ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

SENYAWA FLAVONOID FRAKSI ETANOL-AIR DAN FRAKSI ASETON

DAUN TANAMAN ADAM HAWA (Rhoe discolor (L.) Her. Hance) DENGAN
METODE 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH)

Proposal Skripsi

Diajukan oleh:

Deriven Samurai Teweng

NIM : 138114046

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

i
 Persetujuan Pembimbing

ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

SENYAWA FLAVONOID FRAKSI ETANOL-AIR DAN FRAKSI ASETON
DAUN TANAMAN ADAM HAWA (Rhoe discolor (L.) Her. Hance) DENGAN
METODE 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH)

Proposal skripsi yang diajukan oleh:

Deriven Samurai Teweng

NIM : 138114046

telah disetujui oleh

Pembimbing Utama

(Dr. Erna Tri Wulandari, M. Si., Apt. ) tanggal ......................................

ii
 1

BAB I
PENDAHULUAN

1. Latar Belakang
Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih
elektron bebas yang tidak berpasangan yang dapat berasal dari dalam tubuh
maupun dari lingkungan. Radikal bebas reaktif melakukan reaksi oksidasi
patogenik terhadap sel atau komponennya, sehingga dapat menyebabkan
disfungsi atau mutasi yang berakibat pada timbulnya penyakit degenertif
seperti kanker, penyakit kardiovaskular, kerusakan hati dan penuaan dini
(Hernani dan Rahardjo,2005).
Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menstabilkan radikal bebas
dengan memberikan satu elektron kepada senyawa radikal bebas sehingga
radikal bebas tidak reaktif dan tidak menimbulkan efek yang merugikan
(Suhartono,2003). Jumlah antioksidan di dalam tubuh sangat terbatas sehingga
dibutuhkan senyawa antioksidan dari luar seperti vitamin C dan golongan-
golongan senyawa fitokimia seperti flavonoid dan fenolik.
Indonesia merupakan negara dengan alam yang melimpah. Sebagian besar
telah digunakan secara turun temurun untuk mengobati berbagai penyakit.
Salah satu tanaman yang dapat digunakan sebagai obat ialah tanaman adam
hawa (Rhoe discolor (L).Her. Hance) yang termasuk dalam famili
Commelinaceae. Tanaman ini memiliki khasiat sebagai anti inflamasi,
memelihara paru-paru, mencairkan dahak, anti-batuk, anti-diare dan
membersihkan darah ().
Daun adam hawa (Rhoe discolor (L).Her.Hance) yang berwarna ungu
diduga karena adanya senyawa flavanoid. Senyawa flavanoid adalah kelompok
senyawa fenol terbesar yang terdapat di alam. Senyawa ini merupakan zat
warna merah, ungu, biru dan sebagian zat warna kuning yang ditemukan pada
tumbuh- tumbuhan (Markham, 1988).
Menurut penelitian Sitorus dkk (2012), peneliti melakukan ekstraksi
secara maserasi dengan pelarut etanol 95% dan isolasi dengan KLT preparatif
daun tanaman adam hawa serta identifikasi senyawa dengan spektrofotometer
visibel dengan pergerseran kimia (efek bathokromik). Kandungan senyawa
flavonoid ekstrak etanol 95% daun tanaman adam hawa tersebut adalah
antosianidin (antosianin yang telah terhidrolisis asam).
Menurut penelitian Tan et al. (2014), peneliti melakukan uji aktiivitas
antioksidan DPPH Free Radical Scavenging (FRS) Assay pada ekstrak metanol
70% daun tanaman adam hawa dengan spektrofotometer visibel panjang
gelombang maksimal 517 nm dan operating time (OT) 30 menit.
Sehingga belum ada penelitian yang melakukan hingga tahap fraksinasi
dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH pada daun tanaman adam
hawa (Rhoe discolor (L.) Her.Hance) maka saya ingin melakukan penelitian
untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH pada fraksi polar dan
fraksi semipolar dengan pelarut etanol-air dan aseton dan isolasi fraksi serta
 2

identifikasi senyawa flavonoid secara kualitatif dengan efek bathokromik pada

hasil isolasi menggunakan spektrofotometer visibel.

2. Permasalahan
a) Apakah fraksi etanol-air dan fraksi aseton daun tanaman adam hawa (Rhoe
discolor (L.) Her.Hance) memiliki aktivitas antioksidan ?
b) Apa senyawa yang aktif sebagai antioksidan pada fraksi etanol-air dan fraksi
aseton daun tanaman adam hawa (Rhoe discolor (L.) Her.Hance) merupakan
senyawa flavonoid ?
c) Berapa nilai IC50 sebagai nilai aktivitas antioksidan fraksi etanol-air dan fraksi
aseton daun tanaman adam hawa (Rhoe discolor (L.) Her.Hance) dengan
menggunakan radikal bebas DPPH ?

3. Tujuan Khusus
a) Mengetahui fraksi etanol-air dan fraksi aseton daun tanaman adam hawa (Rhoe
discolor (L.) Her.Hance) memiliki aktivitas antioksidan.
b) Mengetahui senyawa yang aktif sebagai antioksidan pada fraksi etanol-air dan
fraksi aseton daun tanaman adam hawa (Rhoe discolor (L.) Her.Hance) yang
merupakan senyawa flavonoid.
c) Mengetahui nilai IC50 fraksi etanol-air dan fraksi aseton daun tanaman adam
hawa (Rhoe discolor (L.) Her.Hance) dengan menggunakan radikal bebas
DPPH.

4. Manfaat Penelitian
a) Manfaat teoritis dari penelitian ini adalah diketahuinya aktivitas antioksidan
yang berupa nilai IC50 dan senyawa flavonoid dari fraksi etanol-air dan fraksi
aseton daun tanaman adam hawa (Rhoe discolor (L.) Her.Hance).
b) Manfaat praktis dari penelitian ini apabila terbukti, masyarakat dapat
memanfaatkan daun tanaman adam hawa sebagai antioksidan alami dan bagi
formulator dapat diaplikasikan ke bentuk sediaan obat yang sesuai.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
 3

A. Tanaman Adam Hawa

Famili : Commelinaceae
Marga : Rhoeo
Spesies : Rhoeo discolor (L.) Her. Hance (Adam Hawa)
Sinonim : Tradescantia discolor
Tanaman adam hawa (Rhoeo discolor (L.) Her. Hance) biasa ditanam sebagai
tanaman hias, tumbuh subur di tanah yang lembab. Termasuk suku gawar-gawaran
berasal dari Meksiko dan Hindia Barat. Tinggi pohon 40-60 cm, batang kasar,
pendek, lurus tidak bercabang. Daun lebar dan panjang, mudah patah, warna daun
di permukaan atas hijau dan di bagian bawah berwarna merah ungu. Panjang daun
kira-kira 30-40 cm lebar 4-7,5 cm. Bunga berwarna putih berbentuk bunga
kerang. Kandungan kimia dalam daun tanaman adam hawa adalah senyawa-
senyawa flavonoid, antosianin, saponin, karotenoid, lilin, terpenoid, kumarin dan
steroid (Lwin, 2008).
Tanaman ini sering ditanam sebagai tanaman hias karena daun kebiruan
atau keunguan dan / atau bunga nya, tetapi juga dikenal untuk digunakan
etnobotani untuk mengobati banyak penyakit, termasuk infeksi mukosa, penyakit
kelamin, luka, gangguan pencernaan, dan kanker, yang mungkin dikaitkan dengan
antibakteri dan antioksidan. Namun, laporan tentang sifat antibakteri dan
antioksidan dari tanaman ini masih langka sejauh ini (Tan et al,2014).

B. Senyawa Flavonoid
Flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar ditemukan
di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, dan biru, dan
sebagian zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoid
mem- punyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua
cincin benzene (C6) terikat pada suatu rantai propan (C3) sehingga membentuk
suatu susunan C6-C3-C6. Susunan ini dapat menghasilkan tiga jenis struktur,
yakni 1,3-diarilpropan atau neoflavonoid.Senyawa-senyawa flavonoid terdiri dari
beberapa jenis tergantung pada tingkat oksidasi dari rantai propane dari sistem
1,3-diarilpropana.Flavon, flavonol dan antosianidin adalah jenis yang banyak
ditemukan dialam sehingga sering disebut sebagai flavonoida utama. Banyaknya
senyawa flavonoida ini disebabkan oleh berbagai tingkat hidroksilasi, alkoksilasi
atau glikosilasi dari struktur tersebut (Harborne, 1987).

C. Ekstraksi
 4

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif
dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai,
kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang
tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang ditetapkan (Depkes
RI, 1995).
Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan kandungan senyawa kimia dari
jaringan tumbuhan ataupun hewan dengan menggunakan penyari tertentu. salah
satu metode ekstraksi cara dingin yang sering digunakan, yaitu maserasi. Maserasi
adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan
beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar).
Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan
penyaringan maserat pertama, dan seterusnya (Depkes RI, 2000).

D. Fraksinasi
Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam
dan fase gerak. Teknik kromatografi ini sudah berkembang dan telah digunakan
untuk memisahkan dan mengkuantifikasi berbagai macam komponen yang
kompleks baik komponen organic ataupun komponen anorganik (Rohman, 2012).
Fraksinasi yaitu proses pemisahan fraksi yang terkandung dalam larutan
ekstrak yang mempunyai karakteristik berbeda. Pemisahan larutan ekstrak
berdasarkan sifat kepolarannya. Ada berbagai jenis metode pemisahan, ekstraksi
pelarut atau disebut juga ekstraksi cair cair merupakan metode pemisahan yang
paling baik dan populer. Alasan utamanya adalah pemisahan ini dapat dilakukan
dengan baik dalam skala mikro maupun makro. Selain itu, alat yang digunakan
tergolong sederhana (Khopkar, 1990).
Ekstraksi cair-cair dilakukan untuk mendapatkan suatu senyawa dalam
campuran berfase cair dengan pelarut lain yang fasenya cair. Prinsip metode ini
didasarkan pada distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua
pelarut yang tidak saling bercampur, seperti benzena dan kloroform. Alat yang
digunakan adalah corong pisah (Khopkar, 1990).
Kesempurnaan ekstraksi tergantung pada banyaknya ekstraksi yang
dilakukan. Hasil yang baik diperoleh apabila jumLah ekstraksi yang dilakukan
berulangulang dengan penambahan jumLah pelarut sedikit demi sedikit
(Khopkar, 1990).

E. Isolasi
Isolasi merupakan suatu teknik pemurnian setelah melakukan pemisahan
atau fraksinasi. KLT Preparatif adalah salah satu metode isolasi sederhana yang
sering digunakan. KLT Preparatif dapat digunakaan untuk memisahkan bahan
dalam jumlah gram, namun sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah
 5

milligram. Seperti halnya KLT secara umum, KLT Preparatif juga melibatkan fase
diam dan fase gerak. Dimana fase diamnya adalah sebuah plat dengan ukuran
ketebalan bervariasi. Untuk jumLah sampel 10-100 mg, dapat dipisahkan dengan
mengunakan KLT Preparatif dengan adsorben silika gel atau aluminium oksida,
dengan ukuran 20 x 20 cm dan tebal 1 mm, jika tebalnya di dua kalikan, maka
banyaknya sampel yang dapat dipisahkan bertambah 50%, seperti halnya KLT
biasa, adsorben yang paling umum digunakan pada KLT Preparatif adalah silika
gel (Hostettman et al,1995).
Sebelum ditotolkan pada plat KLT Preparatif, sampel dilarutkan terlebih dahulu
dalam sedikit pelarut. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah menguap,
misalnya n-heksana, diklorometana atu etil asetat. Karena jika pelarut yang
digunakan tidak mudah menguap, maka akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi
sampel juga sebaiknya hanya 5-10%. Sampel yang ditotolkan harus berbentuk pita
yang sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan juga bergantung pada
lebarnya pita (Hostettman et al,1995).
Setelah plat KLT Preparatif dielusi, pita yang kedudukannya telah diketahui
dikerok dari plat. Selanjutnya senyawa harus diekstraksi dari adsorben dengan
pelarut yang sesuai (5 mL pelarut untuk 1 gram adsorben). Diupayakan untuk
menggunakan pelarut yang paling nonpolar yang mungkin. Harus diperhatikan
bahwa makin lama senyawa kontak dengan adsorben, maka makin besar
kemungkinan senyawa tersebut mengalami peruraian. Selanjutnya ekstrak yang
diperoleh disaring menggunakan corong berkaca masir atau menggunakan
membran (Hostettman et al,1995).

F. Pereaksi Diagnostik Untuk Identifikasi Flavonoid

Flavonoid diduga dapat membentuk ikatan pada kedudukan yang lain dengan
campuran asam borat dan asam sitrat pada pemanasan, dan dikenal dengan
pereaksi sitroborat. Sampai saat ini mekanisme reaksi yang terjadi antara
flavonoid dengan pereaksi sitroborat belum diketahui secara pasti. Sedangkan
warna/fluoresensi yang terbentuk adalah fluoresensi kuning-kuning kehijauan
dibawah sinar UV 366 nm. Berikut untuk identifikasi flavon dan flavonol :
a. Efek hidroksilasi
Penambahan gugus OH pada cincin A pada flavon atau flavonol menghasilkan
pergeseran batokromik yang nyata pada pita serapan I atau pita serapan II pada
spektra flavonoid. Apabila gugus hidroksi tidak ada pada flavon atau flavonol,
panjang gelombang maksimal muncul pada panjang gelombang lebih pendek jika
dibandingkan dengan adanya gugus 5-OH sedangkan substitusi gugus hidroksi
pada posisi 3, 5, 4' mempunyai sedikit efek atau tidak sama sekali pada spektra
ultraviolet (Mabry, 1970).
 6

b. Efek metilasi dan glikosilasi

Metilasi dan glikosilasi pada pola serapan dari flavon dan flavonol. Jika gugus 3,
5 atau 5'-OH pada flavon dan flavonol termetilasi atau terglikosilasi terjadi
pergeseran hipsokromik, khususnya dapat dilihat pada pita serapan I, pergeseran
yang terjadi sebesar 12-17 nm. Dapat juga 22-25 nm pada flavon yang tidak
mempunyai gugus 5-OH (Mabry, 1970).

c. Efek natrium asetat

Natrium asetat merupakan basa lemah dan hanya akan mengioniasi gugus yang
sifat keasamannya tinggi, khususnya untuk mendeteksi adanya gugus 7-OH bebas
(Markham, 1988). Flavon dan flavonol yang mempunyai gugus 7-OH bebas
menunjukkan pergeseran batokromik sebesar 5-20 nm pada pita serapan II dengan
adanya natrium asetat. Natrium asetat hanya dapat mengionisasi khusus pada
gugus 7-OH. Adanya natrium asetat dan asam borat akan membentuk kompleks
dengan gugus orto dihidroksi pada semua posisi kecuali atom C5 dan C6. Flavon
dan flavonol yang mempunyai gugus orto dihidroksi pada cincin B menunjukkan
pergeseran batokromik pada serapan I sebesar 12-30 nm. Gugus orto dihidroksi
pada cincin A juga dapat dideteksi dengan efek natrium asetat dan asam borat.
Adanya pergeseran batokromik sebesar 5-10 nm pada pita I menunjukkan adanya
gugus orto dihidroksi pada C6 dan C7 atau C7 dan C8 (Mabry, 1970).

d. Efek natrium metoksida

Natrium metoksida pada flavon dan flavonol dalam metanol pada umumnya
menghasilkan pergeseran batokromik pada semua pita serapan. Walaupun
demikian, pergeseran batokromik yang besar pada serapan pita I sekitar 40-65 nm
tanpa penurunan intensitas, menunjukkan adanya gugus-gugus 4'-OH bebas, dan
flavonol yang tidak mempunyai gugus 4'-OH bebas juga memberikan pergeseran
batokromik disebabkan adanya gugus 3-OH. Jika suatu flavonol mempunyai 3
dan 4'-OH bebas, maka spektranya dengan natrium metoksida akan mengalami
dekomposisi. Pereaksi pengganti natrium metoksida yang cocok ialah larutan
NaOH 2M dalam air (Mabry, 1970).

e. Efek AlCl3
Pereaksi ini dapat membentuk kompleks tahan asam antara gugus hidroksil dan
keton yang bertetangga dan membentuk kompleks tak tahan asam dengan gugus
orto sehingga dapat digunakan untuk mendeteksi kedua gugus tersebut (Markham,
1988). Gugus OH pada C3 dan C5 pada flavon dan flavonol akan membentuk
kompleks yang stabil dengan adanya AlCl3. Sebaliknya kompleks yang terbentuk
antara AlCl3 dengan gugus orto dihidroksi bersifat labil sehingga dengan
penambahan asam akan terdekomposisi. Sedangkan kompleks antara AlCl3
 7

dengan C-4 keto dan 3 atau 5 OH tetap stabil dengan adanya asam. Adanya
gugus ortodihidroksi pada cincin B dapat diketahui jika pada penambahan asam
terhadap spektra kompleks AlCl3 menghasilkan pergeseran hipsokromik sebesar
30-40 nm pada pita I (atau pita Ia jika pita I terdiri dari 2 puncak). Dengan adanya
pergeseran batokromik pada pita I (dalam AlCl 3/HCl) dibandingkan dengan pita I
(dalam metanol) 35-55 nm, menunjukkan adanya 5-OH flavon atau flavonol 3-
OH tersubstitusi (Mabry, 1970).

G.Radikal Bebas
Radikal bebas adalah atom atau molekul apa saja yang memiliki satu atau lebih
atom tak berpasangan. Karena jumLah elektron ganjil, maka tidak semua elektron
dapat berpasangan. Meskipun suatu radikal tidak bermuatan positif atau negatif,
spesi semacam ini sangat reaktif karena adanya elektron yang tidak berpasangan.
Suatu radikal bebas dijumpai sebagai zat antara yang tak dapat diisolasi usia
pendek, sangat reaktif dan berenergi tinggi (Fessenden dan Fessenden, 1997).
Radikal bebas DPPH yang memiliki elektron tidak berpasangan memberikan
warna ungu dan menghasilkan absorbansi maksimum pada panjang gelombang
517 nm. Warna akan berubah menjadi kuning saat elektron berpasangan.
Pengurangan intensitas warna yang terjadi berhubungan dengan jumLah elektron
DPPH yang menangkap atom hidrogen. Pengurangan intensitas warna
mengindikasikan peningkatan kemampuan antioksidan untuk menangkap radikal
bebas. Dengan kata lain, aktivitas antioksidan diperoleh dengan menghitung
jumLah pengurangan intensitas warna ungu DPPH yang sebanding dengan
pengurangan konsentrasi larutan DPPH melalui pengukuran absorbansi larutan uji
(Prakash, 2001).

H.Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (elektron donor) atau
reduktan. Senyawa antioksidan memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu
menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi dengan cara mencegah
terbentuknya radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat
menghambat reaksi oksidasi, dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang
sangat reaktif (Winarsi, 2007).
Berdasrakan mekanisme kerja, antioksidan dibagi menjadi 3 yaitu antioksidan
primer, sekunder, dan tersier. Antioksidan primer disebut juga antioksidan
enzimatis yang terdapat dalam tubuh (endogenus) seperti enzim superoksida
dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase (GSH-Px). Antioksidan
sekunder disebut juga antioksidan eksogenus (diluar tubuh) non enzimatis. Cara
kerja sistem antioksidan non-enzimatis yaitu dengan cara memotong reaksi
oksidasi berantai dari radikal bebas. Akibatnya, radikal bebas tidak bereaksi
 8

dengan komponen seluler. Contoh antioksidan sekunder: vitamin C, vitamin E,

flavonoid, betakaroten, isoflavon, flavon, antosianin, katekin, isokatekin serta
asam lipoat. Antioksidan tersier adalah senyawa yang memeperbaiki sel-sel dan
jaringan yang rusak oleh radikal bebas seperti metionin sulfoksidan reduktase
yang bermanfaat bagi penderita kanker (Musarofah, 2015).

I. Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Pengujian Aktivitas Antioksidan Berbagai metode pengujian aktivitas
antioksidan secara in vitro bertujuan untuk mengetahui aktivitas suatu senyawa
antioksidan dalam menghambat radikal bebas. Beberapa metode yang digunakan
untuk menghambat radikal bebas salah satunya Metode DPPH. Penangkapan
radikal bebas (radical scavenger) merupakan mekanisme utama antioksidan
bereaksi dalam makanan. Salah satu cara untuk menguji aktivitas suatu senyawa
sebagai zat antioksidan adalah mereaksikannya dengan reagen DPPH secara
spektrofotometri. Metode DPPH tidak spesifik untuk komponen antioksidan
tertentu, tetapi untuk semua senyawa antioksidan dalam sampel. Pengukuran
kapasitas total antioksidan dapat membantu memahami sifat fungsional suatu
makanan. Metode DPPH dipilih karena sederhana, mudah, cepat dan peka serta
hanya memerlukan sedikit sampel (Prakash, 2001).
Metode DPPH digunakan secara luas untuk menguji kemampuan senyawa
yang berperan sebagai pendonor elektron atau hidrogen. Metode DPPH
merupakan metode yang dapat mengukur aktivitas antioksidan baik dalam pelarut
polar maupun nonpolar. Beberapa metode lain terbatas mengukur komponen yang
terlarut dalam pelarut yang digunakan dalam analisis. Metode DPPH mengukur
semua komponen antioksidan baik yang larut dalam lemak maupun dalam air
(Prakash, 2001).
Antioksidan bereaksi dengan DPPH akan menghasilkan bentuk tereduksi 1,1-
difenil-2-pikrilhidrazin dan radikal antioksidan (Prakash, 2001). Adanya senyawa
yang bereaksi sebagai antiradikal akan mereduksi radikal DPPH, sebagaimana
reaksi berikut :

Gambar 2.1 Reaksi DPPH dan Antioksidan (Molyneux,2004)

Absorbansi kontrol yang digunakan dalam prosedur DPPH ini adalah
absorbansi DPPH sebelum ditambahkan sampel. Kontrol digunakan untuk
 9

mengkonfirmasi kestabilan sistem pengukuran. Nilai absorbansi kontrol dapat

berkurang dari hari ke hari dikarenakan kehilangan aktivitasnya saat dalam stok
larutan DPPH, tetapi nilai absorbansi kontrol tetap dapat memberikan batasan
untuk pengukuran saat itu. Kontrol juga berfungsi menjaga kekonstanan total
konsentrasi DPPH dalam serangkaian pengukuran (Molyneux, 2004).
Metode ini bertujuan untuk mengetahui parameter yang menunjukan aktivitas
antioksidan yaitu parameter konsekuensi yang ekuivalen dapat memberikan efek
aktivitas antioksidan sebesar 50% (IC50). Parameter IC50 dapat diketahui dengan
menginterpretasikan hasil uji dalam suatu data eksperimental (Molyneux, 2004).

J. Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis merupakan salah satu jenis spektroskopi yang sering
digunakan dalam analisis kimia dan biologi. Spektrofotometer ini didasarkan pada
interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Apabila seberkas radiasi
(cahaya) dikenakan pada cuplikan (larutan sampel), maka sebagian dari cahaya
diserap oleh molekul molekul sesuai dengan struktur dari molekul. Setiap
senyawa dalam sampel memiliki tingkatan tenaga yang spesifik. Bila cahaya
mempunyai perbedaan energi antara tingkatan dasar dan tingkatan tereksitasi yang
mengenai cuplikan, maka elektron elektron pada tingkatan dasar akan dieksitasi
ke tingkatan tereksitasi, dan sebagian energi cahaya yang sesuai diserap dengan
panjang gelombang ini. Elektron yang tereksitasikan melepaskan tenaga melalui
proses radiasi panas dan akan kembali pada tingkatan dasar lagi. Perbedaan energi
antara tingkat dasar dengan tingkat tereksitasi yang spesifik untuk tiap tiap
bahan/senyawa menyebabkan frekuensi yang diserap juga berbeda beda
(Sastrohamidjojo, 2001).
Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang
elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 380 nm) dan daerah
visible (380 700 nm) (Khopkar, 1990).
Pada umumnya konfigurasi dasar dari spektrofotometer UV-Vis berupa
susunan peralatan adalah sebagai berikut:

Gambar 2.2 Bagan instrumen spektrofotometer UV-Vis

Adapun penjelasan dari komponen komponen dari spektrofotometer diatas
adalah sebagai berikut:
a) Sumber radiasi, merupakan sumber listrik bertegangan tinggi atau oleh
pemanasan listrik yang dapat mengeksitasi benda hingga ke tingkat yang tinggi.
b) Monokromator digunakan untuk mengubah radiasi polikromatik menjadi
monokromatik.
 10

c) Wadah sampel.
d) Detektor merupakan salah satu bagian spektrifotometer UV-Vis yang
penting.Fungsinya yaitu mengubah signal radiasi yang diterima menjadi signal
elektronik.
e) Rekorder berfungsi mencatat hasil analisis dari detektor.
Prinsip penentuan spektofotometer UV-Vis merupakan aplikasi dari Hukum
Lambert-Bert. Hukum ini menyatakan bahwa intensitas yang diteruskan oleh
larutan zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi kuvet
(Rohman, 2007).
Kesalahan dalam penggunaan spektrofotometer UV-Vis dapat diatasi dengan
dilakukannya proses kalibrasi. Kalibrasi dilakukan dengan menggunakan blanko,
yaitu setting nilai absorbansi = 0 dan nilai transmitansi = 100% (Tahir, 2008).
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri UV-Vis:
1. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis
Hal yang perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap
pada daerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi
senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan
harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu:
a. Reaksinya selektif dan sensitif
b. Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusibel
c. Hasil reaksi stabil dalam dalam jangka waktu yang lama
Keselektifan dapat dinaikkan dengan mengatur pH, pemakaian masking agent
atau penggunaan teknik ekstraksi (Gandjar dan Rohman, 2007).

2. Waktu Operasional (Operating Time)

Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan
warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu
operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran
dengan absorbansi larutan (Gandjar dan Rohman, 2007). Pada saat awal terjadi
reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat sampai waktu tertentu
hingga diperoleh absorbansi yang stabil. Semakin lama pengukuran, maka ada
kemungkinan senyawa yang berwarna tersebut menjadi rusak atau terurai
sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun (Gandjar
dan Rohman, 2007).

3. Pemilihan Panjang Gelombang

Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang
gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih panjang
gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara
 11

absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi
tertentu (Gandjar dan Rohman, 2007).
Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang maksimal,
yaitu:
a. Pada panjang gelombang maksimal, bentuk kurva kepekaannya juga
maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan
absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar
b. Di sekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar
dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi
c. Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh
pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan
panjang gelombang maksimal (Gandjar dan Rohman, 2007).

4. Pembuatan Kurva Baku

Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi
diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (y)
dengan konsentrasi (x). Penyimpangan dari garis lurus biasanya dapat disebabkan
oleh kekuatan ion yang tinggi, perubahan suhu, dan reaksi ikutan yang terjadi
(Gandjar dan Rohman, 2007).

5. Pembacaan Absorbansi Sampel atau Cuplikan

Absorban yang terbaca hendaknya antara 0,2 - 0,8 atau 15% - 70% jika dibaca
sebagai transmitans. Anjuran ini ini berdasarkan anggapan bahwa kesalahan
dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% (Gandjar dan Rohman, 2007).

K. Landasan Teori
Radikal bebas merupakan suatu senyawa yang memiliki satu atau lebih
elektron tidak berpasangan, hal ini yang menyebabkan radikal bebas bersifat tidak
stabil dan reaktif di dalam tubuh. Di dalam tubuh, radikal bebas akan menjadi
stabil dengan cara menyerang elektron disekitarnya sehingga dapat menimbulkan
kerusakan sel dan dapat menimbulkan penyakit degeneratif.
Daun adam hawa mengandung senyawa aktif, yaitu senyawa flavonoid.
Flavonoid merupakan senyawa antioksidan memiliki gugus fenol yang dapat
mendonorkan atom hidrogen pada radikal bebas sehingga radikal dapat bersifat
stabil.
Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut
dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan dan
dilakukan remaserasi untuk mendapatkan hasil yang maksimal. Pelarut yang
 12

sering untuk mendapatkan senyawa flavonoid digunakan yaitu etanol, metanol

dan air.
Fraksinasi yaitu proses pemisahan fraksi yang terkandung dalam larutan
ekstrak yang mempunyai karakteristik berbeda. Pemisahan larutan ekstrak
berdasarkan sifat kepolarannya. Fraksinasi dengan ekstraksi cair-cair
menggunakan corong pisah dengan 2 pelarut berbeda bobot jenis dan
polaritasnya.
Isolasi merupakan proses pemurnian dengan KLT preparatif yang melibatkan
fase diam dan fase gerak, dimana terbentuknya pita-pita yang memgambarkan
senyawa aktif murni yang akan diambil untuk diidentifikasi.
Identifikasi senyawa flavonoid dilakukan dengan pereaksi geser seperti AlCl3
5%, NaOH, NaOAc, dan H3BO3 karena dapat mengetahui gugus-gugus yang
terdapat pada flvanoid dengan efek bathokromik ( pergeseran panjang gelombang)
menggunakan spektrofotometer visibel.
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode DPPH. DPPH
merupakan suatu metode yang mampu menunjukkan terjadinya perubahan warna
larutan karena radikal bebas berikatan atom hidrogen dari senyawa antioksidan.

L. Hipotesis
Fraksi etanol-airdan fraksi aseton daun tanaman adam hawa mengandung
senyawa flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan yang dinyatakan sebagai
IC50
 13

BAB III
METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental dengan rancangan acak
lengkap pola searah. Merupakan jenis penelitian eksperimental karena penelitian
ini mencari hubungan sebab akibat dari fraksi daun tanaman adam hawa
digunakan dengan nilai IC50 yang dihasilkan. Rancangan acak karena pengambilan
sampel daun adam hawa dilakukan secara acak, tidak ada pemilihan secara
khusus. Rancangan lengkap karena terdapat kontrol positif, kontrol negatif dan
kelompok perlakuan.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

A. Variabel Utama
Variabel bebas : Konsentrasi fraksi etanol-air dan fraksi aseton daun
tanaman adam hawa
Variabel tergantung : Aktivitas antiosidan fraksi etanol-air dan fraksi aseton
daun tanaman adam hawa (%IC50)
B. Variabel pengacau
a.Terkendali : cara memanen, waktu panen, tempat tumbuh, lokasi
pengambilan sampel dan bobot sampel
b.Tak terkendali : umur tanaman, cara menumbuhkan tanaman dan kondisi
lingkungan
C. Definisi Operasional
a) Ekstrak etanol 95% daun tanaman adam hawa adalah hasil dari maserasi
simplisia daun tanaman adam hawa menggunakan penyari etanol 95%
selama 24 jam lalu diuapkan membentuk cairan kental berwarna hijau
keunguan.
b) Fraksi etanol-air daun tanaman adam hawa adalah hasil dari ekstraksi cair-
cair menggunakan corong pisah yang akan memisahkan senyawa-senyawa
yang larut dalam etanol-airpada ekstrak etanol 95%.
c) Fraksi aseton daun tanaman adam hawa adalah hasil dari ekstraksi cair- cair
menggunakan corong pisah yang akan memisahkan senyawa-senyawa yang
larut dalam aseton pada ekstrak etanol 95%.
d) Isolat adalah hasil pemurnian fraksi etanol-airdan fraksi aseton dengan
menggunakan KLT preparatif.
e) Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan
kemampuan fraksi etanol-airdan fraksi aseton daun tanaman adam hawa
dalam meredam radikal bebas DPPH.
f) Inhibition concentration 50 (IC50) adalah konsentrasi etanol-airdan fraksi
aseton daun tanaman adam hawa yang dapat meredam 50% radikal bebas
(DPPH).
 14

g) Pereaksi geser adalah reagen yang digunakan untuk identifikasi senyawa

flavonoid yang menimbulkan efek pergeseran panjang gelombang

D. Bahan Penelitian
1. Bahan Utama
Bahan yang digunakan dalam penelitin ini adalah daun tanaman adam hawa yang
diperoleh dari Monjali Depok Sleman Yogyakarta.

2. Bahan Kimia
Bahan kimia kualitas pro analitik E.Merck berupa methanol, bahan kimia kualitas
teknis CV. General Labora berupa etanol 95%, alumunium foil, air suling,
kloroform (teknis), aseton (teknis), DPPH (Aldrich), lempeng KLT, rutin (Sigma),
Fase gerak n-butanol : asam asetat : air (BAA) (4:1:5), AlCl3 5%, NaOH, NaOAc,
dan H3BO3.

E. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain: Shaker (Innova TM 2100),
vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV double beam,
ayakan no.40, bejana maserasi, peralatan kromatografi lapis tipis preparatif,
blender, sentrifugator, waterbath, timbangan analitik, corong pisah, vakum
penguap putar (vaccum rotary evaporator) (Buchi R-205,Jerman), peralatan gelas,
mikropipet (Acura 825, Socorex).

F. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi Tanaman
Determinasi dilakukan pada tanaman adam hawa di Laboratorium Kebun Obat
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta menggunakan acuan
Jurnal Morpholgical, Microscopical Studies and Elemental analysis of
Polygonum chinense and Rhoe discolor Hance.

2. Pembuatan Simplisia
Daun tanaman adam hawa ambil dari kebun di daerah Monjali, Depok, Sleman,
Yogykarta. Daun tanaman adam hawa yang telah dipetik dan ditimbang kurang
lebih 2,0 kg kemudian disortasi basah. Hasil sortasi kemudian dicuci untuk
menghilangkan kotoran yang melekat pada sampel. Daun tanaman adam hawa
kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang
melekat lalu ditiriskan sampai sisa air menghilang. Daun tanaman adam hawa
dikeringkan dengan panas dalam oven pada suhu 40 C selama 7 hari.
Dikatakan kering jika daun dapat hancur ketika diremas dengan tangan. Daun
tanaman adam hawa yang telah dikeringkan kemudian diserbuk menggunakan
blender, lalu diayak menggunakan ayakan nomor 40.
 15

3. Ekstraksi Daun Tanaman Adam Hawa

Ditimbang kurang lebih 50,0 g serbuk kering daun tanaman adam hawa
kemudian dimaserasi dengan pelarut etanol 95% sebanyak 250,0 mL. Maserasi
dilakukan berulang-ulang dengan pelarut yang sama sampai filtrat hasil
maserasi jernih. Hasil maserasi disaring dan filtrat yang diperoleh dipekatkan
dengan vaccum rotary evaporator pada suhu kurang lebih 40C sehingga
diperoleh ekstrak kental etanol 95%. Ekstrak ditimbang dan dihitung rendemen
ekstrak.

4. Fraksinasi Ekstrak Daun Tanaman Adam Hawa

Ekstrak etanol 95% kental dilarutkan dengan kloroform sebanyak 150,0 mL,
diaduk terus sampai larut dan homogen, kemudian dimasukkan dalam corong
pisah, difraksinasi berturut turut secara ekstraksi cair cair dengan pelarut
aseton. Mula mula difraksinasi dengan pelarut etanol-air sebanyak 50,0 mL.
Diperoleh fraksi kloroform dan fraksi etanol-air. Fraksi etanol-air dipisahkan,
kemudian fraksi kloroform difraksinasi lagi dengan etanol-air sebanyak 50,0
mL dilakukan hingga 3 kali sehingga pelarut etanol-air (1:1) yang digunakan
sebanyak 150,0 mL. Fraksi etanol-air pertama, kedua, dan ketiga dikumpulkan.
Sisa fraksi kloroform difraksinasi dengan pelarut aseton sebanyak 50,0 mL
dilakukan hingga 3 kali sehingga pelarut aseton yang digunakan sebanyak
150,0 mL. Fraksi aseton pertama, kedua, dan ketiga dikumpulkan. Kedua hasil
fraksinasi dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator kurang lebih 40oC.

5. Isolasi Fraksi
Isolasi dengan KLT preparatif digunakan plat silika G 60 F 254 dengan ukuran
10,0 cm x 20,0 cm. Fraksi aseton 100,0 mg dilarutkan dengan 10,0 mL etanol
95%, kemudian ditotolkan sepanjang plat pada jarak 1,0 cm dari garis bawah
dan 1,0 cm dari garis tepi. Selanjutnya dielusi dengan n-butanol : asam asetat
glasial : air (BAA) (4:1:5). Setelah gerakan larutan pengembang sampai pada
garis batas, elusi dihentikan. Pita yang terbentuk masing-masing diukur harga
Rf nya. Pita-pita diperiksa di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm
dan 366 nm. Isolat-isolat yang diperoleh dari hasil KLT preparatif dengan cara
mengkerok pila-pita pada fase diam yang telah dielusikan, lalu serbuk
dilarutkan dengan etanol 95% sebanyak 10,0 mL dan disentrifugasi untuk
mengendapkan fase diamnya (silika gel), lalu supernatannya diambil dan
diuapkan di waterbath.

6. Identifikasi Isolat
Analisis untuk identifikasi menggunakan hasil isolasi (isolat) sebanyak 0,10
mg terhadap yang dilarutkan dalam metanol sampai volume 10,0 mL,
kemudian diukur panjang gelombang maksimum (maks) pada
 16

spektrofotometer visibel. Efek batokromik diamati dengan penambahan 1,0 mL

pereaksi geser seperti AlCl3 5%, NaOH, NaOAc, dan H3BO3.

7. Uji Aktivitas Antioksidan

Pada fraksi daun tanaman adam hawa diuji aktivitas antioksidan menurut
metode DPPH dengan beberapa modifikasi. Nilai IC 50 dihitung dengan
menggunakan rumus persamaan regresi.
a. Uji pendahuluan (optimasi panjang gelombang DPPH)
Larutan DPPH yang telah dibuat dengan konsentrasi 0,02 mg/mL ditentukan
spektrum serapan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang
gelombang 400 nm hingga 600 nm dan ditentukan panjang gelombang
optimumnya.
b. Pembuatan Larutan
1) Pembuatan Larutan DPPH
SejumLah 10,0 mg DPPH ditimbang dan dilarutkan dalam 100,0 mL metanol
p.a didapatkan konsentrasi 0,10 mg/mL. Kemudian dipipet 20,0 mL
kemudian ditambahkan volumenya dengan 100,0 mL metanol p.a (0,02
mg/mL).
2) Persiapan Larutan Uji Fraksi Etanol-air dan Fraksi Aseton
Pembuatan larutan induk (konsentrasi 1,0 mg/mL). SejumLah 10,0 mg
ekstrak ditimbang dan dilarutkan dalam 10,0 mL metanol p.a hingga
homogen.
Pembuatan larutan seri (konsentrasi 0,02; 0,04; 0,06; 0,1; dan 0,14 mg/mL).
Dipipet masing-masing 0,2; 0,4; 0,6; 1; dan 1,4 mL dimasukkan kedalam labu
ukur 10 mL dan dicukupkan volumenya dengan metanol p.a hingga 10 mL.
3) Pembuatan larutan kontrol
Larutan blanko yang digunakan adalah 0,20 mL metanol p.a dimasukkan
kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 3,80 mL DPPH, dikocok hingga
homogen. Didiamkan selama 30 menit (operating time).
4) Pembuatan larutan rutin sebagai pembanding
Pembuatan larutan induk (konsentrasi 1 mg/mL). SejumLah 10 mg rutin
ditimbang dan dilarutkan dalam 10 mL metanol p.a hingga homogen.
Pembuatan larutan seri (konsentrasi 0,02, 0,04, 0,06, 0,1 dan 0,14 mg/mL).
Dipipet masing-masing 0,2; 0,4; 0,6; 1; 1,4 mL dimasukkan kedalam labu
ukur 10 mL dan dicukupkan volumenya dengan metanol p.a hingga 10 mL.
c. Pengujian aktivitas antioksidan
Dari masing-masing larutan uji dipipet 0,2 mL dimasukkan kedalam tabung
reaksi, ditambahkan 3,8 mL DPPH 0,02 mg/mL, digojog hingga homogen,
didiamkan selama 30 menit (operating time) dan diukur serapannya pada
panjang gelombang hasil orientasi. Dilakukan pengujian yang sama untuk
pembanding rutin.

G. Analisis Data
 17

Nilai IC50 dihitung berdasarkan presentase inhibisi terhadap radikal DPPH

dari masing-masing konsentrasi larutan sampel dengan rumus :

Setelah didapatkan presentasi inhibisi dari masing-masing konsentrasi,

kemudian dintentukan persamaan y = a + bx dengan perhitungan secara
regresi linear dimana x adalah konsentrasi (mg/mL) dan y adalah presentase
inhibisi (%). Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan Inhibition
Concentration 50% (IC50) yaitu konsentrasi sampel yang dapat meredam
radikal.

H.Jadwal Kegiatan
Jadwal Kegiatan Tahun 2016
Bulan
Bulan Bulan Bulan Bulan Bulan
No Jenis Kegiatan 8 9 10 11 12

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2
1. Determinasi
tanaman adam
hawa
2. Pengambilan,
pemotongan dan
pengeringan daun
adam hawa
3. Penyerbukan
simplisia dan
ekstraksi simplisia
4. Fraksinasi ekstrak
5. Uji DPPH fraksi
6. Isolasi dan
identifikasi fraksi
8. Pengolahan data
9. Menyusun naskah
skripsi
10. Revisi naskah
 18

skripsi
11. Ujian akhir skripsi

DAFTAR PUSTAKA

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi

IV, Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta, hal. 325.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000, Parameter Standar Umum
Ekstrak Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta,
hal. 10-11.
Fessenden dan Fessenden, 1997, Kimia Organik, Edisi Ketiga, Diterjemahkan
oleh Alyosius Hadyana Pudjaatmaka. Jakarta: Erlangga. Hal.436-437.
Gandjar, I., G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta, hal. 252-256, 323-324, 354, 359, 465- 469.
Harborne, J., 1996, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan, Cetakan Kedua, Penerjemah: Padmawinata, K. dan I. Soediro. :
Penerbit ITB , Bandung. 71-72.
Hernani dan Rahardjo,M., 2005, Tanaman Berkhasiat Antioksidan, Penebar
Swadaya, Jakarta, hal.16-20.
 19

Hostettman, K., Hostettman, M. Dan A. Marston, 1995, Cara Kromatografi

Preparatif : Penggunaan Pada Isolasi Senyawa Alam, Penerjemah:
Padmawinata, K., Penerbit ITB, hal.9-25.
Khophar,S.M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press , Jakarta, hal.80-82,
215-217.
Lwin, Moe Moe, 2008, Morpholgical, Microscopical Studies and Elemental
analysis of Polygonum chinense and Rhoe discolor Hance, Jour.Myan.Acad
Art and Sc, 6 (4) : 265 -278.
Mabry, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970, The Systematic
Identification of Flavonoid, Springer-Verlag, Berlin, pp. 50, 52.
Markham, K. R., 1988, Techniques of Flavonoids Identification, diterjemahkan
oleh Padwanita, K., Penerbit ITB, Bandung, hal. 15.
Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable ree Radical DPPH for Estimating
Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26 (2) : 211-219.
Musarofah, 2015, Tumbuhan Antioksidan, Penerbit PT Remaja Rosdakarya,
Bandung, hal.1 -21.
Prakash, A. Rieglhof, F., dan Miller E., 2001, Medallion Laboratories: Analytical
Progress. Antioxidant Activity, www.terranostrachocholate.com
/file/Comparative_and_General_Antioxidant_information.pdf., Diakses pada
tanggal 12 Maret 2016.
Sitorus, Risma Meidy Hardina, Wullur, Adeanne C. dan Paulina V.Y.YamLean,
2012, Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Flavanoid Pada Daun Adam Hawa
(Rhoe discolor), PHARMACON, 1(1) : 53-57.
Rijke E., 2005, Trace-level Determination of Flavonoids and Their Conjugates
Application ti Plants of The Leguminosae Family, Universitas Amsterdam,
Amsterdam.
Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, Liberty, Yogyakarta, hal.43.
Suhartono, E., Fujiati, Alfanie, I., 2002, Oxygen Toxicity by Radiation and Effect
on Glutamic Piruvat Transamine (GPT) Activity at Rat Plasma After Vitamin C
Treatment, International Seminar on Environment Chemistry and Toxicology,
Yogyakarta.
Tahir, I., 2008, Arti Penting Kalibrasi pada Proses Pengukuran Analitik, Aplikasi
pada Penggunaan pH meter dan Spektrofotometer UV-Vis, Laboratorium
FMIPA Kimia Dasar UGM, Yogyakarta.
 20

Tan et al, 2014, Antioxidant Content, Antioxidant Activity, and Antibacterial

Activity of Five Plants from the Commelinaceae Family, Antioxidants, 3 :758-
769.
Winarsi, W., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Kanisius, Yogyakarta,
hal. 15, 79-81.