Anda di halaman 1dari 6

Metode HPLC sederhana dan cepat untuk penentuan simultan plasma

7-dehydrocholesterol dan vitamin E penerapannya pada pasien


Smith-Lemli-Opitz

1. Bahan dan metode


7-DHC dan standar vitamin E, dan Heksana, etanol, metanol. Sampel diderivatisasi
dengan SilPrep reagen Supelco (Bellefonte, PA, USA). Analisis HPLC dilakukan dengan
1.090 amino analyzer seri II dengan autosampler dan dioda detektor array (DAD) Hewlett
Packard (Palo Alto, CA, USA) menggunakan Supercosil LC18 (2535 mm ID, 5 mm)
kolom Supelco (Bellefonte, PA, USA) .

Persiapan sampel untuk analisis HPLC-DAD

Sampel darah dikumpulkan dalam tabung EDTA. Setelah sentrifugasi,


sampel plasma disimpan dalam tempat gelap dan beku di 2208C sampai dianalisis.
Sebuah alikuot dari 200 ml plasma dipindahkan ke tabung kaca 1.031,2 mm dan
200 ml etanol ditambahkan. Setelah vortexing selama 10 detik, larutan
dipindahkan ke dalam tabung gelas bersih 1.031,2 mm dan diekstraksi dua kali
dengan 1,5 ml heksana mengandung 12,5 mg / l dari butilhidroksitoluena. Setelah
vortexing selama 60 detik, sampel disentrifugasi pada 50003g selama 2 menit.
Fase organik dikumpulkan, dan diuapkan pada tekanan berkurang. Residu kering
dilarutkan dengan 200 ml metanol dan 100 ml disuntikkan ke aparat HPLC. Fase
gerak terdiri dari metanol absolut pada aliran-rate 1,5 C. Rizzo et al. / Clinica
Chimica Acta 291 (2000) 97-102 99ml / menit. DAD panjang gelombang yang
282 nm selama 7-DHC dan 292 nm untuk vitamin E. kromatografi selesai setelah
12 menit.
GC-MS

Analisis HPLC puncak eluting di 7.19 min, khas sampel dari pasien SLOS,
dikumpulkan dan diuapkan pada tekanan berkurang. Residu derivasi tized dengan
100 ml SilPrep untuk mendapatkan trimethysilyl (TMS) derivate eter. Untuk
analisis GC-MS, suhu oven ditetapkan dalam dua langkah, dari 220 ke 3008C pada
tingkat 158C / menit., Dan kemudian di 3008 C selama 10 menit. Aliran helium
adalah 1 ml / menit. Suhu lubang injeksi adalah 2508 C, dan suhu detektor adalah
2808C. Sistem GC-MS dioperasikan dalam modus dampak elektron dengan energi
dari 70 eV. Run time adalah 15 menit. Spectra diidentifikasi dibandingkan dengan
perpustakaan spektrum sendiri, perpustakaan spektrum komersial NBS75K dan
spektrum diterbitkan lainnya

2. Hasil
Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 1, metode HPLC memungkinkan
pemisahan 7-DHC, cholesta-5,7,9 (11) -trien-3b-ol dan vitamin E dalam plasma
pasien SLOS dikenal. Puncak tambahan, sesuai dengan vitamin A, juga terdeteksi
dalam jangka yang sama. Identifikasi 7-DHC, vitamin E dibuat oleh perbandingan
dengan kali elusi standar dikenal. Identifikasi cholesta-5,7,9 (11) -trien- 3b-ol,
metabolit karakteristik lebih lanjut dari SLOS [7,8], dibuat dengan GC-MS setelah
koleksi HPLC cairan elusinya sesuai.

Untuk analisis kuantitatif, jumlah standar yang dikenal dari 7-DHC dan
vitamin E yang ditambahkan ke sampel plasma darah donor dan dianalisis dalam
rangkap dua. Deteksi 7-DHC adalah linear (r .0.999) dengan tingkat pemulihan
9.360,7% (CV 0,75%), 9662% (CV 2,4%) dan 9.760,5% dengan 50, 100 dan 500
mmol, masing-masing. Tingkat pemulihan vitamin E adalah 9563% (CV 3,2%)
dan 9.468% (CV 8,7%) menggunakan 15 atau 30 mmol standar. Deteksi linier
dalam kisaran ini (r .0.999).

Untuk menguji reproduksibilitas pengukuran kami, diencerkan dan


dikumpulkan plasma dari pasien SLOS dianalisis dalam enam ulangan per hari
pada tiga hari berturut-turut. Tabel 1 menggambarkan hasil penelitian ini
menunjukkan koefisien variasi lebih rendah dari 6,6% dalam dua senyawa.

Nilai referensi yang berkaitan dengan usia untuk 7-DHC, dan vitamin E
yang diperoleh dari 60 anak yang sehat dan 15 subjek dewasa (Tabel 2). Nilai
referensi ini mirip dengan yang dilaporkan sebelumnya.

Metode HPLC kami merupakan alternatif yang handal untuk teknik GC-MS
yang umum digunakan yang memungkinkan penentuan simultan 7-DHC dan
vitamin

Gambar. 1. Plasma HPLC kromatogram dari pasien dengan sindrom Smith-


Lemli-Opitz menunjukkan puncak sesuai dengan vitamin A (retensi waktu 3,30
menit), cholesta-5,7,9 (11) -trien-3b-ol (waktu retensi 7,19 menit) , vitamin E
(retensi waktu 7.49 menit) dan 7-dehydrocholesterol (waktu retensi 9,23 menit).
Inset (A) menunjukkan spektrum massa cholesta-5,7,9 (11) -trien-3b-ol diperoleh
dengan analisis GC-MS.
E dengan keuntungan yang cukup lama. Kedua tingkat pemulihan dan presisi
yang memuaskan untuk senyawa ini dan deteksi untuk 7-dehydrocholesterol adalah
linier dalam berbagai kritis (10-500 mmol / l) untuk SLOS.
Seperti ditunjukkan pada Tabel 2, pasien SLOS dipresentasikan pada diagnosis
pengurangan mendalam atau kadar vitamin E tidak terdeteksi sedangkan kadar
vitamin A yang normal (data tidak ditampilkan).
Ia telah mengemukakan bahwa vitamin E rendah pada pasien SLOS bisa menjadi
konsekuensi dari sebuah gangguan penyerapan vitamin yang larut dalam lemak
karena sekresi asam empedu yang abnormal [3]. Namun, temuan kadar vitamin A
yang normal pada pasien SLOS kami berpendapat terhadap hipotesis ini. Dengan
demikian lebih mungkin bahwa kelebihan radikal oksigen yang disebabkan oleh
akumulasi sterol oksigen (yaitu 7-hydroperoxy-cholest-5,8-dien-3b-ol), akan
memanfaatkan vitamin E sebagai antioksidan [7]. Oleh karena itu, suplemen
vitamin E mungkin diperlukan untuk meningkatkan pertahanan antioksidan pada
pasien SLOS.

TABEL 1.
Sampel dan hari reproducibility peniitian (xS.D)
Hari 1 Hari 2 Hari 3 Total (N=18) CV% (N=18)

(N=6) (N=6) (N=6)


Vitamin E 12.6 0.2 13.6 0.8 12.8 1.1 13.0 0.9 6.6
7-DHC 31.7 0.7 31.7 2.6 32.3 2.2 31.9 1.9 6.9

TABEL 2
Kadar plasma (mmol / l) vitamin E dan 7-dehydrocholesterol di kontrol dan pada
pasien SLOS pada diagnosis .
Vitamin E 7-Dehydrocholesterol

Range x6S.D. Range x6S.D.


Controls 4.512.6 8.162.1 0.040.1 0.0660.01
Birth to 3 months
3 months to 1 year 4.819.6 13.164.3 0.050.1 0.0860.06
15 years 5.522.4 14.466.1 0.040.2 0.0760.04
510 years 6.721.6 15.263.6 0.050.4 0.0960.09
. 10 years 10.035.6 21.267.6 0.051.0 0.2360.20
SLOS patients nd 356
Pt. 1 (12 months)
Pt. 2 (22 months) nd 59
Pt. 3 (8 months) nd 430
Pt. 4 (1 months) 0.9 233
Pt. 5 (10 days) nd 630

DIAGRAM ALIR

Sampel darah

- Dikumpulkan dalam tabung EDTA


- Di sentrifugasi
- Disimpan dalam ruang gelap dan beku pada 22088 c

200 ml aliquot

- Dipindahkan kedalam tabung gelas 1031,2 mm


- Ditambahkan
- 200 ml etanol
- Di vortex selama 10 detik
- Dipindahkan larutan kedalam tabung 31,2 mm
- Diekstraksi sebanyak 2 kali dengan
- 1,5 ml heksana
- Setelah selesai di vorteks
- di sentrifugasi paa 5000 rpm selama 2 menit

Fasa organik
- Diuapkan sampai tekanan berkurang
Residu -kering
Dilarutkan dengan

200 ml- Di sutikkan ke HPLC

Hasil