La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o cidos nucleicos) sobre la

base de su tamao molecular y carga elctrica. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga
elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan con sustancias
como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso
molecular. Para la separacin se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una
malla). Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir
pasando por la malla, por la que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms
pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida.

Bsicamente, la electroforesis se define como un transporte bajo la accin de un campo elctrico. El

parmetro que determina el comportamiento de una molcula bajo la accin de un campo elctrico se
denomina movilidad electrofortica (U) y se define como la velocidad de migracin por unidad de
campo elctrico.

No existe una relacin clara entre dicha movilidad electrofortica y el resto de parmetros
moleculares, aunque se sabe que depende de forma bastante compleja de la carga, la forma y el
tamao de las molculas; esto es debido a que, por ejemplo, la carga de las molculas depende del
medio (pH y fuerza inica) y, adems, en disolucin las molculas estn rodeadas de un conjunto de
iones que forman una esfera de solvatacin, de tal forma que bajo la accin de un campo elctrico se
desplaza todo el conjunto, aunque la esfera de solvatacin hacia el polo opuesto que la molcula.

Existen dos modalidades de electroforesis:

Electroforesis libre. El campo elctrico se aplica a disoluciones o suspensiones (figura 1).

Histricamente, es el origen de la electroforesis tal y como hoy la conocemos y fue desarrollada
por Arne Tiselius en 1937. Actualmente est en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que
se desarrolla, tiene poco poder de resolucin.

Fig. 1. Las molculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no bien separadas por tratarse de una
disolucin.

Electroforesis en zona. Es una de las tcnicas ms utilizadas en bioqumica y biologa

molecular por su elevada resolucin. El campo elctrico se aplica a un medio o soporte
 estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo
(figura 2).

Fig. 2. Electroforesis de zona sobre un soporte.

Equipamiento electrofortico.

Para llevar a cabo una separacin electrofortica zonal se necesitan los elementos mostrados en la
figura 3:

Fuente de alimentacin. Proporciona el campo elctrico mediante dos electrodos, uno positivo
(nodo) y otro negativo (ctodo) entre los que se establece una diferencia de potencial.
Cubeta. Recipiente en cuyos extremos se sitan los electrodos.

Soporte electrofortico.

Fig. 3. Equipo electrofortico. La cubeta tiene en sus extremos los reservorios para el tampn de
electroforesis. En el centro se aloja el soporte (gel) con la muestra aplicada en su zona central.

El elemento fundamental es el soporte. Aunque todas las electroforesis responden a un mismo

principio, las de zona pueden ser de distintos tipos en funcin del soporte que se utilice. En todos los
casos, la muestra se dispone inicialmente en una pequea zona del soporte, y posteriormente lo va
recorriendo impulsado por el campo elctrico.

Para que esta situacin sea estable, tanto al comienzo como a lo largo del proceso de separacin, es
necesario contrarrestar el efecto de la difusin y las posibles corrientes de conveccin. Para ello se
utilizan reticulados moleculares (el soporte de la electroforesis), que forman un entramado
tridimensional que impide o reduce dicha difusin y permite la entrada de agua en sus poros; el
tamao de estos poros debe permitir el paso de molculas voluminosas como son los cidos nucleicos
y las protenas. Adems, el soporte debe ser inerte, es decir, no debe tener cargas que interfieran con
la migracin de las molculas de la muestra.

Los diferentes tipos de soportes se clasifican en dos grupos:

Soportes No Restrictivos Tipo I. El Tamao de poro no opone impedimento al paso de las

molculas. El agar es el ejemplo ms representativo y se obtiene a partir de algas marinas y esta
formado por dos tipos de polisacridos: la agarosa y la agaropectina; sta ltima posee varios
grupos cargados (grupos carboxilo y sulfato), lo que la hacen inadecuada como soporte
electrofortico por el efecto electroendosmtico que produce. La agarosa (figura 4) se utiliza
ampliamente sobre todo para la separacin de cidos nucleicos y para el anlisis de protenas.
Los diferentes tipos de agarosas se caracterizan por su punto de fusin (entre 35-95C), su
resistencia fsica y el grado de electroendsmosis.

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Fig. 4. Estructura qumica de la agarosa, polisacrido lineal formado por la repeticin de la estructura bsica
(agarobiosa), con un peso molecular medio de 120kDa (que corresponde a unas 400 unidades). Las
caractersticas de la agarosa se ven modificadas dependiendo de la naturaleza de los diferentes radicales R.

La agarosa en polvo se aade sobre el tampn de electroforesis y se calienta a unos 100C para
que se disuelva; la mezcla caliente se deposita sobre un molde colocado sobre un cristal (figura
5). La disolucin gelifica al enfriarse, momento en el cual puede retirarse el molde. Las
dimensiones y el grosor del soporte corresponden, por tanto, a las del molde y la cantidad de
disolucin de agar utilizada. Las propiedades del gel de agar se modulan a voluntad variando la
cantidad de agar, y as el tamao de poro, que suele ser lo ms crtico, depende de la
concentracin de agar empleada en la disolucin y nunca se conoce con exactitud, ya que
durante el proceso de preparacin del gel hay prdidas de agua.
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Fig. 5. Preparacin de un gel de agarosa.

1 El molde de plstico se adhiere a una placa de vidrio utilizando grasa.
2 La disolucin de agarosa caliente se deposita sobre el cristal.
3 Una vez gelificada la agarosa, se retira el molde, quedando el gel preparado para la electroforesis.
Soportes Restrictivos Tipo II. El tamao de poro opone resistencia al paso de las molculas.
El ejemplo caracterstico son los geles de poliacrilamida, que no slo evitan la conveccin y
minimizan la difusin, sino que adems participan en el proceso de separacin. Estos geles son
medios porosos en los que el tamao de poro es similar al de las protenas, de tal modo que
existe un efecto de tamizado molecular y la separacin electrofortica depende de la densidad de
carga de las molculas y de su tamao.

Factores que afectan a la electroforesis.

El resultado de una electroforesis depende de numerosos factores y es necesario conocerlos para

lograr la mxima resolucin.

Campo Elctrico. Es un gradiente de potencial que posibilita que haya electroforesis. A su vez,
depende de diferentes parmetros:
- Diferencia de potencial (V). Se mide en voltios y es lo que define el campo elctrico. Cuanto
mayor sea, mayor ser la velocidad de migracin. Las electroforesis se consideran de bajo
voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la mayora) y de alto voltaje si se realizan entre
500-10.000 voltios.
- Intensidad (I). Se mide en amperios y cuantifica el flujo de carga elctrica. Esta relacionada
con la diferencia de potencial por la Ley de Ohm:

y para una diferencia de potencial dada, su valor (normalmente entre 5-50mA) viene
determinado por la resistencia del soporte, por lo que, en ltima instancia, da cuenta de la
distancia recorrida por las molculas.
- Resistencia (R). Se mide en ohmios y cuanto mayor sea la resistencia del soporte, menor
ser la movilidad electrofortica (ya que la intensidad ha de ser menor para que se cumpla la
Ley de Ohm). Depende de la naturaleza del soporte, sus dimensiones (anchura, longitud y
seccin) y de la concentracin del tampn de electroforesis.
- Temperatura. Por el efecto Joule, el paso de una corriente elctrica produce calor, y este efecto
ser tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia de potencial y la resistencia del sistema.
Debe controlarse de forma estricta, puesto que puede afectar a la muestra
(desnaturalizndola), al soporte e incluso al equipo electrofortico. Todo esto justifica, por s
solo, la necesidad de un sistema de refrigeracin en las cubetas de electroforesis.
Muestra. La movilidad electrofortica de una molcula es tanto mayor cuanto mayor sea su
carga y disminuye segn aumenta su tamao, ya que mayor es la friccin de la molcula con el
medio y menor es su carga por unidad de superficie. Por esta razn, las molculas globulares se
mueven con mayor facilidad que las elongadas, ya que la esfera presenta la mnima superficie a
igualdad de volumen. As, molculas del mismo tamao y carga, pero de diferente forma, pueden
tener una movilidad electrofortica diferente y ser, por tanto, separables mediante una
electroforesis.
Tampn. Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por accin del campo
elctrico, lo cual genera protones en la proximidad del nodo e iones hidroxilo en el ctodo. El
tampn es, por esta razn, esencial durante la electroforesis para evitar que el nodo se
acidifique y el ctodo se haga ms bsico, pero no debe afectar a las molculas a separar.

Adems, la fuerza inica condiciona la movilidad electrofortica de las substancias a separar, ya

 que influye en su esfera de solvatacin y en la conductividad de todo el sistema, por lo tanto, es
necesaria una fuerza inica suficiente para mantener el pH y la conductividad durante todo el
proceso, pero no muy elevada, ya que llegara a interferir en el sistema.

Normalmente, se emplean tampones con fuerzas inicas moderadas (0.05-0.10M), siendo el pH

la caracterstica que debe ser ms controlada, puesto que determina la carga de la muestra.

Conviene sealar tambin que atendiendo a la distribucin del tampn, los sistemas se clasifican
en continuos cuando se emplea un nico tampn en el proceso, y discontinuos cuando se
emplean, al menos, dos tampones de pH y composicin diferentes.
Soporte. La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se presenten una serie
de fenmenos de elevada trascendencia para el resultado del proceso:
- Adsorcin. Es una retencin inespecfica de las molculas de la muestra sobre el soporte, por
lo que afecta negativamente a la resolucin, ensanchando las bandas de migracin.
- Electroendsmosis (EEO). Es un fenmeno que se da en algunos soportes (sobre todo en los
no restrictivos de tipo I), en los que aparecen cargas negativas, debidas a grupos carboxilo o
sulfato, al estar en contacto con una disolucin inica.

Al aplicar el campo elctrico, los iones y las molculas se desplazan segn su carga, pero en
su migracin se encuentran con un flujo de cationes desplazndose sobre la superficie del
soporte y otro de aniones hacindolo por el centro de los poros (figura 6). Este flujo orientado
se llama flujo electroendosmtico. El EEO va en contra de la resolucin de una electroforesis,
ya que las bandas de la muestra se ensanchan y se distorsionan; sin embargo, la EEO
contribuir a una mejor resolucin en las inmunoelectroforesis y en la electroforesis

Fig. 6. Efecto electroendosmtico en la superficie de un soporte cargado negativamente. Los aniones

migran desplazndose por el centro del poro, mientras que los cationes lo hacen por la superficie.

- Tamizado molecular. Es un efecto debido al mayor o menor reticulado de los soportes; cuanto
ms tupida sea la red de fibras, menores sern los poros. El movimiento de las molculas a
travs del soporte es ms o menos fcil en funcin de su tamao respecto al de los poros;
aquellas molculas cuyo tamao se aproxime al del poro, ver impedido su avance respecto a
aquellas cuyo tamao sea muy inferior. Por esta razn, el soporte acta como un cedazo que
separa o tamiza las molculas en funcin de su tamao.

INDICE DEL DOCUMENTO DE APLICACIN

Electroforesis de protenas.
 Inmunoelectroforesis.
Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)
- Preparacin del soporte.
- PAGE en condiciones no desnaturalizantes.
- PAGE en condiciones desnaturalizantes.
- PAGE-SDS.
Electroforesis bidimensional.
Electroenfoque.
Transferencia a membranas (Western Blot).
Electroforesis de cidos nucleicos.
Electroforesis en geles de agarosa.
Factores que afectan a la movilidad electrofortica del DNA.
Deteccin del DNA.
Electroforesis en geles de agarosa en condiciones desnaturalizantes.
Transferencia a membranas (Southern y Northern Blot).
Electroforesis en campos pulsantes (PFGE).