Anda di halaman 1dari 8

TLC (Thin Layer Chromatography)

13.53 LANSIDA No comments

TLC (Thin Layer Chromatography) yang biasa disebut Kromatografi lapis tipis (KLT)
bersama-sama dengan kromatografi kertas (KKr) dengan berbagai macam
variasinya pada umumnya dirujuk sebagai kromatografi planar. Kromatografi lapis
tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. pada
kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada
permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau
pelat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai
bentuk terbuka dari kromatografi kolom.1
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah
dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang
digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih
sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat
melaksanakan setiap saat secara cepat.2,3]

Dibandingkan dengan HPLC dan GC, TLC mempunyai beberapa keuntungan, yaitu:

1. KLT memberikan fleksibilitas yang lebih besar, dalam hal memilih fase gerak.

2. Berbagai macam teknik untuk optimasi pemisahan seperti pengembangan 2


dimensi, pengembangan bertingkat, dan pembaceman penjerap dapat
dilakukan pada TLC.

3. Proses kromatografi dapat diikuti dengan mudah dan daat dihentikan kapan
saja.

4. Semua komponen dalam sampel dapat dideteksi.

BAHAN DAN TEKNIK


A. Penjerap/Fase diam
Penjerap yang paling sering digunakan pada TLC adalah silika dan serbuk selulosa,
sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu mekanisme perpindahan solut dari
fase diam ke fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada TLC adalah partisi dan
adsorbsi. Lapisan tipis yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari
silika yang telah dimodifikasi, resin penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin
yang digunakan untuk pemisahan kiral. Beberapa penjerap TLC serupa dengan
penjerap yang digunakan pada HPTLC. Kebanyakan penjerap dikontrol keajegan
ukuran partikel dan luas permukaannya. Beberapa prosedur kromatografi,
terutama pemisahan yang menggunkan larutan pengembang anhidrat,
mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam silika. Kandungan air yang ideal
adalah antara 11-12 % b/b.
Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penjerap fase terbalik
dengan cara membacemnya menggunakan parafin cair, minyak silikon, atau dengan
lemak. Lempeng fase terbalik jenis ini digunakan untuk identifikasi hormon-
hormon steroid.
Ringkasan berbagai macam agen pembacem silika sbb :4]
Bahan pembacem Tujuan
Carbomer Identifikasi neomisin sulfat
Tetradekana Identifiksi sepradin dan atau identifikasi sefaklor
Tembaga sulfat 2% dan Pemisahan 7 senyawa barbiturat
etilendiamin 2%
Tembaga sulfat 0,1% Pemisahan obat-obat golongan sulfonamida
Seng asetat 1% Pemisahan 7 obat golongan antihistamin
EDTA Pemisahan serotonin, epinefrin, dan nor-epinefrin

B. Fase Gerak pada KLTFase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi
lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar.
Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi
campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga
pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam
memilih dan mengoptimasi fase gerak :

Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif.

Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf
terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,
polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti
juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar
seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan
meningkatkan harga Rf secara signifikan.

Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran


pelarut sebagai fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan
perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia
masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam. 5]

C. Aplikasi (Penotolan) sampel


Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika
menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin.
Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan
terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan secara
manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 l. Penotolan
sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak
ganda. Berdasarkan pada tujuan analisis, berbagai macam jumlah sampel telah
disarankan untuk digunakan dan diringkas pada tabel dibawah ini.
Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit
0,5 l. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 l maka
penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar
totolan.

D. Pengembangan
1. Konvensional dan KLT-kinerja tinggi

Elusi KLT
Pengembangan pelarut biasanya dilakukan dengan cara menaik (ascending), yang
mana ujung bawah lempeng dicelupkan ke dalam pelarut pengembang. Untuk
menghasilkan reprodusibilitas kromatografi yang baik, wadah fase gerak (chamber)
harus dijenuhkan dengan uap fase gerak.
Jarak pengembangan fasegerak biasanya kurang lebih 10-15 cm, akan tetapi
beberapa ahli kromatografi memilih mengembangkan lempeng pada jarak 15 20
cm. Untuk lempeng KLT-kinerja tinggi (HPTLC), yang mempunyai ukuran partikel
lebih kecil, maka pengembangan lempeng dilakukan ada jarak antara 3- 6 cm.

2. Pengembangan 2 dimensi
KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika
komponen-komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama,
karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain
itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan
pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan
pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda.

3. Pengembangan Kontinyu
Pengembangan kontinyu (pengembangan terus menerus) dilakukan dengan cara
mengalirkan fase gerak secara terus-menerus pada lempeng KLT melalui suatu
wadah (biasanya alas tangki) melalui suatu lapisan dan dibuang dengan cara
tertentu pada ujung lapisan.
4. Pengembangan gradien
Pengembangan ini dilakukan dengan menggunakan komposisi fase gerak yang
berbeda-beda. Lempeng yang berisi analit dapat dimasukkan ke dalam bejana
kromatografi yang berisi fase gerak tertentu lalu komponen fase gerak selanjutnya
ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam bejana dan diaduk sampai homogen.
Tujuan utama sistem ini adalah untuk mengubah polaritas fase gerak. Meskipun
demikian untuk memperoleh komposisi fase gerak yang reprodusibel sangatlah sulit
sehingga teknik kromatografi ini kurang begitu polpuler.4]

E. Deteksi
Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna.
Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, maupun biologi. Cara
kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu
pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika
yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan pencacahan
radioaktif dan fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar ultraviolet terutama
untuk senyawa yang dapat berfluoresensi maka bercak akan terlihat jelas. Jika
senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penyerapnya akan diberi indikator
yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam sedang latar
belakangnya akan kelihatan berfluoresensi. Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk
mendeteksi bercak :

1. Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi


secara kimia dengan seluruh solut yang mengandung gugus fungsional
tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang lempeng
dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna
dan intensitas warna bercak.

2. Mengamati lempeng di bawah lampu ultra violet yang dipasang panjang


gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solut sebagai bercak
yang gelap atau bercak yang berfluoresesnsi terang pada dasar yang
berfluoresensi seragam. Lempeng yang diperdagangkan dapat dibeli dalam
bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa fluoresen yang tidak
larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar
fluoresensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen
fluoresensi setelah dilakukan pengembangan.

3. Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu
dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak
sebagai bercak hitam sampai kecoklat-kecoklatan.

4. Memaparkan lempeng dengan uapa iodium dalam chamber tertutup.

5. Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer, suatu


instrumen yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari
permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar
tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat sebagai
puncak (peak) dalam pencatat (recorder).2,5]

Daftar Pustaka
1. Settle, F (Editor), 1997, Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry,
Prentice Hall PTR, New Jersey, USA.

2. Mulya, M., dan Suherman, 1995, Analisis Instrumen, Airlangga University Press, Surabaya.

3. Gritter, R.J., Bobbit, J.M., Schwarting, 1991, Introduction to Chromatography,


diterjemahkan oleh Padmawinata, Edisi II, Penerbit ITB Bandung.

4. Adamovics, J.A., 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals, 2nd Edition, Marcel


Dekker, New York.

5. Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS Scientific
Publishers Limited, New York.

: Alat Instrumen,TLC (KLT)

http://lansida.blogspot.com/2010/06/klt-kromatografi-lapis-tipis-tlc-
thin.html

Thin Layer Chromatography Kromatografi Lapis Tipis


April 7, 2011 Leave a comment

Berdasarkan jenis kepolaran, Thin Layer Chromatography (TLC) system, atau disebut
sebagai kromatografi lapis tipis dibedakan menjadi dua, yaitu normal phase (NP) dan
reversed phase (RP). Dalam sebuah TLC sendiri ada dua komponen utama, yaitu fase diam
(stable / immobilized phase) dan fase gerak (mobile phase) atau biasa disebut solvent/eluent.
Pada jenis NP, untuk fase diam-nya digunakan bahan yang bersifat polar, pada umumnya
menggunakan material silica gel (SiO2). Sedangkan pada jenis RP menggunakan material
yang bersifat non polar, salah satunya adalah ODS (Octadecylsilane). Harga ODS sendiri jauh
sangat mahal dibandingkan dengan harga silica gel, sehingga biaya TLC menggunakan
sistem reversed phase membutuhkan biaya yang lebih tinggi.

Sebuah TLC dari sebuah Butanol ekstrak tanaman Lamiaceae

Material yang digunakan dalam fase gerak memiliki sifat yang berkebalikan
dengan sifat material yang digunakan dalam fase diamnya. Kenapa demikian, hal
ini berfungsi untuk mengetahui apakah nantinya komponen atau senyawa aktif
yang diuji di atas TLC dapat diketahui dia lebih cenderung menyukai fase diam
atau fase geraknya. Kalau senyawa itu lebih menyukai fase diamnya, berarti dia
tidak akan bergerak cepat mengikuti laju pergerakan solvent yang disebabkan
oleh daya kapilaritas, sehingga titik henti atau retention time (Rf), berada pada
nilai rendah (posisi bagian bawah dari TLC), biasanya memiliki nilai Rf antara
0.20 0.30. Sedangkan kalau senyawa itu cenderung menyukai solventnya,
maka dia akan cepat bergerak mengikuti arus kapilaritas dari solvent tersebut,
biasanya berada pada nilai Rf antara 0.75 0.90.
Dengan demikian. pada NP system, dimana digunakan bahan bersifat polar
sebagai fase diamnya, maka untuk fase geraknya digunakan solvent yang
memiliki kepolaran yang rendah. Pada umumnya digunakan campuran antara
chloroform dan methanol dengan berbagai perbandingan dimana komponen
chloroform diberikan porsi yang lebih besar sebagai contoh (CHCl3:MeOH=65:35,
70:30, 75:25 dsb). Sedangkan pada RP system solvent yang digunakan memiliki
sifat kepolaran yang tinggi, dalam hal ini campuran antara methanol dan air
merupakan perpaduan yang sering digunakan dengan berbagai perbandingan
misalnya MeOH:water= 30:40, 50:50, atau 30:20. Angka perbandingan ini
disesuaikan dengan karakteristik senyawa yang sedang diuji. Berkaitan dengan
perbandingan dari campuran solvent ini akan dibahas kemudian.

Normal Phase TLC using SiO2

Reversed phase TLC (ODS/Octadecylsilane)

Sekarang, bagaimana cara kerja dari kedua sistem TLC tersebut? Yang pertama
untuk sistem NP, jika kita menguji kepolaran antara 3 jenis senyawa yang
berbeda tingkat kepolarannya. Sebagai contoh, berturut-turut dari senyawa A, B
dan C, memiliki tingkat polaritas dari yang tertinggi ke yang rendah. Maka ketika
ketiga senyawa diuji pada NP TLC senyawa A akan berada pada posisi terbawah
(Rf terkecil), C akan berada di posisi teratas (Rf tinggi), sedangkan B akan berada
di posisi tengah antara A dan C. Hal ini terjadi karena A (polaritas tinggi) secara
kimia akan cenderung menyukai fase diam daripada fase geraknya karena sama-
sama bersifat polaritas tinggi sehingga ikatan kimianya lebih kuat. Dengan
demikian si A ini lebih memilih diam bersama menempel fase diam daripada ikut
bergerak ke atas bersama solvent. Sedangkan senyawa C dengan polaritas yang
lebih rendah tentunya ikatan kimia dengan fase diam lebih rendah, sehingga dia
mempunyai kecenderungan menyukai fase gerak, oleh karena itu dia akan
bergerak mengikuti pergerakan solvent yang pada akhirnya akan berhenti pada
posisi tertentu (Rf). Sudah bisa dipastikan bahwa senyawa B akan berada pada
posisi tengah2 antara A dan C.
Prinsip yang sama juga terjadi pada sistem RP, hanya saja hasilnya akan
berkebalikan dengan NP, dalam kasus di atas senyawa A akan berada pada
posisi teratas dan C pada posisi terbawah. Hal ini bisa dipahami karena
memang baik fase diam maupun fase gerak kedua sistem berlawanan
sifatnya.
Prinsip kedua jenis TLC yang telah dijelaskan di atas juga digunakan
untuk column chromatography (CC). Karena pada dasarnya antara TLC
dan CC adalah sama secara sistem kerjanya, hanya berbeda dari segi
skala atau volume yang digunakan, baik fase diam atau fase gerak yang
digunakan maupun senyawa yang dielusikan ke dalamnya.
Kemudian berkaitan dengan perbandingan campuran solvent yang
digunakan. Perbandingan yang dipakai didasarkan pada karakteristik
senyawa yang diujikan. Yang pertama untuk aplikasi pada jenis NP, jika
senyawa yang diujikan memiliki tingkat polaritas yang tinggi, maka dia
akan berada pada posisi Rf yang sangat kecil, misalkan antara 0.01-
0.20, hal ini nanti akan kurang jelas terlihat pada saat pengamatan
hasil dan yang lebih penting lagi ketika diaplikasikan pada skala yang
lebih besar dengan menggunakan column chromatography maka hal ini
akan menyulitkan proses elusi. Untuk itu agar Rf berada pada rentang
0.40-0.60, maka tingkat polaritas solvent harus ditingkatkan, misalkan
pada awalnya menggunakan (CHCl3:MeOH=70:30), maka bisa
ditingkatkan konsentrasi methanolnya menjadi (CHCl3:MeOH=60:40
atau 65:35), tergantung hasil ujioba (trial and error). Dan sebaliknya
jika Rf terlalu tinggi (0.75-0.90) maka dapat diturunkan dengan
menurunkan konsentrasi dari MeOH (atau lebih tepatnya komponen
solvent dengan polaritas yang lebih tinggi)
Hal serupa juga berlaku pada sistem RP, misalkan fase geraknya adalah
campuran antara methanol dan air, maka untuk mempertinggi nilai Rf
dilakukan dengan cara meningkatkan konsentrasi methanol. Sebaliknya
untuk menurunkan nilai Rf dengan cara meningkatkan konsentrasi air
dalam campuran fase geraknya. Perbandingan yang optimal hanya
didapatkan dengan melakukan beberapa uji trial and error dengan
berbagai perbandingan, dapat dimulai dari standar (MeOH:water=1:1).
Dapat disimpulkan untuk penentuan formulasi optimal fase gerak, yang
menjadi kunci adalah permainan konsentrasi methanol, baik untuk NP
maupun RP. Khusus pada RP sendiri, peran methanol sebagai kunci
karena dia memiliki boiling point atau titik didih yang jauh lebih rendah
dibandingkan dengan air, sehingga daya kapilaritasnya akan lebih
tinggi dibandingkan air.

http://agn19.wordpress.com/2011/04/07/thin-layer-chromatography-
kromatografi-lapis-tipis/

agungnug19