin berhasil dalam proses ligasinya dan gen dapat masuk: ke dalam plasmid,

namun beberapa plasmid mungkin juga tidak berhasil dalam ligasi sehingga tidak ada gen

yang masuk dalam plasmid. Plasmid-plasmid basil isolasi ini kemudian diuji dengan

teknik PCR untuk mengetahui apakah gen yang diinginkan ter-insert ke dalam plasmid

menggunakan primerforward dan backwcird dari LipL32.

41
5. Pengujia n gen insert LipL32 dengan Polymerase Chain Reaction

Terdapat beberapa cara pengujian untuk mengetahui apakah target gen yang

diinginkan terdapat dalam plasmid rekombinan antara lain menggunakan teknik PCR,

maupun dengan cara pemotongan plasmid rekombinan menggunakan enzim restriksi.

Selanjutnya basil pemotongan ini dielektroforesis untuk melihat panjang gennya. Metode

lain untuk: menyeleksi insert gen pada plasmid adalah dengan metode blue-white

screening menggunakan media yang mengandung X-gal. Plasmid yang mengandung

insert gen yang diingink:an akan menghasilkan koloni yang berwarna putih, sedangkan

plasmid yang tidak mengandung insert gen akan ditunjukkan dengan koloni yang

berwarna biru karena adanya produksi P-galactosidase yang fungsiona] (Russell dan

Sambrook, 2001).

Pengujian gen insert dalam plasmid pada penelitian ini dilakukan dengan

menggunakan teknik PCR. Primer yang digunakan adalah forward dan reverse gen

LipL32 dan template yang digunakan adalah plasmid yang sudah diisolasi yaitu Ll-L3.

Hasil PCR selanjutnya dielektroforesis untuk melihat panjang pita yang dihasilkan. Hasil

positif dapat dilihat pada transiluminator ultraviolet yang ditandai dengan terbentuknya

pita. Hasil PCR dari plasmid dapat dilihat pada Gambar 5

42
Gambar 5. Hasil amplifikasi PCR plasmid gen LipL32 pada. gel agarose dengan
konsentrasi 1%. Keterangan: Marker 100 bp (M), Plasmid dari koloni L1
menunjukkan hasil positif dengan terbentuknya pita DNA (lajur 1), Plasmid ,
dari koloni L2 menunjukkan hasil positif dengan terbentuknya pita DNA
(lajur 2), Plasmid dari koloni L3 menunjukkan hasil negatif tidak terbentuk
pita DNA (lajur 3).

6. Tahap sekuensing

Sekuensing DNA dilakukan di PT. 1st BASE Sequencing dengan menggunakan

metode Sanger (metode terminasi rantai). Sekuensing DNA dilakukan dengan dua kali

reaksi menggunakan primer canine IFN-r forward dan backward masing-masing dengan

konsentrasi 10 pmol Hasil PCR digunakan sebagai cetakan untuk reaksi sekuensing.

Komposisi reaksi sekuensing DNA terdiri dari produk PCR; enzyme Taq Polymerase,

primer, dNTP dan ddNfP. Kondisi reak:si sekuensing DNA yaitu predenaturasi satu.

siklus pada suhu 94C selama 5 menit, diikuti 40 siklus untuk denaturasi 94C selama 1

43

-
menit, annealing 55C selama 45 detik, elongasi 72C selama 1 menit dan postelongasi

72C selama 1 menit

7. Transformasi BL21 (DE3) One Shof Cells dan Ekspresi Protein

Masukkan 15 plasmid DNA ke dalam tiap vial BL21(DE3) One Shof Cells dan campur
secara perlahan dengan menggunakan tip micropipet tetapi jangan eli pipet naik dan turun.

Inkubasikan dalam es selama 30 menit kemudian pindabkan sel dalam incubator 42 C tanpa
shaking, kemudian transfer tube ke dalam es, tambahkan 250 f..l.l SOB medium , tutup rapat tube
kemudian diinkubasikan selama 37C se]ama 1 jam dengan kecepatan shaker 200 rpm,
tumbuhkan selama 24 jam pada suhu 3 7 C dengan shaking (pada tahap ini digunakan 4 vial
BL21 (DE3) One Shot Cells). Kemudian dilanjutkan dengan ekspresi protein, langkah pertama
yang dilak:ukan untuk mengisolasi protein rekombinan LipL 32 dengan cara

menumbuhkan bakteri E. coli BL21 yang telah disisipi gen LipL32 pada plasmid pET

SUMO ke dalam media LB yang mengandung kanamycin, klon protein rekombinan

tersebut ditumbuhkan pada suhu 3'flC, kemudian dilak:ukan induksi dengan IPTG
kemudian dilak:ukan pengkuran optical density hingga 0,600. Optical Density 0,600

dimak:sudkan karena pada OD tersebut bakteri telah mencapai fase pembelahan

(logarhytmik phase atau exponential phase). Bakteri berkembang biak: dengan berlipat

dua kalinya pada fase ini, jumlah bak:teri meningkat secara eksponensiaL Fase

eksponensial berlangsung selama 1 8-24 jam, pada pertengahan fase ini pertumbuhan

bak:teri sangat ideal, pembelahan teijadi secara teratur, semua bahan dalam sel berada

dalam keadaan seimbang (balanced growth) (Syahrurachman et a/., 1994). Kloning gen

penyandi LipL32 menggunakan plasmid pET-SUMO sebagai vektor untuk

mengekspresikan gen penyandi LipL32. Vektor pETSUMO merupakan derivat pBR322

yang memiliki sifat low copy number, dan vektor ini lebih menitikberatkan pada

overekspresi protein .. Pemilihan E.coli sebagai inang unfuk ekspresi disebabkan karena

E. coli mengandung gen chromosomal copy untuk T7 Ribo Nucleid Acid polimerase. Ribo
Nucleic Acid polimerase bacteriophage T7 dapat mentranskripsi plasmid sirkuler

beberapa kali (Sambrook and Russel, 2001; Wong, 2006), sehingga gen LipL32 pada

multiple cloning site dapat diekspresikan secara maksimal. Sistem ekspresi

menggunakan promotor T7, gen LipL32 yang terletak downstream di bawah kendali

44
promotor tidak akan diekspresikan sampai tersedia IPTG. Pemberian IPTG pada media
pertumbuhan akan memacu produksi dari T7 RNA polimerase yang berada di bawah
kendali promotor lac. Transforman akan mengekspresikan gen yang dimilikinya, jika

IPTG ditambahkan untuk: menginduksi T7 RNA polimerase, kemudian berjalan


mengenali promotor T7 pada vektor ekspresi untuk memulai transkripsi (Wong, 2006).

Pemberian ampisilin bertujuan sebagai selectve


i marker yaitu menyeleksi sel bakteri
basil transfonnasi. Selective marker memanfaatkan keberadaan gen resistensi terhadap
antibiotik yang dimiliki oleh vektor seperti bla coding sequence untuk P-lactamase.

Gen resistensi ampisilin mengekspresikan enzim laktamase. Enzim ini mengkatalisis

reaksi hidrolisis pada cincin laktam sehingga bakteri transforman menjadi resisten

terbadap ampisilin (Sambrook and Russel, 2001). Set yang tidak tertransformasi tidak
akan mampu hidup pada media yang mengandung antibiotik (Wong, 2006). Proses
sonikasi diperlukan untuk memecah dinding sel bakteri transfomian sehingga gen
penyandi LipL32 yang terekspresi dapat diperoleh, akan tetapi pada penelitian ini
menggunakan enzymatic digestion untuk memecah dinding sel bakteri, dan dilanjutkan

dengan sentrifugasi untuk mendapatkan gen LipL32 yang terlarut pada supernatan
Protein rekombinan LipL32 kemudian diidentifikasi dengan Sodium Dodecyl Sulphate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis.

8. ldentifikasi protein rekombinan dengan Sodium Dodecyl Sulphate

Polyacrylamide Gel Electrophoresi


s

Ekspresi protein rekombinan dapat diidentifikasi dengan 12% SDS-PAGE menurut

metode Laemmli dengan alat elektroforesis. Identifikasi protein dengan menggunakan

SDS-PAGE didasarkan pada mobilitas elektroforesis molekul. Polyac1ylamide Gel

Electrophoresis yang akan memisahkan molekul protein berdasarkan berat molekul dan

muatan molekul tersebut. Ukuran pori dari PAGE ditentukan oleh total konsentrasi

monomer acrylamide-bisacrylamide (% T) dan konsentrasi cross-linker (% C). PAGE

terdiri atas resolving gel dan stacking gel. Resolving gel merupakan polyacrylamide gel

45
dengan ukuran pori yang kecil (3% monomer aery/amide). Makromolekul pada resolving

gel akan terpisah berdasarkan ukurannya. Stacking gel merupakan polyacrylamide gel

dengan ukuran pori yang besar (4% monomer aery/amide). Proses polimerisasi gel

diinisiasi dengan pemberian ammonium persulfate (APS) dan tetramethylethylenediamine

(TEMED). Konsentrasi APS dan TEMED yang umum digunakan adalah antara 1-10

rnM. Peningkatan konsentrasi APS dan 1EMED akan menurunkan elastisitas gel. Sodium

Dodecyl Sulfate adalah senyawa yang digunakan untuk mendenaturasi protein, sehingga

protein akan menjadi polypeptida yang tunggal. Sampel protein akan bermigrasi dari

kutub negatif ke kutub positif. Sampel protein yang tel.ah terpisah divisualisasikan

dengan menggunakan coomasie brilliant blue. Sampel protein bermigrasi secara

paralel dengan marker protein. Marker protein terdiri dari sejumlah protein standar

dengan ukuran molekul yang telah diketahui, sehingga dapat digunakan untuk

menentukan berat molekul protein target. Penentuan ukuran molekul dilakukan dengan

menganalisis pita-pita protein yang telah terpisah dengan membandingkan jarak migrasi

dengan fragmen yang telah diketahui pada marker. Hasil elektroforesis protein

rekombinan LipL32 pada gel poliakrilamid 12 % disajikan pada Gambar 6.

46
45kDa

34kDa

26.SkDa

Gambar 6. Identifikasi protein rekombinan LipL32 pada SDS-P AGE dengan konsentrasi
12%. Keterangan: Marker (M), Protein rekombinan dari koloni L l dengan
induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 1 ),
Protein rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya
protein rekombinan LipL32 (Lajur 2), Protein rekombinan dari koloni L l
tanpa induksi IPTG (Lajur 3), Protein rekombinan dari koloni L2 tanpa
induksi IPTG (Lajur 4) .

Profil protein pada lajur 1, lajur 2, dan lajur 3 menunjukkan pola pita yang sama

dibandingkan lajur 3. Perbedaan tersebut disebabkan adanya gen insert pada plasmid

pET-SUMO yang mengekspresikan protein rekombinan LipL32 sebesar 32 k.Da,

sehingga mempengaruhi transkripsi dan translasi plasmid yang dibawa sel inang.

Transkripsi menyampaikan informasi genetika dari DNA ke dalam molekul RNA,

sedangkan translasi mengkode informasi yang ada di RNA menjadi protein (Yuwono,

2005).

9. Imunobloting

lmWlobloting atau western blotting adalah suatu teknik identifikasi dimana antibodi

digunak:an untuk mendeteksi keberadaan antigen pada matriks padat seperti membran

47
nitroselulose (Abbas et a/., 2007). Antibodi mempunyai kemampuan untuk berikatan

dengan berbagai macam antigen termasuk makromolekul dan substansi kimia yang

sangat kecil (Abbas and Lichtman, 2009). Antibodi poliklonal adalah antibodi yang

mengenal beberapa antigen (Janeway et al., 2001). Bagian dari antigen yang dapat

tau determinan. Determinan antigen yang


dikenali oleh antibodi dikenal sebagai epitop a _

berbeda-beda dapat dikenali berdasarkan sequence (epitop linier) atau bentuk epitop

(konformasi epitop). Epitop biasanya terdiri dari 4-5 asam amino dan beberapa dari

epitop tersembunyi di dalam molekul antigen dan dapat terekspose apabila terjadi

perubahan physicochemical. Kemampuan interaksi untuk terjadinya pengikatan antara

antibodi dengan satu epitop antigen disebut dengan afmitas (Abbas and Lichtman, 2009).

Teknik western blotting atau imunobloting diawali dengan proses mentransfer pita

protein yang terpisah pada Polyacrilamyde Gel Electrophoresis ke membran

nitroselulosa Gel protein dan membran disisipkan di antara kertas filter, direndam dalam

bufer, dan dialiri listrik, setelah pita protein bermigrasi ke membran, pita tersebut

digunakan untuk deteksi imunologi (Wong, 2006). Penggunaan teknik western blotting

sangat berguna untuk mengetahui keberadan antigen, sehingga dapat diketahui protein

yang dihasilkan dikenali oleh antibodi poliklonal anti-LipL32. Antibodi polikonal anti

ESA diharapkan dapat mengenali protein rekombinan LipL32 saat imunobloting.

Kompleks reaksi antigen-antibodi yang terbentuk kemudian dibandingkan dengan protein

standar (marker) yang telah diketabui berat molekulnya. Antibodi yang spesifik terhadap

antigen, berikatan hanya pada protein rekombinan yang diekspresikan dan

divisualisasikan sebagai pita tunggal (Wong, 2006). Hasil transfer membran dari gel

SDS-PAGE ke membran nitroselulose dapat dilihat pada Gambar 7, sedangkan basil dari

48

visualisasi WesternBreeze Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit

dengan menggunakan antibodi poliklonal anti LipL32 dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 7. Transfer Blotter dari gel SDS-PAGE menuju membrane nitroselulose.


Keterangan: Marker (M), Protein rekombinan dari koloni Ll dengan induksi
IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur I), Protein
rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein
rekombinan LipL32 (Lajur 2), Protein rekombinan dari koloni Ll tanpa
induksi IPTG (Lajur 3), Protein rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi
IPTG (Lajur 4).

49

Gambar 8. Hasil imunobloting dengan menggunakan WesternBreeze Chemiluminescent
Western Blot Immunodetection Kit. Keterangan: Marker (M), Protein
rekombinan dari koloni L l dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein
rekombinan LipL32 (Lajur 1), Protein rekombinan dari koloni L2 dengan
induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 2),
Protein rekombinan dari koloni L1 tanpa induksi IPTG (Lajur 3), Protein
rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi IPTG (Lajur 4) . .

Protein rekombinan yang dihasilkan setelah direaksikan dengan antibodi

poliklonal anti LipL32 tidak menunjukkan adanya pita yang bereaksi positif dengan

antibodi poliklonal yang digunakan, hal ini kemungkinan besar disebabkan karena

pengenceran antibodi poliklonal yang terlalu tinggi yaitu 1 : 1000, ataupun juga karena

terlalu lama terekspose dalam chemiluminecance substrat, kemudian dilakukan

pengulangan kembali proses imunobloting dengan menggunakan antibodi monoklonal

anti-LipL32 dengan pengenceran 1 : 10 dan dapat dilihat pada gambar 9, sebehnn proses

imunobloting diawali dengan identifikasi menggunakan SDS-PAGE 12 %.

50
Gambar 9. Hasil imunobloting pada membrane nitocelulose dengan menggunakan
antibodi monoklonal anti LipL32. Keterangan: Marker (M), Protein
rekombinan dari koloni L l dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein
rekombinan LipL32 (Lajur 1), Protein rekombinan dari koloni L2 dengan
induksi IPTG menunjukkan . adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 2),
Protein rekombinan dari koloni L1 tanpa induksi IPTG (Lajur 3), Protein
rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi lPTG (Lajur 4), Protein rekombinan
dari koloni Ll dengan induksi IPTG menunj ukkan adanya protein rekombinan
LipL32 (lajur 5)

51

-:
-=

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

A.Kesimpulan

Berdasarkan penelitian dapat disimpulkan bahwa hasil penelitian menunjukkan

panjang gen penyandi protein LipL32 telah berhasil diampliflkasi deng'"an panjang 819 bp dan

berat protein LipL32 yang diekspresikan sebesar 32 kDa, protein berhasil diidenti:fikasi dengan

menggunakan SDS-PAGE dan imunoblotting dengan menggunakan antibodi monoklonal anti

LipL32

B.Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang berbagai protein yang terkait dalam

proses patogenesitas dari Leptospira sp., sehingga kedepannya dapat dikembangkan

sebagai kandidat kit diagnostik ataupun kandidat vaksin.

52

-
BAB VI
DAFTAR PUSTAKA

Abbas, A. K., Lichtman, A. H., and Pober, J. S. 2007. Cellular and Molecular
Immunology. 4th ed. W.B. Saunders Company, Philadelphia.

Anonim0 2009. Commonly used bacterial E.coli growth media. Expression Technologies

Inc. http://www.exptec.com/Reagents/Common%20Media. htm. Diakses tanggal
1 5 Agustus 2011.

Chalayon, P., Chanket, P., Boonchawalit, T., Chattanadee, S., Srimanote, P.,
Kalambaheti, T. 2011. Leptospirosis Serodiagnosis by ELISA based on
Recombinant Outer Membrane Protein. Transactions of The Royal Society of
Tropical Medicine and Hygiene. p 289-197.

Faine, S., Adler, B., Bolin, C., Perolat, P. 1999. Leptospira and Leptospirosis.
Medischi:Melboume Australia.

Guerreiro, H., Croda, J., Flannery, B., Mazel, M., Matsunaga, J., Reis, M.G., Levett,
P.N., Ko., A.I., and Haake, D.A. 2001. Leptospiral Proteins Recognized during thr
humoral Immune Response to Leptospirosis in Humans. Infection and Immunity,
69(8). 4958-4968.

Haake, D.A., Chao, G., Zuerner, R.I., Barnett, J.K., Barnett, D., Mazel, M., Matsunaga,
J., Levett, P.N., Bolin, C.A 2000. The Leptospiral Major Outer Membrane Protein
LipL32 Is a Lipoprotein Expressed during Mammalian Infection. Infection and
Immunity. p 2276-2285

Hoke, D.E., Egan, S., Cullen, P.A., Adler, B. 2008. LipL32 Is an Extracelluer Matrix
Interacting Protein of Leptospira spp. And Pseudoalteromonas tunicate. Infection
and Immunity. p 2063-2069.

Invitrogen. 2010. User Manual, Champion pET SUMO Protein Expression System.
Manual Part No. 25-0709.

Lin, X., Sun, A., Ruan, P., Zhang, Z., Yan J. 201 1 . Characterization of Conserved
Combined T and B cell Epitopes in Leptospira interrogans Major Outer Membrane
Protein OmpLl and LipL4 1. BMC Microbiology.
t
Sambrook, J. and Russel, D.W. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. 3 h edition.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Syarurachman, Agus., Staf pengajar Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 1994.


Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Bina Rupa Aksara. Jakarta.

53
Tabor, S.. DNA ligases. Chapter in: Current Protocols in Molecular Biology, Book 1.
2001: Wiley Interscience

WHO. 2003 . Human Leptospirosis: Guidance for Diagnosis, Surveillance and Control.
ILS.

WHO. 2010. Report of The First Meeting of The Leptospirosis Burden Epidemiology

Reference Group. Geneva.

54
55
69
,_,__, . ,..,.-. , _ , ---_: --- 1""- -:_ - - - ----

10 20 30 50 70 90
N T - G Cf.G C G r.1 t. G C l i C. 1 iT ocv. r 1 C tC-G CG G G C TC.!.C..:. C C TG G .:..,.:. u- C C TG G lG G G .-. "'1. G C .\ G A C C.::
60 80 100
C C't T f f. Gl .; T T C iT T T c:. G G ..i T TO .1 G T G G

110 13<J 140 ISO 200 210 2;


C C i G G T T T -- T , G G f ,;. G "( G , Q :... t. f T C i G T - ' G -CC T C T l C T .,:
1 170 180 19Q
\ C G :l :; .,G - TC C T T T C '-C T TC t G T T l T T TI G T G T C G ."'. TG T T T T T C G '- TC G f C :, I ' t

2JO 240 250 2su 210 28o 290 300 31o


1 TG ; T T C T :.a -r: .",Q T TG 1' , C 'f C r l'C 't l TC G :,CC , 1 C T C., 1 C G T C C: J, _., T T 1 T 1 G :,c T G G t T T T G(
32o 330
GO ,.. T T ;: G GQ :, 'TC :.G ,'1-G T TG T T G TO 'T C TC T T T : -G iC :, T C :

360 390
T T G GCG .-, T i T G G 7 c:.GQC .. T .- - T CG C. C G . c .'. l r C T T TC T .. c : C GG ..- : T C C. :. Q C :. ': l G T G G C 1 Q :. r 1G TC T G O G G 1 AGC G G C T T r G ;. J;,A GC 0 TC
350 370 380 400 410 420 4JO 440 450
C T T ., T ,. C C . ' T TT T T

'I
, / .!
.. I . '
' ' ! \
:' l \ :.1 1
<70 .ao oo &>a 50 e10
G r c '!'CC G TC GCC T G G C T C . l" ,tCG : -C T C C C T T 1' C - GC ();. T T - C G G C GG ..-. ., T C C 1 .-. :,c T O 0 :\T : G T . T G C T T T T T fGTT 1
510 520 530 s.o 550
CC G .'- T T TC G C C i G i T G G G G . . . !. iC .

. .

.;
: : l_ :>'
.
,
.- : .
f =

- - = m = -
T .._ - -CCG
TCC GGCGC 1 T G T CC 1' GGC T 1 1 C G T- ICC G r . T -- G T TG T C - C .'
:.G \ TC C G T - G G G :\ ' G T -C G T T T T l :.: cQGT T TC G T T T CH C G C 1 G G G ' fG
T TG TC C TC G

110 no 7311 100 750 760 no 7W 790 800


C - ,.. -.
G GC 1 ll r -- GGC T TGGC;.G \CC .,c C G .: - -O.C .. c c - C GC T T G C - 0 G T GC C 00:.0:. T --GC C :, :. :.. T r;.G .:.. .S. #' G i i T T T T C .. 1 G C T C TC
100
T "'GCGGT - -
r
- -
:. -! -

GO .-,.-. ::. -"' TC,)C GGT;.


1120 830
T GG -'" '-C T T :...G;:.,,
Jle: 1071297_A_LeptoF File: E:\ New folder (2)\ 1 st_BASE_1071.? U
_A_Leptot-.ao1
BLAST

Basic Local Alignment Search Tool


NCBII ID.AII blastn suite! Formatting Results - C6CDPYJV016
Formattin
gop tions
Download
View these resultsin the new enhanced re
oort Learn -about the enhanced report

Nucleotide Sequence (834 letters)

Query ID 1dl17457 Database Name nr


Description None Description Nudeotide collection (nt)
Molecule type nudeic acid Program BLASTN 2.2.27+
Query Length 834

Graph ic Summary

Distribution of 100 Blast Hits on the Query Sequence

Color key for alignment scores


<40 40:00
d'i
'
l:
-
: ..

I I I
150 300 450 600 750

==--=-=-=-
====-- -----

II . . ' ., II 1 1

-
Descrigtions
Legend for links to other resources: [!] UniGene 13 GEO [!3 Gene El Structure IZJ Map Viewer fl PubChem BioAssay

Accession Description Max Total Query Max Links


score score coverage value ident
Leptospira lnterrcgans serovar L.ai str. IPAV chromosome
gi!3534562
77ICP001221.1 1, complete sequence 1548 1548 97% 0.0 99%
Leptospira interrogans serovar L.ai str. 56601
gii2933853961AE010300.2 chromosome I, complele 10e<uence 1548 97% 0.0 99%
Leptospira interrcgansserovar lai hemolysis-associated
gii2351762IU89708.1 protein-1 (hap-1) and hemolytic protein (sphH) genes, 1548 1548 97% 0.0 99%
complete cds
Leptospira lnterrogans serovar Hardjo hemolysis-
gii2890657491GU592525.1 associated protein I (hapl) gene, complete cds 1546 1546 97% 0.0 99%

Leptospira interrcgans serovar hardjo outer membrane


gii37813208IAY442332.1 lipoprotein (lipl..32) gene, complete ods 1546 1546 97% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar lcterohaemorrhagiae
gi127031351GU183106.1 strain RGAhemolysis associated protein I (hap!) gene, 1544 97% 0.0 99%
complete cds
Leptospira interrogans serovar autumnalis hemolysin-
gii164171431AF366366.1 1542 1542 97% 0.0 99%
associated protein 1 (hap1) gene, complete cds
Leptospira interrcgans serovar Coperhageni str. Fiocruz
gi!45602555IAE016823.1 L1-130, c:Vomosome I, complete sequence 1542 1542 97% 0.0 99%
Leptospira interrogans strain UPM-R37 major outer
qi11947400271EU871720.1 membrane protein (lipl..32) gtlne, complete cds JMQ 1540 97% 0.0 99%
Leptospira interrcgans strain UPM-P5 major outer
gi!1947400251EU871719.1 membrane protein (lipl.32) gene, complete cds 1540 1540 97% 0.0 99%
Leptospira interrogans serovar Wolffi major outer
g!!485263191AY609332.1 membrane protein (lipl32) gene, complete cds 1540 1540 97% 0.0 99%
Leptospira interrcgans serovar Grippotyphosa iTiajor outer
gi148526309IAY609327.1 membrane protein (lipl32) gene, complete cds 1540 1540 97% 0.0 99%
Leptospira interrogans serovar Austr:alls major outer
gii48526305IAY609325:1 membrane protein (lipl32) gene, complete cds 1540 1540 97% 0.0 99%
i terrogans serovar Attlrnnalis major outer
Leptospira n
gii485263031AY609324.1 membrane protein (lipl32) gene, complete cds 1540 1540 97% 0.0 99%
Leptospira lnte.rrcgans serovar canlcola major outer
gi!48526297IAY609321.1 membrane protein (lipl32) gene, complete cds 1540 1540 97% 0.0 99%
Leptospira interrcgans putatiVe flpoprotein Upl32 (hap1)
i175282VIAF245281.
g 1 gene, complete cds 1540 97% 0.0 99%
Leptospira lnterrcgans serovar Paid]an major outer
aii485263131AY609329.1 membrane protein (Upl32) gene, complete cds
1534 1534 97% 0.0 99%
Leptospira lnterrcgans serovar Hebdomadis major outer
gi1485263111AY609328.1 membrane protein (lipl32) gene, complete cds 1534 97% 0.0 99%

Leptospira interrcgans strain L.ai major outer membrane


gi!456451711AY568679.1 protein (lipL32) gene, complete cds 1534 1534 97% 0.0 99%

97%
Leptospira fnterrcgans serovar Grippotyphosa hemolysis-
gll289065747
iGU592524.1 associated protein l (hapI) gene, complete cds 1m 1529 0.0 99%

Leptospira interrcgans serovar Pomona major outer


qii1 947400191EU871716.1 membrane protein (ftpl32) gene, complete cds 1529 1529 97% 0.0 99%

Leptospira noguchii serovar Pomona major outer


gi148526307IAY609326.1 membrane protein (lipl32) gene, complete cds 1529 1529 97% 0.0 99%
Leptospira lnterrogans serovar canicola strain RTCC
qi13583572571JN831363.1 2805.outer membrane proieln Qipl32) gene, complete cds 1 523 1523 97% 0.0 99%
Leptospira borgpeterserll serovar Mirl major outer
1523 1523 99%
gii485263211AY609333.1 membrane protein (lipl32) gene, complete cds 97% 0.0

Leptospira lnterrogans serovar canicola lipl32 gene for .


qii335891931AJ580493.1 outer membrane protein
1523 1523 97% 0.0 99%
Leptospira lnterrcgans serovar Hebdomadis hemolysis-
ali2890657451GU59 associated protein I (hapI) gene, complete cds 1517 1517 97% 0.0 99%
Leptospira lnterrogans serovar Mini hemolysis-associated
qii28906574IGU592522.1 protein I (hapl) gene, complete cd s 1517 1517 97% 0.0 99%

1 ## II 1 . .. ,. 'I J lr\1 1 " / n l,.. n 1 "

.
.
Leprospira interrogans strain 56601 Upl32 (llpl32) gene,
gi!426281541AY461908.1 partial c:ds 1515 1515 95% 0.0 99%

leptospira interrogans strain HardjoprajKno Upl32


gii42628148!AY
4 61905.1 (lipl32) gene, partial c:ds 1515 1515 95% 0.0 99%

Ulprospira interrogans serovar Pyrogenes major outer


gi!485263011AY609323.1 membrane protein {lipl32) gene, complete cds ill.1 1511 97% 0.0 99%

Leptospira interrogans strain RGA Upl32 (llpl.32) gene,


g
i!
4262815
6!AY
461909.1
partial c:ds 1509 95% 0.0 99%

Leprospira interrogans strain L1-130 Lipl32 (lipl32) gene,


qi!42628.1521AY461907 1 partial c:ds 1509 95% 0.0 99%

Leprospira interrogans strain Akiyami Upl32 Olpl32)


qi!426281421AY461902.1
gene, par'Jal cds 1 508
95% 0.0 99%
Leptospira interrogans serovar Csnicola lmmunodominant
qlj295641 0561HM026175.1 outer membrane protein Upl32 (lipl32) gene, complete
jQ 1506 97% 0.0 99%
c:ds
Leptospira interrogans serovar Autumnalis hemolysis-
gii289065751(GU592526.1
associated protein I (hapl) gene, complete c:ds 1.2 1506 97% 0.0 99%

leptospira interrogans serovar Grippotyphosa strain


Moskva V major outer membrane protein (llpL32) gene,
g
jl147
0031j;U871 723.1 complete c:ds >gii378942580igbiJN886738.1 1 Leptospira
1Q 1506 97% 0.0 99%
interrogans serovar Grippotyphosa strain RTCC2808
Upl32 (lip132) gene, complete c:ds
Leprospira interrogans serovar Hardjo strain RTCC2821
q!j378942582
1JN886739.1
Upl32 (lipl32) gene, partial eels l.!M 1504 96% 0.0 99%

Leptospira interrogans strain Kremastos Upl32 (lipl32)


gi:428281501AY461906.1
gene, partial c:ds 1504 1504 95% 0.0 99%
Leptospira kirschneri major outer membrane protein
qil7330696jAF121192.1 (lipl32) gene, complete c:ds; and unknown gene w.z 1502 97% 0.0 99%

Leptospira lnterrogans strain Pomona RZ11 Upl32


glj42628158!AY461910.1
(lipl32} gene, partial c:ds 1498 1498 95% 0.0 99%
Leprospira interrogans strain Hond Utrecht Lipl32 (lipL32)
gij42628146IAY461904.1
gene, partial cds 1498 1498 95% 0.0 99%
Leptospira lnterrogans sirain RZ11 Upl32 gene, partial
qii7313074 1AF181553.1 c:ds 498 95% 0.0 99%

Leptospira interrogans isolate F7 major outer membrane


aH3B67784711Jao1351a.1
lipoprotein Upl32 (lipL3:2) gene, partial cds .J.j@ 1496 94% 0.0 99%
Leptospira interrogans strair. Jez-Bratislava Lipl32
g!I426281401AY461901.1 (lipl32) gene, partial cds .lli.1 1494 94% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar Balico major outer


gl138677847SjJQ013520.1
membrane lipoprotein Upl32 (lipl32) gene, partial cda .1m 1492 94% 0.0 99%

Leptospira kirscmeri strain 5621 UpL32 (lipl32) gene,


gji426281721AY46191 7.1 partial c:ds lla 1486 95% 0.0 99%
Leptospira lnterrogans serovar Manilae major outer
gU38677847J!JQ013519.1
membrane Upoprotein LipL32 Oipl32) gene, partial c:ds 1485 94% 0.0 99%
Leptospira interrogans serovar Hebdomadis Upl32
(llpl32) gene, partial cds
gii283105175IGU220823. 1 1485 95% 0.0 99%

Leptospira lnterrogans strain UPM-ND major outer


qll194740023jEU871 718.1 membrane protein (fipl32) gene, complete cds 1485 97% 0.0 99%

Leprospira interrogans serovar Jalna strain SSK1


g!j289065755jGU592528.1 hemolysissociated protein I (hap!) gene, complete c:ds 1483 97% 0.0 99%

Leprospira interrogans servvar Jalna strain MP1


qlj289065753jGU592527.1
hemolysis-associated protein I (hapl} gene, complete c:ds 1483 1483 97% 0.0 99%
Leptospira kirsclvleri strain HS26 Upl32 (lipL32} gene,
i!
i4
l 26281
641Y4
A 61913.1 partial c:ds 1481 95% 0.0 99%

Leprospira kirschneri strain ErinaceusAuritus 670 Upl32


qi1426281621AY461912.1 (lipL32} gene, partial c:ds liD 1481 95% 0.0 99%

Leptospira interrogans strain Van Tienen Upl32 (lipl32)


qi1426281441
AY461903.1 gene, partial c:ds 1481 1 481 93% 0.0 99%
Leptospira kirschneri strain Musa Upl32 (lipL32) gene,
gH42628160jAY461911.1
partial cds .1ill 1479 95% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar Pyrogenes strain MVC


qi1300250762IHM449749.1
hemolysis-associated protein (hap!) gene, complete cds 1ill 1477 97% 0.0 98%

Leptospira lnterrogans sef'ovar Autumnafis strain N2


.alj170280306iEU526391.1 outermembrane lipoprotein UpL32 gene, partial cds .1ill 1475 93% 0.0 99%

11 " II 1
BLAST

Basic Local Alignment Search Tool


NCBII BLAST/ blastr1 s
yitel Formatting Results - C6CNTJ9Z01R
go
Formattin ptions
Download
View these results in the new enhanced report Le
arn about the enhanced re
port

Nucleotide Sequence (837 letters)

Query ID lcll5149 O"tiilbaH Name nr


DeScription None Description Nudeotide collection (nt)
Molecule type nudeic acid Program E3l.ASTN 2.2.27+
Query Length 837

G raphic Summary

Distribution of 100 Blast Hits on the Query Sequence

Color key for alignment scores


-- " <40 . - 40-60 _: ,. =
Qu ..ry
I I I
1 150 300 450 600 750

------
----
-------
-
----
-= ==
----- =
- =====--
==
-=--
==--
--=
=
-
----
= -=
- - ---
= -=
-----
=-=-
- = =
----
-
=
--=
- =
- =
-- =
- ---- ------- - ----------
------- ==

1 II 1 1 '1 , 1 ' fr\ 1

. . .
Descritions
Legend for links to other resources: [!] UniGene 13 GEO m Gene E1 Structure Ill) Map Viewer fj PubChem BioAssay

Accession Description Max Total Query 5 Max Links


score score coverage value ident
Leptospira interrogans serovar L.ai str. IPAV chromosome
gl!353456277!CP001 221.1 1, complete sequence 1554 1554 96% 0.0 100%

Leptospira interrogans serovar L.al str. 56601


gi12933853961AE010 300.2 chromosome I, complete sequence 1554 1554 96% 0.0 100%

Leptospira interrogans serovar tai hemolysis-associated


gl!2351762JU89708.1 protein-1 (hap-1) and hemolytic protein {sphH) genes, 1554 1554 96% 0.0 100%
complete cds
Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz
gl!456025551AE016823.1 L1-130, chromosome I, complete sequence 1548 1548 96% 0.0 99%

Leptospira interrogans strain RZ11 UpL32 gene, partial


gi!73307411AF181553.1 cds .121.1 1511 94% 0.0 99%

Leptospira kirschneri major outer membrane protein


gi!7330696JAF121192.1 (lipL32) gene, complete cds; and unknown gene 1508 1508 96% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar autumnalis hemolysin-


gi11 64171431Af366366.1 associated proteln 1 (hap1) gene, complete cds 1498 1498 93% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar Hardjo hemolysis-


gi!289065749
JGU592525.1 associated protein I (hap!) gene, complete cds 1492 1492 92% 0.0 100%

Leptospira interrogans serovar lcterohaemorrhagiae


.9i!l[03135341GU183106.1 strain RGA hemolysis associated protein I (hap!) gene, 1492 1492 92% 0.0 100%
complete cds
Leptospira interrogans strain 56601 UpL32 (lipL32) gene,
qi!4262B11i41AY461908.1 . 1492 1492 92% 0.0 100%
partial cds
Leptospira interrogans serovar hardjo outer membrane
gii37&1 3?081AY442332.1 lipoprotein (lipL32) gene, complete cds 1492 1492 92% 0.0 100%

Leptospira interrogans strain Hardjoprajitno Up!-32


(lipL32) gene, partial cds
gi!42628148JAY461905.1 1488 1488 92% 0.0 100%

Leptospira interrogans strain UPM-R37 major outer


qli194740027!EU871720.1 1486 1486 92% 0.0 99""'
membrane protein (lipL32) gene, complete cds
Leplt>spira interrogans strain UPM-P5 major outer
gii1947400251EU871719.1 1486 1486 92% 0.0 99%
membrane protein (lipL32) gene, complete cds
Leptospira interrogans serovar Wolffi major outer
membrane protein (lipl32) gne. complete cds
qii485263191AY609332.1 1486 1486 92% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa major outer


gjl48526309iAY609327.1 membrane protein (llp132) gene, complete cds 1486 1486 92% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar Austrafis major outer


membrane protein (lipl32) QBne, complete cds
g!4 AY609325.1
i 8526305J 1486 1486 92% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovarAlltumnalis major outer


gll48526303lAY609324.1 membrane protein (lipl32) gene, complete cds 1486 1486 92% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar Canicola major outer


gi14&526297A 1486 1486 92% 0.0 99%
1 Y609321.1 membrane protein (lipl32) gene, complete cds
Leptospira interrogans strain RGA LipL32 (lipL32) gene,
gii42628156IAY461909.1 1486 1486 92% 0.0 99%
partial cds
Leptospira interrogans strain L1-130 UpL32 (lipL32) gene,
gi!426281521AY461907.1 partial cds 1486 1486 92% 0.0 99%

Leptospira interrogans strain Lai major outer membrane


qii45645171IAY568679.1 1486 1486 92% 0.0 99%
protein (lipL32) gene, complete cds
Leptospira interrogans putative lipoprotein UpL32 (hap1)
gi175282UIAF245281.1 gene, complete cds 1. 1486 92% 0.0 99%

Leptospira interrogans strain Van Tlenen UpL32 (lipL32)


gti426281441AY461903.1 1483 1483 92% 0.0 99%
gene, partial cds
Leptospira interrogans strain Akiyami LipL32 OipL32)
gll42628142lAY461902.1 1483 1483 92% 0.0 99%
gene, partial cds
Leptospira lnterrogans serovar Paidjan major outer
gi!485263131AY609329.1 1481 1481 92% 0.0 99%
membrane protein (lipl32) gene, complete cds
Leptospira interrogans serovar Hebdomadis major outer
gi!485263111AY609328.1 1481 1481 92% 0.0 99%
membrane protein (fipl32) gene, complete cds

1 4 II ' . ., It 1 4 1 1 1"\ /fl / l"'t l'\ 1 "'

.
Leptospira noguchij serovar Pomona major outer
gi!48526307!AY609326.1 membrane protein (Upl32) gene, complete cds 1481 1481 92% 0.0 99%

Leptospira lnterrogans strain Kremastos Lipl32 (lipL32)


gi!42628150!AY461906.1 gene, partial cds 1477 1477 92% 0.0 99%

Leptospira interrogans strain Jez-Bratislava Lipt.32


92% 0.0 99%
gi!42628140!AY41901.1 (lipL32) gene, partial cds 1ill 1477

Leptospira interroga serovar Grippotyphosa hemolysis-


gii2890657471GU592524.1 associated protein I (hap!) gene, complete cds 1475 1475 92% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar Pomona major outer


gii194740019!EU871716.1 membrane protein (upL32) gene, complete cds 1475 1475 92% 0.0 99%

Leptospira borgpetersen!i serovar Mini major outer


0.0 99%
.

membrane protein (lipl32} gene, complete cds


gi!485263211AY609333.1 1475 1475 92%

Leptospira lnterrogans serovar AI:JtumnaHs strain N2


gi!170280306
!EU526391.1 outermembrane lipoprotein UpL32 gene, partial cds
1473 1473 91% 0.0 99%

Leptospira interrogans :;train Pomona RZ11 LipL32


.1..1 92% 0.0 99%
(lipL32) gene, partial cds
gil42628158JAY461910.1 1471

Leptospira interrogans strain Hand Utrecht UpL32 (lipt.32)


qi142628146JAY461904.1 gene, partial cds
1471 1471 92% 0.0 99%

Leptospira interrogens serovar Hardjo strain RTCC2821


qil378942582IJN886739.1 Lip!32 (fip!32) gene, partial cds 1469 1469 92% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar Canicola strain RTCC


gil358357257!JN831363.1 2805 outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds 1469
1469 92% 0.0 99%

Leptospira lnterrogans serovar Mlni hemolysis-assooiated


qli289065743!GU592522.1 protein I (hap!) gene, complete cds 1469 1469 92% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar canlcola lipL32 gene for


gil33589193IAJ580493.1 outer membrane protein .1!1 1469 92% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar Balico major outer


qi!386
7784751JQ013520.1 membranE! lipoprotein UpL32 (lipl32) gene, partial cds 1465 1465 91% 0.0 99%

Leptospira interrogans isolate F7 major outer membrane


gi!386778471!J0.013518.1 lipoprotein Llpl32 (lipL32) gene, partial cds 1. 1465 91% 0.0 99%

Leptospira interrogans serovar Hebdomadis hemolysis-


g1
i 289065745IGU592523.1 assooiated protein I (hapI) gene, complete cds 1463 1463 92% 0.0 99%

1463 1463 0.0 99%


Leptospira interrogans serovar Hebdomadis Upt.32
g1
i 283105175
1GU220823.1 (lipl32) gene, partial cds
92%

Leptospira kirschneri strain 5621 LipL32 (lipt.32) gene,


1460 1460 0.0 99%
gii426281721AY461917.1 partial cds 92%

Leptospira interroga serovar P)'l'ogenes major outer


gi 8526301J
14 AY609323.1 membrane protein (lip132) gene, complete cds 1458 1458 92% 0.0 99%

0.0 99%
Leptospira interrogans serovar Manilae major outer
gi13867784731JQ013519.1 membrane Upoprotein LipL32 (lipl32) gene, partial cds .1..1 1454 91%

Leptospira kirschneri strain LT1014 UpL32 (lipL32) gene,


1454 92% 0.0 99%
partial cds
g1i42
628166JAY461914.1 1454

Leptospira kirschneri strain HS26 UpL32 (lipL32} gene,


ai!42628164
! AY461913,1 partial cds
1454 1454 92% 0.0 99%

Leptospira ldrschneri strain Erinaceus Auritus 670 UpL32


0.0 99%
QipL32) gene, partial cds
qi!426281621AY461912.1 1454 1454 92%

Leptospira kirschneri strain Musa Upl32 (lipL32) gene,


qi!426281601AY461911.1 1454 1454 92% 0.0 99%
partial cds

Leptospira interrogans serovar Canioola immunodominant


g
ii 295641056
1HM026
1Z5.1 outer membrane protein Upl32 (lipl32) gene, complete
1.6 1452 92% 0.0 99"A.
cds
Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa strain
Moskva V major outer membrane protein (lipL32) gene,
gil1947400331EU871723.1 complete cds >gll378942580jgbiJN886738.11 Leptospira
.lill 1452 92% 0.0 99%
interrogans serovar Grippotyphosa strain RTCC2808
Lip!32 (lipl32) gene, complete cds

Leptospira kirschneri strain RM52 Upt.32 Qipt.32) gene,


qii42628168IAY461915.1 1448 1448 92% 0.0 99%
p<trtial cds

Leptospira noguchH strain Fort Bragg UpL32 gene, partial


gli73307471AF181556.1 1448 1448 94% 0.0 98%
cds

1446 92% 0.0 99%


Leptospira lnterrogans serovar Autumnalis hemolysis-
gi!2890657511GU592526.1 associated protein I (hapl) gene, complete cds
1446

Leptospira interroga serovar Aulumnalis strain N2


90% 0.0 99%
m<tjor outer membrane protein (lipL32} gene, partial cds
qii3546835561JN210551.1 1444 1444

t ' t n 1 4 1
MINISTRY OF NATIONAL EDUCATION
FACULTY OF MEDICINE GADJAH MADA UNIVERSITY
ICAL AND HEALTH RESEARCH ETHICS COMMITTEE (MHREC)

ETHICS COMMITTEE APPROVAL


Ref: KE/FK/ /EC

Title of the Research Protocol Pengembangan Prototipe Kit Diagnostik Leptospirosis


dengan Menggunakan Metode ELISA Berbasis pada
Protein Rekombinan LipL32

Documents Approved 1. Study Protocol


2. Information for Subjects I

3. Informed consent form ..J

4. Case report forms (CRF)


i
Principle Investigator Hevi Wihadmadyatami

Name of medically
Responsible Physician(s)

Date -of Approval 0 3 AUG 201Z


(Valid for one year beginning from the date of approval)
....
=.....'
Irfstitution(s)/place(s) of Laboratorium Biokimia FK Hewan UGM
research PAU Bioteknologi UGM
RSUP Dr Sardjito Yogyaka<ta
RSUP Dr Cipto Mangunkusumo Jakarta

The Medical and Health Research Ethics Committee (MHREC) states that the above protocol
meets the ethical principle outlined in the Declaration of Helsinki 2008 and therefore can be
carried out. -

The Medical and Health Research Ethics Committee (MHREC) has the right to monitor the
research activities at any time. The investigator(s) is/are obliged to submit final report upon the
completion of the study or a progress report in case a :;:ontinuing review is needed.

Prof.dr.Mohammad Hakimi, Sp.OG (K),Ph.D



d-
Dr. dr. Eti Nurwening Sholikhah, M.Kes
Chairman Secretary

.
PERJANJIAN KERJASAMA
ANTARA
BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
KEMENTERIAN KESEHATAN RI
;

DAN
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS GADJAH MADA
TENTANG
RISET PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN & TEKNOLOGI KEDOKTERAN
(RISBIN IPTEKDOK)

Nomor : HK.06 . 0 1 / 1 / 1693/20 12

Pada hari ini Kamis tanggal satu bulan Maret tahun dua ribu dua belas,
kami yang bertandatangan di bawah ini :

1 . dr. Trisa Wahyuni Putri, MKes :



Pejabat Pembuat Komitmen Badan Penelitian dan Pengembangan
Kesehatan Kementerian Kesehatan RI berkedudukan dan berkantor di
Jalan Percetakan Negara Nomor 29 Jakarta 10560, dalam hal ini
bertindak dalam jabatannya untuk dan atas nama Bdan Penelitian dan
Pengembangan Kesehatan, selanjutnya disebut PIHAK KESATU;

2. dr. Rr: Titi Savitri Prihatiningsih, MA, MMed.Ed, PhD :


Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada berdasarkan
surat pendelegasian dari Rektor Universitas Gadjah Mada nomor :
1235/P/FK/20 1 2 tanggal 22 Februari 2012 dalam hal ini bertindak
untuk dan atas nama Universitas Gadjah Mada, berkedudukan di Sekip
Yogyakarta, selanjutnya disebut PIHAK l<EDUA.

PIHAK KESATU dan PIHAK KEDUA selanjutnya bersama-sama disebut


PARA PIHAK, telah sepakat untuk mengadakan Peijanjian Keijasama antara
Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan dan Fakultas Kedokteran
Universitas Gadjah Mada dengan ketentuan dan syarat-syarat sebagai berikut:

PASAL 1
DASAR DAN TUJUAN

( 1 ) Perjanjian ini dibuat berdasarkan referensi yang merupakan bagian yang


tidak terpisahkan dari perjanjian 1m, yaitu

1
a. Undang-Undang Nomor 18 Tahun 2002 tentang Sistem Nasional
Penelitian, Pengembangan dan Penerapan Ilmu Pengetahuan dan
Teknologi (Lembaran Negara Republik Indonesia tahun 2002 Nomor
84, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 4219);
b. Undang-Undang Nomor 20 Tahun 2003 tentang Sistem Pendidikan
Nasional;
c. Undang undang Nomor 36 Tahun 2009 tentang Kesehatan (Lembaran
Negara Tahun 2009 Nomor 144, Tambahan .Lembaran Negara Nomor
5063;
d. Peraturan Pemerintah Nomor 39 Tahun 1995 tentang Penelitian dan
Pengembangan Kesehatan (Lembaran Negara Republik Indonesia
tahun 1995 Nomor 67, Tambahan Lembaran Negara Republik
Indonesia Nomor 3609;
e. Peraturan Pemerintah Nomor 6 1 Tahun 1999 tentang Penetapan
Perguruan Tinggi Sebagai Badan Hukum.
f. Peraturan Presiden RI Nomor 54 Tahun 2010 tentang Pengadaan
Barang/ Jasa Pemerintah;
g. Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 791/Menkes/SK/VII/1999
tentang Koordinasi Penyelenggaraan Penelitian dan Pengembangan
Kesehatan;
h. Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 1 144/MenkesfPerfVIII/2010
tentang Organisasi dan Tata Keija Kementerian Kesehatan RI;
1. Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Perigembangan Kesehatan
Nomor : HK.03.05j l / 1273/2012 tentang Penetapan Tim Pelaksana
Risbin Iptekdok Tahun 2012;

(2) Perjanjian ini bertujuan untuk memperbaiki dan membina


pembangunan iptekdok Indonesia dengan menggerakkan,
mendayagunakan, dan meningkatkan kemampuan ilmiah yang ada
untuk ikut serta memanfaatkan, mengembangkan, dan menguasai ilmu
pengetahuan dan teknologi yang diprioritaskan dalam bidang riset dan
teknologi serta pencapaian sasaran pembangunan bidang kesehatan.

PASAL 2
RUANG LINGKUP

Ruang lingkup perjanjian meliputi pelaksanaan kegiatan penelitian ,


pembiayaan, jangka waktu pelaksanaan, tata cara pembayaran, hak dan
kewajiban, pengadaan barangjjasa, laporan, hak atas kekayaan intelektual,
sanksi, keadaan memaksa, dan penyelesaian perse lisihan . f

2
PASAL 3
KEGIATAN PENELITIAN

( 1 ) Penelitian Riset Pembinaan llmu Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran


diarahkan untuk peningkatan kesehatan ibu, bayi dan balita, perbaikan
status gizi masyarakat, pengendalian penyakit menular serta penyakit
tidak menular, diikuti penyehatan lingkungan.

(2) Protokol penelitian yang dibiayai oleh PIHAK KESATU merupakan


protokol yang telah lulus dalam seleksi panel.

(3) Protokol penelitian sebagaimana dimaksud pada ayat (2) tercantum


dalam lampiran perjanjian ini dan merupakan bagian yang tidak
terpisahkan.

(4) Tim peneliti sebagaimana tercantum dalam lampiran peijanjian ini tidak
diperkenankan untuk diganti/ diubah tanpa persetujuan PIHAK
KESATU, dan merupakan bagian yang tidak terpisahkan dari perjanjian
ini.

(5) Penggantian dan atau perubahan tim peneliti sebagaimana dimaksud


pada ayat (4) harus diajukan secara tertulis dengan melampirkan
persetujuan tertulis dari ketua panel pakar dan amandemen etik.

PASAL 4
PEMBIAYAAN

( 1 ) Bantuan dana diberikan dalam bentuk swakelola.

(2) Biaya pelaksanaan kegiatan yang diberikan oleh PIHAK KESATU kepada
PIHAK KEDUA dengan rincian sebagaimana tercantum dalarn lampiran
perjanjian ini dan merupakan bagian yang tidak terpisahkan.

(3) Biaya pelaksanaan kegiatan penelitian sebagaimana dimaksud pada


ayat ( 1 ) sebesar Rp. 499.180.000,- (empat ratus sembilan puluh
sembilan juta seratus delapan puluh ribu rupiah) sudah termasuk PPh
dan PPN, yang dibebankan pada DIPA Sekretariat Badan Penelitian dan
Pengembangan Kesehatan Tahun 2012.

(4) Biaya sebagaimana dimaksud pada ayat (3) meliputi segala pengeluaran

f.
dalam pelaksanaan kegiatan penelitian termasuk pajak-pajak, materai
dan biaya-biaya lainnya harus dibayar oleh PIHAK KEDUA sesuai
dengan ketentuan yang berlaku.

3
(5) Peneliti sebagaimana tercantum dalam lampiran pe:rjanjian ini tidak
diperkenankan untuk mengajukan pembiayaan kepada pihak lain dalam
rangka penelitian yang sama.

(6) PIHAK KEDUA tidak diperkenankan untuk mengalihkan dan atau


memindahtangankan sebagian maupun seluruh kegiatan penelitian
sebagaimana te rcantum dalam lampiran peijanjian ini kepada pihak lain
tanpa persetujuan PIHAK KESATU.

PASAL 5
JANGKA WAKTU

( 1) Pelaksanaan kegiatan penelitian sebagaimana terse but dalam pe:rjanjian


ini dilakukan selama 10 (sepuluh) bulan kalender terhitung sejak
penandatanganan perjanjian ini .

. (2) Apabila pelaksanaan kegiatan penelitian ini tidak selesai dalam waktu
yang telah ditetapkan sebagaimana disebut pada ayat ( 1 } , maka sisa
dana dikembalikan ke Kas Negara.

PASAL
6
TATA CARA PEMBAYARAN

(1) Penyaluran dana oleh PIHAK KESATU kepada PIHAK KEDUA dilakukan
melalui transfer ke rekening resmi institusi PARA PIHAK yaitu:
Nama Rekening : UGM FKU Penunjang
Nomor Rekening : 179 40 2424
Bank : BNI '46
Cabang : Bulaksumur, UGM

(2) Tata cara pencairan dana -penelitian sesuai dengan ketentuan yang
berlaku dan Pedoman Administrasi Keuangan Risbin Iptekdok 2012.

(3) Penyaluran dana sebagaimana dimaksud pada ayat (1) tidak berlaku
untuk belanja sewa dan belanja bahan habis pakai yang mekanisme
pelaksanaannya melalni Panitia dan/atau Pejabat Pengadaan
Barang/ Jasa.

(4) Penyaluran dana sebagaimana dimaksud pada ayat (3) dilakukan


melalui rekening penyedia barangjjasa. I

lI
ll
{5) Penggunaan dana penelitian harus disetujuifdiketahui oleh PIHAK
KEDUA.

PASAL 7
HAK DAN KEWAJIBAN

( 1) PIHAK KESATU
a. Hak :
1) Memperoleh laporan akhir, abstrak dan hasil pelaksanaan
penelitian dari PIHAK KEDUA dalam bentuk hardcopy dan
softcopy;
2) Memperoleh raw data (data mentah) basil penelitian dari PIHAK
KEDUA;
3) Memperoleh semua dokumen asli yang berkaitan dengan
pertanggungjawaban keuangan dari PIHAK KEDUA selambat
lambatnya awal bulan Desember 2012.

b. Kewaj iban:
Melakukan pembayaran pelaksanaan kegiatan penelitian kepada
PIHAK KEDUA melafui rekening resmi institusi sesuai dengan usulan
yang telah diterima oleh PIHAK KESATU.

{2) PIHAK KEDUA


a.. Hak :
Menerima pembayaran atas pelaksanaan kegiatan penelitian dari
PIHAK KESATU sesuai dengan usulan yang telah diserahkan oleh
PIHAK KEDUA.
b. Kewajiban:
1) Melakukan pemantauan dan evaluasi intemal atas pelaksanaan
penelitian di institusinya dan bertanggung jawab penuh atas hasil
penelitian;
2) Menyampaikan laporan akhir penelitian dan abstrak kepada
PIHAK KESATU sesuai denganjangka waktu yang disepakati;
3) Menyerahkan raw data (data mentah) hasil penelitian kepada
PIHAK KESATU;
4) Menyimpan salinan/copy semua dokumen yang berhubungan
dengan pelaksanaan penelitian;
5) Menyelesaikanjmenyerahkan semua bentuk pertanggungjawaban
keuangan kepada PIHAK KESATU sesuai ketentuan yang berlaku .
f

5
PASAL 8
PENGADAAN BARANG/JASA

(1) Proses pengadaan barangjjasa dilaksanakan oleh Panitia danfatau


Pejabat Pengadaan Barang/Jasa yang ditunjuk oleh PIHAK KEDUA.

(2) Panitia danfatau Pejabat Pengadaan BarangjJasa sebagaimana


dirnaksud pada ayat (1) harus memiliki sertiflkat keahlian pengadaan
barangjjasa sesuai ketentuan yang berlaku .

PASAL 9
LAPORAN

( 1 ) PIHAK KEDUA wajib membuat dan menyampaikan laporan kemajuan


penelitian kepada PIHAK KESATU (minggu kedua bulan September 2012)
sebanyak 3 (tiga) rangkap.

(2) PIHAK KEDUA wajib membuat dart menyerahkan laporan akhir


penelitian kepada PIHAK KESATU selambat-lambatnya minggu ketiga
bulan Desember 2012 s.ebanyak 3 (tiga) rangkap.

(3) Penulisan Laporan Akhir harus mengikuti ketentuan dalam Buku


Panduan Penyusunan Laporan Akhir Penelitian Badan Litbangke s yang
diterbitkan oleh Komisi Ilmiah Penelitian Kesehatan Badan Litbangkes.

PASAL 10
KEPEMILIKAN HASIL PENELITIAN

Kepemilikan hasil penelitian yang dimaksud adalah:


(1) H ak Kelayakan Intelektual, teknologi tepat guna, temuan lainnya yang
diperolah sebagai hasil pelaksanaan kegiatan penelitian ini dan menjadi
milik bersama para pihak

(2) Dalam hal terjadi tuntutan dari pihak lain atas penggunaan suatu alat
atau teknologi tertentu akibat penelitian ini, PIHAK KEDUA dalam
rangka pekerjaan berdasarkan perjanjian ini akan membebaskan PIHAK
KESATU dari segala tuntutan hukum pihak lain tersebut.

PASAL 1 1
PERTUKARAN INFORMASI

( 1) PARA PIHAK sepakat untuk saling bertukar data dan inforrtlasi


mengenai hal-hal yang berhubungan dengan pelaksanaan Perjanjian ini
y
6

.'


-"i ..a
l w.. :
dan semata-mata hanya digunakan untuk kepentingan yang sesuai
dengan maksud dan tujuan Peijanjian Keijasama Penelitian ini.

(2) PARA PIHAK sepakat untuk menjaga kerahasiaan seluruh data dan
informasi sebagaimana dimaksud pada ayat (1) dan tidak akan
memberikan kepada pihak ketiga tanpa persetujuan tertulis dari PARA
PIHAK.

PASAL 12
SANKSI

(1) Bilamana PIHAK KEDUA dalam pelaksanaan kegiatan dan penggunaan


dana tidak sesuai dengan syarat dan ketentuan yang tercantum dalam
pezjanjian ini dan/ atau melanggar ketentuan Peraturan Perundangan
yang berlaku, PIHAK KESATU memberikan sanksi berupa peringatan
tertulis mulai peringatan pertama sampai dengan peringatan ketiga.

(2) Pemberian sanksi sebagaimana dimaksud pada ayat ( 1 ) dilakukan


apabila PIHAK KEDUA berdasarkan hasil evaluasi dan verifikasi terbukti
melakukan kekeliruan; baik dalam melaksanakan kegiatan maupun
pengelolaan keuangan yang dapat menimbulkan kerugian Negara.

(3) Apabila PIHAK KEDUA tidak mengindah,kan peringatan tertulis dari


PIHAK KESATU sebanyak 3 (tiga) kali sebagaimana dimaksud pada ayat
( 1 ) , maka PIHAK KESATU dapat memberlakukan sanksi kepada PIHAK
KEDUA berupa:
a. Menarik kembali danj atau menghentikan bantuan dana danjatau
meminta kembali bantuan dana yang telah disalurkan sesuai dengan
perjanjian ini;
b. Memasukkan PIHAK KEDUA ke dalam daftar sebagai lembaga yang
tidak memenuhi syarat sebagai penerima bantuan dana Risbin
Iptekdok.
c. Melaporkan PIHAK KEDUA kepada lembagaj instansi yang berwenang
untuk proses tindak lanjut.

PASAL 13
KEADAAN MEMAKSA (FORCE MAJEURE)

Keterlambatan pelaksanaanj penyelesaian pekerjaan yang diakibatkan oleh


keadaan memaksa (force majeure) dapat membebaskan PIHAK KEDUA dari
sanksijdenda sebagaimana tersebut dalam pasal 12 Perjanjian Keijasama
L
ini. f
( 1 ) Yang dimaksud keadaan memaksa (force majeure) adalah:

7
a. Bencana alam (gempa bumi, tanah longsor, banjir) dan keadaan
cuaca yang tidak memungkinkan pekeijaan dilaksanakan;
b. Adanya perang, huru-hara, pemberontakan, kekacauan, kebakaran
dan epidemi;
c. Kejadian lain diluar kekuasaanjkemampuan manusia dan kejadian
tersebut dapat dipahamijdisetujui oleh PIHAK KESATU.
(2) Apabila teijadi keadaan memaksa, maka PIHAK KEDUA harus
memberitahukan secara tertulis kepada PIH1\K KESATU selambat
lambatnya dalam waktu 14 (empat belas) hari sejak teijadinya keadaan
niemaksa disertai bukti yang sah, demikian pula ketika keadaan
memaksa berakhir.

(3) Atas pemberitahuan PIHAK KEDUA, maka PIHAK KESATU dapat


menyetujui atau menolak secara tertulis keadaan memaksa itu dalam
waktu 3 X 24 jam sejak terjadinya pemberitahuan keadaan memaksa
tersebut dari PIHAK KEDUA .

. (4) Jika dalam waktu 3 x 24 jam sejak diterimanya pemberitahuan PIHAK


KEDUA kepada PIHAK KESATU tentang keadaan memaksa tersebut
tidak ada jawaban dari 'PIHAK KESATU, maka PIHAK KESATU dianggap
menytujui akibat terj adinya keadaan memaksa tersebut.

PASAL 14
PENYELESAIAN PERSELISIHAN

(1) Apabila terjadi perselisihan antara PARA PIHAK, maka pada dasarnya
akan diselesaikan secara musyawarah.

(2) Apabila perselisihan sebagaimana dimaksud pada ayat ( 1) tidak dapat


diselesaikan dengan cara musyawarah, maka perselisihan tersebut akan
diselesaikan melalui Badan Arbitrase Nasional Indonesia atau akan
dibentuk Panitia Penyelesaian Perselisihan yang terdiri dari 3 (tiga)
orang, yaitu:
a. seorang wakil dari PIHAK KESATU;

b. seorang wakil dari PIHAK KED UA;


c. dan seorang wakil yang ditunjuk dan disetujui oleh PARA PIHAK.

(3) dimaksud
Apabila hasil keputusan terhadap perselisihan sebagaimana
pada ayat (2) tidak diterima oleh PARA PIHAK, maka p enyelesaian

f
masalah tersebut akan diselesaikan secara hukum dengan domisili
hukum di Pengadilan Negeri Jakarta Pusat.

8
PASAL 1 5
PENUTUP

(1) Apabila terdapat perubahan dalam perjanjian uu akan dilakukan


perubahan (addendum) atas kesepakatan PARA PIHAK.

(2) Ketentuan lain yang belum tercantum dalam pe.Ijanjian ini akan
ditetapkan kemudian, dan merupa.kan bagian yang tidak terpisahkan
dari perjanjian ini.
\

(3) Perjanjian ini ditandatangani oleh PARA PIHAK, dibuat dalam rangkap 3
(tiga) dan bermaterai cukup serta mempunyai kekuatan hukum yang
sam a.

PIHAK KESATU, PIHAK KEDUA,


Badan Penelitian dan Fakultas Kedokteran
Pengembangan Kesehatan

dr. Rr. Titi Savitri P, MA, MMed.Ed, PhD


NIP. 196607051997022001

Mengetahui,

------.-- ------ ------------


Lampiran Perjanjian Keija Sama
Nomor : HK.06.01/l/1693/2012

Tanggal : 1 Maret 2012

Anggaran
No Peneliti Judul Penelitian
(Rp.)
1. Hevi Pengembangan prototipt kit diagnosis 1 50.000,000
Wihadmadyatami, Leptospirosis dengan menggunakan
drh, MSc metode ELISA berbasis pada protein
rekombinan LipL32

2. Narendra Yoga Pengembangan multiplex dipstik untuk 1 50.000,000


Hendarta, ST, deteksi dini HIV- 1 dan HBV berbasis
M.Biotech kombinasi Multiplex Reverse Transcript
Loop Mediated Isothermal Amplification
(mRT-LAMP} dan Lateral Flow Distick
(LFD)

3.' Retno Pengembangan senyawa derivat kalkon 75.000.000


Arianingrum, Dra, sebagai agen ko-kemoterapi bertarget
M.Si molekuler spesifik pada kanker payudara

4. Shanti Listyawati, Potensi Ekstrak Etanol Temu Kunci 124. 180.000


S.Si, M.Si (Boesenbergia pandurata) sebagai Agen
Kemoprovensi Kanker Kulit Terinduksi
UV-8

10
UNIVERSITAS GADJAH MADA
Bulaksumur, Yogyakarta 55281, Telp. (0274) 588688, Fax. (0274) 565223
. Website : www.uqm.ac.ld. E-mail : setre!!ugm.ac.ld

SURAT KUASA
Nomor : /fP/FK/20 12
.

Saya yang bertanda tangan dibawah ini :

Nama : Prof. lr. Sudjarwad i, M.Eng., Ph.D.


NIP : 1 94703 1 3 197603 I 001
Pangkat I Golongan : Pembina Utama Madya, Gol. IVId.
Jabatan : Rektor Universitas Gadjah Mada

Memberikan kuasa kepad :

Nama : dr. Rr. Titi Savitri Prihatiningsih, MA, M.Med.Ed., Ph.D.


NIP : 19660705 199702 2 00 I
Pangkat I GoIongan : Penata Tk. I., Go!. IIUd.
Jabatan : Dekan Fakultas Kedokteran UGM.

Untuk :
I. Bertindak dalam jabatannya untuk dan atas nama Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah
Mada, menandatangani Kontrak I Surat Perjanj ian Pelaksanaan Penelitian (SP3) Risbin
Iptekdok 2012 dengan Badan Litbang Kesehatan.
2.. Bertanggungjawab atas pelaksanaan penel itian Risbin lptekdok 20 1 2 sesuai dengan SP3.

Demikian Surat Kuasa ini dibuat untukdigu nakan sebagaimana mestinya.

Yogyakarta,

Penerima Kuasa Pemberi Kuasa

..

dr. Rr. Titi Savitri Prihatiningsih, MA, M. -Ed., Ph.D. i, M.Eng., Ph.D.
NIP 1 9660705 1 99702 2 00 I 13 1 97603 I 001 /1tL,.