Reverse Phase Chromatography

(RPC)
(RPHPLC)
Dosen : Asep Saefumillah, M.Si, Ph.D
Outline
Pendahuluan
Prinsip
Proses Pemisahan
Retensi
Optimasi Pemisahan

2
 Pendahuluan
HPLC Modes:
Normal Phase.
- Fasa diam Polar
- Fasa gerak Non-polar

Reverse Phase:
- Fasa diam Non-polar
- Fasa gerak Polar

3
Fasa Diam
Bonded Phases:
C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3
C-8 Octyl Silyl -Si-(CH2)7-CH3
C-18 Octadecyl Silyl -Si-(CH2)17-CH3
CN Cyanopropyl Silyl -Si-(CH2)3-CN

Synthesis of RP Packings

4
Contd
Secara umum: tR lebih
lama pada fasa diam
dengan atom C
banyakretensi lebih
kuatperlu %B yang
lebih tinggi
Fasa diam dengan
retensi tinggi analit
polar
Fasa diam dengan
retensi rendah (atom
C<<) analit
nonpolar
Aktivitas silanol
menguntungkan pada
pemisahan analit polar
(hidrofilitas tinggi)

5
 Fasa Gerak
Secara umum fasa gerak RPC campuran air (A)
dengan pelarut nonpolar (B)

Eluen non-aqueus untuk analit dengan kenonpolaran tinggi

Eluen gradien
Pelarut sangat murni

6
 Selektivitas: Jenis dan Kekuatan Pelarut

P = a Pa + b Pb

7
 P

60% Contd
Nomogram merupakan
penjabaran lebih lanjut
dari diagram triangle,
dan perbandingan
kekuatan elusi pelarut
45% dan %B untuk ketiga
%B jenis eluen.

Nomogram digunakan untuk

mempermudah perkiraan %B
dengan kekuatan sebanding pada
jenis pelarut berbeda

Jika ingin mengganti eluen

MeOH/H2O 70% maka dapat
ditarik garis ke ACN/H2O
didapatkan nilai 60% dan ke arah
THF/H2O didapatkan 45%

8
Prinsip

Normal Phase;
Molekul hidrofilik dari fasa gerak akan
terabsorpsi pada permukaan fasa diam.
Meningkatnya polaritas fasa diam absorbsi
berkurang, sampel terelusi dari kolom.

9
 Prinsip
Reverse Phase; Gradien
Eluen
Molekul hidrofobik terabsorpsi pada fasa diam yang
hidrofobik dengan fasa gerak polar. Berkurangnya
polaritas fasa gerak dengan menambahkan pelarut
organik akan mengurangi interaksi hidrofobik antara
solut dan fasa diam menghasilkan desorpsiabsorbsi
berkurang, sampel terelusi dari kolom.
Semakin hidrofobik molekul maka semakin lama
berada dalam fasa diamdibutuhkan konsentrasi
pelarut organik yang tinggi untuk mengelusi solut

Interaksi Hidrofobik
10
 Contd

Fast

tR cepat, Rs rendah

Slow

tR lama, Rs lebih baik

(2) Benzena, (3) Klorobenzene, (4) o-diklorobenzena, (5)

iodobenzena
11
Proses Pemisahan
(dengan gradien eluen)

12
Contd

13
 Retensi
Senyawa Kekuatan retensi

Alifatik
Dipol terinduksi (CCl4)

Dipol permanen (CHCl3)

Basa Lewis lemah (ROR, RCHO, RCOR)

Basa Lewis kuat (Amina)

Asam Lewis lemah (ROH, ArOH)
Makin berkurang
Asam Lewis kuat (RCOOH)

Retensi berkurang dengan menurunnya kekuatan interaksi hidrofobiknya

Alifatik memiliki interaksi hidrofobik yang tinggi sehingga lebih tertahan
dalam fasa diam
14
 Contd
atom C >>

Interaksi hidrofobik dengan fasa diam >>>

tR meningkat

Senyawa Waktu retensi Branched-chain compared to

normal isomer ?
(1) 1-Dekena (C10H20)
(2) 1-Undekena (C11H22) tR
(3) 1-Dodekena (C12H24) Makin bertambah Terelusi lebih cepat
Karena interaksi
(4) 1-Tridekena (C13H26) hidrofobik rantai dengan
percabangan lebih lemah
(5) 1-Tetradekena (C14H28) dibandingkan rantai lurus
15
Contd
%B >>,
Retensi <<

T naik
Retensi <<

Hidrofobisitas kolom <<

Retensi <<

16
Optimasi Pemisahan RPC
Untuk meningkatkan resolusi pemisahan pada RPC yaitu
dengan mengubah selektivitas terhadap :
1. Kekuatan pelarut (%B)
2. Jenis pelarut (MeOH, ACN, THF)
3. Jenis kolom (C18, siano)
4. Temperatur
Efektivitas relatif keempat parameter sebagai berikut:

17
 Efek Pelarut

Dengan %B 45%
diperoleh
pemisahan yang
lebih baik antara
senyawa 3 dan 4
dengan resolusi
1.5.

18
Snyder, Llyod. R, et. Al. 2010. Introduction to Modern Liquid Chromatography, Third Edition. John Wiley & Sons, Inc.
 Contd

19
Snyder, Llyod. R, et. Al. 2010. Introduction to Modern Liquid Chromatography, Third Edition. John Wiley & Sons, Inc.
 Efek Temperatur

Pemisahan PAH terbaik

pada temperatur 22C
dengan nilai resolusi 2.1

20
Snyder, Llyod. R, et. Al. 2010. Introduction to Modern Liquid Chromatography, Third Edition. John Wiley & Sons, Inc.
 Efek Kolom

Dengan tiga kolom ;

symmetry C18, altima HP
C18 amide, Spherisorb
ODS-2, pemisahan belum
optimal masih terdapat
peak sampel yang
overlap.
Pada Kolom Luna
phenyl-hexyl, peak-peak
kesepuluh sampel
terpisah dengan baik.

21
Snyder, Llyod. R, et. Al. 2010. Introduction to Modern Liquid Chromatography, Third Edition. John Wiley & Sons, Inc.
Pengembangan Metode RPC
A. Sampel nonionik:
Fasa diam C8 atau C18, ACN:air, T ambien
1. %B dengan 1k10
2. Ubah pelarut B
3. Gunakan campuran pelarut B organik
4. Ubah fasa diam (mulai dari langkah 1)
5. Ubah T
6. Optimasi parameter fisik :dimensi kolom, ukuran
partikel, laju alir

22
 Contd
B. Sampel Ionik:
Fasa diam C8 atau C18, MeOH (buffer pH 2.5), T 40C
1. %B atau gradien
2. (a) Ubah pH
(b) gunakan IPC (ion-pair chromatography)
3. %B
HIC
4. Ubah pelarut B organik
5. (a) Ubah pH HILIC

(b) Ubah pH dan reagen IP

6. Ubah T
7. Ubah fasa diam menjadi fenil atau siano (mulai dari
langkah 1)
6. Optimasi parameter fisik :dimensi kolom, ukuran
partikel, laju alir
C. Metode lain: IPC, IEC, dll
23
 Karakteristik HIC, RPC, HILIC, NPC.
HIC RPC HILIC NPC

Fasa Nonpolar (atom C<<) Nonpolar (atom Polar Polar

diam C>>)
Fasa Pure aqueous A(air)-B(pelarut A(nonpolar)- A(nonpolar,
Gerak Gradien [garam] organik) B(Air) heksana)-B(cukup
Gradien %B Gradien %B polar, CHCl3)
Gradien %B
Pemisa Sampel yang interaksi Sampel nonionik Sampel yang Sampel yang
han hidrofobik kuat dan tidak dan ionik sangat ionik ionik
stabil terhadap pelarut berdasarkan
organik (contoh:protein) interaksi
hidrofobik
Retensi Nonpolar tertahan Nonpolar Polar tertahan Polar tertahan
Lebih polar terelusi lebih tertahan Nonpolar Nonpolar terelusi
dahulu Lebih polar terelusi lebih lebih dahulu
terelusi lebih dahulu
dahulu 24
 Aplikasi
Sampel riset bioteknologi:
tryptic hydrolisate dari
Normal aktivator plasminogen
suatu protein yang terdiri dari
527 asam amino pada bentuk
normal dan yang telah
bermutasi (mutan).
Kedua kromatogram
dibandingkan, perbedaan
terlihat pada satu jenis asam
Mutan amino, mutan tidak
mengandung Arg (arginin)
tetapi terdapat Glu (asam
glutamat)
Kromatogram ditampilkan
berkebalikan untuk
memudahkan perbandingan
25
 Contd

Sampel : PAH
Interaksi Hidrofob Interaksi Hidrofob
lemah kuat 17 senyawa dalam PAH
terpisah dengan baik
Pemisahan berdasarkan
kenaikan interaksi
hidrofobik, terlihat
senyawa yang
hidrofobisitas lebih lemah
(benzena) terelusi lebih
cepat, dan sementara
heksasiklik benzena yang
interaksinya kuat, terelusi
terakhir
Waktu retensi sampel PAH
cepat : 15 menit

26
 Hidrophobic Interaction Chromathography
(HIC)

Interaksi sampel dan fasa diam terlalu kuat pada RPC, eluen
aqueous terlalu lemah tanpa penambahan pelarut organik
(pelarut organik tidak diizinkan dalam pemisahan protein
karena dapat mendenaturasi dan menghilangkan aktivitas
biologinya)
Pemisahan menggunakan fasa diam dengan atom C lebih kecil
: butil, fenil.
Eluen yang digunakan memiliki kandungan garam yang tinggi,
terelusi ketika gradien garam menurun
Komposisi fasa diam mempengaruhi retensi

27
HIC

28
Proses pemisahan pada HIC

29
Contd

30
31
Optimasi pemisahan protein dengan HIC

32
 Referensi
Snyder, Llyod. R, et. Al. 2010. Introduction to
Modern Liquid Chromatography, Third Edition.
John Wiley & Sons, Inc.
Meyer, Veronika R. 2010. High Performance
Liquid Chromatography, Fourth Edition. John
Wiley & Sons, Inc.
GE Healthcare. Hidrophobic Interaction
Chromatography and Reverse Phase
Chromatography: Principles and Methods.
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Se
rviceSupport/TechSupport/ResourceCenter/Princip
lesofChromatography/ReversedPhase/
http://www.lamondlab.com/MSResource/LCMS/N
anoflowHPLC/hplc.php

40
Terima Kasih