EDUCACIN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLNICO
Ed Cont Lab Clin 2005;8:49-62
CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA
Jos Mara Hernndez Prez
Servicio de Bioqumica, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Badalona
INTRODUCCIN
La cromatografa es una antigua tcnica
instrumental (Milhail Tswett, 1906) que ha
evolucionado enormemente en los ltimos aos,
principalmente a partir de la dcada de los
setenta, con lo que, inicialmente concebida como
mtodo de separacin, ha llegado a convertirse en
una fuente inagotable de mtodos de anlisis.
Pocos mtodos de anlisis qumico son tan
especficos para un analito en particular, ya que
tanto las fases previas de extraccin como los
procedimientos cromatogrficos son llevados a
cabo en funcin del tipo de molcula.
El proceso cromatogrfico contempla la
separacin de los componentes de una mezcla,
para ello, una muestra de la mezcla (o el extracto
de una muestra) ser disuelta en una fase mvil
(en este caso un lquido). La fase mvil es
impulsada a travs de una fase inmvil, que debe
ser inmiscible con ella, a la que se conoce como
fase estacionaria, y que puede ser slida o
lquida (cromatografa lquido-slido o caractersticas
cromatografa lquido-lquido el lquido puede condiciones cromatogrficas, y debe conseguirse
estar embebido o unido a partculas slidas-). Las
fases son escogidas de tal forma que los
componentes de las muestras presenten
diferencias en cuanto a sus propiedades fsico-
qumicas (solubilidad, tamao, fuerza inica,
polaridad, afinidad, etc.) para cada fase. Las
interacciones qumicas entre la fase mvil y la
muestra, y entre la muestra y la fase estacionaria,
determinan el grado de migracin y separacin de
los compuestos contenidos en la muestra. Un
componente que interacte ms con la fase
estacionaria realizar un "viaje" ms largo a travs
de ella que otro componente que tenga ms
interaccin con la fase mvil. Como resultado de
estas diferencias en la movilidad de los
componentes de una muestra estos se separarn
uno de otro.
En la cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC,
High Performance Liquid Chromatography) la
muestra es inyectada en el seno de la fase mvil,
donde es soluble, y es transportada a travs de
una columna por el flujo continuo de fase mvil a
alta presin. La fase estacionaria est formada por
partculas de pequeo dimetro, por tanto, con
una gran superficie de interaccin, contenidas en
la columna. Este proceso cintico es conocido con
el nombre de elucin. La velocidad a la que un
analito se mueve a travs de la columna, con
respecto a los dems presentes en la mezcla, est
determinada por el tiempo que permanece en la
fase mvil.
Aplicaciones
La HPLC se puede utilizar como tcnica
preparativa y como tcnica analtica, permitiendo
la purificacin, identificacin y cuantificacin del
analito deseado. La eleccin de la fase
estacionaria y la fase mvil, del flujo al que se va a
impulsar la fase mvil a travs de la fase
estacionaria e incluso de la temperatura a la que
se va a realizar la cromatografa, permitirn una
correcta separacin del analito de otros
compuestos.
Cada componente de una solucin tiene unas
determinadas bajo ciertas
que la migracin del componente y de los
contaminantes a travs de la columna sea lo
suficientemente distinta para que dicho compuesto
sea separado de los dems del extracto, para
permitir su posterior identificacin y cuantificacin.
A este proceso se le denomina purificacin.
La identificacin de compuestos es la parte ms
importante de muchos trabajos en HPLC. Para
identificar compuestos se debe seleccionar un
sistema de deteccin que mida diferentes
propiedades fsico-qumicas de la molcula. Entra
en juego el tipo de separacin y la naturaleza de
la deteccin, sea absorbancia, conductividad,
fluorescencia, relacin masa/carga, etc.
En la cromatografa lquida, la fase mvil eluye de
la columna durante un tiempo determinado
conteniendo cantidades muy diferentes de solutos
que pasan a travs de un sistema de deteccin. El
instrumento detecta la presencia del soluto que es
convertida en una seal elctrica y sta puede ser
tratada por un procesador de datos. Se representa
la seal obtenida frente al tiempo o al volumen de
elucin, y al grfico obtenido se le conoce como
cromatograma. Los solutos se representan
grficamente como una serie de picos que pueden
50
identificarse por su anchura, altura o rea. Para la
cuantificacin de compuestos se utiliza la seal
del detector haciendo que sea proporcional a la
cantidad o a la concentracin inyectada de analito.
Es preciso confeccionar previamente una curva de
calibracin para establecer el factor de respuesta
como la pendiente de la medida del detector frente
a las concentraciones de los calibradores. Para
ello se realiza la inyeccin de una serie de
soluciones del compuesto con concentraciones
conocidas para su deteccin. Los cromatogramas
obtenidos muestran una serie de picos cuyas
reas se correlacionan con la concentracin del
compuesto inyectado. Se puede tambin trabajar
con estandarizacin interna donde, tanto a los
compuestos con concentraciones conocidas como
a las muestras a cuantificar, se les aade una
cantidad conocida de un segundo compuesto
conocido como estndar interno. El rea del
estndar interno sirve para estandarizar puesto
que las prdidas sufridas durante todo el proceso
analtico (extraccin, cromatografa, etc.) son
constantes para todos los compuestos. La
representacin de la relacin del rea o la altura
del analito respecto a la del estndar interno frente
a la concentracin del analito proporciona una
curva de calibracin que corrige las prdidas
analticas.
CONCEPTOS CROMATOGRFICOS
Dentro del proceso de elucin se pueden distinguir
procesos termodinmicos, relacionados con la
capacidad de retencin o la diferente migracin de
los componentes de la mezcla, y procesos
cinticos, relacionados con la anchura de banda
cromatogrfica y, por tanto, de pico
cromatogrfico producido por el sistema de
procesamiento del detector.
Factor de retencin
Considerando un solo analito que se encuentra en
equilibrio entre la fase estacionaria y la fase mvil,
se define el llamado coeficiente de reparto o
constante de distribucin (KD) como la
concentracin molar de analito en la fase
estacionaria (Cs) dividida por la concentracin
molar del analito en la fase mvil (Cm):
Cs
KD =
Cm
sustituyendo (C) por el nmero de molculas por
unidad de volumen:
Ns Vm KD
KD = KD = k k=
Nm Vs
JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia
donde (k') es el factor de retencin o factor de
capacidad, que define la velocidad de migracin
de un analito en una columna determinada, y ()
es la relacin de fases. El tiempo que tarda la fase
mvil en pasar a travs de la columna se le
conoce como (t0) y equivale al tiempo para una
sustancia no retenida.
t R t 0 VR V0
k' = =
t0 V0
El volumen de elucin de la fase mvil en el que
sale el compuesto de inters se conoce como
volumen de retencin (VR), y el tiempo
transcurrido desde que el compuesto es inyectado
hasta que alcanza el detector es conocido como
tiempo de retencin (tR). El volumen de retencin
es caracterstico de cada compuesto y est
relacionado con la constante de distribucin. Al
volumen de fase mvil requerido para eluir una
sustancia no retenida se le conoce como (Vm o
Vo).
V R = Vm (1 + k)
Cuando el factor de retencin del analito es
inferior a 1, la elucin es tan rpida que la
determinacin del tiempo de retencin es muy
difcil. Factores de retencin muy grandes
(superiores a 20) significan que la elucin
transcurre durante mucho tiempo. Se considera
que un factor de retencin ideal est entre 2 y 6.
Para llegar a una separacin ptima entre
compuestos, deben obtenerse picos agudos y
simtricos. En general, picos con bajo factor de
retencin son mejores porque se evita su
ensanchamiento cumpliendo mejor las
caractersticas deseables (Figura 1).
Si se observa la Figura 2, puede verse que para
un pico perfectamente simtrico, los segmentos A
y B medidos al 10 % de la altura del pico son
iguales, por tanto el valor de asimetra (Af) segn
la frmula sera de 1:
B(10%h )
Af =
A(10%h )
Para la no existencia de colas, la suma de los
segmentos A y B partido por el doble de uno de
ellos debera ser 1, siendo (Tf) el factor de cola.
A+ B
Tf =
(10%h )
2A
JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia 51

Figura 1. Ensanchamiento de los picos de una cromatografa en funcin del factor de

capacidad.

Figura 2. Elementos de un pico cromatogrfico (tR: tiempo de retencin, h: altura

del pico, w: anchura del pico, t0: tiempo de un compuesto no retenido).

Eficiencia columna por transferencia de fase mvil

El modelo del plato terico supone que la columna
cromatogrfica contiene gran nmero de capas
separadas, llamadas platos tericos. Los
equilibrios para la separacin de la muestra entre
la fase estacionaria y la fase mvil tienen lugar en
estos supuestos platos. El analito se mueve en la
equilibrada desde un plato hasta otro.
Los platos son un concepto imaginario que ayuda
a entender como funcionan los procesos de
separacin en la columna. El modelo proporciona
una medida de la eficiencia de la columna, que se
puede expresar como el nmero de platos tericos
52 JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia

de una columna (N), cuntos ms platos la
columna ser ms eficiente. O como lo que mide
cada plato (HEPT, altura equivalente del plato
terico), cunto ms pequeo mayor eficiencia.
Siendo (L) la longitud de la columna, estos
conceptos quedan relacionados de la siguiente
forma:
2 sigma (inflexin del pico) (menos
-
sensible para colas o frentes).
Hay que escoger el mtodo que mejor se ajuste a
los requerimientos del trabajo y siempre debe
utilizarse el mismo a fin de conseguir la mejor
reproducibilidad en las medidas para que sean
comparables.

HEPT = L / N

El nmero de platos tericos que posee una

columna real se puede calcular a travs del pico
cromatogrfico de un compuesto dado despus de
su elucin. El compuesto es, generalmente, un
compuesto de prueba con buena separacin que
producir un buen pico cromatogrfico. (N) se
definido como:

t R2
N=

Altura del pico (%)

s2
donde (s) es la desviacin estndar del tiempo de
retencin.

El clculo se realiza sobre la representacin

grfica del pico prolongando las tangentes a las
curvas descendentes del pico gausiano hasta
llegar a cortar el eje de las x en dos puntos
(Figura 3). Estadsticamente, la distancia entre los
puntos donde las tangentes cortan la lnea de
base corresponde a 4 desviaciones estndar (s o
sigma). Tericamente, la anchura de un pico
gausiano (Wh) a la mitad de su altura corresponde
a 2,354 desviaciones estndar y, por tanto,
s2 = [w1/2 / 2,354] 2 que conducir a la frmula ms Figura 3. Mtodos basados en la simetra gausiana
conocida para calcular (N) a la mitad de la altura para la medida y el clculo de la eficiencia de una
del pico: columna.

Teora cromatogrfica de las relaciones

5,54 t R2
N=
w12/ 2
donde (w1/2) es la anchura del pico a la mitad de
su altura.
Hay una serie de mtodos usados para la medida
y el clculo de la eficiencia de una columna
mediante la medida de la anchura y la simetra del
pico a diferentes niveles. Referimos en orden de
sensibilidad son (Figura 3):
- Medida basada en la asimetra (ms
sensible para colas o frentes),
- 5 sigma (altura al 4,4 % de la columna),
- 4 sigma (altura al 13,4 % de la columna),
- tangente del pico respeto a la lnea base,
- 3 sigma (altura al 32,4 % de la columna),
- 1/2 altura,
Una descripcin ms real del proceso dentro de la
columna debe tener en cuenta el tiempo
transcurrido para equilibrar el soluto entre la fase
estacionaria y la fase mvil (en contra del modelo
del plato, que asume que el equilibrio es
infinitamente rpido). La forma resultante de un
pico cromatogrfico se ve afectada por la
velocidad de elucin, que es consecuencia de las
posibles diferentes vas que las molculas de
soluto toman en su camino entre las partculas de
la fase estacionaria. Si se consideran los distintos
mecanismos que contribuyen al ensanchamiento
de los picos, se llega a la ecuacin de Van
Deemter para la altura del plato:
H = ( A + B) /(u + Cu )
JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia
Donde (u) es la media de la velocidad de la fase
mvil, y (A), (B) y (C) son distintos factores que
contribuyen al ensanchamiento de la banda:
- Difusin de Eddy (A). Las molculas de soluto
(fase mvil) toman diferentes caminos al azar
a travs de la fase estacionaria. Esto puede
causar el ensanchamiento del pico porque los
diferentes caminos son de longitudes distintas.
- Difusin longitudinal (B). La concentracin de
analito es menor en los extremos de la
columna que en el centro. Esto causa un
cierto ensanchamiento del pico. Si la
velocidad de la fase mvil es alta entonces el
analito pasa menos tiempo en la columna, lo
que disminuye el efecto de la difusin
longitudinal.
- Resistencia a la transferencia de masa (C). El
analito requiere una determinada cantidad de
tiempo para conseguir el equilibrio entre la
fase estacionaria y la fase mvil. Si la
velocidad de la fase mvil es alta, y el analito
tiene una gran afinidad por la fase
estacionaria, entonces el analito en la fase
mvil se mover por delante del analito que
queda en la fase estacionaria. El pico del
analito se ensanchar. Cunto mayor sea la
velocidad de la fase mvil, mayor ser el
ensanchamiento producido.
En la Figura 4 se representa grficamente la
ecuacin de Van Deemter. La expresin de la
relacin entre la velocidad de la fase mvil y la
altura del plato es til para establecer el flujo
ptimo de la fase mvil. Para calcular la eficiencia
de la columna tambin puede usarse la ecuacin
de Knox:
2 1/ 3 v
h= +v +
v 10
donde (h) es la altura reducida del plato y es igual
a (H / dp), siendo (H) la altura del plato terico y
(dp) el dimetro medio de las partculas, y (v)
velocidad reducida de la fase mvil.
Selectividad y resolucin
Se define como selectividad () a la capacidad de
separacin de dos analitos en la columna,
considerando el tiempo de retencin (o volumen
de retencin) de los mximos de los picos para
cada analito.
k2 t 2 t 0 V2 V0
= = =
k1 t1 t 0 V1 V0
53
Normalmente, se puede controlar la selectividad
variando las caractersticas del sistema, tales
como la composicin de la fase mvil (pH, fuerza
inica, solvente orgnico modificador), la forma de
elucin (constante o en gradiente) o el tipo de
columna.
La resolucin (RS) es el parmetro que indica la
calidad de una separacin, como una medida
numrica de la separacin entre dos compuestos,
y se define como:
V2 V1
RS =
1 2(W1 + W2 )
Donde (Vi) es el volumen de retencin de cada
compuesto y (Wi) la anchura de cada pico (Figura 5).
Hay tres parmetros fundamentales que influyen
en la resolucin de una separacin
cromatogrfica: la eficiencia de la columna
(expresada en nmero de platos tericos), la
selectividad y el factor de retencin:
N 1 k'
RS =
4 1+ k'
En general, es recomendable intentar maximizar
estos tres parmetros, existiendo varias
estrategias para ello:
- Aumentar el nmero de platos tericos
reduciendo el tamao de las partculas de la
fase estacionaria. Los picos se estrecharn
(menor ancho de banda) y los tiempos de
retencin no variarn pero se resolvern.
- Aumentar el factor de retencin modificando la
composicin de la fase mvil o la superficie de
interaccin de la fase estacionaria o la
temperatura de elucin. Los tiempos de
retencin cambiarn y los picos sern tambin
ms anchos.
- Aumentar la selectividad modificando la fase
mvil o la fase estacionaria, modificando la
temperatura de la columna, o aadiendo
sustancias qumicas que se unen con alguno
de los solutos en la fase estacionaria. La
selectividad puede ser manipulada de modo
muy similar al factor de retencin porque
depende de l, la diferencia es que mientras
ste contempla las caractersticas
termodinmicas de un pico la selectividad lo
hace de los dos a separar.
54 JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia

Figura 4. Representacin de Van Deemter para establecer el flujo ptimo de la fase mvil.

Figura 5. Definicin de la resolucin de una separacin entre dos picos

cromatogrficos.

TIPOS DE CROMATOGRAFA compuestos activos (antgenos, anticuerpos,

El tipo de cromatografa en HPLC viene
determinado por la fase mvil y,
fundamentalmente, por la fase estacionaria.
Existen diferentes tipos de fase estacionaria
disponibles en forma de soportes de distintos
materiales (polmeros, carbn, hidroxiapatita,
agarosa o slica) contenidos en una columna.
Pueden ser de diferentes tamaos, dimetros,
tamaos de poro, o que tengan unidos diferentes
grupos qumicos, grupos polares).
Lquido-Slido, se basa en la polaridad. Los
compuestos que poseen grupos funcionales
capaces de producir enlaces fuertes de hidrgeno
se unirn ms fuertemente a la fase estacionaria
que los compuestos menos polares. As, los
compuestos menos polares eluirn de la columna
ms rpidamente que los altamente polares.
JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia
Lquido-Lquido, tambin se basa en la
polaridad. Sin embargo, esta tcnica es ms
apropiada para muestras de mediana polaridad
que son solubles en disolventes de dbil polaridad
a polares orgnicos. La separacin de no-
electrolitos se consigue teniendo en cuenta las
polaridades de muestra y fase estacionaria y
usando una fase mvil que posea una polaridad
marcadamente diferente.
Filtracin en gel, se basa en el tamao molecular
de los compuestos que van a ser analizados. La
fase estacionaria est formada por partculas
porosas (slica, no-slica). Los componentes de
mayor tamao sern excluidos del interior de las
bolas y as eluirn primero. Los compuestos ms
pequeos podrn entrar en las partculas y eluirn
de acuerdo con su capacidad para salir de los
poros en los que fueron internados.
Fase normal, se basa en la hidrofilia y la lipofilia
usando una fase estacionaria polar y una fase
mvil menos polar. As, los compuestos
hidrofbicos eluyen ms rpidamente que los
hidroflicos. La fase est constituida por una matriz
de slica a la que se unen grupos silanol, amino y
nitrilo que le confieren polaridad relativa respecto
a la fase mvil.
Fase reversa, tambin se basa en la hidrofilia y la
lipofilia. La fase estacionaria consiste en una
matriz de slica empacada que lleva unida
covalentemente una cadena alqulica de n-
carbonos (por ejemplo, C-8 significa que se
incorpora una cadena octil y C-18 una octadecil).
La ms hidrofbica es, en este caso, la fase
estacionaria, eluyendo los compuestos hidroflicos
ms rpidamente que los hidrofbicos, que
interaccionan con la fase estacionaria. Tambin
hay empaquetamientos polimricos alternativos a
la slice que ofrecen similares caractersticas con
mayor resistencia dinmica y ms amplio rango de
estabilidad de pH. Existen dos variantes de la
cromatografa en fase reversa:
- Supresin inica, se utiliza modificando el
pH de la fase mvil para cidos y bases
dbiles, de forma que el analito pasa a ser
ms lipfilo y se mejora la separacin porque
se establece ms interaccin con la columna.
- Formacin de pares inicos, se utiliza para
compuestos que tienen grupos funcionales
biolgicos que sern unidos a un contrain. El
contrain se asocia al analito y lo desplaza del
par inico normal (corrientemente Na+ o Cl-)
mejorando su hidrofobicidad. Para analitos
catinicos se utilizan grupos alquil o aril
sulfonatos y para analitos aninicos aminas
cuaternarias.
55
Intercambio inico, se basa en el intercambio
selectivo de iones de la muestra por sus
diferencias en signo y magnitud de carga inica
frente a los contraiones de la fase estacionaria. Se
trata de columnas que contienen grupos
funcionales que soportan cargas unidos a una
matriz polimrica. Los iones funcionales estn
permanentemente unidos a la columna y cada uno
tiene su contrain unido. La muestra es retenida
porque reemplaza los contraiones de la fase
estacionaria con sus propios iones. La muestra es
eluida de la columna por cambio en las
propiedades (pH, fuerza inica) de la fase mvil,
haciendo que esta desplace los iones de la
muestra de la fase estacionaria.
Afinidad, usa biomolculas inmovilizadas que
tienen una afinidad especfica hacia el compuesto
de inters. La separacin ocurre cuando la fase
mvil y la muestra pasan a travs de la fase
estacionaria. El compuesto o compuestos de
inters de la muestra son retenidos mientras el
resto de las impurezas y la fase mvil pasa a
travs. Los compuestos son luego eluidos
cambiando las condiciones de la fase mvil
(fuerza inica, pH, sustancis caotrpicas).
ELUCIN
En funcin de la composicin de la fase mvil
inyectada a la columna, la elucin de molculas
puede ser de dos tipos: isocrtica y en gradiente.
Tambin existen casos en los que se cambia
totalmente la fase mvil en el transcurso de la
cromatografa y se conoce como elucin
politptica.
Elucin isocrtica
Los compuestos eluyen usando una fase mvil de
composicin constante durante toda la
cromatografa. Todos los compuestos acaban
migrando a travs de la columna hasta el final. Sin
embargo, cada uno migra con una velocidad
diferente, resultando en una relacin de elucin
ms rpida o ms lenta. Este tipo de elucin es
bastante simple y barato, pero la resolucin de
algunos compuestos es cuestionable y el eluido
puede no ser obtenido en un plazo de tiempo
adecuado.
56
La separacin de los compuestos mediante
elucin isocrtica puede describirse utilizando las
siguientes ecuaciones:
Tiempo de retencin t R = t 0 k '+t 0
Factor de capacidad k ' = (t R t 0 ) / t 0
[ ]
Resolucin Rs = (1 / 4) (( 1) )N 1 / 2 [k ' / (1 + k ')]
Elucin en gradiente
Los diferentes compuestos son eluidos
modificando gradualmente la composicin de la
fase mvil durante el transcurso de la
cromatografa (aumentando la fuerza inica,
modificando la polaridad, etc.). El resultado sobre
la elucin es un acortamiento de los tiempos de
retencin, el factor de retencin disminuye
conforme aumenta la variacin de flujo del
gradiente y el compuesto eluye. Este gradiente
puede llevarse a cabo de forma lineal o
escalonada o linealmente escalonada.
La prediccin mediante ecuaciones que describan
la separacin de componentes por elucin en
gradiente es muy compleja, por lo que se parte de
las ecuaciones empleadas para la isocrtica y se
adaptan casi empricamente. La relacin del
cambio de la composicin de la fase mvil durante
el transcurso de la elucin en gradiente puede ser
Figura 6. Elementos de un equipo de HPLC.
JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia
descrita por la pendiente del gradiente como ( /
tG) dnde (G) simboliza la progresin del gradiente
G= t 0 .S
tG
siendo () el volumen de fase del modificador, (tG)
el tiempo del gradiente, (S) la pendiente del (ln k')
frente a () (o la relacin lineal de fuerza del
solvente).
Tiempo de retencin (
tg = t 0 k log 2,3 k 0 / k )
Factor de capacidad k = t G / St 0 = t G F / SVm
[ ][ (
Resolucin R = (1 / 4) ( 1) ( ) N 1 / 2 k / 1 + k )]
En el caso de que converjan diferentes solutos,
los valores de gradientes (G) para los diferentes
solutos no sern idnticos, ya que (G) es
proporcional a (S). Cuando la concentracin de
gradiente es lineal, el gradiente (G) es constante
durante toda la elucin.
INSTRUMENTACIN
En la Figura 6 se representan los elementos
esenciales que forman parte de un equipo de
HPLC.
JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia
Columna
En HPLC se usan diversos tipos de columnas
secundarias que se asocian a la columna de
separacin con otros fines especficos:
- Precolumnas: se colocan antes de la columna
de separacin y sirven como factor de
proteccin que prolonga la vida y el uso de la
columna separativa. Estn diseadas para
filtrar y retirar: 1) partculas que obstruyan la
columna de separacin; 2) compuestos e
iones que pudieran aumentar el ruido de
fondo, disminuyendo la resolucin y la
sensibilidad, y creando falsos picos; 3)
compuestos que podran causar precipitacin
en contacto con la fase estacionaria o la fase
mvil y 4) compuestos que podran co-eluir y
causar picos extraos e interferir con la
deteccin y cuantificacin. Este tipo de
columnas deben ser cambiadas regularmente
con el fin de optimizar sus funciones
protectoras.
- Columnas para derivatizar (pre- o post-
columna separativa): son columnas que
modifican qumicamente el compuesto a una
molcula con el que se van a obtener datos
potencialmente tangibles que pueden
complementar a otros resultados analizados
anteriormente. Acetilacin, sililacin o estas columnas es aumentar el nmero de
hidrlisis cida son algunas tcnicas de
derivatizacin.
En las columnas analticas es en las que
realmente se lleva a cabo la separacin. En la
Tabla 1 se citan los distintos tipos.
Columnas capilares: los avances en HPLC han
llevado a estas pequeas columnas analticas,
tambin conocidas como microcolumnas. Las
columnas capilares tienen un dimetro menor a 1
mm, y hay de tres tipos: tubular abierto,
parcialmente empacadas, y fuertemente
empacadas. Estas columnas permiten trabajar con
volmenes de muestra de nL, disminuyendo el
flujo y el volumen de solvente usado lo que puede
llevar a una disminucin de los costes. Sin
embargo, la mayora de las condiciones y la
instrumentacin deben ser miniaturizados, la
relacin de flujo puede ser difcil de reproducir, el
gradiente de elucin no es tan eficiente, y se debe
tener mucho cuidado cuando se cargan
volmenes de muestra tan pequeos.
57
Columnas de microcalibre y de calibre estrecho:
se usan para pequeos volmenes de muestra. El
dimetro tpico es de 1-2 mm. Como en las
columnas capilares, los instrumentos deben ser
modificados para acomodarse a la pequea
capacidad de estas columnas. Sin embargo,
excepto la ventaja de la pequea cantidad de
muestra y de volumen de la fase mvil, no se ha
notado un incremento en la sensibilidad a la
cantidad de materia inyectada sin prdida
significativa en la resolucin.
Columnas estndar: son las que se usan
comnmente. Su tamao ms habitual es de 2,4
mm de dimetro y 250 mm de largo, con un
tamao de partcula de 5 m de dimetro (Figura
7-a). Las partculas pueden ser de slica o de otros
polmeros especiales que les confiere resistencia
a determinadas condiciones (pH extremos) y a su
vez pueden ser de forma esfrica o irregular
(Figura 7-a y 7-b). Las partculas son de
naturaleza porosa a fin de aumentar mucho la
superficie de interaccin con los analitos, y dado
que tambin influye en la separacin, se tiene en
cuenta el dimetro de poro. Hay variaciones, pero
los poros de las partculas suelen ser de entre 100
y 300 (Figura 7-c).
Columnas rpidas: la razn principal para usar
muestras que se pueden procesar en un tiempo
dado. Para muchas columnas, incrementando el
flujo o la relacin de migracin a travs de la fase
estacionaria se afectar adversamente la
resolucin y la separacin. As pues, las columnas
rpidas se disean para rebajar el tiempo sin
llegar a significativas desviaciones en los
resultados. Estas columnas tienen el mismo
dimetro interno pero son mucho ms cortas que
la mayora de las columnas, y estn empacadas
con pequeas partculas que son tpicamente de 3
m de dimetro. Las ventajas incluyen incremento
de la sensibilidad, descenso en el tiempo de
anlisis, descenso en la fase mvil usada, e
incremento en la reproducibilidad.
Columnas preparativas: son columnas utilizadas
con el objeto de permitir purificar grandes
cantidades de muestra (mg). Una columna
preparativa normalmente tiene un gran dimetro
porque est diseada para facilitar grandes
volmenes de inyeccin.
58 JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia

Dimetro Relacin de Capacidad de Mxima carga de

Tipo
(mm) flujo (L/min) muestra (g) muestra (mg)
Capilar 0,075 0,25 0,05 -
0,15 1,0 0,2 -
0,30 5,0 1,0 -
0,50 10 2,0 -
Microcalibre 1,0 25 - 50 0,05 - 10 -
Calibre estrecho 2,1 100 - 300 0,2 - 50 -
Analtica 4,6 500 - 1.500 1 - 200 10
Semi-preparativa 10 2.500 - 7.500 1.000 50
Preparativa 22 10.000 - 30.000 5.000 200

Tabla 1. Caractersticas de los distintos tipos de columnas.

a b
Figura 7. Distintos tipos de partculas de las columnas estndar (a) forma
esfrica, (b) forma irregular y (c) tamao de poro entre 100 y 300 .

Inyector separacin con la columna est cerrada, y el

El inyector para HPLC consiste normalmente en
una vlvula de inyeccin y un bucle. Un pequeo
volumen de muestra (previamente disuelta) se
carga en una jeringa y es inyectada en el bucle
por la vlvula de inyeccin. Un giro del rotor de la
vlvula cierra la vlvula y pone en comunicacin el
bucle que contiene la muestra con la corriente de
fase mvil que va de la bomba a la columna. El
volumen del bucle determina la cantidad inyectada
y puede ir desde 5 L hasta 500 L.
La inyeccin a flujo parado es un mtodo especial
por el cual la bomba se detiene para realizar la
inyeccin a presin atmosfrica, este sistema se
utiliza cuando se trabaja a muy alta presin.
Bomba
Bombas de pistn recproco: constan de un pistn
conducido por una leva unida a un pequeo motor
que se mueve rpidamente atrs y adelante en
una cmara hidrulica variando su volumen entre
35-400 L. En la carrera atrs, la vlvula de
pistn aspira el solvente del reservorio de la fase
mvil. En la carrera hacia delante, la bomba
empuja el solvente hacia la columna desde el
reservorio. Se puede conseguir un amplio rango
de flujos alterando el volumen de la carrera del
pistn durante cada ciclo, o alterando la
frecuencia con que ste realiza una carrera.
La presencia de dobles y triples cabezas de
bomba constante en idnticas unidades de
cmara de pistn que operan a 180 o 120 grados
fuera de fase, permiten un bombeo
significativamente suave porque se llena una
bomba mientras la otra est en el ciclo de
expulsin.
Bombas tipo jeringa: son ms adecuadas para
pequeas columnas porque expulsan solo un
volumen finito de fase mvil antes de rellenarse.
Estas bombas tienen un volumen de 250 a 500
mL. Operan mediante un tornillo conductor
motorizado que bombea fase mvil a la columna a
flujo constante. La velocidad de flujo de expulsin
se controla cambiando el voltaje del motor.
JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia
Bombas de presin constante: la fase mvil es
conducida a travs de la columna mediante la
presin de un cilindro de gas. Una fuente de gas a
baja presin se necesita para generar altas
presiones en el lquido. La disposicin de las
vlvulas permite rellenar rpidamente la cmara
del solvente cuya capacidad est sobre los 70 mL,
proporcionando relaciones de flujo de fase mvil
continuas.
Detector
Los detectores utilizados para HPLC siempre
trabajan bajo condiciones de flujo continuo, la
muestra disuelta en la fase mvil atraviesa una
celda de flujo en la que es detectada.
Normalmente, las muestras llegan en cantidades
de ng al detector, pero en anlisis de trazas, esta
cantidad puede llegar a ser de fg e incluso de muy
pocas molculas.
La respuesta del detector al paso de la sustancia
est basada en un amplio rango de caractersticas
fsicas y qumicas de las sustancias. Es por esto
que no existe un detector universal, sino que cada
sustancia, en principio, debe analizarse con el
detector ms adecuado dependiendo de su
naturaleza fsico-qumica, del tipo de anlisis que
se lleve a cabo y del tipo de instrumentacin de la
que se disponga. Los detectores ms
ampliamente utilizados se basan en:
- ndice de refraccin. El ndice de refraccin de
la fase mvil vara cuando eluye la sustancia,
es en principio universal, pero de pobre
sensibilidad.
- Viscosidad.
- Absorcin molecular en ultravioleta y visible.
Pueden ser de (a) longitud de onda fija, slo
se detectan analitos que absorban a unas
determinadas longitudes de onda, en el caso
de que no absorban deben derivatizarse para
cambiar su espectro de absorcin molecular a
esas longitudes; (b) de longitud de onda
variable, se puede seleccionar cualquier
longitud de onda; y (c) de dispositivo de
diodos (diode array), proporcionan un
espectro completo por unidad de tiempo. La
luz policromtica pasa a travs de la celda de
flujo y la luz trasmitida es dispersada por una
red y dirigida al dispositivo de fotodiodos.
Permite la cuantificacin por supresin
espectral, aunque el pico de inters no este
bien resuelto, y la identificacin de sustancias
por su espectro caracterstico.
- Fluorescencia. Ocurre cuando una molcula
absorbe luz excitndose y emitindola a otra
longitud de onda mayor que puede ser
detectada especficamente. Es muy sensible
59
pero muchas sustancias tienen que ser
derivatizadas para convertirse en
fluorescentes mediante modificaciones
qumicas.
- Conductividad (electroqumicos). La muestra
es oxidada o reducida en la superficie de un
electrodo a potencial constante, y pueden ser
potenciados por coulometra.
- Radioactividad.
- Luz dispersada tras evaporacin. Funciona
midiendo la luz dispersada por partculas
slidas del soluto despus de la nebulizacin
y evaporacin de la fase mvil.
- Espectrometra de masas. Se utiliza la
relacin masa/carga de las sustancias eludas
y es aplicable a cualquier analito. Es el
detector ms sensible, selectivo y universal,
pero de coste todava elevado. Para
cromatografa lquida se utilizan detectores
cuadrupolares o detectores hbridos con
acoplamientos a presin atmosfrica como
son fuentes APCI (ionizacin qumica a
presin atmosfrica) o fuentes ESI
(electroespray)
Cualquiera que sea el principio de operacin, un
detector ideal debe ser altamente sensible, de
respuesta rpida y debe asegurar un bajo nivel de
ruido y suciedad (particularmente crucial en el
anlisis de trazas).
La sensibilidad es una de las propiedades ms
importantes del detector de cromatografa lquida.
Es una medida de su capacidad para discriminar
entre pequeas diferencias en la concentracin
del analito y viene representado por la pendiente
de la lnea de calibracin. Tambin es
dependiente de la imprecisin de las medidas. El
aumento de la pendiente de la curva de
calibracin es el aumento de sensibilidad del
detector para un componente en particular, pero
altas fluctuaciones de las medidas rebajarn la
sensibilidad.
Los picos que eluyen ms temprano normalmente
son ms agudos, mientras que los que tienen
tiempos de retencin ms largos son ms anchos
y algunas veces es difcil discernirlos del ruido.
La definicin de respuesta del detector depende
de s es sensible a la masa o sensible a la
concentracin. Para los detectores sensibles a la
masa, la respuesta (R) viene dada por la siguiente
relacin:
hw
R=
sM
donde (h) es la altura del pico, en mV; (w) la
anchura del pico a 0,607 cm de la altura, en cm;
60
(s) la velocidad de registro, en cm/min; y (M) la
masa de soluto inyectada, en ng (puede ir de g a
pg).
Para los detectores sensibles a la concentracin,
la respuesta puede ser calculada usando la
frmula siguiente:
h w F
R=
sM
donde (F) es el flujo, en mL/min.
Se considera que la respuesta del detector es
lineal cuando la diferencia en la respuesta para
dos concentraciones de un determinado
compuesto es proporcional a la diferencia de
concentracin en las dos muestras. La regresin
lineal de las respuestas de los calibradores frente
a las concentraciones da un buen ajuste con (r2)
cercano a 1 apareciendo como una curva de
calibracin en lnea recta.
El rango dinmico del detector es la mxima
respuesta lineal dividida por el ruido del detector.
La mayora de los detectores se convierten en no-
lineales cuando el tamao de la muestra se
incrementa y este lmite de linealidad debe estar
bien definido.
En HPLC el proceso es dependiente del tiempo.
La aparicin del componente eluido de la columna
en el detector es representada por el punto de
inflexin en la lnea de base del cromatograma. Es
un problema distinguir entre el componente y
artefactos causados por la fluctuacin de la
presin o de la composicin, burbujas, etc. Si los
picos son bastante grandes, no hay problema
para distinguirlos. Sin embargo, para los picos
ms pequeos, es muy importante que la lnea de
base no presente altibajos, est libre de ruido y de
deriva.
El ruido de la lnea de base son pequeas
variaciones de la lnea en tiempos muy cortos,
sobre una lnea de base recta, causada por
fluctuaciones de la seal elctrica, por
inestabilidad de la lmpara, por fluctuaciones de
temperatura u otros factores. El ruido es un factor
que limita la sensibilidad del detector. En el
anlisis de trazas, se debe distinguir ente los picos
del ruido y los picos de los componentes. Un lmite
prctico para ello es 3 x relacin seal-ruido, pero
slo con fines cualitativos. En la prctica el lmite
de deteccin cuantitativo puede se escogido como
10 x relacin seal-ruido. Esto asegura la correcta
JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia
cuantificacin de las cantidades de las trazas con
menos de un 2 % de variacin.
Otro parmetro relacionado con la fluctuacin de
la seal es la deriva. La lnea de base debera
desviarse tan poco como sea posible de una lnea
horizontal. Se mide normalmente durante un
tiempo especfico (30 min o 1 h). La deriva, por lo
general, esta asociada al calentamiento del
detector en la primera hora despus de la puesta
en marcha. En la Figura 8 se ilustra un ejemplo de
lo comentado, indicando el nivel de ruido de una
lnea de base (medida a la ms alta sensibilidad
del detector) y los picos ms pequeos que
pueden ser inequvocamente detectados, as
como la deriva de la seal.
El diseo de la clula de flujo tambin es un factor
importante. Las lentes proveen un enfoque del haz
de luz en el centro de la celda. Unas lentes
colectoras post-celda enfocan la totalidad de la luz
desde la celda en el fotodetector. Tambin se
debe considerar la resolucin del detector o
nmero de medidas por unidad de tiempo que
produce, en los sistemas modernos se provee una
alta resolucin en un corto espacio de tiempo. Si
se considera una columna con 10.000 platos
tericos y 15 cm de longitud, los componentes
eluidos en 2 min (2 mL a 1 mL/min de flujo)
podran contenerse idealmente en picos de 80 L
de ancho. De esta forma, teniendo una celda de
flujo de 20 L de volumen slo se podran hacer 4
medidas independientes para este pico.
Definitivamente, esto no es bastante para describir
correctamente la forma del pico y se debera
aumentar el nmero de medidas.
Otra caracterstica importante de la celda de flujo
es compensar el efecto de la refraccin. Cuando
los componentes de la mezcla pasan a travs de
la celda de flujo pueden modificar la composicin
del eluyente con lo que se puede llegar a cambiar
el coeficiente de refraccin. Si el haz de luz no es
paralelo, el cambio en la refraccin cambiar la luz
y contribuir en lecturas de absorcin aparentes.
Si el volumen de la celda de flujo es > 1/10 del
volumen del pico, o si la geometra de la celda no
ha sido optimizada, se puede apreciar un
ensanchamiento aparente de los picos. Como el
rea del pico es proporcional a la cantidad de
analito inyectada, el ensanchamiento del pico
causa la reduccin de su altura. En caso de
ensanchamiento aparente del pico por volumen de
la celda excesivo, si la geometra de la celda se
optimiza no se debera observar una reduccin
significativa de la altura.
JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia
Figura 8. Esquematizacin de los fenmeno de ruido y deriva.
Regulador de contrapresin
El regulador de contrapresin se sita
inmediatamente despus del detector. Se disea
para aplicar una presin constante a la salida del
detector que previene la formacin de burbujas de
aire en el sistema. Esto mejora la estabilidad de la
lnea de base cromatogrfica. Se proyecta para
operar sin tener en cuenta el flujo, la fase mvil o
la viscosidad.
Colector de fracciones
El colector de fracciones es un dispositivo
automtico que recoge uniformemente los eludos
a la salida del HPLC. Los viales o tubos son
colocados en un carrusel o en una gradilla y el
usuario programa el intervalo de tiempo en el que
se recolecta cada fraccin. Cada vial contiene
fase mvil y fracciones de la muestra en el
correspondiente tiempo de elucin.
APLICACIONES EN EL LABORATORIO
CLNICO
La HPLC es utilizada en laboratorios clnicos de
referencia, muchas veces como tcnica definitiva.
Sus aplicaciones son mltiples, algunas de ellas,
clasificadas en funcin del tipo de separacin,
son:
1. Lquido-slido. Separacin de monoglicridos,
diglicridos y triglicridos, y como mtodo
preparativo para esteroides o vitaminas antes del
posterior radioinmunoanlisis.
61
2. Afinidad. Su poder radica en su selectividad, es
profusamente utilizada para separar protenas y
anticuerpos con fines preparativos. Incluso clulas
con distinta composicin en hidratos de carbono
son separadas en columnas de lectinas.
Lipoprotenas, como LDLs y VLDLs, tambin
pueden separarse mediante columnas de
heparina, y glicohemoglobinas mediante columnas
de boronato. En general, es aplicable a cualquier
aislamiento de una sustancia especfica que
pueda llevarse a cabo mediante una reaccin
antgeno-anticuerpo, enzima-substrato o metal-
sustancia.
3. Intercambio inico. Separacin de
hemoglobinas, isoenzimas de la creatina-cinasa o
la L-lactato-deshidrogenasa y anlisis de
aminocidos. Otras aplicaciones van dirigidas a
retirar interferencias inicas de otras sustancias
para su posterior anlisis por otros mtodos. Un
ejemplo es el porfobilingeno en orina que queda
retenido en la columna eluyendo las sustancias
interferentes, posteriormente se eluye
selectivamente y se cuantifica.
4. Filtracin en gel. En la determinacin de las
masas molares de macromolculas o como paso
previo para evitar interferencias en algn
procedimiento de medida enzimtico.
5. Fase reversa (supresin inica y formacin de
pares inicos). La cromatografa lquido-lquido es
la ms potente en cuanto a aplicaciones clnicas y
la ms utilizada en el laboratorio toxicolgico para
drogas de abuso (cocana, benzoilegconina,
cocaetieleno), anfetaminas, metaanfetaminas y
antagonistas o narcticos (naloxona, naltrexona);
y en el laboratorio clnico o alimentario para
Educacin Continuada en el Laboratorio Clnico Casos Clnicos 2004-05 (8)

vitaminas liposolubles, carotenos, licopenos, etc., - Antirretrovirales (aciclovir, delfinavir,

y pptidos y protenas para su posterior anlisis saquinavir).
por espectrometra de masas. Para la deteccin y - Barbitricos (fenobarbital, butabarbital,
monitorizacin de una amplsima variedad de butabital, secobarbital).
frmacos: - Broncodilatadores (albuterol, teofilina,
- Analgsicos (acetaminofeno), analgsicos teobromina, paraxantina, cafena).
narcticos (oxicodona) y analgsicos - Frmacos glucocorticoides (prednisolona,
antiinflamatorios (naproxeno, ibuprofeno, betametasona).
diclofenaco). - Hormonas (dosificacin de testosteronas:
- Antagonistas (ranitidina, omeprazol). acetato, propionato y benzoato de
- Antiagregantes (warfarina). testosterona).
- Antiarrtmicos (procainamida, propanolol - Pptidos teraputicos (oxitocina,
metoprelol, oxoprenol). angiotensinas I y II).
- Antibacterianos (sulfadiazina, - Queratolticos (cido saliclico, cido
sulfamerazina, trimetroprim, benzico).
sulfametoxazol, tetraciclina, minocliclina, - Sedativos (nordiazepam, clordiacepxido,
demeclociclina). oxacepam, norclordiacepxido) y
- Antidepresivos tricclicos (doxepina, opiceos (morfina y sus glucornidos,
nordoxepina, nortriptilina, amitriptilina, metadona).
imipramina, trimipramina, verapamil,
norverapamil).

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EDUCACIN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLNICO

COMIT DE EDUCACIN
D. Balsells (presidenta), F. Canalias, R. Ferragut, P. Munujos, M. Rodriguez, MC. Vill