Anda di halaman 1dari 17

LAPORAN PRAKTIKUM BIOSAINS

ISOLASI dan KULTUR PBMC


Dosen : Prof. Dr. dr.Loeki Enggar Fitri, M. Kes., SpParK

Oleh:
Yulinar Risky Karaman
166070100111004

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK


FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
2017
BAB 1
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Kultur jaringan termasuk dalam ruang lingkup bioteknologi. Bioteknologi kultur
jaringan adalah teknik pemeliharaan jaringan atau bagian dari individu secara buatan
(artifisial). Arti secara buatan adalah dilakukan di luar individu yang bersangkutan dan sering
kali disebut kultur in vitro, sebagai lawan dari in vivo. Dikatakan in vitro (bahasa Latin,
berarti "di dalam kaca") karena jaringan dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau cawan Petri
dari kaca atau material tembus pandang lainnya. Kultur jaringan pada dasarnya dapat
dilakukan baik pada tumbuhan maupun hewan,
Pada percobaan ini, akan dilakukan proses kultur sel monosit yang berasal dari darah
Jika kultur yang dilakukan berhasil dengan baik, maka akan tumbuh sel monosit pada media
yang ditumbuhkan tanpa ada kontaminasi dan saat diperiksa dibawah mikroskop akan
menunjukkan morfologi yang normal

1.2 Tujuan

1. Untuk mengetahui teknik isolasi PBMC dengan menggunakan gradien densitas


2. Untuk mengetahui prosedur kultur sel monosit.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kultur Jaringan/Sel


Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk memperbanyak jaringan/sel yang
berasal atau yang didapat dari jaringan orisinal tumbuhan atau hewan setelah terlebih dahulu
mengalami pemisahan (disagregasi) secara mekanis, atau kimiawi (enzimatis) secara in vitro
(dalam tabung kaca).
Pada mulanya (sekitar tahun 1910), kultur jaringan/sel hewan (animal tissue/cell
culture) merupakan metode untuk mempelajari tingkah laku atau sifat-sifat sel hewan dalam
keadaan fisiologis maupun dalam kondisi artifisial karena suatu perlakuan (treatment). Pada
awalnya yang digunakan untuk kultur adalah jaringan sehingga kembangkan kultur jaringan
menjadi istilah yang digunakan.
Kultur jaringan (tissue culture) dalam arti luas menyangkut pengertian umum yang
meliputi: kultur organ (organ culture), kultur jaringan (explant culture), dan kultur sel (cell
culture). Padahal sebenarnya, batasan mengenai kultur organ adalah kultur dari organ utuh
atau sebagian organ yang secara histologis seperti halnya in vivo. Sedangkan kultur jaringan
dan/atau kultur sel merupakan kultur dispersi sel (sel yang telah dipisahkan) yang berasal
atau yang didapat dari jaringan orisinal setelah terlebih dahulu mengalami pemisahan
(disagregasi) secara mekanis, atau kimiawi (enzimatis). Kultur sel yang didapat dari jaringan
secara langsung disebut kultur sel primer, sedangkan kultur sel yang telah mengalami
penanaman berulang-kali (passage) disebut kultur cell line atau sel strain.
Kultur sel pada hewan dapat terjadi akibat adanya sifat totipotensi sel yaitu setiap sel
mengandung seluruh informasi genetik dan mempunyai kemampuan untuk dapat berkembang
menjadi individu yang sama dengan induknya. Saat ini, kultur jaringan tumbuhan
berkembang lebih pesat daripada kultur jaringan hewan, mengingat kultur jaringan tumbuhan
lebih mudah dilakukan dengan biaya yang relatif murah dan angka keberhasilan yang lebih
tinggi. Hal ini disebabkan karena sel-sel tumbuhan memiliki daya totipotensi yang lebih
tinggi daripada sel hewan. Sel hewan memilki struktur yang lebih komplek daripada sel
tumbuhan baik secara morfologi maupun fisiologis (aktivitas metabolisme lebih banyak).
Peralatan yang digunakan dalam kultur jaringan hewan lebih mahal serta faktor teknis dalam
kultur jaringan hewan lebih sulit.
Untuk menunjang keberhasilan kultur jaringan hewan, maka dalam melaksanakan
kultur jaringan hewan ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan
jaringan yang dibiakkan. Prasyarat yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh
yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh (membelah dan
berkembangbiak) dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media
tumbuh harus mengandung berbagai bahan/ nutrisi yang diperlukan jaringan untuk hidup dan
memperbanyak dirinya seperti air, vitamin, mineral dan hormon.
Di dalam media kultur jaringan hewan harus terdapat kondisi fisik yang optimal
meliputi pH, tekanan, sumber energi dan sumber karbon, asam amino, vitamin, mineral dan
air. Berdasarkan asalnya, media dibagi menjadi 2, yaitu:
1. Media alami adalah media yang berasal dari cairan jaringan embrio dan medium
plasma darah. Plasma darah merupakan komponen terbesar dalam darah, karena lebih
dari separuh darah mengandung plasma darah. Hampir 90% bagian dari plasma darah
adalah air. Plasma darah berfungsi untuk mengangkut sari makanan ke sel-sel serta
membawa sisa pembakaran dari sel ke tempat pembuangan
2. Media sintetik adalah media yang dibuat secara kimia, misalnya: DMEM, RPMI.

Media untuk kultur sel dan jaringan harus mengandung sumber energi dan sumber karbon
(karbohidrat), asam amino (protein), vitamin, mineral, dan air. Hal ini berlaku baik untuk
kultur sel dan jaringan hewan maupun tumbuhan.

Sampai saat ini telah dilakukan banyak penelitian tentang media untuk kultur sel dan jaringan
hewan maupun tumbuhan. Pada dasarnya medium untuk kultur sel dan jaringan dapat berupa
media alami maupun buatan.

Media Alami
Media alami ialah media yang diperoleh dari bahan-bahan alami seperti ekstrak buah-buahan,
darah, ekstrak sel dan lain-lainya. Komposisi kimia yang pasti dari suatu media alami tidak
diketahui. Media alami merupakan media yang kompleks yaitu mengandung karbon, sumber
N (asam amino) vitamin, mineral, air, serta hormon dan enzim-enzim. Kultur jaringan
tumbuhan dapat menggunakan media alami maupun media buatan dengan tingkat
keberhasilan yang sama, tetapi pada kultur jaringan hewan penggunaan media alami seperti
serum juga memberikan tingkat keberhasilan yang tinggi pada kultur jaringan hewan.
Bahan alami yang digunakan untuk menumbuhkan sel dari jaringan dapat dikelompokkan
dalam tiga kategori, yaitu:
1. Koagulat, misalnya koagulan plasma darah dan kolagen.
2. Cairan bologis, misalnya serum.
3. Ekstrak jaringan, misalnya ekstrak embrio.

Plasma darah merupakan salah satu contoh media alami dalam kultur jaringan hewan. Darah
adalah cairan yang terdapat pada semua hewan tingkat tinggi yang berfungsi mengirimkan
zat-zat dan oksigen yang dibutuhkan oleh jaringan tubuh, mengangkut bahan-bahan kimia
hasil metabolisme, dan juga sebagai pertahanan tubuh terhadap virus atau bakteri. Istilah
medis yang berkaitan dengan darah diawali dengan kata hemo- atau hemato- yang berasal
dari bahasa Yunani haima yang berarti darah.

Darah terdiri dari dua komponen yaitu plasma darah dan sel-sel darah. Plasma darah adalah
bagian darah yang cair. Plasma darah ini digunakan sebagai media alami dalam kultur
jaringan hewan, karena plasma darah mengandung berbagai nutrisi yang diperlukan oleh sel-
sel/ jaringan yang sedang dikultur, untuk tumbuh (membelah dan berkembangbiak). Plasma
darah mengandung 91,5% air dan 8,5% zat-zat terlarut. Zat-zat yang terlarut dalam plasma
darah meliputi molekul-molekul dan berbagai ion yaitu glukosa sebagai sumber energi dan
asam-asam amino. Ion-ion yang terdapat dalam plasma darah adalah ion Natrium (Na+) dan
Klor (Cl-). Plasma darah mengandung 7% molekul-molekul protein seperti; serum albumin
4%, serum globulin 2,7% dan fibrinogen 0,3%. Serum adalah cairan darah yang tidak
mengandung fibrinogen (komponen yang berperan dalam proses pembekuan darah).

Media Buatan
Media alami tidak dapat ditentukan komponen-komponen penyusuna secara pasti, demikian
juga dengan prosentase masing-masing komponen masih belum dapat ditentukan. Hal ini
disebabkan media alami adalah media yang kompleks. Oleh sebab itu media alami kurang
tepat jika digunakan dalam penelitian.

Pada saat ini telah dikembangkan media buatan. Media buatan komposisinya dan prosentase
kandungan zat-zat nutriennya dapat diketahui dengan pasti. Disamping itu, media buatan
dapat diamanipulasi komposisi komponen penyusunya sehingga media buatan sangat cocok
digunakan dalam percobaan dan penelitian.
Media buatan dapat memberikan hasil ang sama baiknya dengan media alami apabila
komponen-komponen dan kondosi fisik yang diperlukan oleh sel atau jaringan yang dikultur
pada media tersebut terpenuhi.

Sedangkan berdasarkan kebutuhannya media dibagi menjadi 3, yaitu:


1. Minimum essential medium (MEM) adalah yaitu medium dasar yang tersusun atas
BSS, asam amino esensial dan vitamin.
2. Medium pemelihara (maintenance medium/mm) adalah medium yang digunakan
untuk memelihara kehidupan sel dalam metabolisme rendah dan jangka waktu agak
lama. Medium ini terdiri dari mem dan serum konsentrasi rendah (2 5 %).
3. Medium penumbuh (growth medium) adalah medium yang diperkaya dengan
nutrien-nutrien untuk menumbuhkan kultur sel secara cepat, medium ini ditambahkan
serum cukup banyak (10 20 %).

2.2 Teknik Kultur Jaringan/Sel Hewan


Cara kultur jaringan hewan harus dilakukan pada suatu ukuran kecil (area yang relatif kecil)
untuk meminimalkan kemungkinan terjadinya kontaminasi. Keadaan lingkungan baik
didalam kultur (media) maupun diluar kultur (udara, praktikan/ manusia yang melakukan
kultur, kondisi laboratorium) harus dioptimalkan. Selama kultur, faktor fisik seperti unsur
hara dan hormon harus diperhatikan. Semua sumber kontaminasi (ruangan laboratorium,
laminer dan alat-alat bedah untuk kultur) harus ditiadakan dengan cara sterilisasi.

Berdasarkan tempat yang digunakan untuk kultur sel atau jaringan hewan terdapat 3 teknik
kultur jaringan yaitu :
1. Slide Culture adalah yaitu menumbuhkan kultur sel pada gelas obyek cekung.
2. Flask Culture adalah menumbuhkan kultur sel pada cawan kultur.
3. Test-tube Culture adalah menumbuhkan kultur sel pada tabung reaksi, botol terutama
untuk jenis sel yang tidak melekat.

Flask Culture
Flask Culture memberikan keuntungan lebih jika dibandingkan dengan slide culture. Dengan
Flask Culture jaringan dapat dikultur sampai berbulan-bulan, bahkan bertaun-tahun.
Sejumlah besar kultur dapat dipersiapkan secara komperatif. Kultur dapat berkembang lebih
pesat. Medium dapat dapat diambil untuk keperluan pengujian, fase gas dapat dikontrol
dengan mudah dan jumlah medium dapat dapat diukur secara tepat. Wadah yang baik untuk
flask culture adalah Carrel flask.

Terdapat dua tipe Flask Culture, yaitu Thick Clot Culture dan Thin Clot Culture. Thick Clot
Culture sangat baik untuk mendukung pertumbuhan yang cepat dari suatu kultur jaringan.
Lapisan medium dari Thick Culture dapt diambil beserta eksplanya untuk keperluan
pewarnaan. Sedangkan Thin Culture sangat baik sebagai uji pengaruh makanan pada medium
terhadap kultur.

Prosedur pelaksanaan Flask Culture sebagai berikut:


1. Mengambil beberapa carrel flask yang berdiameter 3,5 cm dan membakar bagian
mulut cawan/tepi tesebut.
2. Meneteskan satu tetes plasma ke dasar cawan dan menebarkan plasma tersebut denga
spatula.
3. Dengan menggunakan spatula, memasukkan sejumlah eksplan kedalam cawan dan
mengatur posisinya.
4. Sesudah plasma mengeras maka eksplan akan terfiksasi pada posisi masing-masing,
kemudian menambahkan medium ekstra. Untuk thick culture yang ditambahkan
adalah serum dengan konsentrasi dan volume yang sama.
5. Kemudian hasilnya disimpan dalam cawan dan disimpan dalam inkubator yang
mengandung gas CO2 5%.

Penggantian medium pada Flask Culture dapat ditempuh dengan cara sebagai berikut:
1. Medium yang lama disedot dengan menggunakan pipet untuk dibuang.
2. Menambahkan medium baru dengan volume 1,2 ml.
3. Cawan dimasukkan kedalam inkubator yang mengandung CO2 seperti semula.

Pada thick clot culture penggatian medium dapat dtempuh dengan jalan cawan dibalik dan
plasma dialirkan selama bebepara jam. Selanjutnya diberikan medium baru. Dalam kasus
tertentu penambahan lapisan plsma dapat ditempuh dengan jalan meneteskan plasma segar
supaya membentuk lapisan.
Flask Culture juga memungkinkan untuk dilakukan pemindahan eksplan. Eksplan yang telah
tumbuh dapat diambil dengan mudah dan dipotong-potong menjadi beberapa potongan dan
masing-masing potongan dapat diperlakukan sebagai eksplan.

2.3 Monosit
Monosit adalah jenis sel darah putih yang tidak memiliki granula (butiran halus dalam
sel), berbeda dengan neutrofil yang memiliki granula yang merupakan dari sistem kekebalan
tubuh. Monosit ini lebih kuat daripada neutrofil dan dapat memakan kuman atau bakteri yang
lebih besar ukurannya. Monosit diproduksi dalam sumsum tulang pada tubuh manusia dan
akan beredar dalam darah dalam jumlah kira kira 300 500 monosit dalam mikroliter
darah. Setelah itu, monosit akan masuk ke dalam jaringan tertentu untuk mengalami
pematangan menjadi sel makrofag yang akan berfungsi untuk sistem kekebalan berikutnya.
Fungsi dari monosit adalah untuk sistem kekebalan pada tubuh manusia. Permukaan
sel monosit yang tidak mulus dikarenakan memiliki protein spesifik di atasnya yang
memungkinkan untuk mengikat benda benda asing seperti bakteri atau sel virus.Monosit
akan menghancurkan benda benda asing tersebut dalam tubuh, menghancurkan sel sel
yang kelainan seperti sel kanker, dan juga membuang jaringan tubuh yang sudah rusak atau
mati. Selain itu, monosit berfungsi dalam proses peradangan sehingga dalam prosesnya
monosit akan menimbulkan gejala seperti demam, rasa nyeri pada organ tertentu, dan juga
warna kemerahan yang timbul pada organ yang mengalami peradangan.

Gambar 2.3 Gambaran Sel Monosit


BAB 3
METODOLOGI

3.1 Alat dan bahan Prosedur


3.1.1 Isolasi PBMC
3.1.1.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah :
1. Tabung sentrifus 15 ml
2. Micropipette
3. Swing/Break Off Centrifuge
4. Vacutainer EDTA/Heparin
Bahan:
1. Ficoll-Hipaque d=1.077 g/mL
2. Phosphat Buffer Saline (PBS)/Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X
3. Sample darah (Whole Blood)

3.1.1.2 Prosedur
1. Semua bahan yang diperlukan dikeluarkan dari lemari pendingin dan dibiarkan
sampai suhu ruang.
2. Disiapkan tabung sentrifus 15 ml dan diisi dengan Ficoll-Hipaque d=1.077 g/mL (1:1)
dengan jumlah sampel darah
3. Sampel darah dalam vacutainer EDTA yang akan diuji, dibolak-balik perlahan agar
homogen kemudian dicampur 1:1 dengan PBS/HBSS. Kemudian diambil dengan
micropipette dan disalutkan secara perlahan pada dinding tabung sentrifus 15 mL
yang sudah diisi Ficoll-Hipaque d=1.077 g/mL maka akan terbentuk 2 lapisan.
4. kemudian disentrifuge suhu ruang dengan kecepatan 1600 rpm selama 30 menit.
5. Setelah disentrifuge akan terpisah menjadi 5 lapisan, yaitu plasma, sel PBMC, Ficoll-
Hipaque, granulosit dan sel darah merah.
6. Cincin PBMC yang terbentuk diambil secara perlahan menggunakan micropipette dan
diletakkan dalam Botol sentrifus 15 ml yang baru.
7. Larutan PBMC kemudian dicuci dengan PBS 10 ml dan disentrifuge suhu ruang
dengan kecepatan 1200 rpm selama 10 menit.
Gambar 3.1.1 separasi larutan sebelum dan setelah disentrufuge

8. Supernatan dibuang dan pelet sel yang terbentuk dicuci kembali dengan PBS dan
disentrifuge kembali pada suhu ruang 1200 rpm selama 10 menit, dilakukan dua kali.
9. Setelah disentrifuge maka akan terbentuk pelet (sel PBMCs) pada dasar Botol
sentrifus 15 ml.

3.1.2 Kultur PBMC


3.1.2.1 Alat dan Bahan
Alat:
1. BSC Class I/BSC Class II
2. Inkubator 5% CO2, 37oC
3. Haemocytometre
4. Disposible pipet
5. Disposible filter
6. Disposible syringe
7. TC Well / TC Flask
Bahan:
1. RPMI-1640
2. Nabic
3. Hepes
4. Fetal Bovine Serum (FBS)
5. Penicillin-Streptomicin
6. Trypan blue 0.05%
3.1.2.1 Prosedur
Serum Free Medium:
1 sachet RPMI 1640 (10,4 gr)
2 gr Natrium bikarbonat
2,4 gr Hepes
1,25 % Pen-strep
Dilarutkan sempurna dlm 950 ml dei- water, dan diadjust pH 7,2 -7,4. Kemudian ditanda
bataskan smp 1 L.
Complete Medium:
SFM + 10% FBS
Kesemuanya difilter dg filter 0,2 um
1. Pellet hasil isolasi PBMC diresuspensi dengan medium komplit sampai 1 ml
2. Lakukan perhitungan viabilitas sel dengan metode pewarnaan tryphan blue dengan
menggunakan haemocytometer
Ambil 20l suspensi sel dan tambahkan 20l larutan trypan blue 0.05% kemudian
inkubasi selama 2-3 menit. Injectkan ke dalam haemocytometer dan hitung sel di
dalam square (sel hidup = berwarna bening, sel mati = berwarna biru)

The concentration in cells per ml =


cells in four red, large squares/4
10,000x dilution factor
3. Tanam dalam TC flask kultur atau TC Well dengan sel seeding tergantung dari luas
permukaan flask kultur atau TC Plate ( contoh : 10 6 sel per well untuk TC plate 24
Well)

4. Inkubasi dlm inkubator 5% CO2 ,37oC


BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Sel monosit diamati dibawah Perbesaran 10x pada kultur sel


haemocytometer

Perbesaran 40x
Perbesaran 20x

4.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan kultur pada sel monosit yang berasal dari whole
blood. Monosit merupakan salah satu jenis dari leukosit, leukosit merupakan komponen
darah yang sering digunakan dalam pemeriksaan pada sistem imunitas serta udah
dikembangkan di media kultur sel sehingga seringkali dipilih sebagai salah satu parameter
untuk analisa kondisi sistem imun. Leukosit dalam darah umumnya tersusun oleh limfosit,
makrofag/monosit dan granulosit. Jika ingin mendapatkan granulosit maka yang perlu
dilakukan hanyalah melisikan sel darah merah. Namun untuk memurnikan sel mononuklear
maka PBMC perlu dimurnikan dengan memanfaatkan prosedur gradien densitas.
Untuk memurnikan PBMC maka digunakan cairan Ficoll-Paque. Cairan ini berfungsi
sebagai larutan yang akan memisahkan komponen darah berdasarkan densitasnya. Prosedur
yang dilakukan adalah meletakkan larutan Ficoll-Paque di dasar eppendorf dan sampel darah
diletakkan diatas larutan Ficoll-Paque namun tidak boleh tercampur.
PBMC dipilih menjadi salah satu sampel biologis karena dapat digunakan untuk
analisa berbagai hal terkait sistem imunitas tubuh, dan juga memiliki ketahanan yang cukup
baik saat disimpan. Sel monosit dalam banyak penelitian terbaru dapat didiferensiasikan
menjadi berbagi sel seperti sel otot polos, sel endotel yang dapat menjadi peluang untuk
terapi regeneratif di masa depan. PBMC juga dapat disimpan dalam jangka waktu yang
panjang dengan cryopreservasi. Sampel PBMC dapat digunakan untuk studi pada reaksi
imun. Sel onosit yang didapat pada lapisan monolayer setelah dilakukan sentrifugasi diambil
dengan menggunakan mirko pipet dan diperiksa dibawah haemocytometer. Pemeriksaan ini
bertujuan untuk memeastikan bahwa kondisi sel monosit yang telah terpisah tidak tercampur
dengan eritrosit atau debris sel yang lain serta untuk melihat morfologi sel monosit apakah
normal atau tidak.
Media yang digunakan pada kultur sel adalah media RPMI 1640. Media RPMI pada
awalnya dikembangkan untuk kultur sel leukemia manusia dalam suspensi dan monolayer
sejak itu media RPMI 1640 telah dicoba untuk kultur berbagai sel mamalia termasuk HeLa,
Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrosit, dan karsinoma. RPMI 1640 dapat dimodifikasi untuk
berbagai aplikasi kultur sel.
RPMI 1640 merupakan medium unik dari media lain karena mengandung glutathione
reducing agent dan vitamin dengan konsentrasi tinggi. Media RPMI 1640 mengandung
biotin, vitamin B 12 , dan PABA, yang tidak ditemukan di Media DMEM atau Dulbecco
Modified Eagle Medium. Selain itu, vitamin inositol dan kolin juga terdapat dalam
konsentrasi yang sangat tinggi. Medium RPMI 1640 tidak mengandung faktor protein, lipid,
atau pertumbuhan. Oleh karena itu, Media RPMI 1640 membutuhkan suplementasi,
umumnya dengan 10% Fetal Bovine Serum (FBS). RPMI 1640 Medium menggunakan buffer
natrium bikarbonat (2,0 g / L), dan karena itu membutuhkan lingkungan dengan kadar CO 5-
10% 2 untuk mempertahankan pH fisiologis.
Pada media kultur perlu ditambahkan antobiotik untuk menghindari kemungkinan
kontaminasi bakteri. Antibiotik yang digunakan pada medaia ini adalah penisilin-streptomisin
yang dicampurkan pada media RPMI 1640 sehingga saat dilakukan inkubasi pada kultur akan
meminimalisir tumbuhnya bakteri. Pengamatan yang dilakukan pada sel monosit yang telah
diresuspensi pada media kultur menunjukkan bahwa sel monosit yang berasal dari PBMC
terlihat utuh dan tidak terdapat kerusakan pada strukturnya. Selain itu sel monosit juga tidak
bertumpuk yang menandakan bahwa populasi sel tidak terlalu padat dan dapat ditumbuhkan
dalam inkubasi media.
Untuk menanamkan sel kultur pada media maka perlu dihitung jumlah sel yang bisa
ditaanam.

Gambar 4.2 . Sel monosit dalam satu lapang pandang (jumlah 8 sel)
Dari hasil pengamatan dibawah haemocytometer didaptkan bahwa jumlah sel satu lapang
pandang terlihat 8 sel, untuk menentukan sel dapat ditanam pada media kultur maka perlu
dihitung jumlah konsentrasi sel/ml. Rumus untuk menetukan konsentrasi sel per ml maka
jumlah sel dalam empat kotak besar lapang pandang haemocytometer/4 x 10.000 x dilution
factor. Faktor dilusi didapatkan total volume dari pbmc sel awal ditambah jumlah larutan
HIPAQ dibagi total volume sel. Pada praktikum kali ini dignakan 20l larutan sel PBMC
ditambah 20l HIPAQ, sehingga faktor dilusi adalah 40/20=2 Sedangkan jumlah sel adalah
8/4x 10.000x 2 = 40.000 sel. Jadi sel dapat diketahui jumlahnya sekitar 40.0000 sel dalam
larutan. Dengan jumlah sel tersbut maka kultur dapat dilanjutkan karena jumlah sel sudah
mencukupi.
BAB 5
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Pada praktikum kali ini dilakukan isolasi dan kultur PBMC yang berasal dari darah
manusia. Sebelum dilakukan kultur maka perlu dilakukan screening pada sel monosit yang
akan ditanam dengan melakukan penghitungan serta pengamatan pada sel monosit dibawah
mikroskop. Pengamatn meliputi morfologi sel, populasi sel, kepadatan dan sebaran dari sel
monosit. Media yang digunakan pada kultur adalah media RPMI 1640 yang merupakan
media kultur yang umum digunakan karena memiliki berbagai kelebihan diantaranya adalah
memiliki kandungan nutrisi yang lengkap, dapat digunakan untuk kultur berbagai jenis
sel,dan dapat dimodidikasi sehingga dapat digunakan sebagai media selektif untuk
sel/jaringan yang diinginkan.
DAFTAR PUSTAKA

Brown, T.A. 1986. Gene Cloning : an introduction. P. 74-99. Chapman & Hall.
Brown, T.A. 1991. Pengantar cloning Gena. Yayasan Essentia Medica. Yogyakarta.

N.T., Smith, M.T., Eskenazi, B., Bastaki, M.2003 . Biological sample collection and
processing for molecular epidemiological studies. Holland,., Mutation Research, 543, 217-
234.

Van den Akker, E.L.T., Baan, C.C., Van den Berg, B., Russcher, H., Joosten, K., Hokken-
Koelega, A.C.S., Lamberts, S.W. J., Koper, J.W.. 2008. Ficoll-separated mononuclear cells
from sepsis patients are contaminated with granulocytes., Intensive Care Med, 34, 912-916.