Sulfat Galactan dari Palisada flagellifera Menghambat Beracun

Pengaruh Lachesis muta Snake Venom

Ana Claudia Rodrigues da Silva 1, , Luciana Garcia Ferreira 2, , Maria Eugenia

Rabello Duarte 2, *, Miguel Daniel Noseda 2, Eladio Flores Sanchez 3 dan Andr
Lopes Fuly 1, *

1 Departemen Biologi Molekuler dan Seluler, federal Fluminense University, CEP

24020-141 Niteri, Rio de Janeiro, Brasil; E-Mail: anacrs1@yahoo.com.br

2 Departemen Biokimia dan Biologi Molekuler, Universitas Federal Paran,

CEP 81531-980 Curitiba, Paran, Brazil; E-Email: lugarciaferreira@gmail.com

(L.G.F.);

nosedaeu@ufpr.br (M.D.N.)

3 Laboratorium Biokimia Protein dari racun Hewan, Pusat Penelitian dan

Pengembangan, Ezequiel Dias Foundation, CEP 30510-010 Belo Horizonte, Minas
Gerais, Brasil;

E-Mail: eladiooswaldo@gmail.com

penulis ini kontribusi sama untuk pekerjaan ini.

* Penulis untuk siapa korespondensi harus ditangani;

E-Email: eugenia.duarte@pq.cnpq.br (M.E.R.D.); andfuly@vm.uff.br (A.L.F.); Tel .:

+ 55-41-3361-1663 (M.E.R.D.); + 55-21-2629-2294 (A.L.F.);
Fax: + 55-41-3266-2042 (M.E.R.D.); + 55-21-2629-2376 (A.L.F.). Editor Akademik:
Valeria Costantino

Diterima: 8 April 2015 / Diterima: 25 Mei 2015 / Diterbitkan: 11 Juni 2015

Abstrak: Di Brazil, gigitan ular adalah masalah kesehatan masyarakat dan kecelakaan
yang disebabkan oleh Lachesis muta memiliki indeks kematian tertinggi.
Envenomation oleh L. muta ditandai dengan sistemik (hipotensi, perdarahan dan
gagal ginjal) dan efek lokal (nekrosis, rasa sakit dan edema). Pengobatan untuk
membalikkan evolusi semua efek beracun dilakukan dengan suntikan antivenom.
Namun, terapi tersebut tidak efektif menetralisir kerusakan jaringan atau efek lokal
lainnya, karena dalam banyak kasus korban menunda mencari perawatan medis yang
tepat. Dengan cara ini, terapi alternatif dalam permintaan, dan molekul dari sumber
alami telah diuji mendalam. Dalam tulisan ini, kami menganalisis efek
penghambatan dari galactan sulfat yang diperoleh dari flagellifera rumput laut
Palisada merah terhadap beberapa kegiatan beracun dari L. muta racun. Inkubasi
galactan sulfat dengan racun mengakibatkan penghambatan hemolisis, koagulasi,
proteolisis, edema dan perdarahan. netralisasi

perdarahan juga diamati ketika galactan itu diberikan setelah atau sebelum injeksi
racun; dengan demikian meniru nyata dalam situasi vivo. Selain itu, galactan yang
diblokir edema disebabkan oleh fosfolipase A2 terisolasi dari racun yang sama. Oleh
karena itu, galactan dari P. flagellifera mungkin merupakan alat yang menjanjikan
untuk mengobati envenomation oleh L. muta sebagai coadjuvant untuk antivenom
konvensional.
Kata kunci: galactan sulfat; Palisada flagellifera; Lachesis muta; racun ular;
penetralan

1. Perkenalan

Envenomation oleh ular merupakan masalah kesehatan masyarakat terutama di

daerah pedesaan Afrika, Asia, Amerika Latin dan Oseania, di mana sering
mempengaruhi orang-orang muda dan aktif secara ekonomi [1,2]. Menurut
Organisasi Kesehatan Dunia, gigitan ular dianggap sebagai penyakit yang diabaikan
[3,4] yang mempengaruhi 20.000 korban per tahun, dengan 0,5% dari kematian dan
8% dari morbiditas. Namun angka-angka ini tidak tepat karena gigitan ular sering
terjadi di mana tidak ada unit kesehatan atau rumah sakit untuk menangani
pemberitahuan. Racun yang diproduksi oleh ular Viperidae terdiri dari campuran
kompleks dari protein termasuk metalloproteinase (SVMPs), proteinase serin
(SVSPs), phospholipases A2 (PLA2), disintegrins, C-jenis lektin protein terkait,
myotoxins, dan lain-lain [5], yang menyebabkan lokal efek (nyeri, edema, nekrosis,
peradangan, perdarahan) dan efek sistemik (merepotkan koagulasi, gagal ginjal dan
jantung, perdarahan dan neurotoksisitas) ke korban [6]. spesies Bushmaster adalah
terbesar berbisa pit viper yang mendiami wilayah Amazon dari beberapa negara
Amerika Selatan dan envenomation parah ditandai dengan pendarahan, gagal ginjal,
syok, nyeri, perdarahan lokal, diare, bradikardia, hipotensi drastis, dan nekrosis
jaringan [7, 8]. Di wilayah Amazon Brasil, frekuensi statistik gigitan ular disebabkan
oleh Lachesis muta adalah 17% dan Bothrops 76% dan harus dianggap darurat medis
tanpa ukuran ular dan produksi racun (168-552 mg / ular) [9] . Karakterisasi
proteomik dari bushmasters (L. muta dan L. stenophris) racun [10] menunjukkan
bahwa racun dari L. muta mengandung sekitar 30-40 protein milik hanya 8 keluarga
toksin, terutama tingkat tinggi metaloproteinase dari PI dan P-III kelas [11]; protease
serin dengan koagulan [12], aktivasi plasminogen [13], dan [14] kegiatan kallikrein-
seperti; phospholipases A2 [15,16], di antara komponen lain yang memainkan peran
kunci dalam bushmaster envenoming.

Gigitan ular telah mendapat sedikit perhatian dari industri farmasi, pemerintah atau
akademisi untuk meningkatkan terapi antivenom. Administrasi antivenom adalah
satu-satunya terapi yang efektif dan diterima untuk gigitan ular. Namun, ia memiliki
beberapa kelemahan, terutama penghambatan miskin efek lokal [1,4], efek samping
(demam dan / atau reaksi anafilaksis) dan biaya produksi yang tinggi [4,17]. Untuk
alasan ini, perlu untuk mencari molekul penetral alternatif yang mampu bertindak
secara efisien terhadap efek lokal dipromosikan oleh racun ular.

organisme laut menghasilkan molekul dengan keragaman kimia besar berasal dari
primer (lipid, polipeptida dan protein, enzim dan polisakarida) dan metabolisme
sekunder (terpene, alkaloid dan sterol), membuat mereka alat yang sangat berguna
untuk penggunaan bioteknologi karena berbagai mereka fungsi farmakologis dan
ekologi [18]. Selain itu, rumput laut dikenal sebagai penghasil polisakarida yang
berbeda, seperti galaktan, fucoidans, rhamnans, xylans, xylogalactans dan
xylomannans, dengan berbagai penyebaran efek farmakologis [19-23]. Meskipun
berbagai aktivitas biologis dikaitkan dengan rumput laut sulfat polisakarida, hanya
sedikit penelitian menggambarkan senyawa alami sebagai agen antivenom. Sebuah
fucoidan sulfat dari Fucus vesiculosus disajikan efek perlindungan terhadap
sitotoksik dan kegiatan myotoxic dari kelompok fosfolipase A2 myotoxin dari bisa
ular crotaline [24]. Bila dibandingkan dengan high-molekul fucoidan berat badan
diperoleh dari F. vesiculosus, fragmen polisakarida sulfat ini diperoleh setelah
hidrolisis parsial disajikan kapasitas yang lebih rendah untuk mencegah nekrosis otot
pada tikus setelah injeksi myotoxin dimurnikan atau racun mentah [25]. Hasil ini
bertentangan dengan harapan penulis, yang berhipotesis bahwa fragmen fucoidan
lebih kecil, menjadi dari diffusibility lebih tinggi untuk jaringan, dapat menimbulkan
aktivitas antivenon lebih tinggi [25].

Beberapa kegiatan biologi telah dikaitkan untuk galaktan diperoleh dari rumput laut,
termasuk antivirus, antikoagulan, antiangiogenic dan efek antitumor [26-29]. Namun,
sejauh yang kita tahu, tidak ada studi melaporkan aktivitas antivenom dari polimer
alami. Sulfat galaktan adalah polisakarida utama yang dihasilkan oleh rumput laut
merah dan menyajikan struktur dasar dibentuk oleh unit berulang dari 3-linked -D-
galaktosa dan 4-linked -galaktosa, bernama A dan unit B, masing-masing [26].
Sering unit B ditemukan sebagai 3,6-anhydro--galaktosa. Selain itu, unit B dengan
konfigurasi enantiomerik L (-L-galaktosa atau 3,6-anhydro--L-galaktosa)
mencirikan galactan milik kelompok agaran, sedangkan unit B dengan konfigurasi
enantiomerik D (-D-galaktosa atau

3,6-anhydro--D-galaktosa) mencirikan galactan milik kelompok karaginan. Dalam

karya ini, kita telah menggunakan galactan sulfat dimurnikan dari Palisada
flagellifera bernama FHS-3. Struktur polisakarida sulfat (xylomannans dan galaktan)
yang dihasilkan oleh spesies ini sebelumnya ditandai dan dijelaskan dengan detail
[30,31]. Mengenai galaktan yang, P. flagellifera biosynthesizes keluarga sulfat yang
sangat kompleks, alkohol dan agarans pyruvylated [31].

Dalam tulisan ini, kami mengevaluasi kemampuan galaktan sulfat terisolasi dari
merah rumput laut P. flagellifera untuk menetralisir beberapa kegiatan beracun dari
L. muta racun. Selain itu, kemampuan penetral yang juga diperiksa terhadap isoform
PLA2 terisolasi dari racun yang sama (bernama LM-PLA2-I), menunjukkan potensi
penggunaan polimer alami dalam pengobatan kecelakaan gigitan ular.

2. Hasil dan Pembahasan

Kecelakaan oleh Lachesis racun harus dianggap sebagai penyakit yang mengancam
jiwa. Terapi antivenom efektif dalam menetralkan efek toksik sistemik, jika diberikan
dalam waktu (dalam waktu 60 menit dari kecelakaan), tapi itu tidak efektif atau
kurang efektif terhadap kerusakan jaringan lokal di lokasi gigitan [32]. Jadi, selain
kematian, korban selamat dengan gejala sisa fisik permanen akibat nekrosis jaringan
lokal. Dengan demikian, ada permintaan yang besar untuk molekul baru dari sumber
alami dengan efek antivenom. ekstrak kasar tumbuhan atau molekul terisolasi dengan
properti antivenom telah dilaporkan [33,34], tetapi sedikit investigasi telah dilakukan
dengan rumput laut [35] dan, bahkan kurang dengan polisakarida dari sumber seperti
[24,25]. Antikoagulan dan efek antivirus polisakarida sulfat dari rumput laut yang
mapan dan, dalam beberapa kasus korelasi yang mungkin antara struktur kimia dan
mekanisme kerja telah diusulkan [36-40]. Selain itu, beberapa laporan
menggambarkan kapasitas penetral ditampilkan oleh fucoidans sulfat dari rumput
laut coklat terhadap racun ular [25]. Jadi, di sini kita melaporkan efek penghambatan
dari sulfat kompleks tinggi, pyruvylated dan alami alkohol jenis agaran galactan
(bernama FHS-3) dari merah rumput laut P. flagellifera terhadap beberapa in vitro
dan in vivo kegiatan beracun dari L. muta racun. FHS-3 dikurangi hemolitik,
proteolitik, koagulasi, hemoragik dan kegiatan edematogenic.

2.1. Netralisasi Koagulasi

pembekuan darah abnormal dan / atau perdarahan sering diamati pada gigitan ular
dan relevansi klinis [41]. L. muta racun (10 mg / mL) plasma bergumpal di ca. 60 s
dan konsentrasi racun tersebut, yang mewakili satu MCD, diinkubasi dengan FHS-3
pada konsentrasi yang berbeda (100, 200 atau 500 mg / mL). Gambar 1 menunjukkan
bahwa FHS-3 menghambat L. muta-diinduksi koagulasi dengan profil tergantung
dosis. FHS-3 tidak menginduksi koagulasi.
Gambar 1. L. muta racun (10 mg / mL) diinkubasi dengan FHS-3 pada 100, 200 atau
500 mg / mL selama 30 menit pada 25 C, maka campuran tersebut ditambahkan ke
plasma dan waktu pembekuan tercatat, sebagai dijelaskan dalam Metode. Data
dinyatakan sebagai berarti SEM dari tiga percobaan individu (n = 3). * Tingkat
Signifikansi (p <0,05) bila dibandingkan dengan kontrol (racun yang dicampur
dengan garam).

2.2. Netralisasi Hemolisis dan Proteolisis

Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2, FHS-3, di 1:10 (180 ug / mL) atau (360 ug /
mL) racun 01:20: rasio polisakarida (w / w) menghambat hemolisis dan proteolisis
disebabkan oleh L. muta (18 pg / mL). Seperti yang terlihat, FHS-3 dihambat lebih
efisien yang proteolitik dari aktivitas hemolitik L. muta racun, karena pada

01:20 rasio, FHS-3 dihambat 100% dari proteolisis dan hanya 40% dari hemolisis,
mungkin karena L. muta racun berisi beberapa isoenzim PLA2 (beberapa dasar dan
lain-lain bersifat asam) yang bertanggung jawab untuk aktivitas hemolitik [15,16,
42]. Pada setiap atau lebih tinggi konsentrasi dievaluasi (hingga 500 mg / mL), FHS-
3 tidak diinduksi hemolisis atau proteolisis.

Gambar 2. L. muta racun (18 mg / mL) diinkubasi dengan FHS-3 (180 atau 360 mg /
mL) untuk

30 menit, dan kemudian hemolisis atau proteolisis ditentukan. Data dinyatakan

sebagai berarti SEM dari tiga percobaan individu (n = 3). * Tingkat Signifikansi (p
<0,05) bila dibandingkan dengan kolom putih.
2.3. Netralisasi Perdarahan dan Myotoxicity

Perdarahan yang disebabkan oleh SVMPs disebabkan degradasi komponen dari

membran basement (BM), misalnya, kolagen tipe IV dan laminin dan sekitarnya
ekstra matriks seluler (ECM) yang memberikan stabilitas mekanik untuk kapiler [43].
SVMPs adalah seng tergantung endopeptidases, dan merupakan salah satu komponen
yang paling beracun dari bisa ular [43]. ion logam ini tampaknya memainkan peran
kunci dalam katalisis serta menawarkan stabilitas struktural untuk enzim ini. Injeksi
L. muta racun (7 mg / g) memicu halo perdarahan pada tikus dari 20 mm, yang sesuai
dengan dua MHD. Kemudian, efek dari FHS-3 pada aktivitas hemoragik konsentrasi
muta racun L. seperti dievaluasi menggunakan inkubasi (Gambar 3A, kelompok 1),
pencegahan (Gambar 3A, kelompok 2) atau pengobatan (Gambar 3A, kelompok 3)
protokol. Seperti yang ditunjukkan (Gambar 3A, kelompok 1), ketika FHS-3 (70
mg / g, kolom putih atau 140 mg / g, kolom hitam) diinkubasi dengan L. muta racun,
penghambatan perdarahan adalah 50% dan 80%, masing-masing . Jika FHS-3 (70 mg
/ g) diberikan secara oral sebelum (kelompok 2, kolom putih) atau setelah (kelompok
3, kolom putih) injeksi nomor pembayar L. muta racun, 30% dan 20% -inhibition
dicapai, masing-masing. Selain itu, i.v. ketika FHS-3 (70 mg / g) diinjeksikan
sebelum L. muta racun, persentase penghambatan telah mencapai

40% (kelompok 2, kolom hitam), tetapi ketika disuntikkan setelah L. muta racun
(kelompok 3, kolom hitam), persentase penghambatan turun menjadi setengah
(20%). Sebagai usulan lain dari pengobatan untuk gigitan ular, L. muta racun
disuntikkan nomor pembayar ke tikus, dan 15, 30 atau 60 menit setelah, FHS-3
disuntik nomor pembayar di tempat suntikan yang sama. Seperti yang terlihat pada
Gambar 3B, tikus FHS-3 dilindungi dari perdarahan oleh ca. 55%, pada setiap
periode waktu dievaluasi.
Gambar 3. (A) Untuk kelompok Inkubasi, L. muta (7 mg / g) racun diinkubasi
dengan FHS-3 (70 mg / kg atau 140 mg / kg) selama 30 menit, kemudian, campuran
disuntikkan s.c .; untuk kelompok Pencegahan, FHS-3 (70 mg / kg) diberikan secara
oral atau intravena, dan 15 menit kemudian, L. muta racun (7 mg / g) adalah
disuntikkan s.c .; dan untuk kelompok Treatment, L. muta (7 mg / g) racun
disuntikkan S.C., dan 15 menit kemudian, FHS-3 (70 mg / kg) diberikan secara oral
atau intravena; (B) L. muta racun (7 mg / g) diinjeksikan S.C., dan 15 menit, 30
menit atau 60 menit setelah, FHS-3 (70 mg / kg) disuntikkan S.C., dan perdarahan
dianalisis. Data dinyatakan sebagai berarti SEM dari tiga percobaan individu (n = 5).
* Tingkat Signifikansi (p <0,05) bila dibandingkan dengan kolom putih.

Selain itu, ketika FHS-3 (200 mg / mL) adalah co-diinkubasi dengan racun, L. muta
(5 mg / mL) -diinduksi aktivitas myotoxic sepenuhnya terhambat. Jadi, itu menarik
untuk meniru situasi in vivo untuk kegiatan tersebut juga. Dengan cara ini, L. muta
racun pertama kali disuntikkan i.m. ke tikus, dan 15 menit kemudian, saline
disuntikkan i.m. (Gambar 4, kolom 1) atau FHS-3 (150 mg / g) pada tempat suntikan
L. muta racun (Gambar 4, kolom 2), secara oral (Gambar 4, kolom 3) atau intravena
(Gambar 4, kolom 4). Seperti yang terlihat pada Gambar 4, FHS-3 dihambat
myotoxicity, terlepas rute administrasi. Secara umum, seperti yang diamati di semua
protokol, FHS-3 perdarahan menghambat (Gambar 3) dan myotoxicity (Gambar 4)
dari L. muta racun; dan hasil tersebut dapat membawa kita untuk berspekulasi
penggunaan FHS-3 untuk meningkatkan terapi antivenom, untuk mencegah atau
untuk mengurangi efek nekrosis lokal yang menyebabkan cacat berat atau cacat dan
kematian. Namun, mekanisme penghambatan FHS-3 pada perdarahan atau
myotoxicity mungkin melalui chelating Zn2 + atau Ca2 + berinteraksi dengan
domain tertentu untuk menonaktifkan SVMPs atau enzim PLA2, masing-masing,
mencegah induksi perdarahan atau nekrosis jaringan.

Gambar 4. L. muta racun (5 ug / g) disuntikkan intramuskular ke tikus, dan 15 menit

kemudian, saline (kolom 1) dan FHS-3 (150 mg / g) disuntikkan di situs yang sama
dari suntikan L. muta racun (kolom 2), secara oral (kolom 3) atau intravena (kolom
4). Kemudian, myotoxicity ditentukan, seperti yang dijelaskan. Data dinyatakan
sebagai berarti SEM dari tiga percobaan individu (n = 4). * Tingkat Signifikansi (p
<0,05) bila dibandingkan dengan kolom 1 (kontrol, L. muta racun dengan saline).

2.4. Netralisasi Edema

Edema adalah efek patofisiologi penting lain dari gigitan ular, dan enzim PLA2, yang
aktivitas enzimatik adalah Ca2 + -tergantung terlibat juga. Setelah sub plantar injeksi
L. muta (7 mg / kg) racun atau LM-PLA2-I (5 mg / kg) dicampur dengan garam ke
dalam cakar tikus, meningkat 40% diamati pada volume mereka, dan kenaikan
tersebut dianggap sebagai 100% dari aktivitas edematogenic. Ketika L. dosis muta
racun seperti diinkubasi dengan FHS-3 pada 10 mg / kg atau 20 mg / kg, edema
berkurang 20% masing-masing (Gambar 5). Selain itu, FHS-3 pada 20 mg / kg
menghambat LM-PLA2-I (5 mg / kg) edema imbas oleh 80% (Gambar 5). Jadi, FHS-
3 edema sebagian dihambat disebabkan oleh suntikan L. muta racun serta edema
yang disebabkan oleh LM-PLA2-I, sebelumnya terisolasi [15]. Baik FHS-3 atau
saline diinduksi edema. Secara bersama-sama, FHS-3 menghambat kegiatan beracun
utama L. muta racun, tetapi mekanisme kerjanya sedang diselidiki, dan pengikatan
FHS-3 untuk logam divalen, sebagai Ca2 + atau Zn2 + harus dipertimbangkan,
karena strukturnya memiliki muatan negatif, dan sebagian besar enzim L. muta racun
memerlukan logam seperti untuk menampilkan efek toksik. Dengan demikian,
netralisasi aktivitas edema-inducing dari L. muta racun menunjukkan penghambatan
reaksi inflamasi serta myonecrosis dan dermonecrosis, kemungkinan besar karena
aktivitas PLA2 dari racun. Meskipun hanya sedikit penelitian menggunakan
polisakarida sulfat dari rumput laut menjelaskan senyawa alami sebagai agen
antivenom [24,25], beberapa polisakarida anionik dari sumber hewani seperti heparin
dan sulfat heparan telah ditunjukkan untuk berinteraksi in vitro dan in vivo dengan
berbagai jenis PLA2s, menghambat efek toksik enzimatik mereka [44]. Mekanisme
ular racun racun netralisasi oleh glycosaminoglycans dari heparin / keluarga sulfat
heparan didasarkan pada pembentukan kompleks multimolecular, yang distabilkan
oleh interaksi elektrostatik antara residu asam amino dasar PLA2s dan muatan
negatif proporsional dengan ini polisakarida sulfat. Selain itu, kehadiran 2-O-sulfat
digambarkan sebagai peran yang lebih menonjol dari 6-O-sulfat untuk interaksi
heparin-PLA2s permukaan [45] yang mengikat. Untuk kegiatan biologis, tidak hanya
tingkat sulfation, tetapi kelompok sulfat positioning merupakan faktor penentu.
Sulfat galactan diperkaya dengan diads didasari oleh 3-linked -D-galaktosa 2-sulfat
dan 4-linked -L-galaktosa

6-sulfat diperoleh dari Acanthophora spicifera menunjukkan aktivitas antiherpetic

tinggi. efek antivirus ini disebabkan interaksi antara galactan sulfat ini dengan
glikoprotein C dari HSV-1. Karena pola sulfatasi galactan sulfat bisa menyajikan
konformasi mirip dengan urutan minimal dari sulfat heparan (HS), menghambat
interaksi glikoprotein C virus dan HS pada permukaan sel [37]. The galactan FHS-3
menyediakan 19,2% dari kelompok sulfat, yang terletak terutama di C-2 unit -D-
galactosyl 3-linked (A unit). Selain itu, jumlah kecil dari kelompok dibebankan
negatif ini hadir di C-4 dan C-6 unit A. Di unit B, kelompok sulfat menempati
terutama C-6 unit -L-galactosyl 4-linked dan C-2 unit 3,6-anhydro--L-galactosyl
4-linked. sejumlah kecil kelompok sulfat yang hadir di C-2 dan C-3 unit -L-
galactosyl 4-linked [31]. Dengan cara ini, beberapa efek penghambatan dari galactan
sulfat FHS-3, seperti hemolisis dan edema, bisa dikaitkan setidaknya sebagian pola
mereka sulfasi. Demikian seperti dijelaskan untuk heparin / keluarga sulfat heparan,
posisi sulfat pada C-2 dari 3-linked unit -D-galactosyl bisa menjadi faktor penting
untuk efek penghambatan dari sulfat galactan FHS-3 terhadap L. muta bisa ular

dan LM-PLA2-I.

Gambar 5. L. muta racun (7 mg / g) dicampur dengan FHS-3 (10 ug / g atau 20 mg /

g). LM-PLA2-I (5 ug / g) dicampur dengan FHS-3 (20 ug / g). Kemudian, campuran
diinkubasi selama 30 menit pada 25 C, disuntikkan ke tikus dan edema dianalisis,
seperti yang dijelaskan dalam Metode. Data dinyatakan sebagai berarti SEM dari tiga
percobaan individu (n = 5). * Tingkat Signifikansi (p <0,05) bila dibandingkan
dengan L. muta racun dicampur dengan FHS (10 mg / kg).

FHS-3 menghambat koagulan (Gambar 1), proteolitik / hemolisis (Gambar 2) dan

hemoragik (Gambar 3) dan myotoxic (Gambar 4) kegiatan racun L. muta yang
disebabkan oleh serin, metalloproteases dan / atau phospholipases A2 . Enzim ini dari
Lachesis dan Bothrops genera bertindak dalam jaringan lokal kerusakan, dikaitkan
dengan kematian dan cacat di envenomation oleh ular. Sejak terapi antivenom tidak
memblokir kerusakan jaringan seperti itu, korban yang mengarah ke kehilangan
anggotanya, pengobatan alternatif untuk gigitan ular relevan. Perlu menyoroti bahwa,
dalam literatur ada banyak artikel yang menunjukkan efek antivenom molekul atau
ekstrak mentah dari sumber alami, hanya ketika bioproducts seperti itu preincubated
dengan racun ular. Namun, dalam pekerjaan ini, pendekatan yang berbeda diuji untuk
menganalisis properti antivenom dari FHS-3, dan protokol meniru situasi nyata dari
envenomation dipekerjakan.

3. Bagian Eksperimental

3.1. Venom dan Hewan

L. muta bisa ular itu ramah disediakan oleh Fundao Ezequiel Dias (FUNED), Belo
Horizonte, negara bagian Minas Gerais, Brasil, vakum kering dan disimpan pada
suhu -20 C sampai digunakan. Sebuah fosfolipase A2 (LM-PLA2-I) diisolasi dari
L. muta, seperti yang dijelaskan sebelumnya [15]. Mencit balb / c (18-20 g) diperoleh
dari Nucleo de Animais de Laboratorio (NAL) dari Federal Fluminense University
(UFF), dan ditempatkan di bawah suhu konstan (24 1 C) dan kondisi cahaya.
Percobaan dilakukan telah disetujui oleh Komite Kelembagaan UFF untuk Etika
dalam Eksperimentasi Hewan (protokol nomor 25) dan sesuai dengan pedoman dari
Komite Brasil untuk Eksperimentasi Hewan (COBEA).

3.2. Alga Koleksi dan Isolasi dari sulfat Galactan FHS-3

Spesimen dari rumput laut merah P. flagellifera (J. Agardh) K. W. Nam dikumpulkan
di pantai timur laut Brazil (Cabo, Pernambuco Negara). Spesimen contoh diendapkan
di herbarium Departemen Botani, Universitas Federal Paran (Curitiba, Brazil)
dengan kode identifikasi UPCB 55549. Bahan alga dibersihkan untuk menghilangkan
kontaminan, dicuci dengan air keran, dijemur dan digiling. Seluruh thalli digunakan
untuk ekstraksi polisakarida. The galactan FHS-3 sulfat diperoleh seperti yang
dijelaskan sebelumnya [30,31]. Secara singkat, rumput laut P. flagellifera kering dan
digiling berturut-turut diekstraksi (3 ) dengan air pada 25 C, dan ekstrak
dikumpulkan menimbulkan fraksi FC (13% yield, berdasarkan kering dan digiling
rumput laut). Residu alga kemudian diekstraksi (3 ) dengan air pada 80 C, dan
ekstrak digabungkan menghasilkan fraksi FH (15% yield, berdasarkan kering dan
digiling rumput laut). Ekstrak air panas diperlakukan dengan 2 M KCl, dan setelah
sentrifugasi supernatan berasal yang FHS fraksi KCl-larut (69,0% yield, berdasarkan
fraksi FH). FHS difraksinasi pada kolom DEAE-sephacel yang berurutan dielusi
dengan air dan NaCl solusi peningkatan konsentrasi (0,1-4,0 M) untuk memberikan
lima subfraksi (dari FHS-1 untuk FHS-5). The galactan FHS-3 (35,0% yield,
berdasarkan fraksi FHS) dielusi dengan 0,6 M NaCl.
The sulfat galactan FHS-3 (10 mg) diresuspensi dalam 1 mL saline (0,15 M NaCl),
aliquoted dan disimpan pada -20 C hingga tes dilakukan.

3.3. Kegiatan Antihemolytic

Derajat hemolisis disebabkan oleh racun dari L. muta ditentukan dengan uji
hemolitik tidak langsung menggunakan eritrosit manusia dan kuning telur emulsi
ayam sebagai substrat [15,16]. Konsentrasi L. muta racun yang dihasilkan 100%
hemolisis yang dilambangkan sebagai hemolitik langsung Minimum Konsentrasi
(MIHC). Efek penghambatan hemolytic dari galactan sulfat ditentukan dengan
menginkubasi satu MIHC L. muta racun dengan FHS-3 pada konsentrasi yang
berbeda (180 dan 360 mg / mL) selama 30 menit 25 C. Kemudian, aktivitas
hemolitik dievaluasi. Percobaan kontrol dilakukan dengan menambahkan FHS-3 atau
garam, bukan racun. 3.4. Kegiatan Antiproteolytic

aktivitas proteolitik L. muta racun ditentukan dengan menggunakan azocasein

sebagai substrat (0,2% w / v, di

20 mM Tris-HCl, 8 mM CaCl2, pH 8,8), dengan sedikit modifikasi [46]. Konsentrasi

L. muta racun yang mampu menghasilkan variasi sekitar 0,2 pada A 420 nm
didefinisikan sebagai Konsentrasi Efektif (EC). Efek penghambatan proteolitik dari
galactan sulfat dilakukan dengan menginkubasi satu EC dari L. mutasi racun dengan
FHS-3 (180 dan 360 mg / mL) selama 30 menit 25 C, dan kemudian aktivitas
proteolitik ditentukan. Percobaan kontrol dilakukan dengan menambahkan FHS-3
atau garam, bukan racun.
3.5. Kegiatan antikoagulan

Aktivitas koagulasi L. muta racun ditentukan menggunakan Amelung coagulometer

digital, Model KC4A (Labcon, Jerman). Plasma adalah ramah diperoleh dari relawan
sehat dari bank darah lokal dari Rumah Sakit Universitrio Antnio Pedro dari
Fluminense Universitas Federal. L. muta racun (50 uL) pada konsentrasi yang
berbeda (2-60 mg / mL) dicampur dengan 20 kolam plasma sitrat manusia
diencerkan dalam air garam (1: 1), dan konsentrasi racun yang bekuan plasma di 60 s
disebut Minimum Koagulan Dosis (MCD). Untuk mengevaluasi efek dari galactan
sulfat, satu MCD L. muta racun diinkubasi dengan FHS-3 pada konsentrasi yang
berbeda (100, 200 dan 500 mg / mL) untuk

30 menit 25 C, dan kemudian campuran ditambahkan ke plasma dan waktu

pembekuan direkam. Percobaan kontrol dilakukan dengan menambahkan FHS-3 atau
garam, bukan racun.

3.6. Kegiatan antihemorrhagic

Hemoragik lesi yang dihasilkan oleh L. muta racun dikuantifikasi dengan

menggunakan prosedur yang dijelaskan oleh Kondo [47], dengan modifikasi. Secara
singkat, L. muta (100 uL) racun disuntikkan subkutan (sc) ke dalam kulit perut tikus,
dan dua jam kemudian, hewan-hewan itu eutanasia oleh pemenggalan kepala, kulit
perut dihapus, menggeliat, dan diperiksa untuk perubahan visual dalam aspek
internal yang untuk melokalisasi tempat hemoragik. Jumlah L. muta racun (ug / 20 g
mouse) yang mampu menghasilkan halo hemoragik dari 10 mm didefinisikan sebagai
Minimum Hemorrhagic Dosis (MHD). Efek penghambatan FHS-3 sulfat galactan
dilakukan dengan menggunakan dua MHD melalui protokol yang berbeda, yang
disebut (1) inkubasi, di mana FHS-3 (70 dan 140 mg / mouse) diinkubasi dengan L.
muta racun untuk

30 menit pada 25 C, maka campuran (100 mL) disuntikkan S.C. ke tikus; (2)
pencegahan, di mana (2a) FHS-3 (100 uL) disuntikkan S.C. dan 15 menit kemudian,
L. muta racun (100 uL) disuntikkan S.C. di tempat yang sama di mana FHS-3 telah
disuntikkan; (2b) FHS-3 (100 uL) diberikan secara oral atau (2c) intravena (i.v.), dan

15 menit kemudian, L. muta racun (100 uL) disuntikkan s.c .; dan (3) pengobatan, di
mana L. muta racun (100 uL) disuntikkan s.c .; dan (3a) 15 menit, (3b) 30 menit atau
(3c) 60 menit kemudian, FHS-3 (100 uL) disuntikkan S.C. di situs yang sama injeksi
racun. Kegiatan hemoragik dinyatakan sebagai mean diameter (dalam milimeter) dari
halo hemoragik disebabkan oleh L. muta racun dalam ketiadaan dan kehadiran FHS-
3. kontrol negatif dilakukan dengan menyuntikkan garam atau FHS-3, bukan racun.

3.7. Kegiatan Antiedematogenic

Kegiatan Edema-inducing dari L. muta racun atau LM-PLA2-aku bertekad sesuai

dengan [48], dengan modifikasi. Kelompok lima tikus menerima S.C. suntikan sub
plantar tunggal 50 uL baik L. muta racun (7 mg / g) atau LM-PLA2-I (5 ug / g) di
kaki kanan, sedangkan kaki kiri menerima 50 uL garam. Satu jam setelah injeksi,
edema dievaluasi dan dinyatakan sebagai persentase kenaikan berat pad kaki kanan
dibandingkan dengan yang kiri. Efek dari galactan sulfat pada edema diselidiki
dengan menginkubasi FHS-3 (10 dan 20 mg / g) dengan L. muta racun selama 30
menit 25 C, dan kemudian campuran disuntikkan S.C. ke tikus (kanan kaki pad)
dan edema diukur.
3.8. Kegiatan Antimyotoxic

L. muta racun atau saline disuntikkan (50 uL) intramuskular (i.m.) ke tikus di bawah
otot tibialis anterior kanan, sehingga situs disuntikkan diposisikan hanya selama
ekstensor Digitorius longus (EDL) otot [49]. Sampel darah dikumpulkan sebelumnya
untuk dan dua jam setelah injeksi, serum dipisahkan dengan sentrifugasi dan, jika
perlu itu disimpan pada suhu 4 C untuk penentuan berikutnya dari aktivitas CK
plasma, ditentukan dengan menggunakan kit diagnostik (Sigma Chemical Co, St.
Louis, MO, USA). Tingkat pelepasan CK dari otot terisolasi dinyatakan sebagai
peningkatan dari rilis CK dibandingkan dengan nilai kontrol. Kegiatan CK
dinyatakan sebagai International Unit, di mana 1 U adalah jumlah enzim yang
mengkatalisis transformasi 1 umol substrat di

25 C. Tingkat pelepasan CK dari otot terisolasi dinyatakan sebagai unit enzim

dilepaskan ke medium per gram per jam dari koleksi (U / g h-1), seperti dilaporkan
sebelumnya [50]. Myotoxicity dinyatakan sebagai peningkatan CK dirilis. Efek
penghambatan FHS-3 dilakukan melalui dua protokol: inkubasi (1), di mana L. muta
racun (5 mg / mL) diinkubasi dengan FHS-3 (200 mg / mL) atau garam selama 30
menit pada 25 C , maka campuran (50 uL) disuntikkan im ke tikus, dan pengobatan
(2), dimana L. muta racun (50 uL) disuntik i.m., dan 15 menit kemudian, FHS-3 (50
uL) disuntikkan i.m. di situs yang sama injeksi racun (2a), secara oral (2b) atau
intravena (2c). Secara paralel, kontrol negatif dilakukan dengan menyuntikkan
garam, bukan FHS. Dua jam kemudian, myotoxicity ditentukan, seperti yang
dijelaskan.

3.9. Analisis statistik

Hasil dinyatakan sebagai berarti SEM diperoleh dengan jumlah yang ditunjukkan
hewan atau percobaan yang dilakukan. Signifikansi statistik perbedaan antara
kelompok eksperimen dievaluasi menggunakan t-test pelajar. Signifikansi diambil
sebagai p <0,05.

4. Kesimpulan

Sebuah galactan sulfat diisolasi dari merah alga laut P. flagellifera memiliki potensi
antivenom terhadap efek racun dari L. muta racun. Perlu menyoroti bahwa protokol
diuji mirip dengan situasi gigitan ular yang nyata. Namun, data tambahan akan
diperlukan untuk memahami mekanisme penghambatan dari FHS-3. Untuk
pengobatan yang lebih efisien toksisitas racun lokal, kombinasi molekul antivenom
akan menjadi perkembangan logis dari pekerjaan ini, karena bisa ular terdiri dari
beberapa racun dengan beberapa kegiatan.

Ucapan Terima Kasih

Karya ini didukung oleh Fundaco Araucria / CNPq (PRONEX-Carboidratos, 117 /

2010-14669), MCT / CNPq / CT-PETRO (558.044 / 2009-3), CNPq (483.722 / 2012-
0) dan jubah. Ana Claudia Rodrigues Silva, mengakui beasiswa doktor dari jubah.
Luciana Garcia Ferreira mengakui beasiswa postdoctoral dari CNPq. Andre Lopes
Fuly, Eladio Flores Sanchez, Maria Eugenia Rabello Duarte dan Miguel Daniel
Noseda adalah Anggota Penelitian dari National Research Council of Brazil (CNPq).

penulis Kontribusi

Ana Claudia Rodrigues Silva melakukan eksperimen biologi dan membantu menulis
naskah; Luciana Garcia Ferreira, Maria Eugenia Rabello Duarte dan Miguel Daniel
Noseda berpartisipasi dalam pengumpulan, identifikasi dan isolasi polisakarida FHS-
3 dari Palisada flagellifera dan membantu menulis naskah; Eladio Flores Sanchez
dilakukan ekstraksi L. muta racun dan membantu menulis naskah; Andr Lopes Fuly
memimpin penelitian studi ini.