BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bioteknologi dapat didefenisikan sebagai aplikasi proses biologis dengan menggunakan
sel-sel mikroba, tanaman maupun hewan untuk menghasilkan barang dan jasa. Bioteknologi
terdiri dari 2 kelompok teknologi utama. Kelompok pertama adalah rekayasa genetika (genetic
engineering). Teknologi ini melakukan semacam proses gunting tempel bagian-bagian tubuh
makhluk hidup, termasuk gen untuk menciptakan makhluk yang unggul. Kelompok kedua adalah
kultur jaringan (tissue culture), penanaman sel-sel yang telah diisolasi dari jaringan atau
potongan kecil jaringan secara in vitro dalam medium yang aseptik.
Perkembangan bioteknologi hingga saat ini sudah mampu menyita banyak perhatian
banyak diseluruh belahan dunia. Banyak hal yang bisa dihasilkan dari proses bioteknologi ini
seperti menghasilkan tanaman baru yang memiliki sifat unggul daripada induknya, menciptakan
tanaman yang tidak memiliki biji dan lain-lain. Salah satu kegiatan dalam bioteknologi yaitu
kultur jaringan dimana kultur jaringan ini merupakan perbanyakan tanaman dengan mengisolasi
salah satu bagian dari tanaman kemudian dikembangbiakkan pada tempat yang sesuai dan
aseptik.
Perkembangan bioteknologi selama 2 dekade terakhir ini sangat pesat, didukung dengan
adanya kemajuan perkembangan teknik-teknik analisis molekuler. Walaupun perkembangan
teknik molekuler sudah dimulai sejak beberapa puluh tahun yang lalu. Akan tetapi loncatan-
loncatan besar dalam bidang ini baru mengalami kemajuan pada tahun 70-an yang ditandai
dengan keberhasilan Paul Berg dalam mengahasilkan Rekombinan DNA pertama (Jamsari,2007).
Bioteknologi merupakan suatu ilmu terapan yang tidak bisa dipisahkan dengan beberapa
ilmu lainnya. Keterkaitan ilmu ini bagi seorang mahasiswa adalah sebuah modal yang sangat
penting untuk dimiliki baik secara teori maupun aplikasinya. Ilmu bioteknologi sendiri adalah
cabang ilmu yang berkaitan erat dengan beberapa ilmu dasar seperti mikrobiologi, genetika,
biokimia, biologi molekuler, dan biologi umum. Selain itu, ilmu bioteknologi juga tidak dapat
dipisahkan keterkaitannya dengan ilmu terapan lain seperti teknologi DNA rekombinan,
Rekayasa genetika, Kultur Jaringan, dan lain-lain.
Di Indonesia sendiri bioteknologi sudah dikenal lama dan hampir disetiap daerah sudah
ada produk atau tanaman baru yang dihasilkan dari kegiatan bioteknologi ini. Ditemukannya
tanaman transgenik merupakan salah satu contoh perkembangan ilmu bioteknologi yang sangat
pesat. Dimulai pada tahun 70-an hingga sekarang, telah banyak ditemukan hal-hal yang dapat
memberikan banyak keuntungan bagi kehidupan manusia dari salah satu cabang ilmu biologi ini.
Secara lebih universal, ilmu bioteknologi memiliki kaitan dan mendukung atau menunjang
beberapa disiplin ilmu lainnya diluar kajian ilmu pertanian seperti kedokteran, peternakan,
farmasi, teknologi pangan, ilmu lingkungan, kehutanan, industri, dan nanoteknologi.
Dalam memenuhi kebutuhan manusia tersebut maka berkembang suatu kemajuan
teknologi baru yang memberikan kesempatan bagi manusia untuk dapat mengembangkannya
yaitu bioteknologi. Bioteknologi merupakan teknik dengan menggunakan makhluk hidup untuk
memecahkan suatu masalah sehingga menghasilkan suatu produk yang
bermanfaat. Wattimena et al (2011) menambahkan bahwa bioteknologi merupakan ilmu biologi
seluler dan molekuler dalam pemuliaan tanaman. Tanaman adalah tumbuhan yang bermanfaat
 baik secara langsung maupun secara tidak langsung bagi kehidupan manusia. Sementara itu,
tumbuhan yang mengganggu disebut dengan gulma. Bagi seorang pemulia tanaman baik
tanaman, gulma dan tumbuhan sangat penting sebagai sumber keragaman genetik.
Semakin pesatnya perkembangan ilmu bioteknologi ini, hendaknya dihadapi dengan
bijaksana. Oleh karena itu, sangat penting kiranya bagi seorang mahasiswa Agroekoteknologi
khususnya BKI Pemuliaan Tanaman untuk memahami dan mengerti ilmu Bioteknologi itu lebih
dalam lagi. Wawasan yang mendalam tentang bioteknologi merupakan modal dasar yang harus
dimiliki oleh seorang pemulia dalam melaksanakan segala kegiatan yang berkaitan dengan
bioteknologi, apalagi menyangkut kegiatan pemuliaan tanaman. Praktikum ini sangat membantu
mahasiswa untuk memahami dan mengaplikasikan ilmu Bioteknologi baik secara teoritis
maupun praktikal di laboratorium.
1.2 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan praktikum ini adalah untuk memberikan pembekalan pengetahuan dasar
tentang prinsip, dan prosedur penyiapan media-media yang akan dibutuhkan dalam kegiatan-
kegiatan dasar yang berkaitan dengan bioteknologi (analisis dan rekayasa molekuler). Disamping
itu, juga diberikan pembekalan tentang prinsip-prinsip kerja di laboratorium yang harus difahami
agar kegiatan praktikum di laboratorium bisa berjalan aman dan lancar.
Praktikum ini lebih lanjut bertujuan agar praktikan mampu memahami prinsip isolasi
DNA dan mampu melakukan kegiatan isolasi DNA dengan mengunakan bahan dan protokol
yang dilaksanakan secara mandiri, mampu memahami prinsip pengunaan teknik elektroforesis
dan mampu secara mandiri melakukan kegiatan elektroforesis, mampu memahami prinsip
restriksi DNA dan mampu secara mandiri melakukan kegiatan restriksi DNA, serta mampu
memahami prinsip-prinsip amplifikasi DNA secara In-Vitro dan dapat melakukan secara mandiri
dengan mengunakan mesin PCR.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolasi DNA
yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan
berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil
sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian
atas dan pelet pada bagian bawah (Aris, 2010). Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari
 tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan
buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2006).
Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler
atau forensik berikutnya (Doyle, 1990). Isolasi DNA merupakan salah satu teknik yang paling
dasar dan penting dalam studi DNA. Ekstraksi DNA dari sel dan pemurnian yang merupakan
kepentingan utama untuk bidang bioteknologi dan forensik (Purwantara, 2001).
Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi
berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam proses
isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan A berfungsi sebagai resuspensi yaitu
penggabungan kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Selain itu
larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Pemilihan buffer tersebut dilihat dari
kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik. Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH
berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein. Sedangkan larutan
C berfungsi untuk merenarutasikan kembali. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi
berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA
bermuatan negatif. Larutan ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang
dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex untuk memudahkan
bakteri tersuspensi. Bakteri yang telah diendapkan tersebut kana lisis dengan penambahan
larutan buffer. Agar proses lisisnya bakteri sempurna maka larutan dibolak-balik secara halus.
Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya lendir. Cairan DNA yang dihasilkan
kemudina dipisahkan dari endapannya. Cairan ini ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA
supaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni (Campbell, 2002).
2.1.1 Isolasi DNA kromosom
Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-
komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia.
Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada
ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase
(yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya
ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi
DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan dengan
air (Purwantara, 2001).
2.1.2 Isolasi DNA plasmid
DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA
plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh
lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan
perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan
penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein
dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium.
DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan
yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian
ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid
dapat dipresipitasi menggunakan etanol (Anderson, 1993).

2.1.3 Macam-macam Metode Isolasi DNA

2.1.3.1 Kitchen Preparation
Ada 4 hal penting yang harus kita lakukan untuk melakukan isolasi DNA yaitu:
Melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
Pemecahan dinding sel.
Pemecahan membran sel.
Pemisahan DNA dari bahan yang lain.
Sumber : Aris, 2010.
Bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk
itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang
mandiri. Proses dilakukan secara fisik dengan menumbuk atau menggerus bahana yang akan kita
gunakan. bahkan bahan yang lunak seperti strowberry cukup hanya diremas-remas saja. Kedua
adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama
pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam
dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA)
bisa keluar (Tohib, 2012).
Jika perlu kita dapat menambahkan proteinase (enzim pengurai protein) untuk
menyingkirkan protein yang mungkin akan mengotori bahan yang kita inginkan. Proteinase
alami yang dapat kita gunakan adalah papain yang merupakan ekstrak daun pepaya, atau
bromelin yang merupakan ekstrak buah nanas. Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari
bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin
berkonsentrasi 90-95% (Tohib, 2012).
2.1.3.2 CTAB
CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi
protein, memisahkan karbohidrat (Suprapto, 2003), merusak membran sel dan melarutkan DNA (
Purwantara, 2001). Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk
DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.
Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti
merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat
aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat.
Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide,
peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan
CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk memdegradasi
protein dan dinding sel (Milligan, 1992).
Klorofrom dan isoamil alkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan
mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan
DNA (Ningrum, 2008). Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA
sehingga terjadi presipitasi (Purwantara, 2001). Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh
dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun
etanol. Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE berfungsi
untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam
buffer TE mengandung EDTA yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion
Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease (Sudarsono,
1996).
 Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal
dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan
(differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan
diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita
RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Aris, 2010).
Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan
menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih
tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil
dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada
ektraksi dengan menggunakan kit (Ningrum, 2008). Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi
CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara
maupun lama waktu penyimpanan (Milligan, 1992).
2.2 Elektroforesis
Elektroforesis merupakan teknik pemisahan molekul-molekul berdasarkan perbedaan
tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan
listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk
separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Pemberian aliran listrik dapat
menyebabkan terjadi perpindahan aliran elektron dan dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda
positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA
(Anderson, 1993).
Pengujian DNA yang meliputi analisis secara kuantitatif dan kualitatif,
merupakan tahap lanjutan pengujian yang harus dilakukan setelah diperoleh isolasi DNA
tanaman. Hal ini dilakukan untuk menentukan kemurnian suatu galur atau kultivar serta untuk
menguji masuknya materi genetik tertentu (misalnya dalam mendeteksi materi transgenik) ke
dalam populasi. Uji kualitatif DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis dari hasil isolasi DNA
(Campbell, 2002).
Metode elektroforesis merupakan teknik yang dapat digunakan untuk menggambarkan
pergerakan molekul-molekul bermuatan dalam medan listrik ke arah elektroda dengan muatan
berlawanan atau teknik yang didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media
penyangga dibawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan dalam
elektroforesis adalah gel agarosa, suatu polisakarida yang diekstraksi dari berbagai jenis
ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu melakukan separasi DNA dengan kisaran
ukuran yang luas (Yuwono, 2006).
Agarose adalah bahan yang sering dan banyak digunakan dalam teknik electrophoresis.
Bahan ini merupakan senyawa disaccarida dari D-galactose dan 3,6-anhydro-L-Galactose dengn
kandungan senyawa sulfat yang rendah, senyawa agarose diisolasi dati rumput laut, untuk
keperluan analisis secara umum agarose yang digunakan adalah agarose endoosmotik-rendah
tipe II (Jamsari, 2007).
Beberapa faktor yang menentukan dalam penggunaan electrophoresis adalah berat
molekul, konsentrasi gel, bentuk konfrormasi dari molekul DNA, dan kekuatan arus listrik yang
digunakan. Senyawa-senyawa yang memiliki berat molekul lebih besar akan bermigrasi lebih
lambat dibandingkan senyawa-senyawa yang memiliki berat molekul lebih kecil, konsentrasi gel
akan menentukan besarnya pori-pori yang akan dilalui molekul DNA. Semakin besar konsentrasi
 agarose yang digunakan, berarti semakin kcil pori yang akan dilalui, sehingga migrasi molekul
DNA juga semakin lambat (Jamsari, 2007).
Laju migrasi DNA ditentukan oleh konformasi molekulnya, dari yang paling cepat yaitu
Covalently Closed Circular (CCC), Open Circular, dan linier. Laju migrasi DNA dalam medan
listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran
panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat
dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA
berdasarkan ukuran panjangnya (Yuwono, 2006).
Prinsip kerja pewarnaan ethidium bromide adalah dengan pembentukan senyawa
interkalar antara DNA dan ethidium bromide. Ethidium bromide ini merupakan senyawa yang
bersifat carcinogenicyang dapat menyebabkab kanker, sehingga seluruh proses kerja dengan
menggunakan senyawa ini perlu dilakukan secara hati-hati, misalkan dengan menggunakan
sarung tangan yang tahan terhadap intervensi ethidium-bromide (Jamsari, 2007).

2.3 Restriksi DNA Genomik

Dalam teknik rekayasa DNA, menciptakan molekul-molekul kombinasi DNA
baru adalah pekerjaan rutin yang harus dilakukan. Untuk keperluan tersebut persyaratan yang
sangat dibutuhkan pertama sekali adalah ketersediaan fragmen-fragmen DNA tertentu dalam
ukuran yang lebih kecil. Dengan demikian maka dibutuhkan peralatan yang mampu memutuskan
benang-benang DNA ke dalam ukuran fragmen yang lebih kecil dengan komposisi yang sesuai
dengan yang dikehendaki (Jamsari, 2007).
Pada tahun 1960, ilmuwan Prancis Stewart Linn dan Werner Arber mengisolasi dua
contoh enzim yang berperan dalam menghambat pertumbuhan bakteriofag yang menyerang E.
coli. Salah satu enzim bekerja memetilasi DNA, sedangkan enzim yang satunya bekerja
memotong DNA yang tidak termetilasi pada beberapa lokasi di sepanjang molekul DNA. Enzim
yang pertama disebut metilase (methylase), sedangkan enzim yang satunya
disebut nuklease restriksi (restriction nuclease) (Philips, 2010).
Enzim restriksi atau endonuklease restriksi adalah enzim yang memotong molekul DNA.
Enzim ini memotong DNA pada rangka gula-fosfat tanpa merusak basa. Setiap enzim
mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa.
Enzim ini memiliki kemampuan untuk berikatan dengan molekul-molekul DNA dan
menyebabkan terjadinya reaksi hihrolisa pada ujung 5 dari ikatan phospodiester molekul-
molekul DNA (Philips, 2010).
Panjang dari sekuen pengenalan memengaruhi seringnya enzim restriksi memotong DNA
dalam ukuran tertentu. Misalnya pada enzim yang memiliki panjang 4 basa, enzim ini
diperkirakan akan memotong setiap 256 nukleotida. Perhitungan tersebut diperoleh dengan
mengasumsikan setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu sebesar
1/4 (kemungkinan muncul 1 dari 4 basa). Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6
basa, maka perhitungannya menjadi: (1/4)6 = 1/4096. Perhitungan ini hanya sebagai perkiraan,
pada kenyataannya belum tentu demikian. Beberapa sekuen bisa jadi lebih sering atau lebih
jarang ditemui dalam suatu organisme. Seperti pada mamalia, sekuen CG sangat jarang ditemui
sehingga enzim HpaII yang mempunyai sekuen pengenalan CCGG akan lebih jarang memotong
pada DNA mamalia (Rinehart, 2005).
 Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan menghasilkan
banyak potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen pengenalan yang panjang, akan
dihasilkan potongan DNA yang lebih sedikit. Baik enzim yang mempunyai sekuen pemotongan
pendek maupun panjang, mempunyai fungsi masing-masing dalam rekayasa genetika.Enzim
restriksi pada umumnya bekerja pada pH 7,4; suhu 37 C; dan memerlukan bermacam-macam
kekuatan ionik, tergantung dari jenis enzimnya. Akan tetapi, beberapa enzim memerlukan
optimasi khusus agar proses restriksi berjalan dengan baik. Dalam larutan stok, enzim restriksi
biasanya dikemas bersama dengan 10X larutan penyangga reaksi yang telah dioptimasi (Aris,
2010).
Jenis-jenis enzim restriksi :
Enzim restriksi dibagi menjadi 3 tipe berdasarkan komposisi subunit, posisi pemotongan,
spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan (Yuwono, 2006) :
Enzim restriksi tipe I

Enzim restriksi ini kompleks dengan multisubunit, memotong DNA secara acak dan jauh dari
sekuens pengenalannya. Pada awalnya enzim ini dikira langka; tapi setelah analisis sekuens genom,
enzim ini ternyata umum. Enzim restriksi tipe I ini memiliki pengaruh besar dalam biokimia, namun
mempunyai nilai ekonomis yang rendah karena tidak dapat menghasilkan potongan fragmen DNA yang
diinginkan sehingga tidak diproduksi.

Enzim restriksi tipe II

Enzim ini memotong DNA dekat atau pada situs pengenalan. Enzim ini menghasilkan fragmen-
fragmen sesuai dengan yang diinginkan sehingga biasa digunakan untuk analisis DNA
dan kloning gen. Enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI, HindIII, EcoRI, dan NotI; dan enzim-
enzim tersebut tersedia secara komersil. Enzim ini tergolong kecil dengan subunit yang memiliki 200-
350 asam amino dan memerlukan Mg2+ sebagi kofaktor. Selanjutnya enzim jenis tipe II yang umum,
biasanya digolongkan sebagai tipe IIs, adalah FokI dan AlwI. Enzim ini memotong diluar situs
pengenalan, berukuran sedang, 400-650 asam amino, dan memiliki 2 domain khusus. Domain pertama
untuk berikatan dengan DNA, sedangkan domain yang satunya untuk memotong DNA.
Enzim restriksi tipe III

Enzim restriksi tipe II ini merupakan enzim restriksi yang tidak digunakan dalam laboratorium. Hal
ini dikarenakan enzim ini memotong di luar situs pengenalan dan membutuhkan dua sekuen dengan
orientasi berlawanan pada DNA yang sama untuk menyelesaikan pemotongan sehingga enzim ini jarang
menghasilkan potongan sempurna.

2.4 Amplifikasi DNA In-Vitro

Aksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari
istilahbahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode
perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik
ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga
memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary
Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya
 tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena
relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil (Jamsari, 2007).
Prinsip dasar PCR adalah perbanyakn molekul-molekul sfesifik DNA dengan bantuan
primer-primer yang berupa oligunukleotid secara invitro, untuk pelaksanaan proses PCR
tersebut, hal-hal yang dibutuhkan adalah molekul DNA yang akan dianalisis. Molekul DNA ini
berfungsi sebagai template untuk pembentukan molekul DNA selanjutnya. Secara umum prinsip
proses PCR kali adalah denaturasi pita ganda DNA reaksi pemanasan suhu 94C, kemudian
pengukatan primer (anneling) dan selanjutnya adalah pembentukan molekul DNA sintesis
(Extensi) dari bahan dNTPS (Jamsari, 2007).
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 2030 kali siklus.
Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus
(Miligan, 1992) :
Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94
96 C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal.
Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk
memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap
menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 12 menit.
Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang
komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 4560 C. Penempelan ini bersifat
spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel
di sembarang tempat. Durasi tahap ini 12 menit.
Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA
polimerase (ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini
biasanya dilakukan pada suhu 76 C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.
Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi,
beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat
berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan
berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial (Miligan, 1992).

III. BAHAN DAN METODA

3.1 Tempat dan Waktu

 Praktikum ini dilaksanakan pada hari Minggu, 8 Desember 2013, bertempat
diLaboratorium Bioteknologi dan pemuliaan Tanaman, jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas
Pertanian, Universitas Andalas, Padang.
3.2 Bahan dan Alat
3.2.1 isolasi DNA
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah daun segar tanaman cabai, 1,5X-CTAB
(buffer ekstraksi) seperti; Tris 200 mM (pH 7,5 diset dengan HCl), EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M,
CATB 1,5%, PVP 1,6%, dan -Mercaptoethanol 1,0% (ditambahkan dalam keadaan segar), 1,0X
TE buffer seperti; Tris 10,0 mM (pH 8,0, set dengan HCl), EDTA 1,0 mM, Washing buffer I
seperti; Na-acetat 10 mM, Ethanol 76%, Washing buffer II seperti; NH4-acetate 200 mM, Ethanol
76%, dan bahan lain-lain seperti; Isopropanol dingin (p.a) 99%, Alkohol teknis 70%,
Chloroform:Isoamylalkohol 24:1, Nitrogen cair (bila ada), Tabung eppendorf 2 ml 3/sampel,
Tabung eppendorf 1,5 ml 3/sampel.
Sedangkan alat yang digunakan adalah mortar dan pistil, spatula, Water bath, pipet 10-
200 l, pipet 100-1000 l, Centrifuge maks: 14.000 rpm, Chemical Hood, Stander Eppendort
Tube, dan timbangan digital.
3.2.2 Elektroforesis
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah Buffer 0,5 x TBE seperti; Tris, Boric
acid, Na2EDTA (pH 8,0) 10,0 mM, 10 x BPB seperti; Tris (pH 7,6) 49,5 mM, Xylene cyonol
0,25%, Bromopenol blue 0,25%, Glycerol 60%, bahan lain yang dibutuhkan seperti; standart
lambda DNA 50 ng/l, agarose/agar 2 gram, Ethidium bromide 10 mg/ml, dan pipet-tip kuning
2-200 l 4 buah/sampel.
Sedangkan alat yang digunakan adalah Bak Elektrophoresis, Power Supply, Comb 8 slot,
Gel Tray, penghambat gel, perangkat dokumentasi, dan pipet mikro 2-10 l.
3.2.3 Retriksi DNA genomik
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah Buffer 0,5 x TBE seperti; Tris, Boric
acid, Na2EDTA (pH 8,0) 10 mM, 10 x BPB seperti; Tris pH 7,6 49,5 mM, Xylene cyanol 0,25%,
Bromopenol blue 0,25%, Glycerol 60,0%, Enzim restriksi EcoRI 15 U/l, Buffer H 10x, DNA
sampel 10 ng/l, ddH2O, 1 kb size maker, Standard lambda DNA 50 ng/l, Agarose/agar 2 gram,
Ethidium bromide 10 mg/ml, Pipet-tip kuning 2-200 l 4 buah/sampel, dan Pipet putih 0,2-10 l
3 buah/sampel. Komposisi larutan cocktail yang digunakan yaitu; Enzim BAM H-I 0,33 l,
Buffer 2,5 l, DNA sampel 4 /l, dan H2O 18,17 l.
Sedangkan alat yang digunakan adalah Bak elektrophoresis, Power supply, Comb 8 slot,
Gel tray, Penghambat gel, Perangkat gel, Perangkat dokumentasi, Pipet mikro 2-10 l, dan pipet
mikro 0,2-10 l.
3.2.4 Amplifikasi DNA In Vitro
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah Buffer 0,5 x TBE (elektrophoresis)
seperti; Tris, Boric acid, Na2EDTA (pH 8,0) 10 mM, 10 x BPB (elektrophoresis) seperti; Tris pH
7,6 49,5 mM, Xylene cyanol 0,25%, Bromophenol blue 0,25%, Glycerol 60,0%, RTG-PCR bead
6 bead, 1 kb size marker, ddH2O 200 l, DNA cabai 5 pmol/l, Agarose/agar 2 gram, Ethidium
Bromida 10mg/ml, Pipet-tip kuning 2-200 l 4 buah/sampel, dan Pipet-tip putih 3 buah/sampel.
Komposisi larutan cocktail yaitu; ddH2O 15 l, Buffer 2,5 l, dNTPS 2,5 l, Taq-Polymerase 1
l, DNA sampel 1 l, Primer RAPD OPA-04 3 l.
 Sedangkan alat yang digunakan adalah Bak elektrophoresis, Power supply, Comb 8, Gel
tray, Penghambat gel, Perangkat gel dokumentasi, Pipet mikro 2-10 l, Pipet mikro 0,2-10l, dan
mesin PCR.
3.3 Cara Kerja
3.3.1 isolasi DNA
Buffer CTAB disiapkan sebanyak 2 ml/sampel dengan menambahkan 1% -
Mercaptoethanol. Pencampuran tersebut dilakukan di bawah lemari asam. Lalu dimasukkan
kedalam beaker 25 ml, ditutup dengan alumunium foil agar tidak menguap dan dipanaskan pada
suhu 65oC sebelum digunakan. Kemudian disiapkan jaringan segar dari daun tanaman cabai
sebanyak 2 gram. Digerus searah dengan mortar sampai halus, lebih cepat lebih baik. Jika
tersedia nitrogen cair ditambahkan secukupnya untuk membantu mempercepat penggerusan.
Lalu dimasukkan jaringan yang sudah digerus secukupnya (sekitar 0,5 gr) kedalam tabung
sentrifus 2 ml yang steril. Kemudian ditambahkan lagi 1 ml 1,5x buffer ekstraksi CTAB yang
sudah diberi 1% -Mercaptoethanol dan sebelumnya sudah dihangatkan terlebih dahulu, lalu
dicampurkan sampai merata dengan menggunakan vortex.
Kemudian diinkubasi pada pada suhu 65oC selama 1 jam sambil dicampur setiap 10
menit secara berhati-hati. Ditambahkan 500 l dan dicampur dengan Chloroform:Isoamylalkohol
(24:1) lalu diaduk dengan cara membolak-balikkan selama 10 menit. Lalu ditransfer supernatant
(jika diperlukan tambahkan lagi isopropanol samapi volume mencapai maksimum). Pengendapan
DNA akan terlihat berupa benang-benang halus setelah penambahan isopropanol. Jika benang-
benang halus tidak terlihat, maka dilakukan inkubasi pada suhu -20oC selama satu jam.
Jika DNA sudah mengendap buang sisa campuran isopropanol dan cuci dengan Washing
Buffer I (WB-I) sebanyak 500 l selama 10 menit. Selanjutnya setelah WB-I dibuang, dilakukan
pencucian dengan Washing Buffer II (WB-II) selama 10 menit. Sisa WB-II selanjutnya dibuang,
sehingga tinggal pellet yang tersisa. Apabila diperlukan dilakukan sentrifugasi beberapa saat
dengan kecepatan rendah (10.000 rpm selama 2 menit). Kemudian dikeringkan DNA pada suhu
ruang. Apabila tersedia Vacuum-dryerdapat digunakan untuk mempercepat pengeringan. Apabila
tidak, sebagai alternatif bisa digunakan oven dengan suhu 55 oC. Penggeringan sangat penting
dan dipastikan bahwa tidak ada lagi alkohol dan cairan lain yang tersisa pada pellet. DNA yang
sudah mengering akan terlihat seperti lapisan lem yang mongering. Kemudian dilarutkan
kembali dengan air atau 1x Buffer TE. Jika akan digunakan untuk jangka waktu yang panjang
pelarutan lebih baik dilakukan dengan 1x Buffer TE, sedangkan jika akan digunakan untuk
jangka pendek serta keperluan rekayasa (kloning, restriksi) sebaliknya dilarutkan dengan ddH 2O
steril. Lalu dilakukan analisis kualitas dan kuantitas DNA menggunakan elektrophoresis.
3.3.2 Elektroforesis
Ditambahkan 1 gram agar (agarose), lalu ditambahkan 10 ml 0,5 x TBE. Lalu dimasak
dengan menggunakan microwave dengan botol dalam keadaan longgar. Dimasak sampai agar
(agarose) benar-benar mencair (larut). Kegiatan ini harus dilakukan di dalam chemical hood.
Lalu dipasang tray gel casting, comb dan penghambat agar gel tidak keluar. Setelah agar benar-
benar larut, dikeluarkan dari dalam microwave dan dibuka tutupnya sampai suhu mencapai kira-
kira 55oC. kemudian ditambahkan kedalam larutan agra tersebut 5 l (10 mg/ml) ethidium
bromide, diaduk sampai merata menggunakan batang thermometer. Lalu dituangkan agar
tersebut kedalam gel tray samapi mencapai tebal yang dikehendaki. Jika terlalu tipis maka
volume DNA yang dapat dimasukkan menjadi sedikit, tetapi jika terlalu tebal buffer yang
dibutuhkan jadi bertambah banyak. Lalu ditunggu sampai agar (agarose) membeku/padat (sekitar
15-20 menit). Sambil menunggu gel membeku/padat disiapkan DNA sampel dalam volume 10 l
yang terdiri dari campuran 2 l DNA, 1 l 10x BPB dan 7 l 1x TE. Demikian pula dilakukan
untuk standart lambda DNA.
Kemudian diisi buffer TBE ke dalam elektrophoresis sistem secukupnya, sampai
permukaan gel terbenam, sekitar beberapa mm dari permukaan buffer TBE. Loading sampel
DNA dan standart lambda DNA pada well (lubang) paling kiri dengan menggunakan pipet mikro
secara hati-hati, jangan sampai merusak sumur gel. Lalu setting power supply menggunakan
tegangan 90 Volt selama 1 jam. Berhati-hati jangan menyentuh sistem elektrophoresis karena
sistem sedang dialiri dengan arus listrik tegangan tinggi. Setelah selesai, dimatikan power supply
dan dicabut kabel dari sumber arus listrik untuk memastikan bahwa tidak ada lagi arus yang
mengalir pada sistem elektrophoresis. Lalu diambil gel beserta traynya dengan berhati-hati dan
diletakkan di atas UV-Transiluminator. Kemudian dilakukan setting posisi gel agar seluruh
sampel bisa terlihat semua. Dihidupkan UV-Transiluminator dan dilakukan pengambilan foto
dengan kamera sistem yang sudah terinstal. Lalu diprint foto gel dan disimpan foto dalam bentuk
digital (jpeg atau bmf ataupun tiff). Penyimpanan dalam format jpeg lebih memiliki
kompatibilitas yang luas, sehingga bisa dibuka dengan berbagai aplikasi software yang lebih
beragam. Lalu terakhir, dilakukan analisis kwalitatif dan kwantitatif dengan membandingkannya
dengan control lambda yang digunakan.
3.3.3 Restriksi DNA Genomik
Disiapkan 4 l DNA sampel dari tanaman cabai hasil praktikum materi II. Lalu dibuat
larutan cocktail untuk lima sampel tersebut, dengan komposisi seperti di alat dan bahan.
Dicampurkan larutan cocktail dengan sempurna, kalau perlu dengan mevorteksnya. Dimana
larutan cocktail tersebut komposisinya yaitul; Enzim BAM H-I 0,33 l, Buffer 2,5 l, ddH 2O
18,17 l, dan DNA sampel 4 l, ditambah 1 l DNA sampel lagi, sehingga dihasilkan 25 l per
sampel. Lalu dibagi larutan cocktail tersebut kedalam lima tabung reaksi yang sudah diberi label
A, B, C, D, dan E untuk masing-masing mendapat 25 l. Kemudian ditambahkan 10 l larutan
DNA (100 ng/l) masing-masing sampel kedalam tabung reaksi A, B, C, D, dan E. Lalu
dicampurkan larutan tersebut dengan baik, dengan cara melakukan tapping menggunakan
ujung jari. Setelah itu, diinkubasikan larutan restriksi tersebut kedalam waterbath dengan suhu
30oC selama 3 jam. Inkubasi juga dapat dilakukan di dalam oven dengan suhu 30 oC. sebagai
alternatif, inkubasi dapat juga dilakukan selama overnight (ON). Lalu dilakukan kegiatan analisis
elektrophoresis seperti pada materi III. Dan jangan lupa untuk menyertakan DNA yang belum
direstriksi sebanyak 500 ng di depan sampel DNA yang telah direstriksi sebagai pembanding.
Lalu dilakukan pengamatan terhadap hasil yang diperoleh.
3.3.4 Amplifikasi DNA in-vitro
Dikeluarkan primer RAPD OPA-04 dari freezer, lalu dicairkan dengan membiarkannya
beberapa saat pada suhu ruang, atau kalau ingin cepat bisa dipanaskan dengan mengiling-
gilingnya menggunakan kedua telapak tangan. Kemudian disiapkan larutan DNA sampel dengan
konsentrasi masing-masing 1 ng/l. Lalu disiapkan 5 buah RTG-PCR beat dan diberi label pada
masing-masing tabungnya dengan kode A, B, C, D, dan E. Lalu ditmbahkan kedalam masing-
masing tube 15 l ddH2O. Lalu ditambahkan pada masing-masing tube 3 l primer RAPD-OPA-
04. Selanjutnya, ditambahkan 1 l larutan sampel DNAn masing-masing sampel pada tube.
Kemudian dipastikan kelima komponen tercampur dengan rata dengan melakukan tipping. Lalu
dihentakkan dengan tangan, agar seluruh komponen larutan bercapur (turun) ke bawah tube.
Dibawa sampel ke ruang PCR. Lalu dihidupkan mesim PCR (Biometra-T Premium), ditunggu
sampai proses self-testing selesai dilakukan. Kemudian dibuka direktori LAB-BIOTEK, dicari
program RTG-PCR. Lalu program RTG-PCR yang digunakan memiliki kondisi sebagai mana
tertera pada tabel.

Aktifitas Suhu (oC) Waktu (menit) Siklus

Denaturasi awal 94 5
Denaturasi 94 30 detik
Annealing 36 1
1
Ekstensi 72 2
Denaturasi 94 0,5
Annealing 42 0,5 29
Ekstensi 72 0,5
Final ekstensi 72 10
Pause 4

Tabel kondisi PCR yang digunakan untuk amplifikasi

Program di atas akan berlangsung kira-kira 2 jam 31 menit 20 detik. Setelah selesai,
maka dilakukan kegiatan analisis Elektrophoresis sebagaimana pada materi III di atas. Dan
dilakukan pengamatan-pengamatan terhadap hasil yang diperoleh.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi DNA

4.1.1 Hasil

4.1.2 Pembahasan
Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding dan membrane sel
dan juga membrane inti. Berdasarkan hasil pengamatan, larutan yang berisi cabai dan buffer
CTAB sesuai dengan metoda isolasi yang dilakukan . Penambahan buffer ekstraksi ini berfungsi
untuk melisiskan membran sel dan mendenaturasi protein sehingga DNA pada jaringan buah
cabai dapat diisolasi. Larutan dalam tabung tersebut dihomogenkan dengan menggunakan
vorteks.
Kemudian diinkubasi sehingga menghasilkan perubahan warna larutan. Penginkubasian
sampel dalam waterbath bersuhu 65oC selama 20 menit ini dilakukan untuk mengoptimalikan
kerja buffer ekstrak. Langkah selanjutnya adalah penambahan Potassium asetat yang bertujuan
untuk membentuk senyawa kompleks CTAB-Potassium asetat-protein-debris sel. Yang kemudian
dilanjutkan dengan sentrifugasi yang bertujuan untuk memisahkan debris dan komponen sel lain
yang menjadi pengotor dengan DNA. Proses ini menghasilkan larutan dengan dua fasa, yakni
fasa atas dan endapan. Kemudian, setelah fasa atas di ambil dan dipindahkan ke dalam tabung
baru, ditambahkan Phenol:Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI) yang dilakukan untuk
mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan
protein, lipid dan molekul lain seperti polisakarida, yang diharapkan akan didapatkan supernatan
yang berisi DNA bebas kontaminan. Kloroform berfungsi sebagai pendenaturasi protein,tetapi
DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena tidak larut didalam pelarut organik seperti kloroform.
Kemudian dilakukan penambahan alkohol sebagai presipitasi DNA setelah dilakukan
sentrifugasi dan pemindahan fasa. Penambahan alkohol ini berfungsi sebagai penghilang
kloroform. Sebab apabila kloroform masih berada di dalam sampel maka dikhawatirkan akan
menghambat kerja enzim-enzim restriksi atau enzim lain yang digunakan untuk analisis
molekuler. Dihasilkanlah larutan bening dan gumpalan di dalam tabung. Gumpalan tersebut
merupakan DNA dari jaringan daun cabai.
Dalam melakukan isolasi DNA, prinsip dasar yang dipahami adalah pemisahan molekul
DNA dari jaringan tanaman tanpa merusak keutuhan dan kemurnian DNA tersebut.
4.2 Elektroforesis
4.2.1 Hasil
4.2.2 Pembahasan
Pada praktikum elektroforesis ini, sampel diambil dari sampel molekul DNA yang telah
dilarutkan dalam TE sebanyak 30 mikroliter dan telah disimpan pada suhu 4C selama 24
jam. Lalu penambahan Loading dye ke dalam sampel dengan perbandingan 5 bagian sampel
DNA dan 2 bagian loading dye.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul DNA ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang
ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian dialirkan listrik dengan kutub yang terpisah satu sisi
dengan sisi lainnya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah
satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah
menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya.
Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamidadigunakan untuk menjaga agar asam nukleat
berbentuk lurus. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar
molekul sampel yang telah terpisah dapat dideteksi. Dalam praktikum ini kami menggunakan Etidium
bromida sebagai zat pewarnanya,. Etium bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan
akan memberikan warna orange fluoresanceyang dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet.
Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet akan terlihat pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane)
yang berbeda pada gel; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari sumur gel. Pita-pita yang
berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di
dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang berarti bahwa molekul-molekul
tersebut berukuran sama. Penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran
berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-
elektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker
tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel
berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.

4.3 Restriksi DNA Genomik

4.3.1 Hasil
 4.3.2 Pembahasan
Perkembangan teknologi DNA rekombinan sangat dimungkinkan karena penemuan
enzim yang dapat memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi yang spesifik yang jumlahnya
terbatas. Enzim-enzim tersebut dikenal sebagai enzim restriksi yang ditemukan pertama kali
pada bakteri pada akhir tahun 1960-an.
Kerja enzim tersebut dalam tubuh inangnya adalah mengenali dan memotong DNA
(termasuk DNA faga tertentu) yang asing bagi bakteri tersebut. Maksud dari kegiatan
memotong DNA asing tersebut tidak lain sebagai mekanisme perlindungan bakteri terhadap
DNA yang menyelinap dari organisme lain seperti virus atau sel bakteri lain. Enzim-enzim ini
bekerja dengan memotong-motong DNA pada lokasi-lokasi yang spesifik- mengenali daerah atau
urutan DNA pendek dalam molekul DNA dimana urutan DNA yang dikenali tersebut bersifat
PALINDROME. Selanjutnya enzim tersebut akan memotong DNA pada titik tertentu di dalam
urutan DNA tersebut. Sel bakteri ini melindungi DNA-nya sendiri dari restriksi dengan
menambahkan gugus metil (CH ) pada adenine atau 3 sitosin di dalam urutan yang dikenali oleh
enzim restriksi tersebut. Enzim-enzim restriksi yang telah ditemukan dan telah tersedia secara
komersial telah berjumlah ratusan (Kusumawaty, 2011).
Hasil pemotongan enzim restriksi ada dua jenis. Hasil
pemotongan yangmenghasilkan ujung tumpul atau Blunt end dan hasil pemotongan yang
menghasilkan ujung lancip/ lengket atau sticky end.

4.4 Amplifikasi In-vitro

 4.4.1 Hasil

4.4.2 Pembahasan
Teknik PCR dilakukan untuk memperbanyak DNA secara in vitro dengan
menggunakan thermocycler melalui pengaturan suhu dan siklus DNA (denaturasi, annealing, dan
sintesis DNA) sehingga dihasilkan jumlah perbanyakan DNA yang diinginkan. Perbanyakan
yang dilakukan memperoleh perbanyakan DNA berukuran 1 kb pada beberapa sumur yang
dielektroforesis. Perbanyakan dilakukan melalui proses denaturasi, annealing, dan sintesis DNA
baru.
PCR adalah suatu metode untuk mengamplifikasi sekwens gen target secara eksponensial
in vitro. Pada reaksi ini dibutuhkan: DNA target, sepasang primer, polimerase DNA yang
termostabil, buffer reaksi dan alat thermal cycler. Jadi pada hasil PCR yang dilakukan oleh
kelompok 2, pada sampel 1 dan 4 tidak terdapat hasil perbanyakan DNA secara In-vitro, mungin
dikarenakan banyak langkah pada proses yang dilakukan banyak terjadi kegagalan. Pada sampel
2 hanya terdapat bayangan-bayangan, yang menandakan banyak nya kontaminan yang terbawa
dalam proses perbanyak DNA secara in-vitro ini, dan pada sampel 3 terlihat adanya terjadi
perbanyak DNA secara in-vitro yang menandakan proses nya dalam mesin PCR berjalan cukup
baik.
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20-30 kali. Setiap siklus terdiri
dari tiga tahap. Berikut adalah tiga thp bekerjanya PCR dalam siklus:

1. Tahap Peleburan (Melting) atau denaturasi

 Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi 94-960C) ikatan hydrogen DNA terputus
(denaturasi) dan DNA menjadi berbekas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini
dilakukan agak lama (sampai menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan
ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat (patokan) bagi rimer. Durasi tahap
ini 1-2 menit.
2. Tahap Penempelan atau Anealing
. Primer menmpel pada bagian DNA templet yang komplementer urutan basanya. Ini
dilakukan pada suhu antara 45-600C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat
menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi
tahap ini 1-2 menit.

3. Tahap Pemanjangan atau Elongasi

Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polymerase yang dipakai. Dengan Taq-
Polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 760C. durasi tahap ini biasanya 1 menit.

DAFTAR PUSTAKA

Anderson. 1993. Genome Shortcut Leads to Problem. Science 259: 1684-1687.

Aris. 2010. Restriction Enzymes and DNA Hibrydization. diakses
darihttp://www.nature.com/scitable/topicpage/Restriction-Enzymes-545 pada tanggal 24
November 2013 pukul 20.30 WIB.
Campbell. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE
Foundation. Bogor.
Doyle. 1990. E. Laras, Sri Widyarti, Sri Rahayu. 2011. Biologi Molekuler Prinsip Dasar Analisis.Penerbit
Erlangga. Jakarta.
Jamsari. 2007. Bioteknologi Pemula : Prinsip Dasar dan Aplikasi Analisis Molekuler. Unri Press. Pekan
Baru.
Miligan. 1992. Genetika Molekuler Mikro. Jakarta : dttbus. Bri.
Ningrum. 2008. Structure and Function of Type II Restriction Endonucleases. Nucleic Acids Res.
Philips, T. 2010. Restriction Enzymes Explained. diakses
darihttp://biotech.about.com/od/proteinengineering/a/restrictenz.htm. pada tanggal 20 November
2013 pukul 15.00 WIB.
Purwantara. 2001. Genetika, Biokimia, dan Biologi Molekuler. PT Rineka Cipta. Bandung.
Rinehart. 2005. Plant and Biologi Molekuler. IPB Press. Bogor.
Sudarsono, 1996. Laju Migrasi DNA Covalently Closed Circular (CCC) The Mcmillan. New York.
Suprapto. 2003. Genetics: The Continuity of Life. 4th ed. Wadsworth Publishing Company. London: xix +
820 hlm.
Tohib, W. 2012. Plant Breeding. Dewa Ruci Press. Jakarta.
Yuwono, A. 2006. Genetika dan Bioteknologi. PT Rineka Cipta. Bandung.