KROMATOGRAFI

Nama : Nia Ayuda Pratiwi

Keles/jurusan : XI Analis kimia
A. KROMATOGRAFI GAS

PENGERTIAN
Kromatografi Gas adalah proses pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya
dengan menggunakan gas sebagai fase bergerak yang melewati suatu lapisan serapan
(sorben) yang diam.

ALAT-ALAT KROMATOGRAFI GAS

- Silinder tempat gas pembawa/ pengangkut
- Pengatur aliran dan tekanan
- Tempat injeksi sampul
- Kolom
- Detector
- Pencatat
- Terminal untuk 3, 4 dan 5 (tempat injeksi sampel, kolom dan detector)
BAGIAN-BAGIAN KROMATOGRAFI GAS
1. Gas Pengangkut
Gas pengangkut/ pemasok gas (carrier gas) ditempatkan dalam silinder
bertekanan tinggi. Biasanya tekanan dari silinder sebesar 150 atm. Tetapi
tekanan ini sangat besar untuk digunakan secara Iansung.
Gas pengangkut harus memenuhi persyaratan :
a. inert, tidak bereaksi dengan cuplikan, cuplikan-pelarut, dan material dalam
kolom.
b. Murni dan mudah diperoleh, serta murah.
c. Sesuai/cocok untuk detektor.
d. Harus mengurangi difusi gas.
Gas-gas yang sering dipakai adalah : helium, argon, nitrogen, karbon dioksida
dan hidrogen. Gas helium dan argon sangat baik, tidak mudah terbakar, tetapi
 sangat mahal. H2 mudah terbakar, sehingga harus berhati-hati dalam
pemakaiannya. Kadang-kadang digunakan juga CO2.
Pemilihan gas pengangkut atau pembawa ditentukan oleh ditektor yang
digunakan. Tabung gas pembawa dilengkapi dengan pengatur tekanan
keluaran dan pengukur tekanan. Sebelum masuk ke kromatografi, ada
pengukur kecepatan aliran gas serta sistem penapis molekuler untuk
memisahkan air dan pengotor gas lainnya. Pada dasarnya kecepatan alir gas
diatur melalui pengatur tekanan dua tingkat yaitu pengatur kasar (coarse) pada
tabung gas dan pengatur halus (fine) pada kromatografi. Tekanan gas masuk
ke kromatograf (yaitu tekanan dari tabung gas) diatur pada 10-50 psi (di atas
tekanan ruangan) untuk memungkinkan aliran gas 25-150 mL/menit pada
kolom terpaket dan 1-25 mL/menit untuk kolom kapiler.

2. Tempat injeksi ( injection port)

Dalam kromatografi gas cuplikan harus dalam bentuk fase uap. Gas dan uap
dapat dimasukkan secara langsung. Tetapi kebanyakan senyawa organik
berbentuk cairan dan padatan. Hingga dengan demikian senyawa yang
berbentuk cairan dan padatan pertama-tama harus diuapkan. Ini membutuhkan
pemanasan sebelum masuk dalam kolom.
Tempat injeksi dari alat GLC/KGC selalu dipanaskan. Dalam kebanyakan alat,
suhu dari tempat injeksi dapat diatur. Aturan pertama untuk pengaturan suhu
ini adalah batiwa suhu tempat injeksi sekitar 50C lebih tinggi dari titik didih
campuran dari cuplikan yang mempunyai titik didih yang paling tinggi. Bila
kita tidak mengetahui titik didih komponen dari cuplikan maka kita harus
mencoba-coba. Sebagai tindak lanjut suhu dari tempat injeksi dinaikkan. Jika
puncak-puncak yang diperoleh lebih baik, ini berarti bahwa suhu percobaan
pertama terlalu rendah. Namun demikian suhu tempat injeksi tidak boleh
terlalu tinggi, sebab kemungkinan akan terjadi perubahan karena panas atau
penguraian dari senyawa yang akan dianalisa.
Cuplikan dimasukkan ke dalam kolom dengan cara menginjeksikan melalui
tempat injeksi. Hal ini dapat dilakukan dengan pertolongan jarum injeksi yang
sering disebut "a gas tight syringe".
Perlu diperhatikan bahwa kita tidak boleh menginjeksikan cuplikan terlalu
banyak, karena GC sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang
diinjeksikan pada waktu kita mengadakan analisa 0,5 -50 ml untuk gas dan
0,2 - 20 ml untuk cairan seperti pada gambar di bawah.
 3. Kolom
Coulom, ada dua jenis kolom yang digunakan dalam GC. Yang pertama adalah
kolom kemas, yaitu berupa tabung yang terbuat dari gelas atau steinstless
berisi suatu padatan inert yang dikemas secara rapi. Kolom ini memiliki
ukuran panjang 1,5-10 m dan diameter 2,2-4 nm.
Yang kedua adalah kolom kapiler, yang biasanya terbuat dari silica dengan
lapisan poliamida. Kolom jenis ini biasanya memiliki ukuran panjang 20-26 m
dengan diameter yang sangant kecil

4. Detektor
Detektor berfungsi sebagai pendeteksi komponen-komponen yang telah
dipisahkan dari kolom secara terus-menerus, cepat, akurat, dan dapat
melakukan pada suhu yang lebih tinggi. Fungsi umumnya mengubah sifat-sifat
molekul dari senyawa organik menjadi arus listrik kemudian arus listrik
tersebut diteruskan ke rekorder untuk menghasilkan kromatogram. Detektor
yang umum digunakan:
a. Detektor hantaran panas (Thermal Conductivity Detector_ TCD)
b. Detektor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector_ FID)
c. Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector _ECD)
d. Detektor fotometrik nyala (Falame Photomertic Detector _FPD)
e. Detektor nyala alkali
f. Detektor spektroskopi massa
Detector, yang paling umum digunakan dalam GC adalah detector ionisasi nyala
(FID) dan detector kondutivitas termal (TCD). Kedunya peka terhadap berbagai
komponen dan dapat berfungsi pada berbagai konsentrasi. Sementara TCD pada
dasarnya universal dan dapat digunakan untuk mendeteksi setiap komponen
selain gas pembawa (selama konduktivitas mereka berbeda dari gas pembawa,
suhu detektor),dalam jumlah besar sensitif terutama untuk hidrokarbon.
Sedangkan FID tidak dapat mendeteksi air. TCD adalah detector non-destruktif,
sedangkan FID adalah detector destruktif. Biasanya detector ini akan
dihubungkan dengan Spektrokopi Masa, sehingga akan menjadi rangkaian alat
GC-MS. Adapun salah satu bentuk dari FID adalah sebagai berikut :

5. Oven kolom
Kolom terletak didalam sebuah oven dalam instrumen. Suhu oven harus diatur
dan sedikit dibawah titik didih sampel. Jika suhu diset terlalu tinggi, cairan
fase diam bisa teruapkan, juga sedikit sampel akan larut pada suhu tinggi dan
bisa mengalir terlalu cepat dalam kolom sehingga menjadi terpisah.
6. Recorder
Rekorder berfungsi sebagai pengubah sinyal dari detektor yang diperkuat
melalui elektrometer menjadi bentuk kromatogram. Dari kromatogram yang
 diperoleh dapat dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif
dengan cara membandingkan waktu retensi sampel dengan standar. Analisis
kuantitatif dengan menghitung luas area maupun tinggi dari kromatogram.
Sinyal analitik yang dihasilkan detektor disambungkan oleh rangkaian
elektronik agar bisa diolah oleh rekorder atau sistem data.
Sebuah rekorder bekerja dengan menggerakkan kertas dengan kecepatan
tertentu. di atas kertas tersebut dipasangkan pena yang digerakkan oleh sinyal
keluaran detektor sehingga posisinya akan berubah-ubah sesuai dengan
dinamika keluaran penguat sinyal detektor. Hasil rekorder adalah sebuah
kromatogram berbentuk pik-pik dengan pola yang sesuai dengan kondisi
sampel dan jenis detektor yang digunakan.
Prinsip Kerja Kromatografi Gas
Gas pembawa (biasanya digunakan Helium, Argon atau Nitrogen) dengan tekanan
tertentu dialirkan secara konstan melalui kolom yang berisi fase diam. Selanjutnya
sampel di injeksikan kedalam injektor (Injection Port) yang suhunyan dapat diatur.
Komponen- komponen dalam sampel akan segera menjadi uap dan akan dibawa
oleh aliran gas pembawa menuju kolom. Komponen- komponen akan teradopsi
oleh fasa diam pada kolom kemudian akan merambat dengan kecepatan berbeda
sesuai dengan nilai Kd masing- masing komponen sehingga terjadi pemisahan.
Komponen yang terpisah menuju detektor dan akan terbakar menghasilkan sinyal
listrik yang besarnya proporsional dengan komponen tersebut. Sinyal lau
diperkuat oleh amplifier dan selanjutnya oleh pencatat (recorder) dituliskan
sebagai kromatogram berupa puncak. Puncak konsentrasi yang diperoleh
menggambarkan arus detektor terhadap waktu.

B. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

 Pengertian
Kromatografi Lapis Tipis adalah suatu teknik pemisahan yang sederhana dan banyak
digunakan. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi
penyerap untuk lapisan tipis dan kering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida
Prinsip Kromatografi Lapis Tipis
1. memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut
yang digunakan.
2. kromatografi lapis tipis memiliki fase diam berupa sebuah lapis tipis silika atau
alumina dan fase gerak pelarut atau campuran pelarut (eluen) yang sesuai.
Alat
1. Silika Gel (fase diam) dan Pewarna (fase gerak)
2. Gelas kimia atau bejana
3. Lempengan
4. Pensil
Cara Kerja
1. Kita siapkan alat.
2. Gambar sebuah garis menggunakan pensil pada bagian bawah lempengan (jarak garis
dari ujung lempengan berkisar antara 1-2cm).
3. Teteskan pelarut dari campuran pewarna pada garis lempengan.
4. Masukkan lempengan pada gelas kimia (jangan sampai terkena pelarut).
5. Komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang
berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.
C. KROMATOGRAFI KERTAS

Pengertian
Kromatografi Kertas adalah teknik metode analisis untuk memisahkan dan
mengidentifikasi campuran yang bisa berwarna (terutama pigmen) yang terdiri
dari dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak.

Alat kromatografi kertas

- Bejana dan penutupnya
- Penggaris
- Pipa Kapiler
- Pensil atau Ballpoint
- Gunting
- Penjepit Kertas
Bahan- bahan kromatografi kertas
1) Kertas Saring
2) Noda (bisa berupa spidol, stabilo, dan zat warna lainnya)
3) Pelarut yang cocok dengan noda
Prinsip kerja kromatografi kertas
Pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen bergerak pada laju
yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak
warna.
Cara Kerja
1) Potong kertas saring menjadi berbentuk persegi panjang (ukuran terserah
kalian yang penting bisa masuk ke dalam bejana, jangan terlalu besar dan
jangan terlalu kecil).
2) Garis ujung kertas bagian bawah (minimal jarak dari ujung kertas 1 cm
untuk mencegah kontak langsung dengan pelarut).
3) Tetesi noda pada garis pembatas pada kertas.
 4) Masukkan kertas yang sudah ditetesi noda tadi kedalam bejana yang
sebelumnya sudah diberi pelarut.
5) Tunggu hingga beberapa menit sampai proses penyerapan selesai.
6) Setelah itu kertas dikeringkan.
7) Ukur jarak yang ditempuh pelarut dan komponen noda yang dipisahkan
dan hitung nilai Rf noda tersebut.

D. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

o Alat kromatografi lapis tipis

- wadah fase gerak (Reservoir)
- pompa,
- alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi),
- kolom,
- detektor,
- wadah penampung buangan fase gerak
- suatu komputer atau integrator atau perekam.
o Bagian-bagian kromatografi lapis tipis
1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut
kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah
fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak
antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang
dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya
elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih
polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
 Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu
untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya
gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas
akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan
detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak

tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase
gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan
pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien
digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks
terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.4)

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan

fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau
campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase
normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan
fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni:
pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai
untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu
nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif,
pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak
adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan
tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang
konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh
ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan
konstan.
3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke
dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom
menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan
karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel
(sample loop) internal atau eksternal.
Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel
4. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase
diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding

dengan kolom konvensional, yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau
lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena
pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih
lambat (10 -100 l/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat
kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan
spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut
lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat
bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor
ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang
bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang
dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak
dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam
karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-
reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam

yang paling banyak digunakan karena mampu
memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil
yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang
polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril)
lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak
 dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan
memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan
karena adanya kandungan air yang digunakan.
5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum,
tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan
detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi,
dan elektrokimia.
o Prinsip kerja kromatografi lapis tipis
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa
diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling
membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada
HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan
kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan
berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-
puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan
hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan
ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.
HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada
proses kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi
adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai
RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak
milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah
spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan
mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum
3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan
adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar
komponen yang dianalisis di dalam sampel. Yang berperan dalam
proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang
digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang
dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan
sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk
tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent)
yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-,
 polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi
oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap
selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC
diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram
akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan
mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang
antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan
dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu
biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi
sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke
HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya
jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat
aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
o Cara Kerja
1) Mula-mula solven diambil melalui pompa.
2) Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar, yang
dipasang tepat pada sampel loop.
3) Sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama
dengan solven masuk kedalam kolom.
4) Hasil pemisahan dideteksi oleh detektor, yang penampakannya ditunjukan
oleh perekam (pencatat = recorder).