Anda di halaman 1dari 25

LAPORAN

PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Acara II
(Teknik Aseptik)

Oleh
Winda Dwi Astuti
NIM. 110210153015
Program Studi Pendidikan Biologi

LABORATORIUM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN


JURUSAN BUDIDAYA PERTANIAN
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS JEMBER
2014
BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Pada dasarnya bahwa banyak kita ketahui bahwa dalam setiap
laboratorium terdapat banyak sekali kontaminasi yang terjadi. Hal ini
dikarenakan mikroorganisme ada dimana-mana. Namun kita tidak pernah
menyadari keberadaannya. Bakteri dapat ditemukan pada tangan kita yang tidak
tampak jika dilihat dengan mata telanjang. Jamur yang berasal dari saluran udara
AC dengan pintu yang terbuka. Infeksi dari kedua nya dapat menyerang media
atau serum yang steril. Karena itu laboratorium yang sangat sering digunakan
untuk berbagai penelitian dan praktikum yang diantaranya praktikum kultur
jaringan perlu adanya upaya untuk mencapai keberhasilan.
Dalam keberhasilan praktikum kultur in vitro membutuhkan tidak adanya
kontaminasi mikroba yang terjadi dengan adanya upaya untuk selalu steril selama
pelaksanaanya. Upaya untuk steril tidak hanya diperuntukkan hanya mediumnya
yang steril namun juga ruang kerja, eksplan yang digunakan dan juga
praktikan. Oleh karena itu, untuk menjamin semuanya steril sebelum memulai
suatu praktikum maka dilakukan suatu teknik aseptik. Prosedur kontrol
pada teknik ini adalah kualitas yang akan memastikan bahwa dalam praktikum
tersebut memang dilakukan dengan aseptik, teknik yang mengutamakan tidak
adanya kontaminasi.
Sehingga sebagian besar praktikum kultur jaringan selalu dilakukan
dengan menggunakan alat sterilisasi dengan bantuan Autoclave untuk
mensterilkan alat dan bahan serta medium yang telah dibuat beserta Laminar Air
Flow (LAF) yang selalu digunakan untuk menjaga kesterilan ruang kerja dalam
proses menanam. Praktikum kultur jaringan yang beracarakan teknik aseptic ini
dilaksanakan yang salah satunya guna mengetahui beberapa proses sterilisasi yaitu
sterilisasi ruang kerja dengan prinsip kerja Laminar Air Flow (LAF), sterilisasi
alat dan media dengan prinsip kerja Autoclave yang sering dipergunakan dalam
setiap praktikum dan sterilisasi bahan tanam yang akan digunakan sebagai eksplan
sebelum ditanam pada medium. Oleh karena itu dilakukan pengamatan dengan
parameter berapa jumlah kontaminan yang terjadi dan jenis kontaminan yang
disebabkan kemungkinan oleh bakteri ataupun jamur.

1.2 Tujuan
1. Mempelajari cara melakukan teknik aseptik yang baik dan benar
2. Mengetahui alat yang digunakan dalam teknik aseptik pada Kultur
jaringan, misalnya Laminar Air Flow (LAF) dan Autoclave
3. Mengetahui jenis dan penyebab terjadinya kontaminasi pada media kultur

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

Seiring perkembangan teknologi yang disertai dengan semakin


berkembangnya usaha di bidang pertanian maka kebutuhan akan bibit semakin
meningkat. Hal ini dapat dilakukan dengan perbanyakan konvensional yang
sangat sulit untuk memenuhi kebutuhan bibit yang sangat banyak dengan waktu
yang dibutuhkan relative lebih sedikit atau cepat. Oleh karena itu, teknologi kultur
jaringan yang telah marak untuk saat ini dapat digunakan sebagai teknologi pilhan
yang sangat menjanjikan untuk pemenuhan kebutuhan bibit tanaman yang akan
dieksploitasi secara besar-besaran (Mariska, 2009).
Namun ada beberapa faktor tertentu yang harus diperhatikan, yaitu
penyimpangan genetic yang dapat terjadi karena metode invitro yang salah
satunya sangat berpengaruh pada lingkungannya. Oleh karena itu teknik aseptic
sangat diperlukan dalam hal menentukan keberhasilannya (Mariska, 2009).
Teknik perbanyakan mikro yang menjadi salah satu bentuk aplikasi dari
teknik kultur jaringan bertujuan untuk memperbanyak tanaman yang telah
dibuktikan berhasil untuk dilakukan perbanyakan. Untuk memanfaatkan secara
optimal teknik ini yaitu diperlukan adanya penguasaan kondisi yang tepat untuk
pertumbuhan dan perkembangan secara in vitro. Sangat diperlukan proses
sterilisasi yang tepat untuk mematikan mikroorganisme yang terdapat pada
eksplan sehingga tidak mengganggu pertumbuhan tanaman. Keberhasilan
sterilisasi dipengaruhi oleh bahan tanam (eksplan), seperti tanaman herbal atau
berkayu, dan kondisi lingkungan (Lili, 2013).
Penggunaan media kultur dengan komponen-komponen yang tepat dapat
merangsang usaha untuk perbanyakan dan juga tumbuhnya tunas. Media menjadi
faktor yang paling utama dalam perbanyakan dengan teknik kultur jaringan.
Keberhasilan dari teknik ini sangat bergantung dengan jenis media yang
digunakan. Hal ini dikarenakan pengaruh media tumbuh pada kultur sangat besar
adanya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang
dihasilkan (Tuhuteru, 2012).
Beberapa kelebihan yang diberikan dalam teknik kultur jaringan
dibandingkan dengan cara konvensional yaitu diperoleh perbanyakan tanaman
yang tidak tergantung pada musim karena lingkungan tumbuh in vitro terkendali.
Bahan tanaman yang digunakan juga sangat sedikit sehingga tidak merusak pohon
induk. Tanaman yang dihasilkan bebas dari penyakit meskipun dari induk yang
mengandung pathogen internal. Selain itu dalam teknik ini tidak membutuhkan
tempat yang sangat luas untuk menghasilkan tanaman dalam jumlah yang banyak.
Hasil yang berupa eksplan (bahan tanaman yang ditanam secara kultur jaringan)
sudah berhasil dibiakkan dalam botol maka untuk selanjutnya bibit dapat
diproduksi secara besar-besaran (Deden, 2003).
Namun biasanya masalah lain atau kendala teknis yang sering muncul
adalah tanaman hasil kultur jaringan sering berbeda dengan tanaman induknya
atau mengalami mutasi. Mutasi dapat disebabkan metode perbanyakan, jenis dan
konsentrasi zat pengatur tumbuh yang digunakan, penggunaan kumpulan sel
somatik yang memang berbeda secara genetis pada tanaman induknya, frekuensi
pemindahan biakan pada media baru, dan tipe jaringan yang digunakan (Mayta,
2009). Hal ini dapat terjadi karena penggunaan metode perbanyakan yang sering
tidak sesuai, seperti frekuensi subkultur yang terlalu tinggi, perbanyakan melalui
organogenesis yang tidak langsung (melalui fase kalus) atau konsentrasi zat
pengatur tumbuh yang digunakan terlalu tinggi. Selain itu aklimatisasi yang
berupa adaptasi tanaman hasil kultur jaringan pada lingkungan yang baru diluar
botol secara in vivo sering mengalami kegagalan. Sterilisasi bahan tanam yang
digunakan dan kontaminasi yang terjadi pada biakan karena lingkungan yang
kurang memadai (Mariska et al., 1992 dalam buku yang dikarang oleh Deden,
2003).
Karena secara umum, produksi bibit melalui metode kultur jaringan
memerlukan beberapa tahap, yaitu penyediaan bahan tanaman (eksplan) dari
induk terpilih, proses sterilisasi eksplan yang akan ditanam pada media yang akan
d inisiasi, penanaman pada media untuk penggandaan atau multiplikasi tunas,
penanaman pada media untuk perakaran atau pembentukan planlet, dan
aklimatisasi (Murashige, 1974; George dan Sherrington, 1984 dalam Yazid,
2010). Pada salah satu metode perbanyakan tanaman yang umumnya tidak
dilakukan tahap multiplikasi tunas dan perakaran tetapi diganti menjadi tahap
induksi tunas dan elongasi, sedangkan tahap perakaran dilakukan pada saat
aklimatisasi. Metode ini cukup sederhana dan mirip dengan cara perbanyakan
dengan stek secara konvensional. Oleh karena itu, metode perbanyakan ini sering
disebut secara stek mikro. Keuntungan penggunaan metode ini adalah tanaman
yang dihasilkan stabil secara genetic (Nur Ajijah, 2010).
Persiapan Bahan Tanaman menjadi salah satu kunci keberhasilan untuk
mendapatkan bahan tanaman yang responsif dan dapat diperbanyak secara kultur
in vitro adalah bahan tanaman yang masih muda. Untuk tanaman kehutanan atau
tanaman tahunan lainnya daya tumbuh bahan yang akan ditanam sangat
diperhatikan (Mariska dan Purnamaningsih, 2001 dalam Deden, 2003). Daya
tumbuh tunas muda akan hilang secara fisik apabila jarak antara ujung tunas dan
akar semakin jauh karena pertumbuhan (George dan Sherrington, 1984 dalam
Nugraha, 2013).
Pada tanaman tahunan dewasa, tunas muda yang memiliki daya tumbuh
tinggi (juvenil) sering muncul pada bagian tanaman yang dekat dengan tanah atau
sering disebut tunas air. Tunas juvenil dari tanaman berkayu tahunan dewasa yang
akan digunakan sebagai bahan tanaman untuk kultur jaringan, juga dapat
diperoleh dengan cara melakukan pemangkasan berat. Tunas yang muncul setelah
pemangkasan dapat digunakan sebagai bahan tanaman. Selain itu, fase juvenil
kadang-kadang dapat juga diinduksi dengan cara melakukan penyemprotan
tanaman dewasa dengan GA3 atau campuran antara auksin dan GA3 (George dan
Sherrington, 1984 dalam Deden, 2003).
Untuk memudahkan proses sterilisasi bahan tanaman, sangat dianjurkan
bahwa tanaman induk berada atau ditanam di kamar kaca. Keberadaan tanaman
induk di kamar kaca memudahkan perlakuan penyemprotan dengan fungisida dan
bakterisida secara periodik sehingga dapat mengurangi tingkat kontaminasi bahan
tanaman yang akan disterilisasi. Sterilisasi bahan tanaman dan inisiasi kultur
dilakukan secara aseptik. Sterilisasi bahan tanaman (eksplan) merupakan langkah
awal yang cukup penting dan dapat menentukan keberhasilan penanaman secara
in vitro. Eksplan yang akan ditanam pada media tumbuh harus bebas dari
mikroorganisme kontaminan. Tahap sterilisasi sering menjadi kendala utama
keberhasilan perbanyakan tanaman secara in vitro. Terlebih iklim tropis seperti
Indonesia yang memungkinkan kontaminan seperti cendawan dan bakteri terus
tumbuh sepanjang tahun. Untuk tanaman tertentu, sterilisasi sulit dilakukan
karena kontaminan berada pada bagian internal dari jaringan tanaman (Patoni,
2012).
Sterilisasi eksplan biasanya dilakukan dengan merendam bahan tanaman
dalam larutan kimia sistemik pada konsentrasi dan waktu perendaman tertentu,
baik dengan menggunakan satu macam maupun dengan macam-macam sterilan.
Bahan-bahan yang biasanya digunakan untuk sterilisasi antara lain alkohol,
natrium hipoklorit (NaOCl), kalsium hipoklorit atau kaporit (CaOCl), sublimat
(HgCl2), dan hidrogen peroksida (H2O2) (Mariska, 2003). Jenis bahan,
konsentrasi, dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi bahan tanaman yang
disajikan pada tabel 1.

(Sumber: Mariska, 2003)


Cara lain yang digunakan dalam sterilisasi eksplan atau bahan tanam yang
pertama eksplan dicuci dengan deterjen atau bahan pencuci lain, selanjutnya
direndam dalam bahan-bahan sterilan baik yang bersifat sistemik atau desinfektan.
Bahan-bahan yang biasa digunakan untuk sterilisasi antara lain clorox, kaporit
atau sublimat. Tunas yang akan digunakan sebagai eksplan dicuci dengan deterjen
sampai benar-benar bersih. Setelah itu, tunas diambil dari rimpang dan direndam
berturut-turut dalam benlate (0,5%) selama 5 menit, alkohol (70%) selama 5
menit, clorox (20%) selama 20 menit, dan HgCl2 (0,2%) selama 5 menit.
Akhirnya eksplan dibilas dengan aquades steril (3-5 kali) sampai larutan bahan
kimia hilang. Dengan perlakuan tersebut, 80-90% eksplan yang disterilkan tidak
terkontaminasi setelah dikulturkan (Mariska, 2003).
Apabila kontaminan tetap ada maka konsentrasi dan lamanya perendaman
sterilan dapat ditingkatkan. Bahan yang digunakan serta metode sterilisasi
biasanya berbeda untuk setiap bahan tanaman, sehingga bahan dan cara tersebut
belum tentu berhasil apabila diaplikasikan pada bahan yang berbeda serta waktu
yang berlainan. Sehingga bahan tanam tertentu memiliki cara yang berbeda antara
satu sama lain (Mayta, 2009).
Oleh karena itu baik media maupun eksplan yang akan digunakan harus
selalu dalam keadaan steril. Sehingga pada tahap persiapan, sebelum digunakan
semua peralatan yang akan digunakan dicuci dengan menggunakan deterjen dan
larutan pemutih atau Bayclin, membilasnya sampai bersih dan kemudian
disterilisasi menggunakan oven atau autoclave. Bahan atau alat yang lain adalah
tutup botol plastik, peralatan gelas, peralatan diseksi, pipet, air murni, dan media
kultur untuk mendapatkan perlakuan sesuai dengan jenis alatnya. Semua peralatan
diseksi dibungkus dengan menggunakan kertas coklat atau kertas merang dan juga
Koran sebelum diautoklav. Aluminium foil tidak direkomendasikan untuk
membungkusnya dikarena uapnya tidak dapat menembus pembungkus.
Sebelumnya kondisi autoklav diatur pada temperatur yang digunakan untuk
sterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 121oC serta tekanan 15-17,5 psi selama
1520 menit. Peralatan yang terbuat dari logam, wadah-wadah gelas, dan lain-
lain, disterilsasi dengan pemanasan dalam oven pada suhu 130170 oC selama 24
jam (Tuhuteru, 2012).
Setelah dioven, alat-alat ini bisa langsung digunakan atau disimpan dalam
lemari. Laminar Air Flow adalah alat yang ditemukan pada tahun 1950 yang
dikolaborasikan struktur yang dilengkapi dengan ruangan udara dengan udara
yang steril. Ada dua macam dari jenis ini yaitu horizontal dan vertical Laminar Air
Flow steril system yang terkadang membutuhkan biaya yang sangat mahal dalam
proses perawatannya. Pengembangan alat ini diharapkan memanipulasi dan
mempertahankan suatu ruangan dalam keadaan yang selalu steril. Alat ini telah
disempurnakan dengan adanya aliran udara steril melalui sebuah prefilter dan alat
yang dialirkan melalui sebuah filter HEPA (High Efficiency Particulate Air) untuk
menggerakkan aliran udara yang steril di dalam ruang kerja di laboratorium.
Laminar dilengkapi dengan adanya lampu UV (Ultra Violet) yang digunakan
untuk memastikan bahwa tidak adanya kontaminan di setiap sisi ruangan (Stignor,
2009).
Hal ini sangat diperuntukan untuk kegiatan praktikum dan pembuatan stok
biologi yang harus dalam kondisi yang steril. Cara kerja laminar air flow sebagai
HVAC&R (Heating, Ventilation, Air-Conditioning, and Refrigeration) sebelum
digunakan terlebih dahulu disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 70 % pada
dinding dan alasnya serta meratakannya menggunakan tissue atau kertas yang
steril. Kemudian mendiamkannya selama kurang lebih 30 menit. Lampu
ultraviolet yang berada di dalam laminar air flow dinyalakan selama 0,5-1 jam
untuk membunuh kontaminan yang berada di dalamnya (Stignor, 2009).
Faktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah
kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet mati.
Kontaminasi yang terjadi disebabkan oleh cendawan atau fungi (jamur) dan
bakteri. Dari kedua faktor penyebab kontaminasi, jamur atau cendawan yang
menjadi penyebab paling dominan karena media yang telah terkontaminasi
cendawan sangat sulit untuk dibersihkan atau disterilkan kembali. Kontaminasi
pada media perlakuan sebelum proses penanaman tidak dapat digunakan untuk
menanam. Sehingga sebelumnya harus diganti dengan pembuatan media yang
baru untuk selanjutnya dapat dilakukan proses penanaman (Tuhuteru, 2012).
Media tanam dapat digunakan setelah diinkubasi selama 4-7 hari dan
memastikan bahwa media yang digunakan terbebas dari kontaminasi, namun
kontaminasi pada planlet mulai terlihat pada umur satu MSP dengan frekuensi
1-5 botol planlet. Kontaminasi yang disebabkan secara langsung oleh cendawan
dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi media yang berkontak
langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan maka cendawan tersebut akan
menutupi seluruh permukaan media. Hal ini berbeda dengan kontaminasi yang
disebabkan oleh bakteri yang terjadi langsung pada eksplan yang ditandai dengan
munculnya lendir berwarna putih keruh disekeliling planlet. Hal ini dapat
disebabkan dari kurang bersihnya botol, peralatan pada saat pembuatan media,
suhu ruang kultur yang sering berganti atau tidak tetap pada saat botol disimpan di
rak kultur dan adanya bakteri yang terbawa dari sumber tanam atau bahan tanam
(Tuhuteru, 2012).
Oleh karena itu hal yang perlu mendapatkan diperhatian dalam teknik
aseptic secara in vitro yaitu dalam beberapa tahapan antara lain pemilihan
eksplan, proses sterilisasi bahan tanam atau eksplan yang telah dipilih, keadaan
selama proses kultur yang terdiri dari suhu atau temperatur, kelembaban relative
serta waktu yang diperlukan untuk proses pertumbuhan dan perkembangannya
selama proses kultur in vitro. Kondisi pertama yang membawa keberhasilan
dalam proses kultur adalah aseptik. Teknik untuk mempertahankan aseptic disebut
teknik aseptic yang berarti bebas dari semua jenis mikroorganisme atau kondisi
yang steril dan layak untuk melakukan proses kultur in vitro. Untuk menjaga
lingkungan yang aseptik maka harus semua komponen kultur baik alat dan bahan
serta media dan juga eksplan yang akan digunakan harus dalam keadaan yang
steril sehingga harus dilakukan proses sterilisasi untuk semua komponen dalam
kultur jaringan. Hal penting yang lain yaitu menjaga udara, permukaan lantai
bebas dan bersih dari debu. Sehingga semua pengerjaan dari praktikum kultur
harus dilakukan dalam Laminar Air Flow Cabinet yang steril (Chawla dalam
Anoop, 2009).
Untuk itu pada dasarnya teknik aseptik yang dilakukan dalam kultur
jaringan sangat perlu digunakan untuk dapat mendukung kondisi yang dibutukan
eksplan yang ditanam dalam media mengalami proses pertumbuhan dan
perkembangan. Teknik aseptic dapat terlaksana dengan baik apabila juga disertai
dilakukannya proses sterilisasi terutama pada eksplan yang harus bebas dari
kontaminan sebelum dilakukan proses penkulturan. Berbagai proses sterilisasi
yang disertai dengan agen sterilisasi digunakan untuk mencegah adanya
kontaminasi pada jaringan dalam eksplan. Agen sterilisasi contohnya yaitu Clorox
atau bayclin ditujukan karena bayclin memiliki kandungan yang dapat
membersihkan eksplan dari berbagai macam kontaminan baik berupa jamur, virus,
bakteri, maupun kontaminan yang lain (Hariyadi, 2010). Hal ini dikarenakan
kedua bahan tersebut merupakan racun untuk tanaman oleh karena itu dalam
penggunaanya diperlukan dosis atau ukuran yang sesuai agar tidak melukai
ataupun mematikan jaringan dalam eksplan.
BAB 3. METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat


Praktikum Kultur Jaringan Tumbuhan dengan acara Teknik Aseptik
dilaksanakan pada hari Minggu, 11 Mei 2014 pukul 12.00 s/d selesai bertempat di
Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas
Pertanian, Universitas Jember.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
1. Laminar Air Flow (LAF)
2. Botol semprot
3. Pinset
4. Pisau
5. Seal (segel)
6. Kertas label
7. Alat tulis
8. Bunsen
9. Petri dish

3.2.2 Bahan
1. Medium padat kultur jaringan yang telah dibuat pada praktikum
sebelumnya
2. Pestisida/ Fungisida
3. Aquades
4. Alkohol 70%

3.3 Prosedur Kerja


Sterilisasi Peralatan
1. Mencuci dengan detergen dan membilasnya sampai bersih dengan
menggunakan aquades, kemudian meniriskannya hingga kering
2. Mensterilkan dengan autoclave dan menyimpannya dalam oven untuk
menjaga peralatan agar tidak kontaminasi
3. Setelah proses sterilisasi, dapat menggunakan semua peralatan dengan
menekan kontaminasi
Sterilisasi Media
1. Menggunakan media tanam yang steril
2. Mensterilkan menggunakan autoclave untuk menghindari kontaminasi
3. Memasukkan media yang telah jadi ke dalam botol kultur dan menutupnya
dengan aluminium foil
4. Melakukan sterilisasi pada temperature 121oC dengan tekanan 17,5 Psi
selama 20-30 menit
Sterilisasi Bahan Tanam (Menyesuaikan dengan praktikum kultur organ)
1. Mencuci bersih bahan tanam dengan menggunakan air mengalir
2. Mengojog bahan tanam dengan menggunakan pestisida atau fungisida
3. Merendam bahan tanam dengan bahan kimia tertentu atau antiseptic di
Laminar Air Flow (LAF)
4. Membilas bahan tanam dengan menggunakan air steril dan kemudian
menanamnya

3.4 Parameter Pengamatan


Mengamati kontaminasi media pada hari ke-7 dan ke-14 berdasarkan parameter:
1. Jenis mikroorganisme dan ciri-ciri yang menyebabkan kontaminasi
2. Prosentase keberhasilan dari teknik aeptik yang di lakukan

Tabel 1. Jumlah kultur yang terkontaminasi dan jenis kontaminan

Bahan Tanam Tembakau


Zat Pengatur
Hari ke-7 Hari ke-14
Tumbuh
K K
MS = 0 0 - 1 j
NAA 0,25
ppm dan BAP
1 ppm
NAA 1 ppm
dan BAP 0,25
ppm
BAP 0,5 ppm
2,4 D 0,5 ppm dst dst

Keterangan :
= Jumlah kontaminasi
K = Jenis kontaminasi
J,B = Jamur, Bakteri
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan


Tabel 1. Jumlah kultur yang terkontaminasi dan jenis kontaminan
pada hari ke-7 dan ke-14

Bahan Tanam Tembakau


Zat Pengatur
Hari ke-7 Hari ke-14
Tumbuh
K K

MS = 0 0 -
NAA 0,25
ppm dan 0 -
BAP 1 ppm
NAA 1 ppm
dan BAP 0,25 0 -
ppm
BAP 0,5 ppm 0 -

2,4 D 0,5 ppm 0 -

Keterangan :
= Jumlah kontaminasi
K = Jenis kontaminasi
J, B = Jamur, Bakteri
4.2 Pembahasan
Pada praktikum kultur jaringan dengan acara teknik aseptik yang bertujuan
untuk mengetahui pelaksanaan teknik septik yang baik dan benar dalam kultur
jaringan serta mengetahui alat yang serig digunakan dalam setiap teknik aseptic.
Tujuan yang terakhir yaitu mengetahui jenis kontaminan yang terjadi karena
beberapa factor. Sebelum memulai praktikum ini maka praktikan harus
mempersiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan. Alat yang digunakan dalam
praktikum ini yaitu, Laminar Air Flow (LAF), Botol semprot yang berisi alkohol
70%, Pinset, Pisau, Seal wrap (segel), Kertas label, Alat tulis, Bunsen dan Petri
dish. Sedangkan bahan yang harus disediakan yaitu medium padat kultur jaringan
yang telah dibuat pada praktikum sebelumnya, Pestisida/ Fungisida, Aquades serta
Alkohol 70%.
Setelah alat dan bahan sudah lengkap tersedia, maka praktikan dapat
memulai praktikum acara teknik aseptik dengan prosedur yang sudah terdapat
dalam modul. Prosedur kerja dalam praktikum ini dibagi menjadi 3 prosedur yaitu
prosedur kerja dalam sterilisasi peralatan, prosedur kerja dalam sterilisasi media,
dan yang terakhir prosedur kerja sterilisasi bahan tanam yanga akan digunakan.
Prosedur kerja yang pertama yaitu proses sterilisasi peralatan yang dimulai
dengan mencuci dengan detergen dan membilasnya sampai bersih dengan
menggunakan aquades, kemudian meniriskannya hingga kering. Mensterilkan
dengan autoclave dan menyimpannya dalam oven untuk menjaga peralatan agar
tidak kontaminasi. Setelah proses sterilisasi, dapat menggunakan semua peralatan
dengan menekan kontaminasi.
Prosedur kerja kedua yaitu proses sterilisasi media yang diawali dengan
menggunakan media tanam yang steril. Mensterilkan menggunakan autoclave
untuk menghindari kontaminasi. Memasukkan media yang telah jadi ke dalam
botol kultur dan menutupnya dengan aluminium foil. Setelah selesai semuanya
lalu melakukan sterilisasi pada temperature 121oC dengan tekanan 17,5 Psi selama
20-30 menit. Prosedur kerja yang terakhir yaitu proses sterilisasi bahan tanam atau
eksplan yang akan digunakan dengan mencuci bersih bahan tanam dengan
menggunakan air mengalir. Hal yang perlu diperhatikan adalah pada saat
pembilasan air yang digunakan harus dengan air yang mengalir agar semua
kontaminan dapat di singkirkan dan agar eksplan tidak mudah terkontaminasi
dengan air bekas bilasan yang telah digunakan apabila menggunakan air yang
tidak mengalir. Mengojog bahan tanam dengan menggunakan pestisida atau
fungisida. Merendam bahan tanam dengan bahan kimia tertentu atau antiseptic di
Laminar Air Flow (LAF) dan yang terakhir membilas bahan tanam dengan
menggunakan air steril dan kemudian menanamnya.
Setelah praktikum selesai dilakukan maka dilakukanlah pengamatan pada
hari ke-7 dan hari ke-14. Namun yang dapat diperoleh hanya pada hari ke-7.
Parameter yang digunakan untuk mengamatinya adalah mengetahui jumlah dan
jenis kontaminan yang terjadi pada media dan berapa prosentase keberhasilan
teknik aseptik yang telah dilakukan. Berdasarkan tabel hasil pengamatan dapat
diperoleh bahwasanya pada hari ke-7 dengan bahan tanam tembakau, media yang
telah ditanami dengan perlakuan MS=0 menunjukkan bahwa tidak ada
kontaminan yang terjadi dalam media tanamnya. Pada perlakuan MS dengan ZPT
NAA 0,25ppm dan BAP 1ppm diperoleh hasil bahwa tidak ada aktivitas
kontaminasi yang terjadi, sehingga tidak adanya kontaminan dalam media
tanamnya. Pada perlakuan selanjutnya dengan menggunakan media MS yang di
tambahi dengan ZPT NAA 1ppm dan BAP 0,25ppm menunjukkan hal yang sama
bahwa tidak adanya aktivitas kontaminan yang dibuktikan dengan tidak adanya
kontaminasi yang terjadi.
Pada perlakuan ke-4 dengan media MS menggunakan ZPT BAP 0,5ppm
menunjukkan tidak adanya kontaminasi baik dari jamur ataupun bakteri.
Perlakuan yang terakhir dengan media MS yang ditambahi dengan 2,4 D 0,5 ppm
tidak terjadi adanya kontaminan yang disebabkan oleh aktivitas jamur ataupun
bakteri. Sehingga dapat disimpulkan berdasarkan hasil pengamatan hari ke-7
dapat diketahui prosentase keberhasilan teknik aseptic yang telah dilakukan
mencapai 100%. Hal ini dibuktikan dengan tidak adanya kontaminan baik yang
berasal dari jamur ataupun bakteri.
Faktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah
kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet mati.
Kontaminasi yang terjadi disebabkan oleh cendawan atau fungi (jamur) dan
bakteri. Dari kedua faktor penyebab kontaminasi, jamur atau cendawan yang
menjadi penyebab paling dominan karena media yang telah terkontaminasi
cendawan sangat sulit untuk dibersihkan atau disterilkan kembali. Kontaminasi
pada media perlakuan sebelum proses penanaman tidak dapat digunakan untuk
menanam. Sehingga sebelumnya harus diganti dengan pembuatan media yang
baru untuk selanjutnya dapat dilakukan proses penanaman (Tuhuteru, 2012).
Media tanam dapat digunakan setelah diinkubasi selama 4-7 hari dan
memastikan bahwa media yang digunakan terbebas dari kontaminasi, namun
kontaminasi pada planlet mulai terlihat pada umur satu MSP dengan frekuensi
1-5 botol planlet. Kontaminasi yang disebabkan secara langsung oleh cendawan
dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi media yang berkontak
langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan maka cendawan tersebut akan
menutupi seluruh permukaan media. Hal ini berbeda dengan kontaminasi yang
disebabkan oleh bakteri yang terjadi langsung pada eksplan yang ditandai dengan
munculnya lendir berwarna putih keruh disekeliling planlet (Tuhuteru, 2012).
Faktor penyebab kontaminasi yang terjadi berasal dari kurang bersihnya
botol, peralatan pada saat pembuatan media, suhu ruang kultur yang sering
berganti atau tidak tetap pada saat botol disimpan di rak kultur dan adanya bakteri
yang terbawa dari sumber tanam atau bahan tanam oleh karena itu harus
dilakukan proses sterilisasi bahan tanam sebelum dilakukan proses penanaman
dan juga kontaminasi sangat ditentukan oleh sterilitas ruangan yang sebab itu
sangat perlu dilakukannya proses sterilisasi ruangan sebelum digunakan untuk
menanam eksplan dalam medium. Proses sterilisasi ruangan yang termasuk dalam
teknik aseptik menggunakan Laminar Air Flow (LAF) untuk menjaga sterilitas
ruangan.
Prinsip kerja alat ini dapat dikolaborasikan dengan struktur yang
dilengkapi dengan ruangan udara dengan udara yang steril. Ada dua macam dari
jenis ini yaitu horizontal dan vertical Laminar Air Flow steril system yang
terkadang membutuhkan biaya yang sangat mahal dalam proses perawatannya.
Pengembangan alat ini diharapkan memanipulasi dan mempertahankan suatu
ruangan dalam keadaan yang selalu steril. Alat ini telah disempurnakan dengan
adanya aliran udara steril melalui sebuah prefilter dan alat yang dialirkan melalui
sebuah filter HEPA (High Efficiency Particulate Air) untuk menggerakkan aliran
udara yang steril di dalam ruang kerja di laboratorium. Laminar dilengkapi
dengan adanya lampu UV (Ultra Violet) yang digunakan untuk memastikan
bahwa tidak adanya kontaminan di setiap sisi ruangan (Stignor, 2009).
Hal ini sangat diperuntukan untuk kegiatan praktikum dan pembuatan stok
biologi yang harus dalam kondisi yang steril. Cara kerja laminar air flow sebagai
HVAC&R (Heating, Ventilation, Air-Conditioning, and Refrigeration) sebelum
digunakan terlebih dahulu disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 70 % pada
dinding dan alasnya serta meratakannya menggunakan tissue atau kertas yang
steril. Kemudian mendiamkannya selama kurang lebih 30 menit. Lampu
ultraviolet yang berada di dalam laminar air flow dinyalakan selama 0,5-1 jam
untuk membunuh kontaminan yang berada di dalamnya (Stignor, 2009).
Proses sterilisasi media dan peralatan dengan menggunakan alat sterilisasi
autoclave yang mempunyai prinsip sebelum digunakan atau dinyalakan bahan
atau alat yang lain adalah tutup botol plastik, peralatan gelas, peralatan diseksi,
pipet, air murni, dan media kultur mendapatkan perlakuan sesuai dengan jenis
alatnya. Semua peralatan diseksi dibungkus dengan menggunakan kertas coklat
atau kertas merang dan juga Koran sebelum diautoklav. Aluminium foil tidak
direkomendasikan untuk membungkusnya dikarena uapnya tidak dapat menembus
pembungkus. Cara kerja yang harus dipatuhi dalam menggunakan autoclave
mengkondisikan autoklav diatur pada temperatur yang digunakan untuk sterilisasi
dengan autoklaf dengan suhu 121oC serta tekanan 15-17,5 psi selama 1520
menit. Peralatan yang terbuat dari logam, wadah-wadah gelas, dan lain-lain,
disterilsasi dengan pemanasan dalam oven pada suhu 130170oC selama 24 jam.
Oleh karena itu hal yang perlu mendapatkan diperhatian dalam teknik
aseptic secara in vitro yaitu dalam beberapa tahapan antara lain pemilihan eksplan,
proses sterilisasi bahan tanam atau eksplan yang telah dipilih, keadaan selama
proses kultur yang terdiri dari suhu atau temperatur, kelembaban relative serta
waktu yang diperlukan untuk proses pertumbuhan dan perkembangannya selama
proses kultur in vitro. Kondisi pertama yang membawa keberhasilan dalam proses
kultur adalah aseptik. Teknik untuk mempertahankan aseptic disebut teknik
aseptic yang berarti bebas dari semua jenis mikroorganisme atau kondisi yang
steril dan layak untuk melakukan proses kultur in vitro. Untuk menjaga
lingkungan yang aseptik maka harus semua komponen kultur baik alat dan bahan
serta media dan juga eksplan yang akan digunakan harus dalam keadaan yang
steril sehingga harus dilakukan proses sterilisasi untuk semua komponen dalam
kultur jaringan. Hal penting yang lain yaitu menjaga udara, permukaan lantai
bebas dan bersih dari debu. Sehingga semua pengerjaan dari praktikum kultur
harus dilakukan dalam Laminar Air Flow Cabinet yang steril (Chawla dalam
Anoop, 2009).
Untuk itu pada dasarnya teknik aseptik yang dilakukan dalam kultur
jaringan sangat perlu digunakan untuk dapat mendukung kondisi yang dibutukan
eksplan yang ditanam dalam media mengalami proses pertumbuhan dan
perkembangan. Teknik aseptic dapat terlaksana dengan baik apabila juga disertai
dilakukannya proses sterilisasi terutama pada eksplan yang harus bebas dari
kontaminan sebelum dilakukan proses penkulturan. Berbagai proses sterilisasi
yang disertai dengan bahan sterilisasi digunakan untuk mencegah adanya
kontaminasi pada jaringan dalam eksplan. Bahan sterilisasi contohnya yaitu
Clorox atau bayclin ditujukan karena bayclin memiliki kandungan yang dapat
membersihkan eksplan dari berbagai macam kontaminan baik berupa jamur, virus,
bakteri, maupun kontaminan yang lain (Hariyadi, 2010). Hal ini dikarenakan
kedua bahan tersebut merupakan racun untuk tanaman oleh karena itu dalam
penggunaanya diperlukan dosis atau ukuran yang sesuai agar tidak melukai
ataupun mematikan jaringan dalam eksplan (Yazid, 2010).
Pentingnya teknik aseptik dalam kultur jaringan tepatnya pada saat
penanaman eksplan harus selalu dalam keadaan yang steril, maka harus dilakukan
sterilisasi. Setiap bahan yang akan kita gunakan harus dalam kondisi yang steril.
Termasuk juga praktikan yang hendak menanam eksplan pada media tanam harus
steril dimulai dari penggunaan jas lab, sarung tangan dan masker. Selain itu
sebelum praktikan memulai melakukan penanaman eksplan di dalam Laminar air
Flow Cabinet, harus menyemprotkan alcohol ke tangan walaupun sudah memakai
sarung tangan lateks. Begitu juga dengan peralatan yang akan digunakan sebelum
memasuki Laminar Air Flow Cabinet seperti pinset dan scalpel, harus direndam
dengan alcohol yang disediakan dalam beaker glass kecil apabila alat tersebut
tidak digunakan. Namun apabila akan digunakan kembali harus di panaskan
terlebih dahulu di atas nyala api Bunsen.
Proses sterilisasi yang merupakan langkah penting dalam teknik aseptik
dilakukan dengan tujuan agar semua proses penanaman yang dilakukan dengan
alat dan bahan yang steril karena penanaman eksplan ini sangat mudah terjadi
kontaminan yang dapat mempengaruhi keberhasilam penanaman eksplan. Oleh
karena itu teknik aseptik sangat penting untuk dilakukan untuk memperoleh
keberhasilan pada proses penanaman dalam kultur jaringan.
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
1. Teknik aseptik dalam kultur jaringan dilakukan pada saat sebelum, pada
waktu penanaman eksplan dan sesusadah penanaman harus selalu dalam
keadaan yang steril, maka harus selalu dilakukan sterilisasi. Setiap bahan
yang akan kita gunakan harus dalam kondisi yang steril. Termasuk juga
praktikan yang hendak menanam eksplan pada media tanam harus steril
dimulai dari penggunaan jas lab, sarung tangan dan masker. Selain itu
sebelum praktikan memulai melakukan penanaman eksplan di dalam
Laminar air Flow Cabinet, harus menyemprotkan alcohol ke tangan
walaupun sudah memakai sarung tangan lateks. Begitu juga dengan
peralatan yang akan digunakan sebelum memasuki Laminar Air Flow
Cabinet seperti pinset dan scalpel, harus direndam dengan alcohol yang
disediakan dalam beaker glass kecil apabila alat tersebut tidak digunakan.
Namun apabila akan digunakan kembali harus di panaskan terlebih dahulu
di atas nyala api Bunsen. Sterilisasi setelah penanaman dengan
membersihkansemua alat dan bahan yang digunakan untuk tidak berada
dalam LAF pada saat setelah proses penanaman.
2. Proses sterilisasi yang merupakan langkah penting dalam teknik aseptik
dilakukan dengan tujuan agar semua aspek yang terdiri dari peralatan dan
bahan serta media, praktikan dan eksplan atau bahan tanama yang akan
digunakan dan juga lingkungan kerja pada saat proses kultur jaringan
mempunyai alat tertentu yang digunakan untuk melakukan proses
sterilisasi pada semua aspek. Proses sterilisasi peralatan, dan media
dilakukan dengan menggunakan autoclave dengan suhu 121oC dan tekanan
17,5 Psi. Proses sterilisasi lingkungan kerja beserta praktikan dengan
selalu berada dalam Laminar Air Flow Cabinet dengan dilengkapi lampu
UV untuk mempertahankan sterilitas ruangan selama proses penanaman.
Proses sterilisasi bahan tanam dngan menggunakan bahan sterilisasi
seperti Clorox atau bayclin ditujukan karena bayclin memiliki kandungan
yang dapat membersihkan eksplan dari berbagai macam kontaminan baik
berupa jamur, virus, bakteri
3. Faktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah
kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet
mati. Kontaminasi yang terjadi disebabkan oleh cendawan atau fungi
(jamur) dan bakteri. Dari kedua faktor penyebab kontaminasi, jamur atau
cendawan yang menjadi penyebab paling dominan karena media yang
telah terkontaminasi cendawan sangat sulit untuk dibersihkan atau
disterilkan kembali. Kontaminasi yang disebabkan secara langsung oleh
cendawan dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi
media yang berkontak langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan
maka cendawan tersebut akan menutupi seluruh permukaan media. Hal ini
berbeda dengan kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri yang terjadi
langsung pada eksplan yang ditandai dengan munculnya lendir berwarna
putih keruh disekeliling planlet. Faktor penyebab kontaminasi yang terjadi
berasal dari kurang bersihnya botol, peralatan pada saat pembuatan media,
suhu ruang kultur yang sering berganti atau tidak tetap pada saat botol
disimpan di rak kultur dan adanya bakteri yang terbawa dari sumber tanam
atau bahan tanam yang digunakan.

5.2 Saran
Dalam hal menaikkan keberhasilan pada praktikum ini, adapun beberapa
saran yang pastinya perlu untuk diperhatikan, yaitu
1. Sangat memperhatikan kesterilan alat dan bahan dan memastikan semuanya
dalam keadaan steril.
2. Selalu memakai jas praktikum saat praktikum maupun pada saat
pengamatan baik pada praktikan maupun asisten laboratorium untuk
menghindari adanya kontaminasi.
DAFTAR PUSTAKA

Anoop, Badoni and J. S. Chauhan. 2009. In Vitro Sterilization Protocol for


Micropropagation of Solanum tuberosum. Academia Arena, 2009;
1(5):5-8]. ISSN 1553-992X.

Deden, Sukmadjaja dan Mariska, Ika. 2003. Perbanyakan Bibit Jati melalui
Kultur Jaringan ISBN 979-95627-8-3. Bogor: Balai Penelitian
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian.

Hariyadi, Purwiyatno. 2010. Sterilisasi UHT dan Pengemasan Aseptik.


Jakarta: Ikatan Dokter Indonesia

Lili Herawati Siregar, Luthfi A. M Siregar, Lollie A. P. Putri. 2013.


PENGARUH - BENZIL AMINO PURINA DAN - ASAM ASETAT
NAFTALENA TERHADAP PERTUMBUHAN AKAR Boesenbergia
flava SECARA IN-VITRO. Jurnal Online Agroekoteknologi Vol.1,
No.3, Juni 2013

Mariska, Ika. 2009.Perkembangan Penelitian Kultur In Vitro pada Tanaman


Industri, Pangan, dan Hortikultura. Buletin AgroBio 5(2):45-50 VOL 5,
NO. 2

Mariska, Ika dan Deden S. 2003. Perbanyakan Bibit Abaka melalui Kultur
Jaringan ISBN 979-95627-9-1. Bogor: Balai Penelitian Bioteknologi
dan Sumberdaya Genetik Pertanian.

Mayta Novaliza Isda dan Irfan Sulianyah. 2009. INDUKSI KALUS Centella
asiatica MELALUI APLIKASI AUKSIN DAN SITOKININ (The Role
of Auxin and Cytikinin in Callus Induction of Indian Pennywort
(Centella asiatica). Jerami Volume 2 No. 3, September - Desember
2009 ISSN 1979-0228

M. Yazid, Aris Bastianudin. 2010. PENGARUH STIMULAN ASAM


ASETAT TERHADAP EFISIENSI PENGIKATAN URANIUM
DALAM BIOREMEDIASI LINGKUNGAN MENGGUNAKAN
Bacillus sp. dan Pseudomonas sp. Prosiding PPI - PDIPTN 2010
Pustek Akselerator dan Proses Bahan BATAN ISSN 0216 3128.
Nur Ajijah, Ireng Darwati, Yudiwanti, Dan Roostika. 2010. PENGARUH
SUHU INKUBASI TERHADAP PERTUMBUHAN DAN
PERKEMBANGAN EMBRIO SOMATIK PURWOCENG (Pimpinella
pruatjan Molk.). Jurnal Littri 16(2), Juni 2010 Hlm. 56 63 ISSN
0853-8212.

Nugraha Pratama Dhanal, Lahmuddin Lubis, Lisnawita. 2013. ISOLASI


JAMUR Oncobasidium theobromae P.H.B TALBOT & KEANE
PENYEBAB PENYAKIT VASCULAR STREAK DIEBACK PADA
TANAMAN KAKAO DI LABORATORIUM. Jurnal Online
Agroekoteknologi ISSN No. 2337- 6597 Vol.2, No.1: 288-293
Desember 2013.

Patoni A. Gafar dan Susi Heryani. 2012. PENGEMBANGAN PROSES


PENGOLAHAN MINUMAN NIRA AREN DENGAN TEKNIK
ULTRAFILTRASI DAN DEODORISASI (The Development of Aren
Sap Drink Processing Technology by Using Ultrafiltration and
Deodorization Techniques). JURNAL HASIL PENELITIAN INDUSTRI
Volume 25, No. 1, April 2012.

Stignor, Caroline Haglund. 2009. Laminar-flow Liquid-to-air Heat


Exchangers-Energy-effeciency Display Cabinet Applications. Sweden:
Lund University.

Tuhuteru, M. L. Hehanussa, S.H.T. Raharjo. 2012. PERTUMBUHAN DAN


PERKEMBANGAN ANGGREK Dendrobium anosmum PADA
MEDIA KULTUR IN VITRO DENGAN BEBERAPA
KONSENTRASI AIR KELAPA. Agrologia, Vol. 1, No. 1, April 2012,
Hal. 1-12. ISSN 2301-7287.