ANALISIS DENGAN SPEKTROFOTOMETER

I. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa dapat membuat kurva kalibrasi.
2. Mahasiswa mampu menganalisis sampel dengan mengggunakan alat
spektrofotometer.

II. Dasar Teori

Spektrofotometri adalah suatu metode analisis yang didasarkan pada pengukuran

serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang
yang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dan detector
vakum phototube atau tabung foton hampa. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer,
yaitu suatu alat yang digunakan untuk menentukan suatu senyawa secara kualitatif
maupun kuantitatif dengan mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu senyawa
sebagai fungsi konsentrasi. Spektrofotometri ini hanya terjadi bila terjadi perpindahan
elektron dari tingkat energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Pada
spektrofotometri ini yang digunakan sebagi sumber sinar/energi adalah cahaya tampak
(visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh
mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga
semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna
apapun. Selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar
tampak (Khopkar 2003).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu
tungsen. Tungsen yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia
dengan symbol W dan nomor atom 74. Tungsen mempunyai titik didih yang tertinggi
(3422 oC) dibanding logam lainnya, karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber
lampu. Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanyalah sample yang memiliki
warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh
karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dahulu dibuat
berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa
berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan
analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan
harus benar-benar stabil. Metode analisisnya didasarkan pada pengukuran serapan sinar
monokromatis oleh suatu laju larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik
(Setiono dan Dewi 2013).
Serapan dinyatakan dengan nilai intensitas absorbansi pada panjang gelombang
maksimal. Pengukuran konsentrasi cuplikan didasarkan pada hukum Lambert Beer, yang
menyatakan hubungan antara banyaknya sinar yang diserap sebanding dengan
konsentrasi unsur dalam cuplikan, dengan rumus sebagai berikut :
A = log I/Io atau A = a.b.c
dengan :
A = absorbansi
a = koefisien serapan molar
b = tebal media cuplikan yang dilewati sinar
c = konsentrasi unsur dalam larutan cuplikan
Io = intensitas sinar mula-mula
I = intensitas sinar yang diteruskan
Aplikasi rumusan tersebut dalam pengukuran kuantitaf dilaksanakan dengan cara
komparatif menggunakan kurva kalibrasi dari hubungan konsentrasi deret larutan standar
dengan nilai absorbansinya. Konsentrasi cuplikan ditentukan dengan substitusi nilai
absorban cuplikan ke dalam persamaan regresi dari kurva kalibrasi (Fatimah 2009).
Spektrofotometer UV berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri
UV berdasarkan interaksi sample dengan UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang
190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut
juga heavy hydrogen. Dia merupakan isotop hydrogen yang stabil yang terdapat
berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu
neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros yang berarti dua.
Mengacu pada intinya yang memiliki dua partikel. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi
oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan
senyawa yang tidak memliliki warna, bening dan transparan. Spektrofotometri UV
memang lebih simple dan mudah disbanding spektrofotometri visible, karena banyak
kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain analat yang juga menyerap pada
panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa
(Khopkar, 1990).
 Gambar 6.1. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotmeter UV- VIS,
spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible.
Menggunaka dua buah sumber cahaya berbeda. Sumber cahaya UV dan sumber cahaya
Visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan satu sumber sinar
sebagai sumber UV dan VIS, yaitu Photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk system spektrofotometri UV-VIS paling banyak tersedia dan paling populer
digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna
juga untuk sample tak berwarna (Khopkar, 1990).
Larutan blanko merupakan larutan yang tidak mengandung analat untuk dianalisis
(Basset, 1994). Larutan blanko digunakan sebagai kontrol dalam suatu percobaan sebagai
nilai 100% transmitans. Kurva standart merupakan standart dari sample tertentu yang
dapat digunakan sebagai pedoman atau acuan untuk sample tersebut pada percobaan.
Pembuatan kurva standart bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi
larutan dengan nilai absorbansinya, sehingga konsentrasi sample dapat diketahui.
Terdapat dua metode untuk membuat kurva standart yakni dengan metode grafik dan
metode least square (Underwood, 1990).
Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau
absorban suatu sample sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap
cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna
terbentuk. Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari empat bagian penting yaitu :

a. Sumber cahaya
Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki panacaran radiasi yang
stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah
tampak, ultraviolet dekat dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan
kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola
lampu pijar biasa. Daerah panjang gelombang (I) adalah 350-2200 nm.
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya
polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu
(monokromatis) yang berbeda (terdispersi).

c. Kuvet
Kuvet adalah alat yang digunakan sebagai tempat cuplikan yang akan dianalisis.
Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa, plexiglass, kaca, plastik dengan bentuk
tabung persegi empat, panjang 1x1 cm dan tinggi 5 cm. pada pengukuran di
 daerah UV dipakai kuvet kuarsa atau plexiglass, sedangkan kuvet dari kaca tidak
dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam kuvet dapat
dipakai untuk pengukuran di daerah sinar tampak (visible).

d. Detector
Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian
diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan
dalam bentuk angka-angka pada reader (komputer).
Terdapat beberapa jenis detector pada spektrofotometer :

Tabel Jenis
6.1. Jenis detector pada
detector spektrofotometer
range (nm) Sifat pengukuran Penggunaan
Phototube 150 1000 arus listrik UV
Photomultiplier 150 1000 arus listrik UV/Vis
Thermocouple 600 20.000 arus listrik IR
Thermistor 600 20.000 hambatan listrik IR

Secara sederhana instrument spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri

dari : sumber cahaya monokromator sel sampel detector read out (pembaca).

Gambar 6.2. Bagan optis instrumentasi UV-Visible

 Proses absorbsi cahaya pada spektrofotometri adalah ketika cahaya dengan berbagai
panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenahi suatu zat, maka cahaya dengan
panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap. Di dalam suatu molekul yang
memegang peran penting adalan elektron valensi dari setiap atom yang ada sehingga
terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat
berpindah (eksitasi), berputar (rotasi), dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.
Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahaan elektron dari
keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut
transisielektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka electron
yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar
(vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi
misalnya pada gelombang radio.
Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi larutan yang
ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada di dalam sel sampel disinari dengan cahaya
yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya mengenahi sample sebagian
akan diserap, sebgian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan. Pada
spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenahi
permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur
adalah It/Io atau Io/It (perbandingan cahaya dating dengan cahaya setelah melewati materi
(sampel).
Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut :

Gambar 6.3. Proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel

Pengenceran adalah menurunkan atau memperkecil konsentrasi larutan dengan

menambahkan pelarut pada proses pengenceran. volume dan molaritas berubah
sedangkan jumlah molarnya tetap, oleh karena itu berlaku rumus :
 V1 . M1 = V2 . M2

Keterangan :

M1 = Molaritas larutan sebelum pelarutan

V1 = Volume larutan seblum pelarutan
M2 = Molaritas larutan setelah pelarutan
V2 = volume larutan setelah pelarutan

Pengenceran yaitu suatu cara atau metode yang diterapkan pada suatu senyawa dengan
jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral. Larutan dipakai yaitu aquades dalam
jumlah tertentuan. penambahan pelarut dalam suatu senyawa dan berakibat menurunnya
kadar kepekatan atau tingkat konsentrasi dari senyawa yang di larutkan diencerkan.

Metode yang digunakan dalam analisis kuantitatif

a) Metode satu standar

Pengukurannya berdasarkan hokum Beer, namun standar yang dipaki hanya satu.
Jika tidak bias didapatkan suatu grafik yang lebih atau sesuai kelemahan system
ini. Jika standar salah maka hasil analisa yang dilakukan semua akan salah.
Rumus pada larutan standar , As = .b.Cs
Rumus pada larutan sampel, Ax = .b.Cx

Jadi, Cx = x Cs

Keterangan :
Cx = Konsentrasi sampel
As = Absorbansi larutan standar
Ax = Absorbansi sampel
Cs = Konsentrasi larutan standar

b) Metode kurva Kalibrasi

Metode kurva kalibrasi standar yaitu dengan membuat kurva antara konsentrasi
larutan standar (sebagai absis) lawan absorbansi (sebagai ordinat) di mana kurva
tersebut berupa garis lurus . Kemudian dengan cara menginterpolasikan
absorbansi larutan sampel Absorbansi
ke dalam kurva standar tersebut dan akan diperoleh
sampel
konsentrasi sampel.

Absorbansi
larutan Konsentrasi
standar sampel

Konsentrasi larutan

Gambar 6.4 Kurva Kalibrasi

 A = a + bC
Keterangan :
A = Absorbansi
a = Intersep
b = Slope
C = Konsentrasi

III. Alat dan Bhan

1. Alat
a) Beker gelas
b) Pipet ukur 1 ml
c) Pipet ukur 25 ml
d) Pipet ukur 10 ml
e) Ball filler
f) Labu takar
g) Spektrofotometer genesys 10 UV
h) Pipet tetes
i) Kuvet
2. Bahan
a) Sampel ( dari teknisi )
b) Larutan KMnO4 0,05M
c) Aquades
IV. Skema Kerja
1. Pengenceran larutan KMnO4

Larutan KMnO4 0,05 M Aquades 24,5 ml

diencerkan

Larutan KMnO4 10.10-4 M Aquades 5 ml

diencerkan

Larutan KMnO4 8.10-4 M Aquades 7 ml

diencerkan

Larutan KMnO4 5,76.10-4 M Aquades 10 ml

diencerkan

Larutan KMnO4 3,45.10-4 M Aquades 16 ml

diencerkan

Larutan KMnO4 1,25.10-4 M

Gambar 6.5. Skema kerja pengenceran larutan KmnO 4

2. Mengukur absorbansi untuk mencari panjang gelombang maksimum

Larutan baku KMnO4 10.10-4 M

Diukur absorbansinya pada 500-560 nm

Gambar 6.6. Skema kerja pengukuran absorbansi untuk mencari maksimum

Didapatkan hasil maksimum dari absorbansi tertinggi

Diukur absorbansinya pada 500-560 nm

 3. Pengukuran absorbansi larutan dan membuat kurva kalibrasi

Mengukur absorbansi masing masing larutan hasil

pengenceran pada maksimum (525 nm)

Diperoleh data absorbansi masing masing konsentrasi

Membuat kurva kalibrasi dari hasil pengukuran

konsentrasi dengan absorbansinya

Gambar 6.7. Skema kerja pengukuran absorbansi larutan

4. Pengukran absorbansi larutan sampel

Larutan sampel

Di ukur pada maksimum (525 nm)

Diperoleh nilai absorbansi

Gambar 6.8. Skema kerja pengukuran absorbansi larutan

V. Analisis data dan Pembahasan

 1. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 0,05 M = 25 ml . 10.10-4 M
V1 = 0,5 ml

2. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 10.10-4 M = 25 ml . 8.10-4 M
V1 = 20 ml

3. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 8.10-4 M = 25 ml . 5,76.10-4 M
V1 = 18 ml

4. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 5,76.10-4 M = 25 ml . 3,45.10-4 M
V1 = 15 ml

5. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 3,45.10-4 M = 25 ml . 1,25. 10-4 M
V1 = 9 ml

Tabel 6.1 Data Perhitungan Analisis

Kuvet Konsentrasi V1 M1 V2 M2
1 10.10-4 M 0,5 ml 0,05 M 25 ml 1.10-3 M
2 8.10-4 M 20 ml 10.10-4 M 25 ml 8.10-4 M
3 5,76.10-4 M 18 ml 8.10-4 M 25 ml 5,76.10-4 M
4 3,45.10-4 M 15 ml 5,76.10-4 M 25 ml 3,45.10-4 M
5 1,25.10-4 M 9 ml 3,45.10-4 M 25 ml 1,25.10-4 M

Tabel 6.3. Penentuan panjangan gelombang maksimal

No Panjang gelombang (nm) Absorbansi (A) Keterangan

1 500 0,715 -
2 505 0,820 -
 3 510 0,845 -
4 515 0,855 -
5 520 0,945 -
6 525 1,038 max
7 530 0,996 -
8 535 0,916 -
9 540 0,958 -
10 545 1,002 -
11 550 0,943 -
12 555 0,771 -
13 560 0,664 -

Tabel 6.4. Pengukuran absorbansi larutan dengan max = 525 nm

No Konsentrasi (M) Absorbansi (A)

1 0,0001 1,038
2 0,0008 0,828
3 0,000576 0,601
4 0,000345 0,361
5 0,000125 0,143
6 Sampel 1,139

Dari kurva kalibrasi larutan KMn04 dapat di buat berdasarkan data konsentrasi dan
absorbansi tersebut yakni sebagai berikut :
 Gambar 6.9. Kurva Kalibrasi

Berdasarkan persamaan kalibrasi yang telah didapatkan,maka dapat mengetahui nilai

absorbansi dari larutan sampel yang telah disediakan pada maksimum yaitu 525 nm,
didapatkan nilai absorbansi larutan sampel sebsar 1.139 A. Sehingga konsentrasi larutan
sampel dapat dihitung berdasarkan nilai absorbansinya melalui persamaan kurva
kalibrasi, dimana Y adalah nilai absorbansi .

Y = 1023,5 X + 0,0116

1,139 = 1023,5 X + 0,0116

1023,5 X = 1, 139 0,0116

1023,5 X = 1,1274

X = 1,1015 x 10-3

Jadi nilai konsentrasi larutan sampel tersebut adalah 1,1015 x 10 -3

VI. Kesimpulan dan Saran

Simpulan
 1. Persamaan kurva kalibrasi didapatkan berdasarkan hubungan antara konsentrasi
larutan dengan nilai absorbansinya.
2. Pengukuran konsentrasi sampel yang belum teridentifikasi dapat diketahui
dengan perhitungan menggunakan persamaan kurva kalibrasi.

Saran
1. Diperlukan ketelitian dalam melakukan pengenceran zat yang digunakan
(KMnO4) untuk mendapatkan kurva kalibrasi yang baik.
2. Diperlukan kecermatan dalam menggunakan atat-alat yang terbuat dari kaca,
terutama spektrofotometer.

DAFTAR PUSTAKA

Cairns,D. 2009. Intisari Kimia Farmasi. Edisi 2. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran
EGC.
Fatimah S.2009.Pengaruh uranium terhadap analisis menggunakan spektrofotometer UV-
VIS.[Seminar Nasional].Serpong(ID) BATAN
Khasana,nisa.N,Nia,prillizya,steephanny,dan desy.2015.Studi Aplikasi Metode
Spektrofotometri pada Penentuan Kandungan Logam Besi dalamSampel Air).Bandung.
jurnal analitik spektrofotometri UV-vis.
Khopkar. 1990. Konsep Dasar Analitik. Jakarta : UI Press.
Khopkar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta (ID): UI Press.
Setiono M dan Dewi avriliana. 2013. Penentuan jenis solven dan pH optimum pada
analisis senyawa delphinidin dalam kelopak bunga rosela dengan metode
spektrofotometri UV-VIS. Jurnal Teknologi Kimia dan Industri 2(2):91-96.