2.

8 Cultivo y conservacin de los

microorganismos

M. en C. Sandra Ruiloba de Len y Frescas

Departamento de Microbiologa
Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, IPN
 Cultivo de microorganismos
Gran parte de la microbiologa depende de la capacidad de
cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto
solo es posible si se dispone de los medios de cultivo adecuados.
Adems, los medios especiales son imprescindibles para aislar e
identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los
antibiticos, analizar el agua y los alimentos, en la microbiologa
industrial y en muchas otras actividades. Aunque todos los
microorganismos necesitan fuentes de energa, carbono,
nitrgeno, fsforo, azufre y varios minerales, la composicin
precisa de un medio adecuado depender de la especie que se
quiere cultivar, porque las necesidades nutricionales varan
considerablemente. El conocimiento del hbitat normal de un
microorganismo es a menudo til para elegir un medio de cultivo
apropiado, porque sus necesidades de nutrientes reflejan su
ambiente natural.
 Composicin de los microorganismos
La clula debe obtener la mayora de las pequeas
molculas que requiere del ambiente ya que las
macromolculas son sintetizadas en el interior de la clula.
Sin embargo es conveniente hacer hincapi en que tambin
dentro de la clula se sintetizan molculas pequeas de las
sustancias obtenidas del ambiente. Existen muchos
elementos naturales presentes en una clula, sin embargo,
la masa total est formada de 4 tipos de tomos: carbono,
oxgeno, hidrgeno y nitrgeno. Se tiene adems otros
elementos cuantitativamente menos importantes pero
funcionalmente indispensables. Entre estos se incluye al
fsforo, calcio, magnesio, azufre, fierro, zinc,
manganeso, cobre, molibdeno, cobalto y tungsteno.
Principales componentes celulares

El agua constituye aproximadamente el 94-

98% del peso de una clula y las
macromolculas constituyen el porcentaje
mas alto en el peso seco siendo las
protenas la clase de macromolculas mas
abundante, seguido de los cidos nucleicos
(DNA y RNA), los lpidos y por ltimo los
carbohidratos.
Composicin qumica de una clula procaritica a
Molcula Peso seco Molculas Clases
(%)b por clula diferentes
Total de macromolculas 96 24,610,000 ~2,500
Protenas 55 2,350,000 1,850
Polisacridos 5 4,300 2c
Lpidos 9.1 22,000,000 4d
DNA 3.1 2.1 1
RNA 20.5 255,500 ~650
Total de monmeros 3.5 ~350
Aminocidos y precursores 0.5 ~100
Azcares y precursores 2 ~50
Nucletidos y precursores 0.5 ~200
Iones inorgnicos 1 18
Total 100
a Los datos son de Neidhardt, F.C. y col (eds).1996. Escherichia coli y Salmonella typhimurium-Cellular and
Molecular Biology, 2a, ed, ASM; b Peso seco de una clula de E. coli creciendo activamente (2.8 x 10-13 g); c
Asumiendo que la peptidoglicana y el glucgeno son los polisacridos mayoritarios presentes; d Existen diversas
clases de fosfolpidos; de cada uno de ellos se presentan muchas formas debido a la variabilidad de los cidos
grasos entre las especies y las condiciones de crecimiento.
 Requerimientos nutricionales
Las sustancias en el ambiente utilizadas por los organismos para
el anabolismo y el catabolismo se denominan nutrientes.
Nutriente. Sustancia requerida por los organismos para la
sntesis de materiales celulares y para la generacin de
energa y que es obtenida del ambiente
Los nutrientes se pueden dividir en dos clases: 1.
Macronutrientes, los que se requieren en grandes cantidades.
2. Micronutrientes, aquellos que se necesitan en pequeas
cantidades.
Algunos nutrientes constituyen la base sobre la cual la clula
sintetiza macromolculas u otras importantes estructuras
mientras que otros nutrientes sirven solo como generadores de
energa sin ser directamente incorporados al material celular;
algunos nutrientes pueden jugar los dos papeles.
 Macronutrientes en la naturaleza y en los medios de cultivo
Elemento Forma habitual del
nutriente en el ambiente
Carbono CO2, Compuestos orgnicos
Oxgeno H2O, Compuestos orgnicos
Nitrgeno NH3, NO3-, N2, Compuestos
orgnicos nitrogenados
Compuestos orgnicos
Fsforo PO43-
Azufre H2S, SO42-, Compuestos
orgnicos azufrados, sulfuros
metlicos (FeS, CuS, ZnS, NiS,
etc.)
Potasio K+ en solucin o como sal
Magnesio Mg2+ en solucin o como sal
Sodio Na+ en solucin o como sal
Calcio Ca+ en solucin o como sal
Hierro Fe2+ o Fe3+ en solucin o como FeCl2, FeSO4, soluciones de Fe quelado con
FeS, Fe(OH)3, u otras sales
Forma qumica utilizada en medios de
cultivo
Glucosa, malato, acetato, piruvato, extracto
de levadura, peptona, etc.
H2O, Compuestos orgnicos
Inorgnicos: NH4CL, (NH4) SO4, KNO3, N2
Orgnicos: aminocidos, bases nitrogenadas
de nucletidos, compuestos con nitrgeno
KH2PO4, Na2HPO4
Na2SO4, Na2S2O7 Na2S, Compuestos
orgnicos azufrados
KCl, KH2PO4
MgCl2, MgSO4
NaCl
CaCl2
EDTA o citrato
 Micronutrientes necesarios para los microorganismos
Elemento Funcin Celular
Cromo Requerido por los mamferos en el metabolismo de la glucosa, no se
conoce algn microorganismo que lo requiera
Cobalto Vitamina B12, Transcarboxilasa (bacterias del cido lctico)
Cobre Lo requieren como cofactor algunas protenas implicadas en la
respiracin (citocromo c oxidasa), la fotosntesis (plastocianina) y las
destoxificacin de radicales libres (superxido dismutasa)
Manganeso Varias enzimas lo requieren como cofactor. Por ejemplo, la
superxido dismutasa, la fotoliasa del fotosistema II.
Molibdeno Presente en enzimas que contienen flavina. Tambin presente en la
nitrogenasa, nitrato reductasa, sulfito oxigenasa, DMSO y TMAO
reductasas, formato deshidrogenasas, etc.
Nquel La mayora de las hidrogenasas, coenzima F430 de las metangenas,
deshidrogenasa de monxido de carbono, ureasa, etc.
Selenio Formato deshidrogenasa, selenocistena
Tungsteno Formato deshidrogenasas, oxotransferasas de termoflicos
Vanadio Vanadio nitrogenasa, bromoperoxidasa
Zinc Anhidrasa carbnica, alcohol deshidrogenasa, DNA y RNA
polimerasas y protenas que se unen al DNA
Hierro Citocromos, catalasas, peroxidasas, protenas con hierro y azufre
(ferredoxina), oxigenasas, nitrogenasas
 Constituyentes de los
microorganismos
Las cuatro principales macromolculas que
constituyen a los microorganismos son
entonces:
1. Protenas
2. Acidos nucleicos
3. Lpidos
4. Carbohidratos
Definicin de medio de cultivo

Un medio de cultivo es un sustrato

o solucin de nutrientes en donde
se cultivan microorganismos en un
laboratorio. Es la imitacin de las
condiciones favorables para el
desarrollo de los microorganismos.
Requerimientos de un medio de
cultivo

1. Fuente de carbono
2. Fuente de nitrgeno
3. Fuente de energa
4. Agua
5. Sales minerales
6. Factores de crecimiento
 Tipos de medios de cultivo por su
composicin qumica
En microbiologa se usan dos grandes grupos de medios de cultivo:
1. Los qumicamente definidos
2. Los indefinidos o complejos
Los qumicamente definidos se preparan aadiendo agua destilada a
cantidades precisas de compuestos orgnicos o inorgnicos
altamente purificados. Por ello se conoce la composicin qumica
exacta.
Los medios complejos emplean lisados de casena, de carne, de
soya, de levadura o cualquier otra sustancia altamente nutritiva
(qumicamente indefinida) como por ejemplo la sangre, el suero,
jugos de verduras, frutas etc. Entonces los medios complejos no se
conoce con precisin la composicin qumica ni la cantidad
exacta de cada uno de los nutrientes.
 Ejemplos de medios de cultivo
por su composicin qumica
Medios definidos Medios complejos
o indefinidos
Medio E de Vogel y BHI
Bonner. Gelosa sangre
Medio de Knop Caldo nutritivo
Medio PDA
Medio de Fowell para
ascosporas Medio Luria Bertani
Medio Baird Parker
 Tipos de medios de cultivo por su
consistencia
Los medios de cultivo pueden ser:
1. Lquidos
2. Slidos o semislidos
Los medios slidos o semislidos pueden contener los mismos ingredientes que
los medios lquidos, pero poseen adems agentes solidificantes que pueden ser
agar, gelatina slica gel.
El agar proviene de las algas rojas Gelidium, Gracilaria, Acanthopeltis,
Ceramium y Pterocladia y qumicamente es un polmero de azcares que posee
interesantes propiedades que lo hacen ideal para el cultivo de una gran variedad
de microorganismos. Se funde a altas temperaturas (87oC) y solidifica a 40-
45oC. Adems no es degradado por la mayora de las bacterias. Se usa a una
concentracin del 1.5-2%
La gelatina tiene el inconveniente de que se lica a temperaturas relativamente
bajas y muchos microorganismos la utilizan como fuente de carbono y
nitrgeno. Se utiliza a una concentracin del 5-10%.
La slica gel se emplea para algunos microorganismos que se inhiben en
presencia de agar.
 Tipos de medios de cultivo por su uso

Los medios de cultivo dependiendo de su uso

pueden ser:
1. Simples
2. Enriquecidos
3. Selectivos
4. Diferenciales
5. De enriquecimiento
6. De transporte
 Medios Simples

Los medios simples son medios comunes, que slo

tienen un tipo de infusin o extracto adems de
otros componentes. Son medios para fines
generales porque mantienen el crecimiento de
muchos microorganismos que no son muy
exigentes.
Ejemplo de estos tipos de medio son la gelosa
nutritiva, el PDA, el caldo simple o caldo
nutritivo.
 Medios Enriquecidos
Los medios enriquecidos estn constituidos por algunas
sustancias que lo hacen ms nutritivo. En estos medios
puede crecer una gran variedad de microorganismos.
Como son medios complejos no se conocen las
cantidades exactas de sus componentes.
Se pueden incorporar sangre, suero, plasma y diversos
extractos nutritivos a un medio simple hacindolo
adecuado para el crecimiento de microorganismos
exigentes.
Ejemplos de estos medios de cultivo son el BHI, gelosa
sangre, medio Eugon, gelosa chocolate, agar Columbia,
medio Infusin de hgado, etc.
Ejemplos de medios enriquecidos

Gelosa sangre
 Medios Selectivos
Los medios selectivos favorecen el crecimiento de
microorganismos particulares debido a que entre sus ingredientes
poseen un inhibidor que nos permite escogerlos o seleccionarlos.
Las sales biliares o los colorantes como la fucsina bsica, el cristal
violeta, la eosina o el verde brillante permiten el crecimiento de las
bacterias Gram negativas, mientras que inhiben el crecimiento de
las Gram positivas.
Tambin se pueden aislar microorganismos incubndolos con
nutrientes que puedan utilizar de forma especfica. Un medio que
contenga celulosa ser muy efectivo para aislar bacterias que
digieran celulosa o bien la adicin de sustancias tales como el
NaCl o la sacarosa a concentraciones relativamente altas lograr el
propsito de aislar microorganismos definidos.
Ejemplos de medios selectivos son el agar EMB (Eosina Azul de
Metileno), agar ENDO, agar MacConkey, S-110, SS, gelosa Rosa
de Bengala, agar Biggy, agar Verde Brillante, etc.
Medio selectivo

En esta imagen se
observan colonias de
Legionella pneumophila
creciendo en el medio de
carbn extracto de
levadura.
MacConkey, ejemplo de un medio
selectivo y diferencial

Este medio de cultivo tiene entre

sus ingredientes sustancias que
lo hacen selectivo (rojo neutro y
cristal violeta) que permitirn el
crecimiento de bacterias Gram -
y diferencial (lactosa) que
definir entre aquellos
microorganismos que fermentan
la lactosa (colonias rojas) de los
que no pueden utilizar este
azcar (colonias incoloras,
amarillas o blancas).
Medios selectivos y diferenciales
 Agar Sal manitol (ASM), ejemplo de medio
selectivo y diferencial
Este medio de cultivo permite el desarrollo de microorganismos capaces de
crecer en concentraciones de NaCl del 7.5%, adems diferencia a aquellos que
fermentan el manitol provocando el vire del indicador de pH (rojo de fenol) de
rojo a amarillo.
 Medios diferenciales
Son medios que distinguen, separan, diferencian grupos distintos
de bacterias e incluso permiten una identificacin tentativa de los
microorganismos segn sus caractersticas metablicas.
La gelosa sangre es tanto un medio diferencial como un medio
enriquecido. Sirve para distinguir entre bacterias hemolticas y no
hemolticas. La bacterias hemolticas producen zonas claras
alrededor de sus colonias debido a la utilizacin de los eritrocitos.
El agar MacConkey tambin es un medio diferencial ya que
contiene lactosa y rojo neutro de tal forma que las bacterias
fermentadoras del azcar aparecern de color rosa a rojo y son
fcilmente distinguibles de las colonias no fermentadoras.
Ejemplos de medios diferenciales son el Gelosa sangre, SS
(Salmonella-Shigella), agar MacConkey, agar Baird-Parker, agar
XLD, agar Vogel Johnson, Citrato de Simmons, LIA, Kligler,
Verde Brillante, etc. Ntese que algunos de estos medios son
adems selectivos.
Medio de gelosa sangre: enriquecido y diferencial
Gelosa sangre, medio de cultivo enriquecido y
diferencial
El medio de gelosa sangre es un
medio enriqucido que estimula
el crecimiento de una amplia
variedad de microorganismos,
sobre todo de aquellos
denominados fastidiosos,
adems permite diferenciar la
capacidad de las bacterias de
utilizar los eritrocitos
observndose entonces tres
tipos de hemlisis, la parcial
llamada alfa (), hemlisis total
o beta () y por ltimo aquellos
micrrorganismos que no
utilizan a los eritrocitos y que
no provocan ningun cambio en
el medio y se conoce como
hemlisis gamma ().
 Gelosa sangre tipos de hemlisis
Alfa Beta Gamma
SS ejemplo de un medio selectivo y diferencial

En esta imagen se observa

el desarrollo de tres tipos
de colonias crecidas en
medio SS (Shigella-
Salmonella). Las colonias
rojas pertenecen a
bacterias capaces de
fermentar la lactosa
(Lac+), las incoloras son
bacterias que no
fermentan este azcar
(Lac-) y las negras son las
que producen cido
sulfhdrico (H2S).
Cromoagar, ejemplo de medio selectivo y
diferencial

El cromoagar es un medio
de cultivo desarrollado
por BiomeriauxTM que
permite selccionar y
diferenciar diversas
especies microbianas en
funcin del color que
presentan las colonias.
Diversos medios de cultivo
 Medios de enriquecimiento
Enriquecer significa, en este caso, proporcionar al
microorganismo que se desea aislar todos los elementos nutritivos
necesarios para que alcance su ptimo crecimiento.
Las aplicaciones de esta metodologa estn sujetas a la pericia e
ingenio del investigador. Los medios de enriquecimiento se usan
para aumentar el nmero relativo de organismos de un tipo en
relacin al total. Por ejemplo, enriquecer un patgeno minoritario
particular presente en una muestra altamente contaminada con
otros microorganismos irrelevantes desde el punto de vista
mdico pero que se encuentran en franca mayora.
Ejemplos de estos medios son: caldo tetrationato de Meller,
caldo selenito de sodio, medio de Stuart, caldo Meller-Hinton,
caldo urea, caldo tioglicolato, agua peptonada, Monsur, etc.
 Medios de transporte
Estos medios se utilizan para el transporte de
diversas muestras biolgicas evitando la muerte de
los microorganismos de inters.
La caracterstica de estos medios es que su
composicin permite la viabilidad de los
microorganismos pero no permite su
multiplicacin
Ejemplos de estos medios son los medios de
Stuart, de agua peptonada para Vibrio, Cary y
Blair, Glicerol-Solucin Salina, Amies y Douglas,
Hajna, Caldo de Fildes etc.
 Bibliografa
Baron J. E, y S. M. Finegold. 1990. Bailey and Scott Diagnostic
Microbiology. 8a. Ed. The C.V. Mosby Co.
Barrow G. I. y R. K. A. Feltham. 1993. Cowan and Steels Manual for the
Identification of Medical Bacteria. 3a. Ed. Cambridge University Press.
Gerhardt, P. 1993. Molecular Biology, Genetics Methods for General and
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Hurst, C. J., R. L. Crawford, G. R. Knudsen, M. J. McInerney, & L. D.
Stetzenbach. 2002. Environmental Manual of Environmental Microbiology.
ASM Press, Washington, USA
MacFaddin F. J. 1991. Pruebas Bioqumicas para la identificacin de
Bacterias de Importancia Mdica. Editorial Mdica Panamericana.
Madigan M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 1999. Brock. Biologa de los
Microorganismos. 8a Ed. Prentice Hall, Inc.
Prescott L. M., J. P. Harley y D. A. Klein. 1999. Microbiologa. 4a. Ed.
McGraw Hill-Interamericana.
Wistreich, G. 1999. Microbiology perspectives. Prentice-Hall Inc.
 2.9 Aislamiento
En los hbitats naturales, los microorganismos crecen en
poblaciones mixtas y complejas que contienen varias especies. Esto
representa un problema para el microbilogo porque no se puede
estudiar adecuadamente un nico tipo de microorganismo en un
cultivo mixto. Se necesita un cultivo puro o axnico, poblacin de
clulas que procede de una nica clula. La obtencin de cultivos
puros ha sido vital para el desarrollo y transformacin de la
microbiologa. Fue el bacterilogo alemn Robert Koch el iniciador
de las importantes tcnicas de aislamiento utilizando la superficie de
una papa, gelatina y mas tarde agar.
En casi 20 aos, se ha aislado a la mayora de los agentes patgenos
responsables de las principales enfermedades infecciosas humanas.
Para el aislamiento de microorganismos se cuenta con varios
mtodos, los mas usados son el mtodo de la estra cruzada y el
mtodo de las diluciones
Objetivo del aislamiento: separar a los
microorganismos a partir de una mezcla
 Mtodos de Aislamiento

Mtodo de las diluciones

a) Dispersin con varilla
b) Vaciado en placa

Mtodo de la estra cruzada

 Mtodo de las diluciones
El mtodo de las diluciones consiste en mezclar una
serie de volmenes definidos, de los cuales se toman
alcuotas que se siembran en medio de cultivo slidos ya
sea depositando la alcuota en la superficie y
dispersndola uniformemente con una varilla de metal o
de vidrio acodada o bien mezclando la alcuota con
medio de cultivo fundido en un tubo enfriado a 45oC y
vertiendo inmediatamente en una caja de Petri estril o
bien haciendo una variante en donde la alcuota se
deposita directamente en la base de una caja de Petri y
se le adiciona el agar previamente enfriado, procediendo
a mezclar suavemente.
 Mtodo de las diluciones

La muestra original se diluye varias veces para

reducir suficientemente la poblacin bacteriana.
Luego se mezclan las muestras ms diluidas con agar
fundido y se vierte en placas de Petri. Las clulas
aisladas crecen formando colonias que se pueden
utilizar para desarrollar cultivos puros. Las colonias
de la superficie son generalmente circulares, las
situadas dentro del agar sern lenticulares.
Mtodo de las diluciones
 Mtodo de las diluciones dispersin
con varilla

Si se extiende una mezcla de clulas en una superficie de agar, de

manera que cada clula crece formando una colonia
independiente, cada colonia representa un cultivo puro o axnico.
La siembra por dispersin con una varilla acodada de vidrio o
metal es una forma directa y fcil de conseguir este resultado. Se
deposita un volumen pequeo de una mezcla microbiana diluida
conteniendo entre 100 y 200 clulas, o menos, en el centro de una
placa de agar y se extiende uniformemente sobre la superficie con
la varilla previamente esterilizada. Las clulas dispersas
desarrollarn colonias aisladas. Como el nmero de colonias
debera ser igual al nmero de organismos en la muestra, este tipo
de aislamiento se utiliza para contar una poblacin microbiana.
 Mtodo de las diluciones: vaciado en placa
La siembra por vaciado en placa que se emplea ampliamente con
bacterias y hongos, genera tambin colonias aisladas. La muestra
original se diluye varias veces para reducir la poblacin
mirobiana lo suficiente, con el fin de obtener colonias separadas
cuando se depositen en un medio de cultivo apropiado. El mtodo
consiste en mezclar volmenes pequeos de varias muestras
diluidas con agar lquido que se ha enfriado a aproximadamente
45oC y la mezcla se deposita en cajas de Petri estriles, o bien se
deposita la alicuota en la base de una caja de Petri estril y se
adiciona el agar fundido. La mayora de las bacterias y de los
hongos no se destruyen con una exposicin breve al agar caliente.
Una vez que el agar se ha solidificado, cada clula forma una
colonia individual. El nmero total de colonias equivale al
nmero de organismos viables en la muestra diluida. Las colonias
que crecen obre la superficie se pueden utilizar tambin para
inocular un medio fresco y preparar cultivos puros.
Dispersin con varilla y vaciado en placa
Tcnicas de siembra con varilla de vidrio y vaciado
en placa
 Mtodo de la estra cruzada
El mtodo de la estra cruzada consiste en depositar en una rea de
la placa de medio de cultivo slido una asada de la muestra o cultivo
mixto que sirve de inculo, el cual se extiende con el asa haciendo
varios trazos en forma de secante cada vez mayor de la orilla hacia
el centro, pero solamente a una distancia de 1 a 2 cm de la orilla. Se
esteriliza el asa, se deja enfriar o se introduce en el medio en un
lugar que no interfiera con las siguientes estras. Se gira la caja de
Petri un quinto de vuelta y con el asa estril, se hace una serie de
nuevas estras que deben extender una pequea porcin de la
primera serie en forma similar con trazos que vayan de la orilla
hacia el centro. La operacin se repite dos veces mas y en la quinta
se hace una serie de estras abiertas que termine en o cerca del
centro, cuidando que no se toquen las estras anteriores.
Mtodo de la estra cruzada
Aislamiento por estra cruzada
Toma de inculo y siembra por estra cruzada
Mtodos de aislamiento: diluciones y estra cruzada
 Las cajas de Petri y el cuentacolonias
Las tcnicas anteriores precisan de placas especiales de cultivo, denominadas
placas o cajas de Petri, en memoria de su inventor, Julius Richard Petri, miembro
del laboratorio de Robert Koch. Petri dise estas placas hacia 1887, estn
formadas por dos mitades circulares; la parte superior (tapa) se superpone sobre
la inferior. Son muy fciles de usar y pueden apilarse para ahorrar espacio y
constituyen uno de los materiales ms comunes de los laboratorios de
microbiologa.
El cuentacolonias como su nombre lo dice permite la cuantificacin precisa de las
colonias que aparecen en la superficie de un medio de cultivo.
 Se pueden cultivar todas las bacterias?
No todas las bacterias viables presentes en una muestra
pueden cultivarse in vitro, dependiendo de la muestra,
se estima que solamente crecen en los diferentes medios
de cultivo entre un 20-50% de las especies presentes.
Incluso a partir de muestras de suelo y marinas se
pueden cultivar slo el 1% de las especies presentes.
Esto es debido a que algunas de ellas viven en simbiosis
obligada, o son inhibidas por los componentes del
medio de cultivo, tienen requerimientos nutricionales o
condiciones de incubacin y tensin de oxgeno y
bixido de carbono muy particulares y estrechas, que el
medio de cultivo y condiciones de incubacin no les
proporcionan.
 Bibliografa
Black, J. G. 1999. Microbiology Principles and Explorations. 4a. Ed.
Prentice Hall, Inc.
Madigan M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 1999. Brock Biologa de
los Microorganismos. 8a Ed. Prentice Hall, Inc.
Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2000. Brock Biology of
Microorganisms. 9a. Ed. Prentice Hall Inc.
Prescott L. M., J. P. Harley y D. A. Klein. 1999. Microbiologa. 4a.
Ed. McGraw Hill-Interamericana.
2.11 Conceptos de microorganismos aerobio, facultativo,
anaerobio, microaeroflico, aerotolerante y capnico.

Los microorganismos varan en sus

necesidades o tolerancia de oxgeno. De
hecho los microorganismos pueden ser
divididos en diversos grupos dependiendo
del efecto del oxgeno.
Clasificacin de los microorganismos
dependiendo del efecto del oxgeno

Aerobios obligados
Facultativos
Microaeroflicos
Aerotolerantes
Anaerobios
 AEROBIOS OBLIGADOS
Los aerobios son capaces de crecer con
tensin de oxgeno que se encuentra en la
atmsfera (21%) y muchos pueden soportar
incluso concentraciones mas altas.
Estos microorganismos poseen enzimas como
catalasa, peroxidasa, superxido dismutasa
(SOD) que descomponen los productos txicos
derivados del metabolismo del oxgeno.
Ej. Bacillus spp., Pseudomonas spp,
Mycobacterium spp., Micrococcus spp.,
Streptomyces spp.
 ANAEROBIOS
Son organismos que carecen de sistemas
respiratorios y no pueden utilizar el oxgeno
como aceptor final de electrones. Estos
microorganismos no pueden producir energa
mediante la respiracin aerobia y deben utilizar
vas de fermentacin o respiracin anaerobia
para este objetivo. Mueren adems en su presencia
porque son incapaces de eliminar los productos
txicos derivados del metabolismo del oxgeno
(H2O2, O-2, OH- ).
Ej. Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium,
Methanococcus.
 FACULTATIVOS
Son microorganismos que pueden crecer en
ausencia o en presencia de oxgeno.
No lo requieren para crecer, pero lo hacen
mejor en su presencia llevando a cabo un
metabolismo aerbico. Cuando no hay
oxgeno, fermentan o realizan una
respiracin anaerbica.
Ej. Escherichia, Klebsiella, Salmonella,
Shigella.
 MICROAEROFLICOS
Los microaeroflicos son aerobios que
pueden utilizar el oxgeno cuando su
tensin es mas baja que la del aire (2-
10%), usualmente por su limitada
capacidad de respirar o porque poseen
algunas enzimas sensibles al oxgeno.

Ej. Campylobacter
 AEROTOLERANTES
Son microorganismos que pueden tolerar o
soportar el oxgeno y crecer en su
presencia an cuando no lo utilizan.
Utilizan vas fermentativas o respiracin
anaerobia para la produccin de energa.

Ej, Enterococcus, Streptococcus.

 Relacin de los microorganismos con el oxgeno
Grupo Relacin con el Tipo de Ejemplo Habitat
O2 metabolismo
AEROBIOS
Obligados Lo requieren Respiracin aerbica Micrococcus luteus Piel

Facultativos No lo requieren pero Respiracin aerbica, Escherichia coli Instestino delgado de

crecen mejor en su anaerbica y mamferos.
presencia. fermentacin

Microaeroflico Lo requieren pero a Respiracin aerbica Spirillum volutans Lagos

niveles menores que
el atmosfrico
ANAEROBIOS
AerotolerantesS No lo requieren y no Fermentacin o Streptococcus Tracto respiratorio
crecen mejor en su respiracin anaerbica pyogenes superior
presencia

Obligados Daino o letal Respiracin Clostridium Suelo, fango.

anaerbica o botulinum
fermentacin
 Crecimiento aerbico, anaerbico,
facultativo, microaeroflico y aerotolerante.
(a) El oxgeno slo penetra un
poco en el medio, as los
aerobios obligados crecen solo
en la superficie.
(b) Los anaerobios, como son
sensibles al oxgeno, crecen en el
fondo, lejos de la superficie.
(c) Los facultativos crecen en
todo el tubo.
(d) Los microaeroflicos tienden
a crecer cercanos a la superficie.
(e) Los aerotolerantes crecen en
todo el tubo.
Se ha aadido una pequea
cantidad de agar al medio as
como resazurina, indicador de
potencial redox (rosa en estado
oxidado e incoloro en estado
reducido).
 Microorganismos capnicos
Este grupo de microorganismos requieren
para su crecimiento una atmsfera de CO2
y por lo tanto deben incubarse en estufas
especiales que proporcionen este ambiente.

Ejemplos: Listeria, Brucella,

 Bibliografa
Black, J. G. 1999. Microbiology Principles and Explorations. 4a. Ed.
Prentice Hall, Inc.
Madigan M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 1999. Brock Biologa de
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Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2000. Brock Biology of
Microorganisms. 9a. Ed. Prentice Hall Inc.
Prescott L. M., J. P. Harley y D. A. Klein. 1999. Microbiologa. 4a.
Ed. McGraw Hill-Interamericana
 2.13 METODOS DE CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS A CORTO, MEDIANO
Y LARGO PLAZO.
La conservacin de organismos de referencia es
el punto central sobre el que se basan la
adecuada nomenclatura y clasificacin.
Objetivos
1. Que el microorganismo se mantenga vivo
2. Que se mantenga puro, es decir sin
contaminacin.
3. Que la clulas se mantengan genticamente
estables.
Mtodos de conservacin de microorganismos
Corto plazo
1. Subcultivos o resiembras peridicas
2. Suspensin en agua destilada o en agua de mar
estril.
Mediano plazo
1. Inmersin en aceite mineral
2. Congelacin
3. Desecacin
Largo plazo
1. Liofilizacin
2. Ultracongelacin
 Mtodos de conservacin a corto plazo
1. Subcultivos o resiembras peridicas
Es el mtodo ms comn para conservar a las bacterias y consiste en
transferencias peridicas a medios nuevos. El intervalo entre las resiembras vara
de acuerdo al microorganismos, el medio empleado y a las condiciones externas.
Se deben determinar las siguientes condiciones cuando se utiliza este mtodo:
un medio adecuado de mantenimiento, una temperatura ideal de
almacenamiento y establecer la frecuencia adecuada de las transferencias

2. Suspensin en agua destilada o en agua de mar estril

Es un mtodo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos
microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y bacterias. En el
caso de microorganismos marinos se utiliza agua de mar diluida. La
concentracin celular no debe de ser superior a 104-105 clulas/mL en el caso de
bacterias y levaduras y para los hongos se suspenden trocitos de agar con el
crecimiento del hongo.
 Desventajas de los mtodos a
corto plazo
1. Riesgos de contaminacin
2. Equivocaciones al etiquetar
3. Seleccin de variantes o mutantes
4. Posible prdida del cultivo por un medio
de mantenimiento inadecuado, temperatura
de conservacin incorrecta o un intervalo de
transferencia equivocado
5. Espacio requerido para el almacenamiento
Mtodos de conservacin a mediano plazo

1. Inmersin en aceite mineral

Muchas especies bacterianas pueden ser exitosamente conservadas por
meses o an aos utilizando este mtodo sencillo y barato que consiste
en inocular aceite mineral o aceite de parafina con los
microorganismos que deseamos mantener.
El aceite se esteriliza en un horno a 180oC de 1.5 a 2 horas.
Con este mtodo se minimiza la deshidratacin y se reduce la actividad
metablica.
El cultivo que se encuentra bajo el aceite se transfiere utilizando el asa
a un medio fresco y el crecimiento se reanudar.
Desventajas
Las desventajas son similares a las de resiembra peridica pero adems
el trabajar con aceite no siempre es agradable
 Mtodos de conservacin a mediano plazo

2. Congelacin
La conservacin de bacterias en el congelador comn con una
temperatura de 0 a -20oC produce resultados muy variables y su
xito depende del tipo de bacteria. Se congelan las clulas en
suspensin en un lquido con un agente crioprotector. El agua se
congela a estas bajas temperaturas por lo que las clulas detienen
su crecimiento.
Existen factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las
clulas conservadas por este mtodo
a) Edad de las clulas
b) Velocidad en la congelacin y descongelacin
c) Temperatura de almacenamiento
d) Uso de agentes crioprotectores
 Mtodos de conservacin a
mediano plazo
3. Desecacin
La mayora de los cultivos mueren si se dejan secar en el laboratorio,
sin embargo aquellas clulas capaces de formar estructuras de
resistencia pueden ser conservadas por aos.
Desecacin en papel filtro
Desecacin en suelo, arena o silicagel
Desecacin en gelatina
Desecacin en bolitas de alginato
Desecacin en sal gorda para halobacterias
Todos los mtodos son sencillos y baratos y consisten en aadir
suspensiones densas de clulas al sustrato estril seleccionado, dejar
secar y almacenar.
 Mtodos de conservacin a largo plazo

1. Liofilizacin
La liofilizacin involucra la remocin de agua de una suspensin
celular congelada por medio de una sublimacin bajo presin
reducida, esto es, el agua se evapora sin pasar por el estado lquido.
Las clulas secas pueden almacenarse por largos perodos si se
mantienen alejadas del oxgeno, la humedad y la luz. Y podemos en
cualquier momento rehidratarlas y restaurar su estado original.
Para una buena liofilizacin es conveniente considerar: la velocidad
de la congelacin, la seleccin de agentes crioprotectores, el tipo de
organismo, la concentracin celular, la temperatura durante la
sublimacin, el grado de deshidratacin alcanzado, la atmsfera de
oxgeno en el tubo de liofilizacin y las condiciones de
almacenamiento.
 Equipo de liofilizacin
Equipos de liofilizacin en donde se observan las charolas que se utilizan para
eliminar la humedad. Una vez que el proceso de liofilizacin ha terminado, este
equipo tapa de manera automtica los recipientes.
El equipo que se muestra a la derecha tiene muestras precongeladas en recipientes
de diferentes tamaos que se unen a la desecadora la cual proporciona el vaco que
permite remover el agua. La muestra estar seca en 4-20 horas.
 Mtodos de conservacin a largo plazo

2. Ultracongelacin
Una conservacin a largo plazo puede tambin lograse
almacenando los cultivos a la temperatura del nitrgeno lquido (-
196oC). La American Type Culture Collection (ATCC) ha
conservado por 25 aos bacterias fastidiosas sin prdida alguna
de sus propiedades fenotpicas y fenotpicas.
La conservacin tambin puede hacerse utilizando un Revco que es
un ultracongelador con temperatura de -70oC.
El uso de nitrgeno lquido se considera un mtodo caro, pero la
historia reciente indica que es un mtodo muy exitoso. Existe una
amplia variedad de refrigeradores de nitrgeno lquido cuya
capacidad permite almacenar de 300 a 40,000 ampolletas.
 Agentes Crioprotectores
Las clulas que se van a conservar por congelacin,
ultracongelacin o liofilizacin deben suspenderse en un agente
crioprotector.
Se tienen dos tipos de agentes crioprotectores, los que protegen
desde el interior de la clula y los que actan desde el exterior.
Entre los del primer tipo estn el glicerol y el dimetil sulfxido
(DMSO) que son capaces de atravesar la membrana citoplsmica y
proporcionar proteccin por dentro y por fuera de la clula durante
el drstico proceso de congelacin. Entre las sustancias que
protegen desde el exterior se encuentran la sacarosa, lactosa,
glucosa, manitol, sorbitol, dextrana, polivinilpirrolidona (PVP)
y el poliglicol.
Los agentes mas afectivos han sido el DMSO y el glicerol que se
utilizan de rutina a una concentracin del 5-10% (vol/vol). Sin
embargo la seleccin del mejor agente depender de la especie
bacteriana.
 Bibliografa
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